（生药学专业论文）益气扶正注射剂中间体质量标准研究.pdf

黑龙江中医药人学硕士论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交硕士学位论文，是本人在指导教 师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经 注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经 发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本 声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：j 日期：0 7 年月归日 关于论文使用授权的说明 本人同意学校有权保留并向国家有关部门送交学位论文 的复印件，允许论文被查阅和借阅。同意学校及国家有关机 构有权公布论文的全部或部分内容，并采用影印、缩印或其 他复制手段保存论文。 本论文内容以任何形式公开发表或成果转让时须经导师 同意。 论文作者签名：奇舟 日期：呷年6 月日 指导教师签名 臼期：曰年6 黑龙江中医药大学硕士论文 中文摘要 本课题对益气扶正注射剂的中间体进行了较为系统的质量 标准研究，参照中国药典2 0 0 5 版中人参、丹参项下的内容， 分别对益气扶正注射剂中的主要药物人参、丹参药材进行了相 关内容的分析，同时增加了人参总皂苷含量测定及丹参总酚酸 含量测定，建立了人参、丹参原药材的质量标准。其中人参皂 苷总含量不得少于1 o ，丹参总酚酸含量不得少于3 0 。按照 中药新药研究的技术要求及中国药典2 0 0 5 版中药注射 剂项下的要求分别制定了人参中间体、丹参中间体的质量标准。 其中，人参中间体性状为棕黄色粉末、含水量小于5 o 、人参 总皂苷含量不得少于7 3 0 ；丹参中间体性状为棕红色粉末、含 水量小于5 o 、丹参总酚酸含量不得少于8 5 o 。薄层鉴别项， 人参中间体与丹参中间体均需符合药典要求。 按照中药注射剂指纹图谱研究的技术要求( 暂行) 的规定， 采用高效液楣色谱法分别制定了人参、丹参药材及中闻体指纹 图谱。人参药材与人参中间体以人参皂苷r b 。为参照峰分别确 定了1 9 个、1 0 个共有峰：丹参药材与丹参中间体以丹酚酸b 为参照峰确定了1 5 个共有峰，方法学考察均符合指纹图谱要求， 相似度均达到0 9 以上。 关键词；人参 丹参 注射剂 质量标准 指纹图谱 黑龙江中医药大学硕士论文 a b s t r a c t t h et o p i cb u i l du ps y s t e mq u a l i t yc r i t e r i o no fy i q i f u z h e n g i n j e c t i o ni n t e r m e d i a t e t h et o p i ce s t a b l i s h e dq u a l i t yc r i t e r i o n a c c o r d i n gt op a n a xg i n s e n ga n ds a l v i am i l t i o r r h i z ao f c h i n e s e m e d i c a ld i c t i o n a r y ) ) 2 0 0 5 ，s i m u l t a n e o u sa d dt o t a lg i n s e n o s i d e s a s s a y i n ga n dt o t a l w a t e rs o l u b i l i t yc o m p o u n da s s a y i n g t o t a l g i n s e n o s i d e sc a nn o tl e s st h a n1 o a n dc c t o t a lw a t e rs o l u b i l i t y c o m p o u n dc a nn o tl e s st h a n3 0 a c c o r d i n gt o t h et e e h n i c a l d e m a n do fn e w d r u gs t u d ya b o u tt r a d i t i o n ac h i n e s em e d i c i n e ) ) a n d c h i n e s em e d i c a ld i c t i o n a r y ) ) 2 0 0 5 ，g i n s e n gi n t e r m e d i a t eq u a l i t y c r i t e r i o na n dm i l t i o r r h i z ai n t e r m e d i a t eq u a l i t yc r i t e r i o nw e r e e s t a b l i s h e d t h eg i n s e n gi n t e r m e d i a t ei st h ep a l mt r e e y e l l o w p o w d e r m o i s t u r el e s st h a n5 o a n dt o t a lg i n s e n o s i d e sc a nn o t l e s st h a n7 3 t h em i l t i o r r h i z ai n t e r m e d i a t ei st h ep a l mt r e er e d p o w d e r ，i n o i s t u r e l e s st h a n10 a n dt o t a lw a t e r s o l u b i l i t y c o m p o u n d c a nn o tl e s st h a n8 5 o t h ec h e c ko fl a m e l l a r i d e n t i f i c a t i o na l ln e e dt om e e t c h i n e s em e d i c a ld i c t i o n a r y r e q u e s t t h et o p i ca c c o r d i n gt o t h et e c h n i c a ld e m a n do ft h ef i n g e r p r i n t a b o u ti n j e c t i o no ft r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e ) ) ，a d o p t e d h i g h e f f i c i e n c yl i q u i dc h r o m a t o g r a p h yt od r a wu pt h ef i n g e r p r i n to f g i n s e n g a n d g i n s e n gi n t e r m e d i a t e ，a n d t h e f i n g e r p r i n t o f m i l t i o r r h i z aa n dm i l t i o r r h i z a i n t e r m e d i a t e b ya n a l y z i n g t h e g i n s e n ga n dg i n s e n gi n t e r m e d i a t ef i n g e r p r i n to f10s a m p l e s ，t h e r e w e r e1 9a n d1 0c o m m o np e a k sr e f e r r i n gt ot h eg i n s e n o s i d e sr b l t h em i l t i o r r h i z aa n dm i l t i o r r h i z ai n t e r m e d i a t eh a v e15c o m m o n p e a k sr e f e r r i n gt ot h es a l v i a n o l i ea c i db 。t h et e c h n o l o g yr e s e a r c h a l lm a t c ht h ef i n g e r p r i n tr e q u e s ta n dt h es i m i l a r i t ya 1 1w e r em o r e t h a n0 。9 2 黑龙江中医药大学硕士论文 k e yw o r d s ：p a n a xg i n s e n g s a l v i am i l t i o r r h i z a i n je c t i o n q u a l i t yc r i t e r i o n f i n g e r p r i n t 3 黑龙江中医药大学硕士论文 第一章文献综述 第一节处方主要药效成分研究概况 1 人参皂苷研究概况 人参( r a d i xe tr h i z o m ag i n s e n g ) 为五加科植物人参属植 物人参p a n a x g i n s e n g c a m e y 的干燥根及根茎。人参最早记 载于神农本草经【l 】，其性平，味甘，微苦，具有大补元气， 补脾益肺，生津，安神的功效，用于体虚欲脱，肢冷脉微，脾 虚食少，肺虚喘咳，津伤口渴，内热消渴，久病虚赢，惊悸失 眠，阳痿宫冷；心力衰竭，心源性休克【2 1 ，素有“百草之王”之 称，在我国药用历史约五千年。人参的现代研究表明，其化学 成分复杂，药理作用广泛，现将与本实验相关文献报道概述如 下。 1 1 人参皂苷类化学成分研究概况 人参的化学成分研究始于1 8 5 4 年，但由于当时条件限制， 直到2 0 世纪7 0 年代才取得了较大进展，相继确立了主要人参 皂苷的结构。现代药物学研究已证明人参皂苷类成分是人参的 主要活性物质，迄今为止，从人参中分离鉴定出4 0 多种皂苷 类成分【3 1 ，根据皂苷元类型人参皂苷主要分为以下三种： ( 1 ) 人参皂苷二醇型：包括人参皂苷( g i n s e n o s i d e ) r a l ， r a 2 ，r a 3 ，r b j ，r b ，r b 3 ，r c ，r d ，r 9 3 ，r h 2 ，r s l ，r s 2 ：乙 酰人参皂苷( a c e t y l g i n s e n o s i d e ) r b l ，r b 2 ，r e l ；丙二酰人参皂 苷( m e i l o n y l g i n s e n o s i d e ) m r b l ，m r b 2 ，m r c ，m r d ；三七皂 苷( n o t o g i n s e n o s i d e ) r 4 ，西洋参皂苷( q u i n q u e n o s i d e ) r l 等。 ( 2 ) 人参皂替三醇型：人参皂苷( g i n s e n o s i d e ) r e ，r f ，r g 】， r 9 2 ，r hz ；三七皂苷r l ；假人参皂苷( p s e u d o g i n s e n o s i d e s a p o n i n ) f i i ，r p l ，r t i ；c h i k u s e t s u s a p o n i n i v a 等。 ( 3 ) 齐墩果酸类：人参皂苷r 。 1 2 人参皂苷类质量控制研究概况 本世纪6 0 年代以前，人参研究进展缓慢，人们只能根据 直观的判断从性状上对人参进行初步鉴别，6 0 年代以后，随 黑龙江中医药大学硕士论文 着科学技术发展，人参的研究取得了突破，在确定了主要活 性物质的同时，开始利用这些活性成分的化学性质进行定性 鉴别【4 1 。例如皂苷类成分独有的泡沫反应、伍一萘酚浓硫酸反 应等均可作为人参皂苷类成分的检识反应 5 1 ，此后的薄层层析 又进一步分析鉴别了人参几个主要单体皂菅化合物【6 。】，近些 年来开始采用各种不同的方法对单体皂苷及总皂苷进行含量 测定，从宏观到微观，从定性到定量，更加全面、系统地对 人参进行质量控制。 早期多采用比色法对人参总皂苷进行含量测定1 8 - 9 ；用双 波长薄层扫描法测定人参单体皂苷含量【1 0 0 1 i ；j c o r t h o u tt 应 用薄层层析光度法对人参单体皂苷r b l ，r g 。进行含量测定 1 2 1 ，这些方法存在着许多不足，比如精密度较差、分辨率不 高等。而后的高效液相色谱法 1 3 - 1 6 | 凭借其分辨率高，重现性 好等优点，在含量测定方面应用广泛，高效液相色谱一质谱联 用等技术的应用又使人参皂苷的分离、鉴别、测定上升到了 一个新的水平【1 7 之1 1 。高效液相色谱法是2 0 0 5 年版中国药典 中规定的人参含量测定方法，国内外研究学者已采用不同色 谱柱填料、多种流动相系统分析了人参皂苷类成分 2 2 - 2 4 。 1 3 人参皂苷药理作用研究概况2 5 2 9 】 现代药理学研究表明，人参皂苷药理作用广泛，对中枢神 经系统、心血管系统、内分泌系统、物质代谢等均有影响， 同时还有增强机体免疫力、抗肿瘤、保肝、抗溃疡和抗炎作 用。 人参皂苷r g 类对中枢神经系统有兴奋作用，人参皂苷r b 类则有抑制作用；人参皂苷r b l 有增强记忆力、增强肾上腺皮 质、促进核酸和蛋白质的合成、拮抗海马球神经细胞凋亡、 扩张血管和调节血压：抗老年痴呆的作用；人参皂苷r d 与 r e 具有促进淋巴血细胞转化、增强机体免疫力的作用；人参 皂苷r b l 、r b 2 能够促进肾上腺皮质激素合成与分泌；人参皂 苷r e 、r 9 1 、r b l 、r e 是人参扩张血管的主要有效成分；近年 黑龙江中医药大学硕士论文 来的研究也表明，人参中分离出的2 0 多种单体皂苷均有抗肿 瘤作用，人参皂苷r h 2 的抗肿瘤作用备受国内外科研人员的重 视。 2 丹参总酚酸研究概况 丹参( r a d i xe tr h i z o m as a l v i a em i l t i o r r h i z a e ) 为唇形科植 物丹参( s a l v i am i l t i o r r h i z ab g e ) 的干燥根及根茎。丹参在历 代本草中多有记载，其味苦，性微寒，具有祛瘀止痛，活血 通经，清心除烦的功效，用于治疗月经不调，经闭痛经，瘸 瘕积聚，胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿瘤，心烦不眠；肝脾 肿大，心绞痛1 2 等症，为活血化瘀的要药。 2 1 丹参总酚酸化学成分研究概况 丹参的化学成分研究已有5 0 多年历史1 3 0 - 3 2 1 ，早在3 0 年代 日本学者n a k a o 首先得到了3 种脂溶性成分。此后，我国学 者在化学研究方面进行了深入系统的探索，先后分离得到了一 系列水溶性化合物【33 1 。酚性芳香酸为其水溶性部位的主要成 分，多含有苯丙烷( c 6 c 3 ) 结构，以及由该类酸缩合形成的 多酚芳酸1 3 4 。 1 9 8 0 年从丹参中得到d ( + ) b ( 3 ，4 二羟基苯基) 乳酸即丹参 素，是各种丹酚酸的基本化学结构，而后又得到了该化合物的 两分子缩合物丹参酸丙( s a l v i a n i cc ) ，丹参素与一或二分子咖啡 酸缩合形成的迷迭香酸、丹酚酸a 【35 。3 6 1 ( s a l v i a n o l i ea c i da 1 和 l i t h o s p e r m i ca c i d ，以及三分子丹参素和一分子咖啡酸缩合形 成的丹参酸乙( s a l v i a n i cb ) 。目前，分离得到的丹参酚酸类化合 物主要有：丹参酚( s a l v i 0 1 ) ，丹酚酸a ，b ，c ，d ，e ( s a l v i a n o l i c a c i da ，b ，c ，d ，e ) ，丹参酸甲，乙，丙( s a l v i a n i ca ，b ， c ) ，原儿茶醛( p r o t o c a t e c h u i c a l d e h y d e ) ，丹参素，原儿茶酸 ( p r o t o c a t e c h u i ca c i d ) ，异阿魏酸( i s o f e r a l i ca c i d ) ，琥珀酸 ( s u c e i n i ea c i d ) ，咖啡酸( c a f f e i ea c i d ) ，紫草酸( 1 i t h o s p e r m i c a c i d ) ，紫草酸乙氨钾盐( a m m o n i u m p o t a s s i u ml i t h o s p e r m a t e a c i d ) ，熊果酸( u r s o l i ea c i d ) ，紫草酸乙镁盐( m a g n e s i u m 黑龙江中医药大学硕士论文 l i t h o s p e r m a t eb ) ，原紫草酸( p r o l i t h o s p e r m i ca c i d ) ，迷迭香酸 ( r o s m a r i n i ca c i d ) ，天然苯并呋喃、鼠尾草酚等【3 3 。7 1 。 2 2 丹参总酚酸质量控制研究概况 国内外对丹参质量控制标准研究较早，但是大多数都是对 丹参脂溶性化学成分进行定性与定量测定，随着丹参酚酸类成 分药理作用研究的深入，控制丹参酚酸类成分的质量成为衡量 丹参药材及制剂质量优劣的一个重要标准。因此在2 0 0 0 年版 中国药典对丹参酮i ia 进行定性与定量分析的基础上， 2 0 0 5 年版中国药典增加了对丹酚酸b 的定性与定量分析。 丹参酚酸类成分质量控制的研究主要由t l c 定性鉴别与 含量测定两部分组成。有时也采用指纹图谱对丹参进行宏观定 性。对丹参酚酸类成分含量测定的方法较多。比色法、紫外分 光光度法都可用于丹参总酚酸含量的测定 3 8 - 3 9 1 ；竺叶青等曾 利用薄层层析分光光度法测定丹参中的原儿茶醛含量1 4 0 1 ；薄 层扫描法也凭借其操作简便，分离效果好，结果准确的特点在 单体化合物含量测定上占据了一定的位置 4 1 】，但是该方法重 现性较差，含量测定结果受分离效果的影响，有一定的不足之 处；高效液相色谱法在丹参酚酸类成分的含量测定上显现了分 析精密度高、测定结果准确、重现性好等优点，因此在测定丹 参酚酸类成分单体化合物的含量方面高效液相色谱法几乎替 代了其它所有的方法，例如丹参主要酚酸类成分丹酚酸b 、原 儿茶醛、原儿茶酸以及丹参素等都有用h p l c 法测定含量的相 关文献报道1 4 2 - 4 4 。 2 3 丹参总酚酸药理作用研究概况【2 5 4 “4 7 j 现代药理学研究表明丹参酚酸类成分的药理作用广泛，具 有改善微循环、抗血栓、促进组织恢复等多种活性。 丹参总酚酸类化合物主要活性成分之一的丹参素能够明显 扩张冠状动脉，使其血流量增加，具有抗心肌缺血的作用；原 儿茶醛具有抗心绞痛作用；总酚酸类成分具有很强的抗脂质过 氧化和清除自由基等作用，其中含量最高的2 个成分丹酚酸a 和 黑龙江中医药大学硕士论文 丹酚酸b 活性最强，对脂质过氧化引起的细胞膜损伤有明显的保 护作用：丹参总酚酸具有增加胃粘膜的防御功能从而起抗消化 性溃疡作用；近年来的研究进一步表明，丹参总酚酸在抗肝脏 损伤、抗动脉粥样硬化及细胞凋亡等方面也有显著活性。 黑龙江中医药大学硕士论文 第二节中药质量标准研究概况 药品标准是国家对药品的质量规格和检验方法所做的技 术规定，是药品生产、经营、使用、检验和监督管理部门共同 遵守的法定依据。为了不断完善和丰富祖国中医药，保证中药 的安全性和有效性，更好地为人类的健康服务，有必要在中药 的质量标准方面进行深入的研究。其实，中药一直处在不断规 范化、标准化的进程中。从神农本草经，新修本草到本 草纲目，古人为中药的标准化做了大量工作。新中国成立后， 我国颁布了8 版药典，从收载的内容到收载的品种都在逐渐增 多，每个品种项下的“鉴别”、“含量测定”等项目都随着时代和 科技的发展而不断完善提高。 1 中药质量标准研究发展过程 中药质量标准的建立经历了从无到有的发展过程。自1 9 8 5 年药品管理法颁布实施以来，药品的质量标准成为药品生 产必须遵循的法定依据。现行的中药质量标准模式基本是参照 国外植物药的质量控制方法，借鉴化学药品质量控制的模式， 选定某一中药的“有效成分”、“活性成分”、或“指标成分”，建 立相应的理化鉴别，再发展到以光谱、色谱为主的鉴别和含量 测定1 4 8 1 。随着历版中国药典的制订、修订、增订以及药 品注册管理办法的实施，这种模式的中药分析方法和质量标 准被大面积普及推广，并逐步提高和改进。在中药材及中成药 的生产、研究和上市药品的监督管理等方面，起着不可替代的 重要作用，广泛地渗透到中药原料、制剂及某些商品的质量和 控制的应用中。现行中药质量标准包括中国药典、部( 局) 颁标准和少数地方标准，其中中国药典和部( 局) 颁标准属 于国家标准的范畴。 目前中药质量标准的研究对象主要是药材和成方制剂。药 材质量标准的内容包括名称、基源、药用部位、采收加工、性 状、鉴别、检查、浸出物、含量测定、炮制、性味与归经、功 能与主治、用法与用量、注意、贮藏等。成方制剂质量标准的 黑龙江中医药大学硕士论文 内容包括名称、处方、制法、性状、鉴别、检查、含量测定、 功能与主治、用法与用量、注意、规格、贮藏等f 2 】。 2 分析技术在中药质量标准中的应用与发展 中药的分析鉴别手段，在二十世纪五、六十年代主要是以“基 源”、“外观性状”、“试管反应”为主，从1 9 8 5 年版中国药典 开始，色谱、光谱等仪器分析技术在中药质量控制中逐步被采 用，到2 0 0 5 年版中国药典，现代仪器分析有了大量的应用， 已经渗透到现代中药质量标准研究的每一个环节中。 显微鉴别和理化鉴别等经典的分析技术在现代中药质量标 准中仍有广泛应用，但是随着科学技术的发展，色谱( t l c 、 h p l c 、g c 、h p l c m s 等) 、光谱( 紫外、红外、近红外) 、 波谱( 质谱、核磁共振谱) 等高科技技术成为分析技术的主流。 例如，t l c 具有简便、快速、并具有分离和分析的双重功能等 优点 4 9 1 ；g c 具有分离效能高、样品用量少、分析速度快等特点， 常用于分析挥发性成分【5 0 ”1 ；随着中国药典) ) 2 0 0 0 年版中h p l c 含量测定应用幅度增大，h p l c 凭借其快速、灵敏、柱效高、重 现性好等特点成为一种有效并且普遍实用的中药分析技术，可 用于高分子、极性、离子和热不稳定化合物的分离分析，在中 药的定性、定量和杂质检查等方面都发挥了重要作用1 5 2 - 5 5 1 。光 谱法是通过某些化学基团在特定波长或一定波长范围内有选择 性的吸收，对药材或制剂进行定性与定量分析。波谱主要是在 化合物的结构鉴定上发挥着其与众不同的作用。 随着科学的发展，一些新技术、新方法也正在逐步进入常 规检验的范畴。如超临界流体萃取超临界液体色谱( s f e s f c ) 、 高效毛细管电泳法( h p c e ) 、电感耦合等离子体质谱( i c p m s ) 、 分子生物学技术、中药指纹图谱、化学模式识别( p c a 、s i m c a 、 n l m 、a n n 等) 以及色谱与光谱联用技术( g c m s 、g c f t i r 、 h p l c m s 、h p l c n m r 、c e m s ) 等都是新一代先进分析技术 的代表。这些先进技术的应用必将推动中药质量标准的进一步 发展。 黑龙江中医药大学硕士论文 3 中药注射剂质量标准的研究现状 中药注射剂质量标准的制订必须在处方组分固定、理化性质 研究基本明确、工艺稳定的基础上进行。根据实验研究的结果， 以方法成熟、灵敏度高，准确性及重现性好，专属性强为原则 来确定必要的检测项目，制定质量标准。为保证质量稳定，对 注射剂的组份、半成品、成品均需制定质量控制项目。 自从1 9 8 5 年我国药品管理法颁布以来，已收载于国家 标准，目前仍在使用的中药注射剂有l o o 多种。每个注射剂品种 均需进行装量差异、鉴别、含量测定、不溶性微粒、可见异物、 无菌检查、热原或细菌内毒素、蛋白质、鞣质、树脂、草酸盐、 钾离子等项目检查。其中鉴别与含量测定项目是中药注射剂质 量控制的关键内容。注射剂组成药物中每味药物均应进行定性 鉴别，对处方主要组成药物需进行含量测定1 2 1 。 2 0 0 0 年国家食品药品监督管理局颁发中药注射剂指纹图谱 研究的技术要求( 暂行) 的通知，为了加强中药注射剂的质量 管理，确保中药注射剂的质量稳定、可控，中药注射剂在固定 中药材品种、产地和采收期的前提下，需制定中药材、有效部 位或中间体、注射剂的指纹图谱。指纹图谱成为中药注射剂质 量控制中非常重要的一个研究项目。 黑龙江中医药大学硕士论文 第三节中药指纹图谱的研究概况 随着现代分析技术的发展，指纹图谱技术是当今国际公认的 控制中药质量的重要标准之一。它能从原药材的栽培、引种， 中成药生产工艺的规范与优化，到产品质量控制提供全方位的 质量保证。近年来国外对草药产品的质量评价也在提倡指纹图 谱。日本汉方药在2 0 世纪8 0 年代就采用高效液相指纹图谱控制 质量【56 j ；欧共体也将指纹图谱监控技术应用于植物药质量控制 【57 】；美国食品药品管理局允许草药保健品申报时提供色谱指纹 图ps l ；世界卫生组织在1 9 9 6 年草药评价指导原则中也规定：如 果草药的活性成分不明，可以提供色谱指纹图以证明产品质量 的一致性”9 】；此外英国、印度、加拿大等国家在植物药的研究 中，也对指纹图谱十分重视【6 们。2 0 0 0 年国家药品监督管理局颁 布了中药注射剂指纹图谱研究的技术要求( 暂行) ，要求中药 注射剂必须进行指纹图谱的研究，并建立其相关的标准，规范 了中药指纹图谱的研究，从而促进了国内近几年来对指纹图谱 的研究热潮。我国对中药指纹图谱的研究尚处于初级阶段，与 发达国家相比有一定差距。目前中药指纹图谱分析主要是利用 各种方法建立中药材及制剂的指纹图谱，以及对相应信息进行 数字化处理，使其能够评价和控制中药材及制剂的质量，是对 原药材、半成品、最终产品判断其真实性、质量一致性与稳定 性的可行而有效的手段。 1 中药指纹图谱研究的内容、特点及意义 中药指纹图谱的主要研究内容包括 6 1 l ：( 1 ) 规范化的中药 特征总提物获取程序的研究及其指纹图谱的建立；( 2 ) 中药指 纹图谱的解析研究；( 3 ) 指纹图谱的相关性研究；( 4 ) 指纹图谱 技术在中药材和复方制剂质量控制中的推广应用。 中药指纹图谱具有以下几方面特点【6 2 】：一是特征性和专属 性，图谱应能体现出中药的种属、产地或采收季节的差异；二 是可量化性，通过选取合适的定量函数解析方法，图谱应能对 中药成分进行有效控制，确保产品质量的相对稳定一致；三是 黑龙江中医药大学硕士论文 稳定性和重现性，这是由药材的标准化和图谱采集手段两方面 决定的；四是完整性，由于部分中药的有效成分未被阐明或未 被全部阐明，因此，仅对某个有效成分或指标性成分进行定性、 定量分析，不能有效控制中药的质量，所以图谱应能相对全面、 系统地体现中药中已知和未知药理作用的物质成分；五是细节 处理的模糊性，因为中药成分间协同、交互作用的复杂机制， 故在解决实际问题时应采用模糊数学等分析手段。 中药指纹图谱是从中药物质基础的角度出发，运用多学科 的交叉综合技术手段对复杂物质组成体系质量稳定性进行评价 的计算机辅助分析检测方法，主要体现了信息获取、信息处理、 信息挖掘三方面的内容，满足了对中药质量的可控、保证其疗 效的要求。指纹图谱力图从药材的各个角度和方面，进行中药 样品的理化分析，通过相似性和相关性对比发现质量变异和缺 陷，有效地鉴别样品的真伪或产地；通过指纹图谱主要特征峰 的含量或比例的制定，能有效控制样品的质量，从而全面、特 异地控制和把握住中药的质量命脉。同时指纹图谱通过把握药 材、成方中有效部位或有效组分的理化特性，直接将化学物质 基础与药效相结合，从整体综合的角度把握住了药物作用的针 对性，为新药产生和快速筛选提供了研究思路和方法。中药指 纹图谱技术是当前符合中药特色的评价中药真实性、稳定性和 一致性的质量控制模式之一。通过中药指纹图谱的建立，能比 较全面反映中药所含化学成分的种类与数量，尤其是在现阶段 有效成分绝大多数没有明确的情况下，能更好地反映中药内在 质量，大大提高了中药质量评价的技术水平和科技含量 6 3 1 。中 药指纹图谱质控技术是使中药制剂达到“安全、有效、可控”， 实现其走向标准化、现代化、国际化的必备保证。 2 中药指纹图谱的分类1 6 4 1 指纹图谱可分别按照应用对象和测定手段进行分类。 按应用对象分类：可分为中药材指纹图谱、中药原料指纹图 谱、中间产品指纹图谱、中药制剂指纹图谱。 黑龙江中医药大学硕士论文 按测定手段分类：根据测定时所采用的分析手段不同可分 为，中药生物指纹图谱和中药化学指纹图谱。中药生物指纹图 谱包括中药材d n a 指纹图谱，中药基因组学指纹图谱，中药蛋 白组学指纹图谱。中药化学指纹图谱又可以分为光谱指纹图谱 ( 如i r 、u v 、x 射线衍射等) ，色谱指纹图谱( 如t l c 、g c 、h p l c 、 c e 等) ，波谱指纹图谱( 如m s 、n m r 等) 、以及采用多种现代分 析仪器联用得到的多维多息特征谱( 如h p l c m s 、h p l c m s m s 、g e m s 、c e m s ) 等。其中色谱法为主流方法，尤其 是t l c ，h p l c ，g c 已经成为了公认的三种常规分析手段。 3 本课题处方药材指纹图谱研究现状 3 1 高效液相指纹图谱的研究现状 高效液相指纹图谱是中药指纹图谱分析技术中最常用的一 种分析技术，它信息量较大，对中药及制剂的质量提供较全面、 可靠的科学评价，当主要有效成分具有对照品时，可达到中药 的识别、半定量、定量及各成分相对比较定量，对中药及制剂 的质量控制十分有效，具有分离效能高，分析速度快等优点。 在品种鉴定方面：洪筱坤等较早利用g c 指纹谱的原理，首 次引入特征峰群的概念，建立了大黄的h p l c 指纹图谱 6 5 - 6 6 ；张 思巨等通过对阿胶、鹿角胶和龟甲胶h p l c 指纹图谱的比较研 究，提出了3 种胶的真伪鉴别、提供了内在质量控制的科学依据 旧7 。在质量控制方面：德国学者o s t i e h e r 早在1 9 9 3 年发表的 文章中指出银杏叶主要成分是黄酮苷类与银杏内酯，采用十多 种化学成分的高效液相色谱图作指纹图谱，同时用其中多个化 学成分( 指标成分) 作为定量的标准，作为中药指纹图谱研究的成 功范例【6 引。在注射剂指纹图谱研究方面：已报道的三七注射液 【69 1 、复方人参注射液【7 0 1 、银杏注射液 7 h 及注射用七叶皂苷钠的 h p l c e l s d 指纹图谱【7 2 】等均为注射剂的质量控制提供一定依 据。 3 2 人参指纹图谱研究现状 人参的指纹图谱研究较多，主要是针对人参皂苷类成分进行 黑龙江中医药大学硕士论文 的分析研究。起初谢培山 t s - t s 等采用薄层色谱法对人参、西洋 参、三七进行薄层指纹图谱分析，而后翟为民【7 6 】等又采用h p l c 法研究了人参、西洋参、三七的h p l c 指纹图谱。由于h p l c 法 分析速度快、精密度高、重现性好等优点，用h p l c 法制定人参 药材指纹图谱的方法广为应用。游元元【7 7 】采用s h i m p a c k 色谱柱 ( 2 5 0 m m x 4 6 m m ，5 p m ) ，乙腈5 0 m m o l l k h 2 p 0 3 梯度洗脱制定 人参药材指纹图谱。仇熙等r 7 8 】采用z o r b a xo d s ( 2 5 0 m m x 4 6 m m ， 5 m ) 色谱柱，乙腈水梯度洗脱分析人参复方注射剂中人参皂 苷指纹图谱，吴昊 7 9 1 等也采用h p l c 法研究了参麦注射液的指纹 图谱等人参皂苷类成分指纹图谱报道。但各文献报道的色谱条 件及其h p l c 指纹图谱均不相同，不同的仪器设备、不同的药材 来源、不同的样品制备方法等因素均影响色谱条件的确定，从 而得到不同的指纹图谱。 3 3 丹参指纹图谱研究现状 丹参化学成分分为脂溶性成分和水溶性成分两种，所以通常 分别制定丹参的脂溶性成分指纹图谱与丹参的水溶性成分指纹 图谱。丹参的水溶性指纹图谱通常采用t l c 法与h p l c 法，但 h p l c 法更为常用。金樟照 8 0 1 等采用s h i m p a c kv p o d s ( i5 0 m m x 4 6 m m ，5 m ) 色谱柱，甲醇0 5 冰醋酸水溶液为流动相梯度 洗脱6 0 分钟建立丹参总酚酸类化学成分指纹图谱，夏广平 s l 】等 也采用h p l c 法研究了丹参药材的指纹图谱，李永吉【8 2 】等采用 n p v a p a r kc l8 柱( 3 9 1 5 0 m m ，4 1 a m ) ，甲醇一1 磷酸水溶液梯度 洗脱的方法制定心肌康注射液丹参药材指纹图谱检测标准。由 于丹酚酸类化合物为酸性化合物，因此流动相几乎均采用酸水 洗脱，但酸水种类的选择、各种酸水的比例则各有不同。另外， 不同的仪器设备、不同的药材来源、不同的样品制备方法等影 响因素，所得指纹图谱均不相同。因此建立指纹图谱时，应在 参考相关文献的基础上，根据不同实验条件，建立适宜的、相 应的样品指纹图谱分析方法。 第四节立题依据及研究意义 益气扶正注射剂主要是治疗病毒性心肌炎以及由病毒性 心肌炎引起的心律失常等后遗症的有效方药。中药新药研究 的技术要求中规定，需对注射剂的组份、半成品、成品制定 质量控制项目。以有效部位组方的中药注射剂，测定含量的组 分应不低于总固体量的7 0 ( 静脉注射剂不低于8 0 ) 。 本文拟对益气扶正注射剂中的主要药效成分人参皂苷类 化合物和丹参总酚酸进行质量标准研究，将按照2 0 0 5 版中 国药典及中药新药研究的技术要求中有关规定制定两类 化合物及其相应药材的质量标准。同时，按照中药注射剂指 纹图谱研究的技术要求( 暂行) 的规定，研究人参中间体及原 药材、丹参中间体及原药材的指纹图谱，并分别进行半成品与 原药材的相关性研究，以确保该注射剂中间体质量的稳定与可 控。 其研究结果可为益气扶正注射剂质量标准的制定提供实 验依据，对益气扶正注射剂的新药研发具有理论和实际意义。 黑龙江中医药人学硕十论文 第二章益气扶正注射剂药材及其中间体的 鉴别、检查及含量测定 第一节人参药材及其中间体的鉴别、检查及含量测定 1 人参药材的鉴别，检查及含量测定 1 1 仪器与试药 1 1 1 仪器 w a t e r s2 6 9 5 型四元液相色谱泵，2 9 9 6 型二极管阵列检测器； m i l l e n n i u m ”色谱工作站；紫外可见分光光度计u v l 6 0 0 型； a b n 电子分析天平( 梅物勒托利多仪器上海有限公司) ；恒温 于燥箱( 上海一恒科技有限公司) ；恒温水浴锅( 上海跃进医疗 器械厂) 。 1 1 2 试药 甲醇、氯仿、乙酸乙酯、冰醋酸：北京益利精细化学品有限 公司，分析纯；香草醛：天津市化学试剂一厂，化学纯：高氯 酸：天津市津东天正精细化学试剂厂，分析纯；乙腈：美国天 地( t e d i a ) 试剂公司，h p l c 级；水：杭州娃哈哈集团公司， 娃哈哈纯净水；硅胶g ：青岛海洋化工厂，化学级。 1 1 3 对照品与样品 人参皂苷对照品r g i 、r e 、r b l ( 供含量测定用) ，r f ( 供定 性鉴别用) 均购子中国药品生物制品检定所；人参药材样品购 于吉林长白参隆集团有限公司g a p 基地。 1 2 薄层鉴别 1 2 1 对照品溶液的制各 取人参皂苷r g l 、r e 、r b l 和r f 对照品，加甲醇制成每1 m l 含四种对照品各l m g 的混合溶液，作为对照品溶液。 1 2 2 供试品溶液的制备 取人参药材样品粉末1 9 ，加三氯甲烷4 0 m l 回流1 小时，弃 去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，加水0 5 m l 搅拌湿润，加水饱合 正丁醇1 0 m l ，超声处理3 0 m i n ，吸取上清液加3 倍量氨试液， 摇匀，放置分层，取上层液蒸干，残渣加甲醇1 m l 使溶解，作 黑龙江中医药大学硕士论文 为供试品溶液。 1 2 3 鉴别 照薄层色谱法( 中国药典2 0 0 5 年版一部附录v ib ) ，吸 取对照品溶液和样品溶液各1 2 1 x l ，分别点于同一硅胶g 薄层 板( 厚5 0 0 9 m ) 上，以三氯甲烷乙酸乙酯甲醇一水( 1 5 ：4 0 ： 2 2 ：1 0 ) 1 0 以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾 干，喷以1 0 硫酸乙醇溶液，在1 0 5 加热至斑点显色清晰，置 紫外光灯( 3 6 5 n m ) 下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相 应位置上，分别显相同颜色的荧光斑点。结果见图1 - 1 。 图1 1 人参药材t l c 鉴别 1 3 检查 1 3 1 水分 参照中国药典2 0 0 5 版水分测定法( 附录h 第一法) ， 测定人参药材样品的含水量，人参药材水分不得超过1 2 o 。结 果见表1 6 。 1 3 2 灰分测定 参照中国药典2 0 0 5 版灰分测定法( 附录k ) ，测定人 参药材样品的灰分，人参药材总灰分不得超过5 0 ，酸不溶性 灰分不得超过1 o 。结果见表1 - 6 。 1 4 人参总皂苷含量测定 黑龙江中医药大学硕士论文 1 4 1 对照品溶液的制备 取人参皂苷r e 对照品，加甲醇制成每1 2 5 m g m l 的溶液， 作为对照品溶液。 1 4 2 供试品溶液的制备 精密称取人参药材样品粉未2 9 ，7 0 甲醇超声提取3 次，每 次1 5 m i n 。合并提取液，回收甲醇，残渣加水饱和的正丁醇5 0 m l 溶解，转移到分液漏斗中，加氨水洗涤2 次，每次5 m l ，取正丁 醇层，再加正丁醇饱和的水洗涤2 次，每次5 m l ，取正丁醇层蒸 干，残渣加甲醇溶解，定容至1 0 m l 容量瓶中，作为供试品溶液。 1 4 3 样品含量测定 精密吸取人参药材样品溶液4 0 1 t l ，置磨口带塞试管中，4 0 c 水浴加热蒸干，冷却，精密加入新配制的5 香草醛冰醋酸溶液 0 2 m l 及高氯酸0 8 m l ，振摇后，置6 0 水浴中加热1 5 r a i n ，冷 水浴冷却5 m i n ，再加入冰醋酸5 m l ，充分摇匀，随行空白，于 5 8 2 n m 下测定样品吸收度，计算含量，标准曲线及方法学考察 见人参中间体质量标准研究项下。人参药材中人参总皂苷含量 不得少于1 0 。结果见表1 6 。 l 。5 人参单体皂苷的含量测定 1 5 1 色谱条件 色谱柱：k r o m a s a i lo d s ( 4 6 m m x 2 5 0 m m ，5 u m ) ( 中国科学 院大连化学物理研究所) ；流动相：乙腈( a ) 一水( b ) 梯度洗脱； 流速：1 3 m l m i n ；检测波长：2 0 3 n m ；柱温：4 0 ；进样量： 2 0 9 l 。 1 5 2 对照品溶液的制备 精密称定人参皂苷对照品r g i ，r e 和r b l 适量，加甲醇制成 黑龙江中医药大学硕士论文 每l m l 各含0 2 m g 的对照品混合溶液。 1 5 3 样品溶液的制备 取人参药材样品粉末1 9 ，精密称定，置索氏提取器中，加三 氯甲烷4 0 m l 加热回流3 小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂， 连同滤纸筒移入1 0 0 m l 锥形瓶中，精密加水饱和正丁醇5 0 m l ， 密塞，放置过夜，超声处理3 0 分钟，滤过，弃去初滤液，精密 量取续滤液2 5 m l ，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至 5 m l 容量瓶中。加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即 得。 1 5 4 标准曲线制备 精确量取对照品混和溶液5 l ，1 0 9 l ，1 5 斗l ，2 0 l x l ，3 0 9 1 分 别注入高效液相色谱仪，按1 5 1 项下色谱条件测定峰面积，以 峰面积为纵坐标，皂苷含量为横坐标绘制标准曲线，线性回归 方程、相关系数r 值和线性范围见表1 1 ，h p l c 色谱图见图1 2 。 表1 1 人参药材单体皂菅含量测定线性关系 y ：峰面积； x ：人参皂苷含量( m g ) ； n = 3 1 5 5 精密度实验 精确吸取对照品混和溶液2 0 9 l ，按1 5 1 项下色谱条件测定， 连续进样5 次，测定人参皂苷峰面积，峰面积积分值的r s d 均 小于2 ，结果见表1 2 。 表1 - 2 人参药材单体皂苷含量测定精密度实验结果 1 5 6 重现性实验 精密称取人参药材样品粉末l g ，按照1 5 3 项下平行操作制 备5 份样品溶液，进样量2 0 p , l ，代入标准曲线计算人参皂苷含 量，各成分含量的r s d 均小于3 ，结果见表1 3 。 盘1 3 人参鍪梦单体皂苷含量测定重现性实验结果单位：m g g 1 5 7 稳定性实验 精密称取人参药材样品粉末1 9 ，按照1 5 3 项下制备样品溶 液，测定样品溶液随时间变化的峰面积积分值，各峰面积积分 值的r s d 均小于2 。结果见表1 - 4 。 黑龙江中医药大学硕士论文 表1 4 人参药材单体皂苷含量测定稳定性实验结果 ( n = 3 ) 1 5 8 加样回收率实验 精密称取已知含量的人参