（药物分析学专业论文）磁性微球的制备及其在基因组脱氧核糖核酸提取上的应用.pdf

中文摘要随着生命科学和生物工程的快速发展，磁分离技术以其简便而快速的分离应用，适于多样化的样品基质，易自动化和微型化的特性正成为生命科学领域不可缺少的手段。本文以本实验室采用模板法和化学共沉淀法制备的三种不同基质类型的磁性微球和硅胶为吸附剂，聚乙二醇( p e g ) 和氯化钠( n a c l ) 组成的吸附液，研究了小牛胸腺脱氧核糖核酸( d n a ) 在基于硅醇基的固相载体上的吸附行为。实验结果表明，吸附液组成为2 0 ( w v ) p e g 和2 0m o l ln a c l 和洗脱时间为1 0m i n 的条件下，d n a 的回收率可达8 0 。磁性微球的提取效率与硅胶相仿，但是由于省去了离心分离步骤，缩短了核酸模板制备时间，有利于实现自动化操作。为了研究d n a 在磁性微球上的吸附机理，我们进一步研究了从p e g 和n a c i 组成的吸附液中，d n a 被吸附至固相载体上的吸附等温线，研究中发现，d n a 的吸附可用弗仑德里希吸附模型加以描述，相关系数均可达0 9 9 4 以上。采用研磨法粉碎哺乳动物组织小牛胸腺和植物组织玉米仁，经细胞裂解液破细胞后，以硅醇基表面的磁性微球为固相载体，进行基因组d n a 磁分离提取，得到了片段约2 0k b ，a 2 6 0 a o 大于1 7 7 的高纯度d n a 。将磁性微球用于野生酿酒酵母菌基因组d n a 的提取。采用两种不同的方法部分和完全裂解酿酒酵母细胞壁，获得了片段分别为5k b 和2 0k b 左右，且a 2 6 0 a 2 8 0 在1 7 7 1 8 9 之间的d n a 片段。对所制各的磁性微球用硅烷化试剂表面改性后将不同表面官能团的磁性微球用于小牛胸腺、玉米仁和野生酿酒酵母基因组d n a 的提取。与硅醇基表面的磁性微球一样，获得了较好的结果。关键词：磁分离，磁性微球，聚乙二醇，小牛胸腺，脱氧核糖核酸，弗仑德里希吸附模型，酿酒酵母，玉米仁，a b s t r a c tw i t ht h er a p i dp r o g r e s so fl i f es c i e n c e sa n db i o t e c h n o l o g y , m a g n e t i cs e p a r a t i o nt e c h n i q u eh a sb e c o m ea ni n d i s p e n s a b l et o o lb e c a u s eo fi t se a s eo fu s e ，r a p i ds e p a r a t i o n , b e i n gc o m p a t i b l ew i t hv a r i e t yo fs a m p l em a t r i c e sa n da m e n a b l et oa u r o r a a t i o na n dm i n i m i z a t i o n i nt h i st h e s i s , w er e p o r tp r e p a r a t i o no ft h r e et y p e so fm a g n e t i cm i c r o s p h e r e sb yp o l y m e rt e m p l a t e dm e t h o da n dc h e m i c a lc o - p r e c i p i t a t i o na n dt h e i ra p p l i c a t i o na sa d s o r b e n t sf o ri s o l a t i o no fg e n o m i cd n af r o mt h r e ed i f f e r e n tb i o l o g i c a ls a m p l e s p o l y e t h y l e n eg l y c o l ( p e g ) a n ds o d i u mc h l o r i d ew e r eu s e da sl o a d i n gb u f f e r s e f f e c t so fe x p e r i m e n t a lp a r a m e t e r si n c l u d i n gc o m p o s i t i o no fc a p t u r i n gb u f f e ra n de h t i o nt i m eo nt h ey i e l d so fd n ai s o l a t e du s i n gt h em a g n e t i cm i c r o s p h e r e sw e r ee x a m i n e da n dc o m p a r e dw i t ht h o s eo b t a i n e dw i t hs p h e r i c a la n di r r e g u l a rs i l i c ap a r t i c l e s r e s u l t ss h o wt h a tr e c o v e r yy i e l d so fd n au pt o8 0 c a nb eo b t a i n e do ns o l i d p h a s ea d s o r b e n t sw i t hac a p t u r i n gb u f f e rc o m p o s e do f2 0 p e ga n d2m o l ln a c la n de l u t i o nt i m eo f1 0r a i n t h em a g n e t i cm i c r o s p h e r e sa r ec o m p a r a b l ew i t ht h es i l i c ap a r t i c l e si nt e r m so fy i e l da n dp u r i t yo fd n ai s o l a t e d h o w e v e r , s i n c es e r l e m e n to fp a r t i c l e sb yc a n t r i f u g a t i o ni so m i t t e d ，t h ep r o t o c o lo fd n ai s o l a t i o nb a s e do nm a g n e t i cm i e r o s p h e r e sa l l o w st h er e d u c t i o no ft h es a m p l ep r e p a r a t i o nt i m ea n da u t o m a t i o no ft r a d i t i o n a l l yt e d i o u so p e r a t i n gp r o c e d u r e s t ou n d e r s t a n dt h em e c h a n i s mo fd n a a d s o r p t i o n0 1 1t h em a g n e t i cm i c r o s p h e r e s ，w ef u r t h e rs t u d yt h ea d s o r p t i o ni s o t h e r m so fd n af r o mp e ga n dn a c lb u f f e t s i tw a sf o u n dt h a tt h ea d s o r p t i o no fd n ao nt h es o l i d - p h a s ea d s o r b e n t sc a nb ed e s c r i b e dw i t hf r e u n d l i c ha d s o r p t i o nm o d e lw i t hr e l a t e dc o e f f i c i e n ta b o v eo 9 9 4 ，c r u s h e du pt h ec a l ft h y m u sa n dm a i z ek e r n e l sb yw h e t t i n g ，i s o l a t e dt h eg e n o m i cd n ao fc a l ft h y m u sa n dm a i z ek e r n e l sw i t hm a g n e t i cm i c r o s p h e r e sa f t e rt h ec e l l sw e r el y s e db yl y s i sb u f f e r w er e c e i v e dp u r ed n af r a g m e n t so fa b o u t2 0k bw i t ht h ea z 6 0 a 2 8 0v a l u e sa b o v e1 7 7 t h em a g n e t i cm i c r o s p h e r e sw e r ea p p l i e dt oi s o l a t i o no fg e n o m i cd n af r o mw i l d t y p es a c c h a r o m y c e se e r e v i s i a e t w od i f f e r e n tc e l ll y s i sm e t h o d sw e r eu s e dt ob r e a ku pt h ec e l lw a l l sp a r t l ya n de n t i r e l y , t h eg e n o m i cd n af r a g m e n t so b t a i n e dw c r ea b o u t5k ba n d2 0k bw i t ht h ea 2 6 0 a 2 8 0v a l u e si nt h er a n g e1 7 7t o1 8 9 d i f f e r e n tm a g n e t i cm i c r o s p h e r e s ，w h i c hs u r f a c em o d i f i e db ys i l a n er e a g e n t s ，w c l ca p p l i e df o re x t r a c t i o no fg e n o m i cd n af l o mc a l ft h y m u sa n dm a i z ek e r n e l sw i l d t y p es a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e w eg a i n e db e t c e rr e s u l t st h a ts a m ea st h em a g n e t i cm i c r o s p h e r e sb a s e do i ls i l i c i ch y d r o x y l k e yw o r d s ：m a g n e t i cs e p a r a t i o n , m a g n e t i cm i c r o s p h e r e s ，p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，c a l ft h y m u s ，d e o x y r i b o n u d e i ca c i d ( d n a ) ，f r e u n d l i c ha d s o r p t i o nm o d e l ，m a i z ek e r n e l s 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨鲞盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材科。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：张主明签字日期：挪年月7 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解墨叠盘茎有关保留、使用学位论文的规定。特授权鑫壅盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明)一躲弛朋：万獐宠签字日期：劲“年月9 日签字日期渺月7 。日刖吾核酸分离纯化是许多分子生物学和现代医学研究中的重要步骤，在进行核酸测序、扩增、杂交、酶切等操作之前通常都需要对复杂混合物中的核酸进行纯化，以制备合适的核酸模板。这主要是由于样品基质中存在大量的细胞裂解产物如蛋白质、多糖和其他杂质，它们可能抑制核酸操作中使用的聚合酶和限制性内切酶的活性或者由于导致目标核酸的降解而引起假阴性结果。因此，必须采取适当措施将这些杂质除去。从生物样品中提取脱氧核糖核酸( d n a ) 的常规方法涉及细胞裂解、有机溶剂抽提、乙醇沉淀和离心分离等步骤。这个过程费时费力，不易实现自动化。自从1 9 7 9 年v o g e l s t e i a 和g i l l e s p i e 1 】报道在高浓度碘化钠存在下玻璃粉末作为吸附剂用于从琼脂糖凝胶中提取d n a 片段以来，基于硅胶和其他具有亲水性表面的载体的固相核酸纯化技术被广泛采用。基于磁性微粒的核酸纯化方法就是其中的一种。利用磁分离技术进行核酸纯化通常要经历吸附、洗涤和脱附等三个步骤。核酸在高浓度变性剂或聚乙二醇( p e g ) 溶液中被吸附到磁性微粒的表面。然后利用外磁场将负载核酸的磁性微粒从样品溶液中分离出来，经适当清洗后，在水中脱附即得到纯化核酸。磁性核酸提取技术避免了常规技术中的乙醇沉淀、苯酚氯仿萃取、离心和柱层析处理，从而避免连续重复的手工抽提，不仅减少了样品损失与污染，还极大地提高了样品处理的通量。基于磁珠的自动化核酸分离纯化系统以其操作简便快捷和省时省力的特点，成为目前分子生物学和临床医学研究的理想的辅助工具。磁性微粒是磁性固相核酸提取技术中的关键成分。由于核酸吸附剂含有高浓度盐或表面活性剂，加入核酸样品后使得溶液的粘度增大。利用外磁场从样品溶液中分离磁性微粒，就要求磁性微粒具有较高的磁化强度。在本文中我们报道利用自主开发的专利技术制备了磁响应性高、粒径分布均匀的磁性硅胶微球，用于生物样品中核酸的分离纯化。以非磁性球形硅胶和无定型硅胶为对照，考察了吸附剂组成和洗脱时间等实验参数对小牛胸腺基因组d n a 在磁性硅胶固相载体上的提取回收率的影响。并将其应用于哺乳动物组织小牛胸腺，植物组织玉米仁，真菌( 酿酒酵母) 和人类全血基因组d n a 的分离纯化。第一章导论与综述第一章导论与综述生物磁分离技术是在传统磁分离技术的基础上发展起来，以细胞、细菌、核酸和蛋白质等生物体为应用对象的高效分离技术。它利用磁性或磁性标记生物体在外磁场作用下做定性运动这一特性，对目标生物体进行提取、富集、分离和纯化。早期的工作主要集中于发展磁性标记物的制备技术上，包括通过在磁流体中浸渍将磁性纳米粒子吸附到琼脂糖、聚丙烯酰胺、聚戊二醛和聚乙烯醛等聚合物微球中。这种微球以颗粒大小分布均匀和磁性粒子含量均匀为特征，保证了不同生物分离过程的可重现性和可控性。因此，在细胞生物学、免疫学、分子生物学和临床医学等生命科学领域中获得了广泛的应用，成为生物磁分离技术发展史上的一个重要里程碑。生物磁分离技术与标准分离步骤相比有一定优势。首先磁分离过程通常是非常简单的，只涉及几个处理步骤，所有的纯化步骤都可在单个试管或者容器中发生，不需要昂贵的液相色谱系统、离心机、过滤器或者其它设备。分离过程可以在含有悬浮固体物质的粗制样品上直接进行。在某些情况下( 例如细胞内蛋白质的提取) 甚至可以整合裂解和分离步骤，从而缩短整个分离时间。磁分离技术对细胞、蛋白质和核酸等生物体通常是非常温和的。与高速离心和亲和色谱相比，磁分离技术具有较低的剪切力。能较好地保持被分离细胞的活力和生物分子的生物活性。此外，磁分离技术也是各种自动化和微型化分离纯化步骤的基础，基于磁性微粒的免疫检测系统已经在临床检验中获得广泛的应用。最近用于分离蛋白质或者核酸的自动化磁性纯化系统已有商品可供。目前，生物磁分离技术正在成为生命科学研究的一个重要手段。在细胞生物学领域中，根据细胞表面表达的不同蛋白质，表面结合特异性抗体的磁珠被用来分离富集特殊类型的细胞。在蛋白质科学领域内，根据蛋白质表面特性或组成氨基酸的差异，利用金属螯合磁性微球可对蛋白质进行分离、富集和纯化。在分子生物学研究中，经常涉及核酸的分离和纯化，基于磁珠的核酸纯化方法具有高效快速和易于自动化的特点，正在逐步替代传统的溶剂萃取法，广泛地应用于核酸的提取、纯化、序列测定和扩增等过程中。第一章导论与综述1 1 磁性粒子的制备与修饰1 1 1 磁性高分子微球制备方法机械分散或喷珠法这是一种早期制备磁性微球的方法，是将磁性材料粒子分散在天然高聚物如微晶纤维素、淀粉、白蛋白中，通过混合、研磨或喷珠分散而成。这类方法简单，但所得粒子粒径分布宽，形状不规则，粒径不易控制，壳层中难免混杂一些诸如乳化剂之类的杂质，用于免疫测定，细胞分离等领域受到很大限制。这种磁性微球虽然可用，但性能较差且不稳定，己逐渐被淘汰。单体聚合法这种方法是将磁性粒子加入高分子单体聚合反应，引发共聚或缩聚反应，从而在磁流体表面形成一层有机聚合物。单体聚合法制备磁性微球的方法主要有：悬浮聚合法、分散聚合法、乳液聚合法、种子聚合法等。单体聚合法成功的关键在于确保单体的聚合反应在磁粒表面顺利进行，然而很多有机单体疏水性很强，难于与磁流体亲水表面紧密结合，这样直接聚合制备的磁性微球均一性与稳定性很差，有效的解决方法是将磁流体表面用两性物质处理，使其表面富于一定的疏水性，易于与有机单体亲近。用这种方法成功地制备了很多磁性微球。单体聚合法是目前研究比较多的方法，但该方法存在的比较突出的缺点是，在磁性粒子存在下聚合反应比较难以控制，并难以得到磁含量比较高的磁性微球。渗磁法该法是先合成十分均一的多孔有机聚合物微球，这些微球通常含有a 、c h o 、- n 0 2 、o h 等官能团，能够吸附和固定金属离子，将大孔的高分子微球浸于f e a 2 和f c a 3 的混合溶液中并抽成真空，f c 2 + 和f c 3 + 进入微球孔内并被上述基团络合，再加入碱溶液使p h 升高，f c 2 + 和f e 3 + 在微球孔内部形成f e 3 0 4 1 妇于微球的均一性和溶液的均一性，这样的磁球无论粒度还是磁性均具有高度的均一性。该方法较为成功并己商品化的是挪威d y n a l 公司已畅销世界的m 4 5 0 、m 2 8 0 产品。大分子稳定铁氧化物溶胶法在铁溶液中加入亲水性高分子物质，然后升高溶液的p h 值。因大分子对新生成的铁氧化物溶胶具有稳定作用，从而形成了生物相容性好并且只有几十纳米大小的磁性微球。在右旋糖酐中添加f e c l 2和f e c l 3 混合物，通过调节口h 值，制备了粒径为3 0 - 4 0 r i m 的磁性微球，这种磁微球用n a i o 一活化后可与蛋白质形成共价结合。天然磁颗粒有些细菌( 如m a g n e t o s p i r l l u ms p ) 体内含有磁性颗粒，称为b m p ( b a c t e r i am a g n e t i cp a r t i c l e s ) 。直径5 0 - - - l o o n m ，化学本质为磷脂包被的磁铁颗粒。b m p 已成功地用作“射击法”基因导入的载体。这一现象已启发人们成第一章导论与综述功地寻找出了纯种系的菌株，然后再通过细胞培养和分离，从而大批量地生产粒径均匀的细菌磁微球：磁性转化法磁性转化法应该引起足够的重视，目前制备磁性微球的思路大多是先得到磁性粒子，然后再将其制各成球，但该方法难以保证磁含量和磁性均一性。在磁性转化的方法中，不但可以通过氧化的方法得到磁性微球，同时也可以反过来通过还原的方法得到磁性微球。本文就通过先制备单分散的f c 2 0 3 - - s i 0 2 微球，然后将其转化成磁性的四氧化三铁二氧化硅微球，最后在表面进行改性和修饰增强其稳定性和具备不同的官能团。该微球不但磁性很强，而且粒径和磁性都比较均匀。1 1 2 磁性离子的表面修饰磁流体是一种悬浮在载液中的胶体状磁性粒子。水溶性磁流体除了被用于基础研究外，还用于临床诊断、治疗，以及生物技术。在生物磁性分离中，磁珠表面活性基团是一个非常重要的因素。理想的磁珠表面配基是单克隆抗体( m o n o c l o n a la n t i b o d y ) ，链霉亲和素( s t r e p t a v i d i n ) 和寡聚核苷酸( o l i g o n u c l e o t i d e s ) 等。对磁珠上配基的要求：无降解和官能团的流失；在苛刻条件如( 温度，p h 值) 下，尽量无流失；在复杂基质中，几乎无非特异性结合。所有以上特性都是通过磁珠表面电荷及其亲水性而控制的。可用硅烷化试剂在粒子表面引入氨基( 枷2 ) ，羟基( - o h ) ，巯基( - s h ) ，羧基( - c o o n ) ，磺酸基( s 0 3 ) 等，在此基础上，还可引入多糖类化合物、链霉亲和素、生物素、抗生物素等。磁性粒子还可经修饰后用于体内。磁性粒子的每一种应用都有其自身的核一壳式结构。因此被用于药物和生物医学的磁性粒子均需要对其表面进行改性，以保证其在生物体内的稳定性，生物相容性，可降解性，并且无毒。这种磁性粒子可作为抗癌药物的输送载体一磁性药物靶向1 2 】；磁性粒子极高热f m a g n e t i cf l u i dh y p e r t h e r m i a ) 3 1 ；外科手术【4 j ：磁共振成像( m a g n e t i cr e s o n a n c ei m a g i n g ( m r i ) ) 【5 】：将药物或对照试剂输送到病理部位发挥作用，在其他部位浓度尽可能低是药剂学研究的最终目的，药物载体进入人体以后，可被生物分子乳蛋白质吸附，进而被吞噬，因此，药物载体或试剂，既要抵抗网状内皮细胞体内防御系统的吞噬，还要透过生理学屏障，载体的粒径和表面特性决定了药物在体内的存活时间 6 】。为了降低磁性粒子的半衰期，延长在血流中的存在时间，多采用生物活性物质对其进行修饰，如嵌段共聚物聚乙二酵( p e g ) 、聚环氧乙烷( p e o ) ，叶酸等【7 - 8 】。还有许多其他高分子如淀粉、聚异丙基甲基丙烯酰氨、4第一章导论与综述聚乙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸，以及生物分子如右旋糖苷、白蛋白、转铁蛋白等都可以根据需要自行选择【9 硼。1 2 磁性粒子在生物磁分离技术上的应用1 2 1 磁性粒子在细胞标记和细胞分离上的应用利用磁流体或超顺磁性物质标记细胞已是体内细胞分离中日趋普遍的方法。多数当前用的标记技术主要包括以下两种方法：将磁性粒子连接到细胞表面【1 2 j ：通过液相内吞、受体调解内吞或噬菌作用使生物相容性磁性粒子内在化f 协1 4 1 。有效而特异性的磁性粒子细胞标记策略就是用能经过受体中介吞噬而被靶细胞吸收的配基，如单克隆抗体，对磁性纳米粒子进行改性。靶向配基如：转铁蛋白、乳转铁蛋白、白蛋白、胰岛素、生长因子等已被用于修饰细胞表面1 1 5 】，且这些配基稳定性好，并无免疫原性。而目前发展迅速的细胞磁分离技术，设备简单，费用低廉，仪器操作简便，不影响细胞活性，且可实现连续分离，可克服荧光激活细胞分离法( f l u o r e s c e n c e a c t i v a t e dc e l ls o r t i n g ，f a c s ) 和免疫亲和柱分离法中，仪器昂贵，设备复杂，处理量小，且收集的细胞活性低的缺点。免疫磁性细胞分离法( i m m u n o m a g n e t i cc e l ls e p a r a t i o nm e t h o d s ) 在细胞生物学中越来越成为专家学者关注的焦点。免疫磁性细胞分离依靠两种机制实现靶细胞分离。直接方法就是通过将亲和配基( 即抗体) 连接到磁性粒子上，形成表面结合单克隆抗体的免疫磁性微球( i m m u n o m a g n e t i em i c r o s p h e r e s ，i m m s ) ，此抗体能特异性地与靶细胞结合并使之具有磁响应性，当此结合物受到外磁场作用时，可以使靶细胞与其它杂质分离，整个结合过程见图1 - 1 。间接法就是先将自由亲和配基( 抗体) 加到细胞悬液中，孵化后没有结合配基的细胞被洗掉，而抗体一靶细胞复合物则通过标记有另一配基( 即二抗) 的免疫磁性微球捕获【1 7 1 ，图1 - 2 为免疫磁标记细胞示意图。第一章导论与综述s t r e p t a m e rm a g n e t i cb e a d sl a b e l i n gl o a d i n g w a s h i n ge l u t i o n二可蔓_ 刚_审49 c禽一0 掣q0图1 - 1 免疫磁性细胞分离示意图f i g1 - 1d i a g r a mo fi m m u n o m a g n c t i cc e l ls e p a r a t i o n 来自h t t p ：w w w i b a - g o c o m f b au s s t r e p t a m e r s t rpb c a d s h t m l图1 - 2 免疫磁性标记细胞示意图f i g 1 - 2d i a g r a mo fa l li m m u n o m a g n e t i c a l l yl a b e l e dc e l l 来自h t t p w w w , s t e m c e l l c o m t e c h n i c a l 1 8 0 0 1 - p i s p d f 1 2 2 蛋白质和多肽的磁性分离与纯化传统方法难以对蛋白质进行分离且保持其活性，但采用连在磁珠上的单克隆抗体进行免疫沉淀富集，s d s 一只a g b 电泳法检测则可达想要结果。用磁珠分离细胞溶菌液中的蛋白质，几乎不需要预先处理，与其他方法相比，非特异性结合也较少。要从全血，培养上清液，血清，腹水中分离蛋白质，用于制备、分析，运用磁珠作为固相载体进行免疫测定的优点在于快速的结合动力学和简单的分6肇，鹕一味章晴簦第一章导论与综述离，洗涤过程。在蛋白质纯化中，为了得到高结合容量需使用大孔如粒径为3 5 u r n ，并用链霉亲和素修饰的磁珠，生物素修饰的免疫球蛋白( i g m ) 可顺利结合到磁珠上。键合配基的活性不会因孔结构而改变。金属鳌合磁珠亲和纯化是一种纯化重组蛋白的方法。在磁珠表面共价键合n i t r j j o t r i a c e t i ca c i d ( n t a ) ，加入n i “形成整合亲和磁珠纯化组氨酸标记的多肽，就见图1 3 。利用低浓度咪唑可将鳌合的肽洗脱。这种磁性鳌合载体为含量稀少，疏水，不稳定的重组蛋白和多肽纯化提供了新的思路【1 s l 。图1 3 金属镍螯合琼脂糖磁珠捕获组氨酸标记蛋白质用于蛋白质、核酸、免疫分离分析。蛋白质蛋白质相互作用( i ) ，d n a - 蛋白质相互作用( i i ) ，用于抗原抗体特异性捕获( i i i ) 。来自德国q i a g e a , g m b h f i g1 - 3m a g n e t o e a p t u r ep r o t d ni n t e r a c t i o na s s a y s n i - n t am a g n e t i ca g a r o s eb e a d sp r e c h a r g e dw i t hn i c k e lc a p t u r e s6 x h i st a g g e dp r o t e i n s ，w h i c hc a nb eu s e df o rs t u d y i n gp r o t e i n - p r o t e i n ( i ) a n dd n a - p r o t e i ni n t e r a c t i o n s ( i i ) ，a n di n m m n o a s s a yp r o c e d u r e su s i n ga n t i b o d i e ss p e c i f i cf o ra n t i g e n s ( i i i ) 来自m a t e r i a l sp r o v i d e db yq i a g e n ，g m b h ，g e r m a n y 1 2 3 磁性微球在核酸纯化上的应用核酸是现代生物学、医学研究中的重要课题。核酸作为遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础，除了在生物体正常的生长、发育、和繁殖等生命活动中具有十分重要的作用外，它与生命的异常情况，如肿瘤发生、放射损伤、遗传疾病等也有密切关系。因此核酸是现代生物学、医学研究中的重要课题。无论是进行核酸结构与功能的研究，还是进行基因工程、蛋白质工程，首先需要对核酸进行分离纯化。超顺磁性磁性粒子是细胞分离、鉴定，基因分析，细菌和病毒的病原体诊7第一章导论与综述断，核酸分离分析，蛋白质纯化的一个有效手段。通过寡聚核苷酸 o l i g o ( d t ) 】序列或链霉亲和素等将d n a 和r n a 连接磁性粒子表面已开发了许多应用。1 2 3 1d n a 瓜n a 结合蛋白分离在基因表达中，蛋白质也是一个重要角色，然而与d n a r n a 特异性结合得蛋白质通常寿命都很短，且含量少，链霉亲和素修饰的磁珠可用来提取分离d n p r n p 。结合有生物素的d n a 或r n a 序列与链霉亲和素修饰的磁珠相互作用，蛋白质识别了这些序列，就可在几分钟内结合到固定化d n a r n a 上f 1 9 1 ，这种方法已被用来分离转录因子，限制性内切酶，复制蛋白等。1 2 3 2m r n a 分离在研究基因表达中，结合免疫磁性细胞分离和基于磁珠分离后进行逆转录( r e v e r s et r a n s c r i p t i o n ) 及聚合酶链反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n , r t - p c r ) 扩增，是一种强有力的手段。典型哺乳动物一个细胞中只有大约x o p g 的r n a , 而m r n a 则仅占总r n a 的1 5 。传统的m r n a 分离技术含有总r n a 纯化，即基于0 1 i g o ( d t ) - 纤维素亲和色谱柱的p o l y a + r n a 选择，此过程费时并费力。因此，d y n a b e a d so l i g o ( d 1 ) 2 5 被用于从复杂溶菌液中提取m r n a 。p o l y ( a ) - t a i l是m r n a 序列上普遍存在的一段碱基，因此磁珠表面只需要有0 1 i g o ( d t ) 2 s 序列，就可以有效地与m r n a 上的p a l y ( a ) - t a i l 杂交，这种杂交非常迅速，在1 2 分钟内就可完成，能有效地除去r r n a , t r n a 以及其他r n a , 且有7 0 一1 0 0的回收率。除去溶菌液的洗涤，整个提取只需耗时十五分钟，且只用一个管，也不必前面的纯化步骤。利用d y n a b e a d so l i g o ( d t ) 2 5 可在一小时内从单核细胞和t 一淋巴细胞，b - - 淋巴细胞等中提取出m r n a ，磁珠也可以经过改性后对血液、骨髓中的癌细胞进行检测或进行单核细胞( m o n o n u c l e a rc e l l ) 制各。此外，磁珠还可从动、植物组织中分离m l n a ，比如，曾有人从血清、血浆、骨髓液中分理出聚腺苷酸( p o l y a d e n y l a t c dv i r a l ) r n a 病毒：h i v - 1 r n a , 从肝、脾、植入石蜡组织，以及果蝇中都提出了m r n a 除了d y n a b c a d so l i g o ( d t ) 2 s 外，可用于核酸提取的磁珠还有m a g n e s i l t m ,o l i g o ( d t ) c e l l u l o s e ，o l i g o ( d t ) 一l a t e x ，o l i g o ( d t ) - a g a r o s e ，b i o t i n y l a t e do l i g o ( d t ) ，和链霉亲和素修饰的等磁珠。利用这些磁珠从动、植物细胞、组织等复杂样品中提取的m r n a ，可用于构建c d n a 文库。o l i g o ( d n 2 5 磁珠消除了总r n a 纯化，柱色谱处理，过滤，有机溶剂提取，醇沉淀等过程，酶的下游应用也不会因为磁珠的存在而受到抑制。d y n a b e a d so l i g o ( d t ) 2 5 最终要的特性还在于可定量提取m r n a , 使得定量r t - p c r 和环境监测成为可行。实现m r n a 提取高通量也8第一章导论与综述已成为可能，f a n g 和o t t o 等已报道了9 6 孔板和3 8 4 孔板磁分离，- i n 时进行9 6 或3 8 4 个样品的提取1 2 0 - 2 1 1 。1 2 3 3d n a 分离基因组d n a 分离是许多分子生物学技术如序列分析，p c r 扩增，杂交，检测等的先决条件。d n a 的提取分为两个步骤：裂解细胞和提取核酸。从样品中提取d n a 首先要通过物理、化学或酶解作用裂解细胞，使d n a 释放出来，常用的方法包括物理法( 煮沸、冻融、微波、超声、研磨等) ，化学法( 高盐、表面活性剂、热酚等) 和酶解法( 裂解酶、溶菌酶、蛋白酶k ) 等阎。根据实际样品的类型及用量可选择不同的裂解方法。1 2 3 3 1 传统酚一氯仿抽提法细胞或组织按照上述方法裂解细胞后，采用酚氯仿有机溶剂抽提，通过离心，分离成两相后，核酸在水相中，再醇沉淀除去大量的蛋白质，脂质，糖类，r n a 等。此法适用于多数分子生物学技术，但却耗时耗力，也不适于自动化和微型化。另外，酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染，有损人体健康【矧。1 2 3 3 2 固相提取法由于p c r 扩增已是一项快速，自动化技术，因此，基因组d n a 提取就成了限时步骤，即使后来又有了新的方法可节省时间，但却需进行不易自动化的沉淀，柱处理后浓缩，离心等。要从速度和自动化上配合p c r 技术，自1 9 7 9年v o g e l s t e i n 和g i u e s p i e t 【l l 提出了用玻璃粉末在高浓度碘化钠下从琼脂糖凝胶中提取出了d n a 后，一种新的基于固相提取的方法随即蓬勃发展起来。根据固相载体的种类不同，用于核酸固相提取的方法主要包括以下几种方式。鳌合树脂纯化柱法近年来，以螯合树脂为基础提取d n a 的方法不断有人报道，w 融s h 瞄】最初用c h e l e x1 0 0 作为金属离子鳌合剂来提取人类d n a ，利用人类细胞在含有5 c h e l e x1 0 0 悬液中煮沸时可使细胞膜破裂释放出d n a ，同时与二价金属离子鳌合，从而避免样品中存在的金属离子在高温和低离子强度条件下作为催化剂使d n a 降解。一步完成提取过程，同时获得纯度较高的d n a 。u e f i e 等瞄悃c h e l e x l 0 0 螯合桂从培养和临床标本中快速提取细菌及病毒d n a 用于p c r 反应。s e p h a d e x g 一2 0 0 离心柱法是由e r b 和d f b l e r 2 7 后来发明的，以后又经过他人改进，用于d n a 提取。玻璃粉铁矿石吸附法利用玻璃粉在高盐下吸附d n a 的特性，制备模板第一章导论与综述d n a 近年来多有报道，国内在这方面的研究也很多，军事医学科学院杨瑞馥等【硼利用玻璃粉从土壤中分离核酸，取得较好的效果，回收率达7 5 一1 0 0 。此方法提取核酸操作简便，采用物理吸附法提取d n a ，不需要特殊的设备，虽不能彻底除去抑制剂，但所提取的核酸完全可以满足p c r 扩增的需要。1 9 9 1 年，r o m a n o w s k i l 2 9 等研究了利用不同的盐将质粒d n a 吸附到矿物上用以抵御d n a s e i 的降解行为，这是首次将金属物质引入d n a 固相提取中。后来m a n i n l 3 0 j 及其同事将铁磁体作为固相载体，成功的从质粒中提取出了d n a 。免疫亲和法g e l s t h o r p e 等1 3 1 】利用抗d n a 单克隆抗体与磁珠结合的方法从小样本、陈旧样本及含p c r 抑制剂的样本中提取核酸获得很好的效果。用系统性红斑狼疮小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞杂交获得抗d n a 单克隆抗体，这种抗体可以与d n a 特异性结合，但与质粒及少于2 0 m e r 的寡聚核苷酸结合很弱。用这种方法提取d n a 可以大大提高p c r 的敏感性，尤其适用于样本中d n a 含量很少或者是陈旧样本。研究同时也发现抗体与磁珠反应的最适条件为温度2 0 、含1 n o n i d e t p - 4 0 及1 4 5 m m o l l n a c l 的溶液，蛋白含量超过5m g m l 就会抑制该反应。磁珠吸附法m a 髓e s n 刑超顺磁性磁珠是磁性粒子与s i 0 2 形成的表面带硅羟基两中心为磁性核的磁珠。d n a 与硅羟基相互作用形成复合物，此复合物在磁场中有一定的响应性。在分离中，主要经历三步过程，即结合( b i n d i n g ) ，洗涤( w a s h i n g ) ，洗脱( e l u t i o n ) 。整个提取过程见图l - 4 。通过优化结合条件，d n a 可从复杂基质中被吸附到磁珠上，外加磁场使被吸附d n a 与未被吸附的分子分离，纯化的d n a 被洗脱后，则可进行下游工程如p c r 扩增，d n a 序列分等析。在m a g n e t i t e s i 0 2 磁珠的基础上，不少学者引入了其他官能团，获得了带羧基、氨基等的磁性微球【3 2 - 3 3 ，并将其用于了核酸的提取，已获得了良好效果。多糖类如纤维素、琼脂糖也可应用于磁性微球的修饰后，进行核酸提取【3 们”。各种键合生物配基如链霉亲和素、抗生物素 3 6 - - 5 7 等的磁性微球不仅可以用于核酸提取，在其他生物分子的分离分析中更是广泛应用。第一章导论与综述图1 - 4d n a 磁分离过程f i g1 - 4m a g n e t i cs e p a r a t i o no fd n a不同表面基团的磁珠，提取条件也不同，但仍需经历结合( 吸附) ，洗涤，洗脱( 解吸附) 这三步，通过对分离条件的优化，就可达预期目的。当然，磁性的形成中也可引入其他金属离子如c o ，n i 等改善并扩大其应用条件及范围【3 8 1 。m a g n e s 已被广泛使用，实现了d n a 纯化的自动化和高通量，r a p x t r a c t t m 3 8 4d y et e r m i n a t o rr e m o v a lk i t 和q u a d r a 3 t mw o r k s t a t i o n 已经被用于d n a 纯化，使得在5 分钟内可纯化3 8 4 个样品【2 1 】。第一章导论与综述表1 - 1 几种d n a 提取方法比较! ! ! ! ! ! ：! 鱼巴p 墼尘i 2 呈2 11 1 ! ! 型里塑垒坚! ! 型! ! 墨巴! ! 塾2 垒!传统法鳌合树脂法玻璃粉法磁珠法免疫亲和法芯片法随着微机械加工技术和i c 工艺的发展，生物医学和临床诊断上的仪器以及分析方法的小型化引起人们极大的关注。由于体积的减小，减少了试剂的消耗，缩短了反应的时间，同时使高通量，大规模的检测成为可能。因此，近几年来，关于这方面的研究越来越多，尤其是基于微机械加工的生物芯片得到了迅速发展。在d n a 分析和疾病检测中，常常需要进行d n a 提取、d n a 扩增和d n a 分离检测等步骤。目前，d n a 扩增芯片和d n a 电泳分离芯片的研究比较多1 3 9 1 。而d n a 提取芯片研究较少，不利于生物芯片的集成化和自动化，因此有必要进行d n a 提取芯片的研究目前d n a 提取芯片采取的方法有：超声波法【柏】，热法【4 l l ，介电电泳法等，这些方法各有优缺点，近年来s p e 法引起了人们的关注。s p e 法是利用一些固体物质的表面，如硅胶、玻璃、离子交换树脂或者经过修饰的磁珠等特异的吸附d n a 。这种方法的好处是d n a 的降解较少，结合使用蛋白变性剂和r n a 降解试剂，可以使d n a 的纯度和产量得到提高。且s p e 法操作步骤较少，可以适应不同的样本。目前利用s p e 法制作芯片进行d n a 提取的报道较少，较早利用s p e 法制作芯片的如t i a n 等【4 2 】制作的样品制备芯片，将硅微珠第一章导论与综述放置在毛细管内，提取d n a 整个过程时间为3 0 m i n ；w o l f e 4 3 l 改进此方法，将硅微珠固定在溶胶的微沟道内，能在2 5 m i n 内完成提取纳克级的d n a 。c h r i s t e l等即1 利用深刻蚀技术在硅片上刻出许多小柱，利用此结构捕获d n a 。然而，现在多数d n a 芯片是基于硅球的，基于磁性微球的d n a 微芯片仍然比较少，这将是我们以后发展的重点；以磁性微球为基质，用磁场来控制固相载体的d n a 芯片制作与应用。现在固相提取中，随着磁性微球的引入，从动植物组织、全血、细菌、真菌、质粒等中提取d n a 的方法更趋于简便、快速，小型化和自动化。磁分离已成为一个缺少的手段。1 3 本文研究目标与内容1 3 1 研究目标生物磁分离技术中的主要成分就是磁性固相载体，即磁性粒子。磁性粒子的制备方法很多，但最为成熟的是丹麦d y n a l 公司生产的d y n a lb e a d s 。本文将采用磁性转化法制备的磁性粒子应用于磁性分离，得出基因组d