（分析化学专业论文）铕荥光探针及其在药物和dna分析中的应用.pdf

at h e s i si na n a l y t i c a lc h e m i s t r y y 18 4 2 m i l m r19i m p l | 1 6 r l l l lilt r l ” e u r o p i u m f l u o r e s c e n tp r o b ea n d a p p l i c a t i o n s i nt h e a n a l y s i so fm e d i c a m e n ta n dd n a b yl i uz h e n s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rx us h u k u n n o r t h e a s t e r nu n i v e r s i t y j a n u a r y2 0 0 8 1 独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下完成的。论文中取得 的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人己经发表或撰写过 的研究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 = e 思0 学位论文作者签名： 未1 日 期：瑚，了 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者和指导教师完全了解东北大学有关保留、使用学位论 文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人同意东北大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索、交流。 ( 如作者和导师不同意网上交流，请在下方签名；否则视为同意。) 学位论文作者签名： 签字日期： 导师签名： 签字日期： 一 东北大学硕士学位论文摘要 铕荧光探针及其在药物和d n a 分析中的应用 摘要 铕( e u ) 和铽( t b ) 为代表的稀土配合物以其窄的发射光谱、较大的s t o k e s 位移、 长荧光寿命、荧光稳定等许多优越特性，已成为目前分析化学领域中十分活跃的研究课 题。 本研究采用时问分辨荧光法，以稀土铕( ) 作为荧光探针，建立了一种简单而灵 敏的测定吡哌酸( p p a ) 含量的新方法。吡哌酸和铕( ) 配合后，作为配体的吡哌酸 吸收紫外光并将能量传递给铕，然后发射铕离子的特征荧光。详细研究了e u 3 + p p a 配 合物体系的荧光光谱特征及实验条件对体系荧光强度的影响，配合物荧光体系的最大激 发和发射波长分别为2 7 4a m 和6 1 6a m ，在p h8 2 的 i r i s h c l 缓冲溶液中，加入适量阴 离子表面活性剂十二烷基硫酸钠( s d s ) 后，体系荧光强度大大增强，吡哌酸溶液在5 o o 1 0 一- - - 5 0 0 1 0 击m o l l 浓度范围内与荧光强度呈良好的线性关系，方法的检出限为2 1 0 一m o l l ，测定精度r s d 为0 6 ( 2 0 0 1 0 6m o l l ，n = 1 1 ) 。该方法可用于吡哌酸 药片含量及尿液中痕量吡哌酸的测定，药片测定结果与药典方法基本一致，尿样中加标 回收率令人满意。 脱氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，d n a ) 的天然荧光很微弱，使得直接利用其 荧光进行研究受到很大限制。吡哌酸与铕( 1 1 ) 反应生成的配合物发射e u n 的特征荧光， 而d n a 的加入又可使其荧光强度大大增强。本研究采用时间分辨荧光法，以e u s + - p p a 作为荧光探针，使其与鲱鱼精d n a 相互作用，实验发现荧光强度随鲱鱼精d n a 的浓 度的增加而增强，可以定量检测鲱鱼精d n a 的含量。鲱鱼精d n a 的浓度在0 1 - - 一6 0 m g l 范围内与荧光强度呈良好的线性关系，方法的检出限为o 0 3m g l ，对浓度为4 0 m e l 的鲱鱼精d n a 平行测定1 1 次的相对标准偏差为0 3 ，已成功用于合成样品中鲱 鱼精d n a 的测定。 竹 关键词：铕；吡哌酸；荧光探针；时间分辨荧光法；d n a y 1 y 曩v ， 东北大学硕士学位论文a b s tr a c t e u r o p i u mf l u o r e s c e n tp r o b ea n da p p l i c a t i o n s i nt h e a n a l y s i so f m e d i c a m e n ta n dd n a a b s t r a c t t h ef l u o r e s c e n c eo fl a n t h a n i d ec h e l a t e sf e a t u r e saw i d es t o k e ss h i f t ( 1 5 0n m ) ，n a r r o w e m i s s i o nb a n d ( k x ，两者之差为斯托 克斯( s t o k e s ) 位移，这个值越大越有利于提高选择性。有时在高温的稀薄气体中， 可能发现相反现象，此时的荧光称为反斯托克斯荧光，与激发光相同波长的荧光称 为共振荧光。 1 4 4 荧光强度和荧光寿命 荧光强度是指在一定条件下仪器所测得荧光物质发射荧光强弱的一种量度，荧 光物质所发射的荧光无固定方向，实际上所测得的是某一方向的荧光，它除与物质 本身的荧光量子产率有关外，还与介质、环境、仪器性能等因素有关。物质吸收光 越多，处于激发态的分子数越多，发出的荧光强度就越大。可用下述数学公式表达 荧光强度( f ) 及其影响因素的关系： f = 2 3 巾fl o e b c( 1 1 ) 式中：f 为荧光强度；巾f 为荧光量子产率；i o 为照射到被测物质上的光强度； 为该物质的摩尔吸光系数；b 为检测池厚度；c 为物质浓度。 在荧光测定中，荧光强度应与入射光强度及被测物质的浓度成比例。由荧光强 度的计算公式可以看出，在荧光物质浓度很小的情况下，产生的荧光强度才与溶液 中该物质的浓度成正比，当浓度增大到一定程度，荧光强度增加与浓度不成线性关 系时，常常随浓度的增加而下降。 荧光寿命是指分子在返回基态之前在激发态存留的平均时间。 荧光寿命可用下式测定 l n f 0 一l n f ( = 一t ( 1 2 ) f o 和f ( ，分别代表t = 0 和t = 时的荧光强度，通过实验测量不同时间的f 。值， 确定l n f t t 的关系曲线( 应为直线) ，其斜率就是荧光寿命。 也可以用下式： = 1 0 一e m 。x ( 1 3 ) 估计荧光寿命，m 。x 为最大吸收波长下的摩尔吸光系数，如s o s 1 跃迁的e 值一 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 般为1 0 3 ，估计荧光寿命是1 0 一s 。 1 5 时间分辨荧光分析法 由于分子荧光的寿命不同，可在激发和检测之间延缓一段时间，使具有不同荧 光寿命的物质达到分别检测的目的，这就是时间分辨荧光分析技术。时间分辨荧光 技术( t i m e r e s o l v e df l u o r o m e t r y ) ，简称t r f 技术，是2 0 世纪8 0 年代中期在荧光 分析的基础上发展起来的一种新的荧光技术【7 9 1 。 时间分辨荧光分析技术具有灵敏度高、标记物制备简单、稳定性好、标准曲线 线性范围宽、操作方便等优点，已成为最有发展前途的超微量分析技术和当前标记 免疫分析发展到新阶段的代表性技术之一。通过波长和时间两种分辨，大大降低了 各种短寿命散射光和本底荧光对测定的干扰，还可以消除瑞利和拉曼散射的干扰。 该方法自问世以来，无论在理论研究方面，还是在实际应用方面都引起了广泛的关 注。目前已成为生物医学研究和临床超微量生化检验中最有应用前景的分析手段之 一。 在稀土研究方面，时间分辨荧光技术所采用的荧光示踪物为稀土离子，利用稀 土荧光化合物具有荧光寿命长、s t o k e s 位移大的特点，通过延迟测量时间，在排除 了来自于样品、试剂及其他的非特异性荧光的干扰，待本底短寿命荧光消失之后， 才对配合物的长寿命荧光进行采样与数据处理，可最大限度地消除本底荧光的干扰， 大大提高分析检测的灵敏度。 1 5 1 时间分辨荧光分析法的检测原理 根据荧光物质的不同荧光寿命，采用时间分辨测定技术仅测定长寿命荧光物质 发出的荧光，而不测定短寿命荧光物质发出的荧光，此即时间分辨荧光分析法的测 定原理，如图1 3 所示。 该方法可以有效地消除来自样品、试剂及其他非特异性短寿命荧光的干扰，极 大地提高荧光检测的灵敏度。 荧光标记离子为稀土离子，稀土离子的下述特点决定了它为时间分辨荧光分析 的顺利进行提供了可靠保证： ( 1 ) 稀土离子的荧光激发光波长范围宽，发射光谱峰范围窄，是类线性光谱， 有利于降低本底荧光强度，提高分辨率。 ( 2 ) 稀士离子的激发光和发射光之l h j 有一个较大的s t o k e s 位移，有利于排除 1 2 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 激发光及特异荧光的干扰，增强测量的特异性。 ( 3 ) 稀土离子螯合物产生的荧光强度高、寿命长，有利于消除样品及环境中荧 光物质对检测结果的影响。每一秒钟可检测样品1 0 0 0 次，结果取平均值，有利于提 高检测的准确性。 制 辖 装 粼 嚣扑饭珲l i r e s ) o 捌婚锕 1 0 0 0 对甸l 峭 图1 3 时间分辨荧光测定原理【8 0 l f i g 1 3p r i n c i p l eo ft i m e r e s o l v e df l u o r e s c e n c em e a s u r e m e n t 8 0 l 1 5 2 时间分辨荧光分析法的特点及应用 传统荧光分析方法的主要问题是测量过程中的高背景荧光干扰使检测灵敏度受 到限制，这些背景荧光主要来自塑料、玻璃，以及样品中的蛋白质，其荧光寿命大 约为1 1 0n s 。以荧光素作为标记物，由于其荧光寿命也不与背景荧光相当，不能 通过采用时间分辨技术消除干扰，因而必须借助荧光寿命比背景组分产生的荧光寿 命更长的基团作为标记物，才能发挥时间分辨技术的优势。与传统的荧光标记示踪 物不同，t r f 技术所采用的荧光示踪物为稀土离子，如e u 3 + 、t b 3 + 、g y “、s m 3 + 等。 稀土离子配合物的荧光寿命很长，一般为1 0 0 1 0 0 0 “s ，比常用的荧光标记物高3 6 个数量级，很容易用时间分辨荧光方法把它的荧光与背景荧光区分丌。时问分辨 荧光测定就是基于稀土配合物与背景荧光寿命之问的巨大差异，待背景荧光完全消 失后彳对配合物的荧光进行采样和数据处理，从而完全消除背景荧光的干扰，大大 提高分析检测的灵敏度。 由于具有以上特点，近年来，关于采用e u 3 + 、n 3 + 的时问分辨荧光分析法的报 道很纠8 。y e 等制成了硅基包被的铽、铕有机配合物的纳米颗粒1 8 2 , 8 3 】，以及二氧化 1 3 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 钛包被的铕纳米颗粒【8 4 1 ，并应用于生物标记1 8 5 , 8 6 l 。 t r f 自问世以来，首先在免疫分析领域内得到了广泛应用【8 。时间分辨荧光免 疫分析( t r f i a ) 是以稀土离子标记抗原或抗体、核酸和细胞等为特征的超灵敏检 测技术，它克服了酶标记物不稳定、化学发光仅能一次发光且易受环境干扰、电化 学发光的非直接标记等缺点，使非特异性信号降低到可以忽略的程度，达到了极高 的信噪比，从而大大地超过了放射性同位素所能达到的灵敏度，且还具有标记物制 备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围 宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点，成为继放射免疫分析之后 标记物发展的一个新里程碑。 国外已逐渐将t r f 拓展应用于核酸分析领域中，并显示出其稳定性好、灵敏度 高、无放射性污染、易自动化分析等优点，具有良好的应用前景。时间分辨荧光免 疫分析( t r f 认) 也广泛地应用于许多半抗原，包括一些药物抗原、抗体及病毒的 测定。潘利华等【韶l 应用t r f i a 以e u 3 + 标记兔抗人( r a h ) i g g 抗体：高平等应用 t r f i a 进行血清中孕酮【8 9 1 、氧氟沙星【9 0 1 的测定；p o m e l o v a 等【9 1 l 还用t r f i a 对蜱传 播的马铃薯病毒进行了研究。另外t r f i a 还被应用于时间分辨荧光核酸探针分析、 时间分辨荧光细胞活性分析等【9 2 9 6 1 。 1 6 表面活性剂的作用 表面活性剂作为一种两性分子，由极性的头基连接着疏水长链的尾部所组成， 具有明显的亲水部分和疏水部分。根据头基的性质，表面活性剂可以分为阳离子、 阴离子、非离子和两性表面活性刹y 7 1 。在低浓度的水溶液中，表面活性剂绝大部分 被分散为单体，也可能有少数的二聚体、三聚体等形式存在。当表面活性剂的浓度 达到临界胶束浓度( c m c ) 时，表面活性剂分子便会动态地缔合形成聚合体，称为 胶束。表面活性剂的胶束水溶液，光学上透明、稳定，对荧光的测定具有增溶、增 敏、增稳等独特性质，是提高荧光测定灵敏度和选择性的有效途径。 荧光物质在胶束溶液中所处的微环境与在水溶液中所处的微环境不同，胶束能 保护处于激发单重态的金属离子少受或不受溶剂分子的碰撞，减少了由此而带来的 能量损失，在胶束有序的微环境罩，减少了荧光物质的非辐射去活化过程和碎灭过 程的速率，有利于提高荧光量子产率。已有文献指出胶束溶液中会属离子荧光螯合 物荧光强度的增大也是由于表面活性剂参与组成更高层次的配合物而增大配合物分 子的有效吸光截而积，导致摩尔吸光系数的增大。其结果，荧光强度增大的倍数， 1 4 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 约为荧光量子产率增大的倍数与摩尔吸光系数增大倍数的乘积。另一方面，表面活 性剂胶束还具有增溶、增稳、改变荧光反应速率，改善反应的选择性，分散产物电 荷等作用，因此表面活性剂胶束是一种理想的反应介质。 对表面活性剂的增敏机理研究有许多报道，t a k e t a t s u 9 8 l 研究了用噻吩甲酰三氟 丙酮一氧化三正辛基膦( t r a t o p o ) 钡, q 定e u 和s m 时，非离子表面活性剂t r i t o n x 1 0 0 的作用，指出e u ( s m ) 与”r a 和t o p o 形成的混配络合物在t r i t o n x 1 0 0 的c m c 值以上，可溶于其中，此时配位体的荧光强度比其萃取到有机相中强得多，而且荧 光强度稳定。在其他非离子表面活性剂，如壬基氧化烯十二烷基醚存在下也观察到 混配络合物增强荧光的作用。h e m m l i a 9 9 】等研究了1 2 种b 二酮类试剂在t o p o ， t r i t o n x 1 0 0 存在下分别与t b 形成的混配络合物的荧光特性。 文献【1 0 0 j 认为表面活性剂的增溶效应与其分子和配体，络合物分子结构和电性有 关，且随其亲水性的减弱而增强，适量的表面活性剂可使体系荧光大为增强，并提 出了大分子共聚物分子链能量传递的机理，认为表面活性剂分子所形成的胶束可借 助静电作用、疏水作用、亲核作用和电荷转移作用，将配体和络合物分子吸附在胶 束表面或嵌入其中，由于胶束对配体分子的浓缩作用，而更有利于生成高配位数的 络合物，增加了络合物分子的有效吸收光面积，增大了值，从而增强了荧光。如 把这种带有配体络合物的胶束看成为一个大分子共聚物的整体，则可在分子链上进 行能量的迁移和传递，表面活性剂的加入可促进配体向中心离子的能量传递，提高 了稀土离子的跃迁几率和辐射弛豫几率，使络合物的荧光增强，同时使荧光寿命增 加。这说明胶束对荧光质点有保护作用，降低了体系的淬灭作用，使荧光寿命增加。 总之，表面活性剂的加入，对荧光体系具有增敏、增溶、增稳作用，并使量子 产率、荧光寿命、摩尔吸光系数和溶解度增加，改善了荧光体系的分析性能，在稀 土元素的荧光光度分析中起了重要作用【1 0 。 本研究中，在水溶液中稀土铕与配体吡哌酸形成的发光配合物，由于水分子的 热振动使发光配合物所吸收的能量以无辐射方式耗散，从而造成荧光淬灭。实验结 果表明，加入阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠( s d s ) ，可使水分子从配合物周围 排斥丌，将配合物包裹在胶束中，减少了配合物发光的能量损失，使荧光得到增强。 1 7 本项研究的工作思路和意义 随着近代科学技术的发展，分析技术和分析仪器都有很大发展，药物分析检验 技术在药物研究中占有越来越重要的地位。药物研究和生产过程中，分析检验保证 1 5 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 了药品的质量和流程的控制和改善，生物药剂学的发展离不开分析的指引，体液药 物浓度的分析使药物代谢动力学研究得以开展，高灵敏度和高选择性的分析手段给 药物体内代谢过程的研究提供了有利的工具。因此，研究建立灵敏、快速的药物分 析方法对于新药的开发、药理学的研究以及药物的临床应用具有重要的意义。此外， 通过对生物样品，如尿液、血液等的药物含量分析，为人体给药、药物的吸收和代 谢、与蛋白质的结合以及对人体的毒副作用等方面的研究提供重要依据。 由于许多有机药物分子所具有的结构特征对紫外光有特征吸收，又具有特征的 荧光光谱，故开发、研究光谱分析新技术、新方法，将给药物分析领域带来新的活 力。随着药物分析的发展，尤其是体内药物分析的开展以及药物代谢动力学、临床 药理研究的需要，对分析方法提出了更高的要求。当对微量和痕量药物进行灵敏准 确的检测时，荧光分析等发光分析法将显示出极大的优越性。 而利用形成多元络合体系，通过改变体系微环境，借助紫外吸收、荧光光度法 的新技术、新方法，建立对药物分子、生物分子准确、高灵敏、高选择性的测定新 方法，研究在复杂环境中药物分子的存在状态，与金属离子、生物小分子、大分子 作用机理，具有更重要的理论意义与实际应用价值。 由于稀土配合物荧光探针技术能充分将其激发态能级跃迁的优点和配体宽吸收 带有效传递能量的特点结合起来，发射出本身特有的窄谱线荧光。适宜的激发和发 射波长范围、较高的量子产率、大的s t o k e s 位移和长荧光寿命( 稀土荧光寿命通常 为1 0 - 1 0 0 0 岬，而生物样品本底荧光寿命只有1 - - 2 0n s ) ，使荧光法和时间分辨荧 光分析技术得以应用，且有利于消除生物样品的背景干扰，使该方法在药物分析与 生化分析方面的应用越来越引起人们的关注。 e u 3 + 、t b 3 + 离子的精细荧光激发光谱和发射光谱对离子周围环境非常敏感，激 发态寿命较长，发射峰分裂模式简单等，这些离子已成为确定配合物及生物大分子 体系结构的灵敏发光探针。本论文选题依据是基于稀土的荧光特性，采用时间分辨 荧光法以稀土铕( i i i ) 作为荧光探针检测药物( p p a ) 、生物大分子( d n a ) ，获得 药物分子、生物大分子的有关信息，研究稀土与它们的作用机理。建立了稀土铕( 1 l i ) 作为荧光探针定量检测药物、d n a 含量的新分析方法。 1 6 东北大学硕士学位论文第2 章铕( 1 i i ) 荧光探针时间分辨荧光法测定吡哌酸 第2 章铕( ) 荧光探针时间分辨荧光法测 定吡哌酸 2 1 实验原理 吡哌酸( p p a ) 是一种喹诺酮类抗菌消炎药物，因它的分子结构中含有q 一酮酸 结构，故能与稀土e u ( ) 发生配合反应，吡哌酸吸收紫外光后，可将能量传递给 稀土e u ( ) ，发生分子内能量转移，该配合物发射出e u ( ) 的特征荧光。实验 结果表明，铕与吡哌酸生成e u ：p p a 为1 ：3 的配合物，在适当p h 缓冲体系中，加入 适量的阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠( s d s ) ，其配合物的荧光强度大大增强， 最大荧光激发和发射波长分别为2 7 4n m 和6 1 6n m ，并且e u ( ) 浓度一定时，在 一定范围内，荧光强度与p p a 的浓度成正比关系。依据此原理，本研究采用时间分 辨荧光法，建立了以表面活性剂敏化的铕离子荧光探针灵敏测定吡哌酸的新分析方 法。 2 2 实验部分 2 2 1 仪器与试剂 l s 5 5 荧光光度计( 美国p e r k i ne l m e r 公司) ； u v - 2 1 0 0 双光束紫外可见分光光度计( 北京瑞利分析仪器公司) ； p h s 3 c 数字式p h 计( 上海理达仪器厂) ； 吡哌酸对照品( 中国药品生物制品检定所) ； e u 2 0 3 ：含量大于9 9 9 9 9 ( 包头京瑞新材料有限公司) ； 吡哌酸标准贮备液：准确称取0 0 3 5 8g 吡哌酸对照品，用少量o 1m o l l 盐酸 溶解后，定容至1 0 0m l 容量瓶中，配制成浓度为1 0 0 x 1 0 。3m o l l 的标准贮备液， 于4 。c 冰箱中保存，使用时根据要求稀释至所需浓度； 铕离子标准贮备液：准确称取0 3 5 2 3ge u 2 0 3 ，用少量h c i ( 1 + 1 ) 水浴加热溶 解，蒸发近干，定容至1 0 0m l 容量瓶中，配制成浓度为0 0 2 0 0 2m o l l 的标准贮备 液，于4 c 冰箱中保存，使用时根据要求稀释至所需浓度； 1 7 东北大学硕士学位论文第2 章铕( i i i ) 荧光探针时间分辨荧光法测定吡哌酸 十二烷基硫酸钠( s d s ) 水溶液：0 0 0 5m o l l ； t r i s h c i 缓冲溶液：0 1m o l l ，称取1 2 0 3 3gt r i s 溶于5 0m l 水中，用1m o l l 盐酸调节p h 至8 2 ，稀释至1 0 0m l 容量瓶中； 所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。 2 2 2 实验方法 于1 0m l 具塞刻度管中加入一定体积的5 0 0 x 1 0 5m o u l 吡哌酸标准溶液，1 0 0 m l5 0 0 x 1 0 4 m o l l 铕离子标准溶液，1 0 0m l0 0 0 5m o l ls d s 溶液，3 0 0m l0 1 m o l l p h 为8 2 的t r i s h c l 缓冲溶液，用二次水定容至刻度，摇匀，室温放置2 0m i n 使其充分反应，然后设置时间分辨荧光参数( 见表2 1 ) ，于1c m 石英皿中测定体系 的荧光强度l ，同时测定试剂空白l o ，计算其相对荧光强度ai = l l o 。荧光激发狭 缝和发射狭缝均为1 0a m ，扫描速度1 2 0 0n m m i n ，荧光激发波长为2 7 4a m ，发射 波长为6 1 6n m 。 2 3 结果与讨论 表2 1 时间分辨荧光参数设置 t a b l e2 1p a r a m e t e r so ft i m e r e s o l v e df l u o r e s c e n c e 参数设定值 延迟时间 测量时间 周期时间 闪亮次数 6 0 s 1m s 2 0m s 1 2 3 1 紫外吸收光谱 分别扫描e u 3 + 、p p a 、e u “p p a 、e u “p p a s d s 的紫外吸收光谱。如图2 1 所 示，水溶液中单独的铕离子在紫外区吸收很弱，几乎无吸收；吡哌酸( p p a ) 在紫 外区有两个吸收峰( 分别位于2 6 4a m 和3 3 0a m 处) ，且在2 6 4a m 处有较强吸收； 当铕和吡哌酸配合后紫外吸收峰略有红移( 红移至2 6 6a m ) ，证明二者发生配合反 应，增大了体系的共轭程度；当加入表面活性剂十二烷基硫酸钠( s d s ) 后，由于 表面活性剂本身的增稳增敏作用使吸收峰波长又出现红移( 红移至2 7 0n m ) ，且吸 收峰强度有所增加。 18 东北大学硕士学位论文第2 章铕( i i i ) 荧光探针时间分辨荧光法测定吡哌酸 图2 1 铕、吡哌酸及其配合物的紫外吸收光谱 f i g 2 1u va b s o r p t i o ns p e c l f ao fe u ”、p p aa n de u * + _ p p a 1 e u ”： 2 p p a ；3 e u ”p p a ；4 e u ”p p a s d s ( e u 3 + ：5 0 0 x 1 0 。5m o l l , pp ：a ：5 0 0 x 1 0 6m o l l , s d s ：5 0 x 1 0 4m o l l ) 2 3 2 时间分辨荧光激发和发射光谱 分别扫描了e u “、e u “p p a 、e u 3 + p p a s d s 的时间分辨荧光激发光谱( 图2 2 ) 和发射光谱( 图2 3 ) ，结果与紫外吸收光谱所得结论一致。如图2 2 所示的时间分 辨荧光激发光谱图中，曲线1 单独的铕离子的水溶液在紫外区吸收微弱，看不到荧 光激发峰；而当曲线2 吡哌酸和铕发生配合反应后，由于增大了体系的共轭程度， 可以看到e u 3 + p p a 配合物的荧光激发峰在2 7 4n m 处。 在如图2 3 所示的时间分辨荧光发射光谱中，曲线1 单独的水溶液中铕离子的荧 光发射强度很弱，只有当缩小波长标尺比例才能看到它的特征发射峰分别位于5 9 3 n m 和6 1 2n m ；但是当吡哌酸和铕配合后，可以看到，在5 9 3n m 和6 1 6n m 处出现 了比铕离子本身的荧光要强很多的e u 3 + 的特征荧光发射峰，分别对应e u 3 + 的 5 d o _ 7 f l 和5 d o _ 7 f 2 能级跃迁，这一现象充分说明了配合物发生了分子内能量传递， 吡哌酸作为配体吸收了紫外激发能，将能量传递给了中心离子铕，再通过铕的4 f 轨 道能级跃迁而发射出铕的特征荧光。 分别从两图中的第3 条曲线还可以得出结论，当加入表面活性剂十二烷基硫酸 钠( s d s ) 后，由于表面活性荆的增溶、增稳、增敏作用，使得荧光物质在胶束环 境中降低了非辐射去活化过程和淬灭过程的速率，有利于提高荧光量子产率，从而 使铕吡哌酸配合物的激发光谱和发射光谱的荧光强度都得到明显增强，可以改善荧 光体系的分析性能，大大提高分析测定的灵敏度，可见s d s 的加入对测定也起着至 关重要的作用。 19 东北大学硕士学位论文第2 章铕( i i i ) 荧光探针时间分辨荧光法测定吡哌酸 图2 2 铕及铕吡哌酸配合物的时间分辨荧光激发光谱( k 。= 6 1 6n m ) f i g 2 2t i m e r e s o l v e df l u o r e s c e n c ee x c i t a t i o ns p e c t r ao fe u j + a n de u 3 + p p a ( k m = 6 1 6n m ) 1 e u + ： 2 e u + _ p p a ； 3 e u o + - p p a s d s ( e u 3 + ：5 0 0 x 1 0 5m o l l , pp ：a ：5 0 0 x 1 0 6m o l l , s d s ：5 0 x 1 0 。4m o l l ) 5 5 4 05 8 05 8 0 6 0 0 翰o8 4 0 w a v e l e a g t h a m 图2 3 铕及铕一吡哌酸配合物的时间分辨荧光发射光谱队。= 2 7 4n m ) f i g 2 3t i m e - r e s o l v e df l u o r e s c e n c ee m i s s i o ns p e c t r ao fe u ”a n de u ”一p p a ( k x = 2 7 4n m ) 1 e u + ： 2 e u + p p a ； 3 e u j + p p a s d s ( e u 3 + ：5 0 0 x 1 0 m o l l ，p p a ：5 0 0 x 1 0 一m o l l ，s d s ：5 0 x 1 0 4m o l l ) 2 3 3 普通荧光与时间分辨荧光的对比 从以上讨论可以看出，e u 3 * p p a 配合物接收激发光能量和发射荧光是由不同的 部分完成的，配合物发光是经过配位体的三重激发态的能量转移所致，所产生的荧 光是延迟荧光，其荧光寿命比普通荧光化合物的荧光寿命长大约5 个数量级。因此， 利用这种长寿命荧光，可以进行时1 日j 分辨荧光测定。 本研究分别采用传统的普通荧光与时间分辨荧光两种测定方法，对同一样品中 2 0 湖 枷 铷 猫 皇一昌3暑3lo葺匠 东北大学硕士学位论文 第2 章铕( i i i ) 荧光探针时间分辨荧光法测定吡哌酸 p p a 测定的实验结果( 荧光强度、线性范围、检出限、干扰情况) 进行比较，考察 本研究采用时间分辨法进行测定的优势，实验结果见表2 2 。 表2 2 普通荧光法与时间分辨荧光法的对比 t a b l e2 2c o m p a r i s o no fc o n v e n t i o n a la n dt i m e r e s o l v e df l u o r e s c e n tm e t h o d 可见，由于稀土离子具有长寿命的荧光特性，采用时间分辨荧光法可以有效地 降低来自样品和本底荧光的干扰，显著地提高检测灵敏度、降低检出限、拓宽标准 曲线的线性范围，从而改善了分析性能。另外，对于尿液中吡哌酸含量的测定，用 普通荧光法，由于基线很高，掩盖了铕的特征荧光峰，无法进行测定，但采用时间 分辨荧光法测定，通过时间延迟，待短寿命的背景荧光消失后，才对配合物的荧光 进行测定，大大降低了基体干扰，可成功用于样品测定。故本研究以下均采用时间 分辨荧光法进行测定。 2 3 4 铕- p i t 哌酸配位比的测定 分光光度法是研究配合物组成十分有效的方法，其中包括摩尔比法( 饱和法) 、 等摩尔连续变化法、平衡移动法以及斜率比法。为了分析e u 3 + 与吡哌酸( p p a ) 的 配位情况，本项研究利用前两种常用方法分别对铕吡哌酸配合物的配位比进行了测 定，具体方法如下。 ( 1 ) 摩尔比法 摩尔比法的操作方法如下：配置一系列溶液，固定金属离子的浓度不变，改变 配体的浓度，将所得吸光度a5 f j - r m 作图，其中【m 】为金属离子的浓度，【r 】为配 体的浓度。 本实验配制一系列铕离子溶液浓度均为5 0 0 x 1 0 一m o l l ，吡哌酸浓度分别为 5 0 0 x 1 0 m o l l 、1 0 0 x 1 0 一m o l l 、1 5 0 x 1 0 m o l l 、2 0 0 x 1 0 一m o l l 、3 0 0 x 1 0 4m o l l 的溶液，使 p p a e u 分别等于1 、2 、3 、4 、5 、6 ，分别测定这一系列溶液的吸光 度a ( 测定波长入m 。= 2 8 1n m ) ，并绘制a 一 p p a e u 】曲线，如图2 4 所示。 2 1 东北大学硕士学位论文 第2 章铕( i i i ) 荧光探针时间分辨荧光法测定吡哌酸 o23456 n p a l 刚 图2 4 摩尔比法测定e u ”p p a 的配位比 f i g 2 4d e t e r m i n a t i o no fl i g a n c yo fe u 3 + _ p p ab ym o l er a t i om e t h o d 当吡哌酸的量较小时，铕离子没有完全配合。随着吡哌酸量的逐渐增加，生成 的配合物便不断增多。当铕离子被配位后，如果吡哌酸的量再增多，吸光度也不会 增大。图中曲线转折点不敏锐，是由于配合物离解所造成的。运用外推法得一交点， 从交点向横坐标作垂线，对应的【p p a 】【e u 】比值就是配合物的配位比。 经过实验考察，由外推法作图，可以得出【p p a 】【e u 】= 3 。 ( 2 ) 等摩尔连续变化法 等摩尔连续变化法的操作方法如下：配制一系列溶液，保持【m 】+ 【r 】= 常数， 其中【m 】为金属离子的浓度，【r 】为配体的浓度。在配合物最大吸收波长下，测定各 溶液的吸光度a ，当a 值达到最大时，即浓度最大，该溶液中【r i m i 的比值即为配 合物的组成比。以吸光度a 为纵坐标，【m 】( 【r 】+ 【m 】) 的比值为横坐标作图，绘出 连续变化法曲线。 本实验保持【e u 】+ 【p p a = 1 0 0 x 1 0 4m o l l ( 常数) ，配制的6 组溶液浓度分别为： 【e u 】= 0m o l l 、【p p a 】= 1 o o x l o qm o l l ； 【e u - - 2 0 0 x 1 0 一m o l l 、【p p a 】- 8 o o x l o 巧m o l l ； 【e u = 4 0 0 x 1 0 一m o l l 、【p p a = 6 0 0 x 1 0 巧m o l l ； 【e u = 6 o o x l o m o l l 、 p p a - 4 0 0 x 1 0 。5m o l l ； 【e u - - 8 0 0 x l0 5m o l l 、【p p a 】_ 2 0 0 xl0 巧m o l l ； 【e u 】= 1 0 0 x 1 0 。4m o l l 、【p p a = 0m o l l 。 然后测定各组溶液的吸光度a ，在入m 。x = 2 8 1l l m 下测定，并绘制a 一 e u ( p p a 】 + 【e u ) 曲线，如图2 5 所示。 一，) 4 2 o 8 6 4 2 o 他 ” ：宝 吆 8写qjosqv 东北大学硕士学位论文第2 章铕( 1 i i ) 荧光探针时间分辨荧光法测定吡哌酸 0 0u zu 4 u口0hu i b l 】( p p a + 【哪 图2 5 等摩尔连续变化法测定e u s + p p a 的配位比 f i g 2 5d e t e r m i n a t i o no fl i g a n c yo fe u 3 + _ p p ab ye q u i m o l a r s e r i e sm e t h o d 经作图可知，吸光度最大值所对应的横坐标i - e u ( p p a + e u ) l 拘值为0 2 5 ， 即【e u p p a - - 0 2 5 0 7 5 ，表明配合物组成比为【e u 】【p p a 】= 1 ：3 。 根据以上两种方法进行实验，所得结论一致，故最终可确定铕吡哌酸的配位比 为1 ：3 。 2 3 5 反应条件的选择 2 3 5 1 缓冲溶液种类及溶液酸度对体系的影响 不同的缓冲溶液对体系的荧光强度影响很大，本研究考察了k h 2 p 0 4 n a o h 、 t r i s h c i 、三乙醇胺h c i 、n h a a c n a o h 及硼砂硼酸五种缓冲溶液对体系荧光强度 的影响，结果表明，k h 2 p 0 4 n a o h 使荧光完全淬灭( h 2 p 0 4 、h p 0 4 二、p 0 4 3 - 对体系 干扰大) ，其它四种缓冲体系对荧光都有不同程度的增敏，其中t r i s h c l 缓冲溶液 的荧光增敏效应最大。 一 体系的酸度对铕与吡哌酸配合物的形成也有很大的影响，在较低或较高的p h 介质里，荧光都比较弱，其原因可能是因为在强酸性条件下，吡哌酸的c o o h 难以 解离，不易与铕形成配合物，而在强碱性条件下，铕离子则易水解生成氢氧化物沉 淀。 考虑到t r i s h c i 缓冲溶液的荧光增敏效应较大，且缓冲范围( p h7 2 9 0 ) 比 较合适，本研究考察了t r i s h c l 缓冲溶液的p h 值在7 2 - - 一8 6 范围内变化时对体系 荧光强度的影响，如图2 6 所示。实验结果表明，当p h 为8 2 时，体系荧光强度达 到最大，故实验选择此p h 值。 2 3 帖 啦 u兰日d-0so 东北大学硕士学位论文第2 章铕( i i i ) 荧光探针时间分辨荧光法测定吡哌酸 2 1 0 0 司1 1 7 0 1 1 5 0 图2 6p h 对荧光强度的影响 f i g 2 6e f f e c to fp ho nt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y ( e u ”：5 0 0 x 1 0 。m o l 厂l p p a ：2 0 0 x 1 0 。t o o l l , s d s ：5 o 1 0 4t o o l l ) 实验又进一步考察了t r i s h c l 缓冲溶液的浓度对体系荧光强度的影响，实验中 加入不同体积的浓度为0 1m o l l 的t r i s h c l 缓冲溶液，考察荧光强度对缓冲溶液 浓度的变化情况，如图2 7 所示，结果表明t r i s h c l 缓冲溶液的浓度为o 0 3m o l l 时，其荧光强度最大，故实验选择加入浓度为0 1m o l l 的t r i s h c i 缓冲溶液3 0 0m l ， 最终定容至1 0m l 比色管，以达到浓度要求。 o 0 1o 0 2n 0 3n 0 4q 0 5 - i d 恤扎 图2 7 i r i s h c i 缓冲溶液浓度的影响 f i g 2 7e f f e c to ft h ec o n c e n t r a t i o no ft r i s h c lb u f f e rs o l u t i o n ( e u ”：5 0 0 x 1 0 m o l l ，p p a ：2 0 0 x 1 0 m o l l 。s d s ：5 0 1 0 “m o l l ) 2 3 5 2 铕离子浓度的影响 荧光强度受铕离子浓度的影响较大，这是因为当铕离子浓度过小时，无法和吡 哌酸发生配位反应，无荧光信号产生，而铕离子浓度过大，会对荧光产生淬灭作用。 2 4 东北大学硕士学位论文第2 章铕( 1 i i ) 荧光探针时间分辨荧光法测定吡哌酸 为考察铕离子浓度变化对配合物荧光强度的影响，实验通过固定吡哌酸的浓度 2 0 0 x 1 0 一m o l l ，逐渐改变铕离子的浓度进行优化，发现当铕离子的浓度为5 0 0 x 1 0 5 m o l l 时，配合物荧光强度最大，如图2 8 所示，故实验选择铕离子的浓度为5 0 0 x 1 0 巧 m o l l 。 051 01 52 53 0 叩矿脚札 图2 8 铕离子浓度的影响 f i g 2 8e f f e c to ft h ec o n c e n t r a t o i no fe u 3 + 2 3 5 3 表面活性剂种类及浓度对体系的影响 实验考察了于e u 3 + p p a 体系中，不加表面活性剂与分别加入不同种类的浓度为 5 0 x 1 0 4m o l l 的表面活性剂( p v p 、环糊精、十六烷基三甲基溴化铵c r a b 、十二 烷基硫酸钠s d s 共4 种) 对体系荧光强度的影响，如图2 9 所示。结果表明，其中 加入阴离子表面活性剂s d s 对体系有较大的增敏作用，体系的荧光强度大幅度增 强，是其它类型的2 倍以上。这是因为十二烷基硫酸钠s d s 是以上几种表面活性剂 中唯一的阴离子表面活性剂，带负电荷，易与带正电荷的e u 3 + 作用，由表面活性剂 形成的胶束对配合物荧光起到保护作用，使处于激发态的e u 3 + 少受或不受溶剂分子 的碰撞，减少了由此带来的能量损失，降低了体系的淬灭作用，使配合物的荧光增 强，表面活性剂胶束是一种理想的反应介质。故本实验选择加入的表面活性剂为十 二烷基硫酸钠s d s 。 加入十二烷基硫酸钠的浓度不同，对体系荧光强度的影响也不同。当加入s d s 的浓度为分别0m o l l 、1 o x l o m o l l 、5 0 x 1 0 一m o l l 、7 5 x 1 0 一m o l l 、1 0 x 1 0 。3 m o l l 、1 5 x 1 0 一m o l l 、2 0 x 1 0 弓m o l l 时对荧光强度的影响如图2 1 0 所示。通过对 s d s 的浓度优化的实验结果，最终选择加入s d s 的浓度为5 0 x 1 0 一m o l l ，即向1 0m l 比色管中加入浓度为0 0 0 5m o l l 的s d s 溶液1 0 0m l 。 2 5 东北大学硕士学位论文 第2 章铕( i i i ) 荧光探针时间分辨荧光法测定吡哌酸 表面活性剂种类 图2 9 表面活性剂种类的影响 f i g 2 9e f f e c to fd i f f e r e n tk i n d so fs u r f a c t a n t s ( e u + ：5 0 0 x 1 0 一m o l l , p p a ：2 o o x l o 。m o l l ) z 曲 2 1 司1 4 0 1 6 0 051 0 1 5 约 c i 一矿m 地 图2 1 0s d s 溶液浓度的影响 f i g 2 1 0e f f e c to ft h ec o n c e n t r a t