（植物学专业论文）中国特有种—濒危植物岷江柏（cupressus+chengiana+syhu）的遗传多样性研究.pdf

凹川犬学硕士学位论文 中国特有种濒危植物岷江柏( c u p r e s s u s c h e n e i a n as 。y h u ) 的遗传多样性研究 檀物学专业 磺突垒髋羲 警嚣敬疼王黎 教授 摘要 岷江柏( c u p r e s s u sc h e n e a n as y h u ) 是中国特有的种柏科 ( c u p r e s s a c e a e ) 糖本藩( c u p r e s s u s ) 乔本，仅产予我国圈川帮嚣豢覆省，作 为国家二级重点保护植物被收录于中国植物红皮书。岷江柏的自然种群主要 分布于溅江流躐，自宠江流域帮大渡河流域上游，是三条江河流域分布区内酌 主要树种之一。该柏术生长谯河谷，可在雾种土壤类型上，甚至岩石缝隙或稍 育积土的裸岩t 生存，极耐干早瘠薄，是干旱河谷人工造林的优良树种。其木 楗质优良，具露芳香蟓，宣吉以来多用于修痘字、割用具、邈渡躲等。由予长 期以来的人工采伐、生境的变化以及岷江柏自然熙新缓慢的生物学特性，其自 然群落懿分毒魏区霸分鑫蟊谈均瑟藏壤小，现琶覆漆滋惫懿麓壤。 为了解岷源柏居群的遗传学状况，分析其濒危的机制，为其保护措施的制 定提供科学的壤论根据。采瑙a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 分子标记，对m 民江柏耀群的遗传多榉性和遗传结构进行了分橛；此外，为更好 翻衄保护蛾江柏的种源投满足人工植树造林的需求，还对其种予的萌发和愈伤组 缓泌诱譬进行了探讨。主要硬究缝暴熟下： 1 。采雳a f l 。p 分子标记技术，对8 个斌江稻鸯然嚣群鹣遗传多祥琶至承平帮器群 呱川大学硕：卜学位论变 遗传结构进行了研究。用4 对a f t p 引物对8 个居群的1 0 6 个样品进行了扩 增，共得到2 7 4 条清晰的扩增位点，其中多态性位点1 9 5 个，多态位点百分 零( p p b ) 为7 1 1 7 。n e i s 遗传多样性g s t = o 。4 7 4 8 ，援群闻的基因流 动频率较低为0 5 5 3 2 。a m o v a 分子方差分析表明岷江柏居群间的遗传变异占 变化裁分数3 9 。1 3 ，6 0 。8 7 鳇变劳发生屡群内。个髂聚类黼表鹗各屠群内 个体大部分能很好地聚在起，m a n t e l 检验( r = 0 7 5 ，p = 0 0 3 ) ，说明遗传距 离帮魏理距离有正捐关程。通过辩氓江籀藉群静遗传多样毪帮詹群遗传结鞫 状况的分析，我们可以看到该物种居群物种遗传多样性较赢，而居群水平较 低，且居群问分化较明显。人为干扰是替致该物种濒危的主器孤困之一。 2 将岷江柏的种子接种到7 种不同激素成分的m s 培养綦上，进行培养。研究 表明，g a 辩& 蔑、趸撩耱予戆葫发蠢较疆燕翘促滋捧焉；a b a 粼显著逮撩裁了 岷江柏种子的萌发；6 一b a 则有解除a b a 的抑制作用。以通过种子萌发而来 静氓江榴无麓菌为材料，m s 培养基作为基本培养基，璃不间的激索靛比组 成1 2 种不同的培养基，对岷江的外植体进行愈伤组织的诱导培养，优化嫩 适宜的培养藏。实验发现，2 , 4 d 在岷江柏愈伤组织的诱导中起决定性的作 用。 关键词：岷江柏；a f l p ；遗传多样性；遗传结构；萌发率；愈伤组织 2 叫川大学硕上学位论文 s t u die s o ng e n e ticdiv e fsit yo fa n e n d a n g e r s p e c ies ，c u p r e s s u sc h e n e a n a s y h u m a j o r ：b o t a n y a u t h o r ：y a ol i s u p e r v is o r ：p r o f w a n gl i a b s t r a c t c u p r e s s u sc h e n g i a n as y h u ，al o n g - l i v e dc o n i f e ro ft h eg e n u sc u p r e s s u si n c u p r e s s a c e a e ，i sa ne n d a n g e r e ds p e c i e se n d e m i ct os i c h u a na n dg a n s up r o v i n c ei n c h i n a ，w h i c hh a sb e e nn o m i n a t e da st h e2 mc l a s sp r o t e c t i o np l a n t si n t h en a t u r ep o p u l a t i o n so fcc h e n e g i a n a d i s t r i b u t e dr e s t r i c t e d l yt ot h eu p p e rr e a c h e so fm i n j i a n g ，d a d u h ea n db a l o n g h e r i v e r s c c h e n g i a n ai st o l e r a n to fd r o u g h ta n dc o l d n e s ss ot h a ti t c a ng r o wi n v a r i o u ss o r t so fd r o u g h t ya n dl e a ns o i l s ，e v e no nt h ep e t r o u sa p e r t u r e s a n di ti so n e o ft h em o s ti m p o r t a n tp l a n t sf o rf o r e s t a t i o n ，s o i la n dw a t e rc o n s e r v a t i o ni nt h ed r y v a l l e yi ns i c h u a np r o v i n c e ，b e c a u s eo f i t sf i n e c a p a b i l i t yo fw a t e rr e s o u r c e s c o n s e r v a t i o n ，i nt h ep a s ty e a r s ，i th a db e e nu s e dt ob u i l tt e m p l e s ，b o a t sa n dl o t so f t r a d i t i o n a lc h i n e s ef a r mt o o l sf o ri t sf i n ew o o d i n e s sa n ds p e c i a lb a l m r e c e n t l y , t h e d i s t r i b u t i o na r e a so f c h e n g i a n ad w i n d l e dg r a d u a l l ya n di n d i v i d u a l sb e c a m ef e w e r s h a r p l yo w i n gt ob a d l yd e s t r o y e de n v i r o n m e n t s ，o v e r l o g g i n g ，g r a z i n ga n di t s b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c 鞠川丈学颤十学位论文 髓ek n o w l e d g ec o n c e r n i n ga b o u toc h e n g i a n a sg e n e t i cb a c k g r o u n d sw e r e s t i l lu n k n o w n 。i nt h ed n al e v e l t h eg e n e t i cd i v e r s i t ya n dg e n e t i cs t r u c t u r eo fc c h e n e g i a n ap o p u l a t i o n sw a ss t u d i e db ya f l pm a r k e r s t h ea i m sw e r et oi l l u m i n a t e t h eg e n e t i cb a c k g r o u n do fe c h e n e g i a n aa n da n a l y z et h ee n d a n g e r e dm e c h a n i s m ， w h i c ho f f e rg e n e t i ce v i d e n c e sf o rt h ec o n s e r v a t i o ni m p l i c a t i o n i no r d e rt op r o t e c t t h es o u r c e so fcc h e n e g i a n a ，t h ec o n d i t i o n so fs e e d g e r m i f i a t i o na n dc a l l u s i n d u c e m e n tw e r ed i s c u s s e d t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h ee x t e n to fg e n e t i cv a r i a t i o na n dg e n e t i cs t r u c t u r ew i t h i na n da m o n g8n a t u r e p o p u l a t i o n s w a sa s s e s s e d u s i n ga f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ) a n a l y s i s 4p r i m e r sp r o d u c e dat o t a lo f2 7 4s c o r a b l em a r k e r s ， 1 9 5o fw h i c h ( p p b = 7 1 。1 7 、w e r ep o l y m o r p h j c g e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o n ( g s t ) a m o n gp o p u l a t i o n sd e t e c t e db yn e i sg e n e t i cd i v e r s i t ya n a l y s i sw a so 4 7 4 8 p a r t i t i o n i n go fm o l e c u l a rv a r i a n c eb ya m o v aa n a l y s i si n d i c a t e ds i g n i f i c a n t g e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o nw i t h i np o p u l a t i o n s ( 6 0 8 7 馨妁，0 1 ) 。g e n ef l o wf n m ) w a s0 5 5 3 2 s a m p l e sf r o mt h es a m ep o p u l a t i o n m o s t l yc l u s t e r e d i nt h e p o p u l a t i o n s p e c i f i cc l u s t e r ，a n dg e n e t i cd i s t a n c ew a sp o s ! t i v ec o r r e l a t e dw i t ht h e c o r r e s p o n d i n gg e o g r a p h i c a ld i s t a n c e ( r = o 7 5 ，p = 0 。0 3 ) 。b a s e d o ng e n e t i c d i v e r s i t ya n dg e n e t i cs t r u c t u r eo fp o p u l a t i o n so fec h e n g i a n a ，w ef o u n d t h a tt h e s p c i e s - l e v e lg e n e t i cd i v e r s i t yi sr e l a t i v eh i 【g h ，b u tl o wi np o p u l a t i o nl e v e la n dt h e v a r i a t i o na m o n gp o p u l a t i o n sw a ss i g n i f i c a n t ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h em a n m a d e i n t e r f e r e n c ew a sam a j o rr e a s o nw h yo c h e 裙i a n aw a si ns e v e r ed a n g e c 2 t h ea s e p s i ss e e d sw e r ei n o c u l a t e do ns e v e nm sm e d i u mw i t hd i f f e r e n th o r m o n e c o m p o n e n t s 。t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h es e e dg e r m i n a t i o nw a sa c t i v e l y s t i m u l a t e db yg i b b e r e l l i n ( g a ) a n ds i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e db ya b s c i s i ca c i d ( a b a ) ，w h i l e6 - b e n z y - l a m i n o p u z i n e ( 6 - b a ) h a da na c t i v er o l ei np r o m o t i n g s e e d g e r m i n a t i o n 。t h ea s e p s i sy o u n gp l a n t s f r o ms e e d g e r m i n a t i o nw e r e d 毅川大学颧 一学经论文 i n o c u l a t e do nt w e l v ed i f f e r e n tk i n d so fc u l t u r em e d i u mm a d eu po fm sa n d d i f f e r e n th o r m o n e s ，s ot h a tt h em o s tf i t t i n gi n d u c t i o nm e d i u mc a nb es e l e c t e d a st h er e s u l t s , 2 , 4 - 1 3h a dt h ec r u c i a le f f e c ti nc a l l u sl n d u c e m e n t 。 k e y w o r d s ：c u p r e s s u sc h e n e g i a n a ；a f l p ；g e n e t i cd i v e r s i t y ；g e n e t i cs t r u c t u r e g e r m i n a t i o nr a t e ；c a l l u s 5 叫川i 大学硕士学位论文 第一章岷江柏居群遗传多样性的a f l p 分析 摘要：采用a f l p 分子标记技术，对8 个岷江柏自然居群的遗传多样性水平和 居群遗传结构进行了研究。用4 对a f l p 引物对8 个居群的1 0 6 个样品进行了扩 增，共得到2 7 4 条清晰的扩增位点，其中多态性位点1 9 5 个，多态位点百分率 ( p p b ) 为7 1 1 7 p o p g e n e 分析结果表明，岷江柏物种水平具有较高的遗传多 样性然而，各个居群的遗传多样性水平相对较低( 1 7 8 8 t o5 0 0 0 ) ，甘肃 文县的遗传多样性水平最高( p p b = 5 0 o o ，h e = 0 2 0 3 8 ，i = 0 2 9 5 6 ) ，四川 小金县遗传多样性水平最低( p p b = 1 7 8 8 ，h e = o 0 7 5 1 ，i = 0 1 0 8 1 ) 。个体 聚类图表明，各居群内个体大都聚在一起。n e i s 遗传多样性分析表明，8 个 自然居群间出现了较高程度的遗传分化( g s t - - - - 0 4 7 4 8 ) 。居群间和居群内都存 在着明显的基因差异，居群内的遗传多样性水平为5 2 5 2 ，居群间的遗传多 样性水平为4 7 4 8 。a m o v a 方差分析得出，岷江柏居群内的遗传变异占变化成 分的6 0 8 7 ，3 9 1 3 的变异发生在不同居群间，居群间的基因流动频率较低， 为0 5 5 3 2 ，居群间较低的基因流动频率可能是岷江柏各个居群间遗传差异的原 因。 关键词：岷江柏a f l p 遗传多样性遗传结构 引言 岷江柏( c u p r e s s u sc h e n g i a n as y h u ) 是中国特有的一种柏科 ( c u p r e s s a c e a e ) 柏木属( c u p r e s s u s ) 乔本，俗称香柏、油柏、木香树，仅产 于我国四川和甘肃两省，作为国家二级重点保护植物被收录于中国植物红皮 书。岷江柏的自然种群主要分布于岷江流域，白龙江流域和大渡河流域上游， 是三条江河流域分布区内的主要树种之一。该柏木生长在河谷，可在多种土壤 叫一l 人学硕士学位论文 类弛上，甚至岩石缝隙或稍有积土j ：】勺裸岩上生存，极耐干早瘠薄，是干旱河谷 久王造拣涎谯庭樾耪。其本撼蒺谯楚，具鸯芳香味，叠吉以来多翔手修痿字、 制用具、造渡船等。由于长期以来的人工采伐、生境的变化以及岷江柏自然更 掰缓慢静生秘学特性，其鑫然群落盼分布魏区和分布面积均醋益缩小，现已面 临濒危的处境。因此，对其濒危机制进行探讨、制订有效保育措施追在眉睫。 a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 即扩增片段长度多态性， 是幽蓠兰科学家z a b e a u 亵v o s 予1 9 9 2 年发明约一静检测d n a 多态性骢毅方法 h i 。其基本原理是：b n a 经内切酶酶切后，片段的末端连接上一个接头，随后经一 个与接头鞠连接酶蠕使点相蕊配戆引秘遘行扩璞，交牲浆秀烯凝菝奄泳嚣分离 扩增产物。通过利用一簇特别的引物在不需要知道d n a 序列的情况下，可在次 单个反赢中捡浏蓟大鬣的片段【2 q 。阑诧，它是一种检涮效率穰离的d n a 指纹技 术。同时，a f l p 是r f l p 与r a p d 相缝合的一种分予标记技术，既具有r f l p 檬记 的专一性、可靠性，又熬有r a p d 标记的随机性、方便性，因此被称为最有力的分 子标记或下一代分子橼记。豫篷，a f l p 标记是曼性标记，按典型载蠡德尔方式 遗传。扩增时具有带纹丰富、用样鬣少、灵敏度高、快速高效等特点。一次分 褥霹获褥蔟嚣缓大量鲍遗绩铸惠，并表瑷大量静多态豢，待澍蹩对吴象缘关系及 遗传上区别不大的种类来说怒比较合适的分子标记方法 1 , s - 6 】。近几年在种群生 态、作秘晶系鍪嗣、基嚣定位作图、遗传多样性研究等方面表现出广泛的应用 价谯。迄今为止，已利用a f l p 对多莘巾植物群体遗传结构与穆闻、辩内遗传多样 性进行了广泛的研究 “n 1 。 物孝孛的基爨库襄共最大麴遗传多撵煌瓣保鸯是残功曝弯一个物耱靛关键， 而保育遗传多样性的綦础是对该物种遗传多样性的进行了解。前人用r a p d 、同 功酶等方法萋嚣究了毒鑫熊萁它撞貔熬遗传多释毪迸萱亍过一些研究 1 2 4 4 1 ，但对躐江 柏的研究仅见于细胞学方面的报道，其居瓣遗传结构、遗传多样性等信息尚一 秃所知。阂此智必要对氓江稻晦遗传多样髓迸行研究。 本研究采用a f l p 分子撂记岷江糖8 个自然鼹嚣的遗传多榉性进搀了分毒厅， 并探讨了岷江柏居群的遗传结构特征。旨在为阐明其濒危机制旗定基础，并为 避一步龛善蜒辽糖瓣辍枣篆旗及制订有效铩育爨施提袋科学袋据。 7 西川大学碳j 学位论文 1 材料与方法 。 实验毒旁瓣 在岷江柏分布的四川省和甘肃省采集了8 个居群，每一居群选取i l 1 5 个个体，合计1 0 6 份材料的样品。8 个居群在四川的分布见圈1 1 。各居群所在 遮见表1 1 。每令圭| 羹区蔽攘女晁注糖分奄范围蕤稳选取l l 1 5 个搀撩。每样拣溜 隔距离至少1 0 m 以上，每株采集的叶片装入自辩袋中用硅胶干燥保存，并尽快 进行总撼因组d n a 的提取。 图1 1 蠛汪柏8 个采样滕群的分布 f l g u r e 。 d s t r b u t o no fe l g h tp o p u la t i o n so f0c h e n e i a n a 躐川入学硕士学位论文 表 。18 个莛群耪$ 慕樽缝盎 t a b e1 1o e s e r i 外j o no 干8n a t u r m 最c h e n g i a n ap o p u a t i o n sa n b l y z e d 1 2 试验方法 1 2 澡江稚慧d n a 静提取方法 i 2 1 1s d s 法p 5 1 ( 1 ) 取2 9 叶片，在液氮中迅速研磨成细粉状； ( 2 ) 将粉末转移至5 0 m l 囊心管孛，燕入1 6m l 绥麓爨玫液( 1 0 0 m mp h 8 。0 t r i s h c h5 m mp h 8 0e d t a ；5 0 0 m mn a c l ；1 2 5 s d s ；i m m1 3 巯基乙醇) ， 混匀，6 5 0 c 水浴保淞2 0 m i n ： ( 3 ) 加入5m l 5 mk c i 溶液，冰浴2 0 r a i n 爱，4 0 0 0 r p m4 0 c 离心2 0 m i n ； ( 4 ) 取上清液，翻等体积黔底仿，异戊酪滢匀，4 0 0 0 r p m4 + c 离心5 m i n ； ( 5 ) 取上清寝，加等体积氯仿异戊醇，4 0 0 0 r p m4 0 c 离心5 m i n ； ( 6 ) 取上清液，加入2 3 倍体积的异丙醇，静置1 5 m i n ，离心获得沉淀物 罴7 0 熬乙藜洗3 次震，热入2 0 0 # i t e ( 1 0 m m o l f l t f i s h c l ，lm m o l l e d t a ) 缓冲液，d n a 溶解看加入孤1 r n a s e ； ( 7 ) d n a 浓度和纯度的检测：琼脂糖凝胶电泳，检测结果。 q 职川大学颤l 、学能沦文 1 2 1 2c t a b 法 参照m u r r y 簿( 1 9 8 0 ) 1 稍提出的方法并经适当的修改。 ( 1 ) 取2 9 叶片，嫣液氮磷磨成细粉，瘩粉寒堤移到5 0m l 离心蛰中，加 入2 0m l 预热至6 5 0 c 的2 xc f a b 缓冲液( 1 0 0 m m o l l p h 8 0 的t r i s h c l ， l 。4 m m o f l n a c l ，2 0m m o l l p h 8 。0e d t a ， 2 静c t a b ，2 巯蒸乙醇) ， 混匀，置于6 5 0 c 水浴中放置6 0 r a i n ； ( 2 ) 混合溺冷至室温岳鸯嚣入等体积酌氯仿缮戊醇，5 0 0 0 9 离心1 0 m i n 分 相； ( 3 ) 在上清液中加1 1 0 0 体积的r n a s e a ，3 7 0 c 保渝3 0 m i n ； ( 4 ) 艇入2 3 体积麴异稳醇，室瀑放鬟1 5 r a i n 爱5 0 0 0 9 离心1 0 m i n ； ( 5 ) 将d n a 转移歪5m l7 6 乙醇、o 2 m o l 几n a a c 的离心管中，冰上放 置2 0 m i n ，再转移至5m l 7 0 l 。醇麴离心繁中，琛主旋转5 m i n ； ( 6 ) 将d n a 溶于尽可能少的t e 缓冲液； ( 7 ) 同s d s 法。 1 2 。1 3 改艮c t a b 法 采曼lm u r r y 等( 1 9 8 0 ) 掇逛的，劳经中匡科学院檀物职突鼹系统遴纯与檀 物学开放研究实验室改进的方法f 17 1 。 ( i ) ( 2 ) 溺c t a b 法； ( 3 ) 蘑复第( 2 ) 步； ( 4 ) 在上清液中加入z 珞体积韵羿丙醇，置予2 0 0 c 放置3 0 m i n ，室温1 0 0 0 0 9 离心1 0 m i n 收集沉淀： ( 5 ) 沉淀溶于1 1 0 倍t e 缓冲液，加1 1 0 0 体积的r n a s e a ，3 7 0 c 保温3 0 m i n ； ( 6 ) 爰等体积弱氯傍，舅发醇嚣麴提一次，鑫承翱中撵入1 5 箨辍1 0 m o l l n h , a c ，后加入2 倍体积冰冷的9 5 乙醇，在2 0 0 c 放置至少3 0 r a i n ( 7 ) 室溢1 0 0 0 0 9 离i l , 1 0 r a i n 浚集沉淀； ( 8 ) 加入7 0 乙醇洗沉淀： ( 9 ) 将沉淀溶于t e 缓冲液中； c 1 0 ) 同c t 怂法躲( 7 ) 步。 秘引大学硕士学谊论交 1 2 1 4 岷江柏总d n a 的提取方法比较 德测d n a 样品用t e 缓冲渡稀释至3 m l ，馁证其浓度藏豳在5 5 0 u g m i 之 蕊。戮t e 乍为参院滚调零，三静方法提取豹d n a 释品作为待溺液，在u v v i s s p e c t r o p h o t o m e t e r ( t u - 1 9 0 1 ) 型紫外分光光度仪上分别测定其在2 6 0 n m 和2 8 0 n m 处的o d 值。 1 2 2a f l p 扩增程序 a f l p 反应的基本程序参照z a b e a u 和v o s 的方法【1 8 1 。各个反成体系见 表1 2 。 蓑1 。2 ：a f l p 爱成体系 t a b i e1 2t h es y s t e m so fa f l pr e a c t io n 酶切逡搂体系预扩增体器选择扩增髂系 d i g e s t i o n l i g a t i o np r e a m p l i f i c a t i o n s e l e c t i v ea m p l i f i c a t i o n 3 p l d n a ( 1 0 0 n g 1 1 2 u l 酶切连接模板4 l a l 预扩模板 2 5u l l o x b u f f e r2 1 t l l 0 p c r b u f f e r2 u l l 0 p c r b u f f e r d 2 hl 1 0 0 x b s a1 2 pl m + ( 2 5 m m 哟! 2 hl m d ( 2 5 m m 0 1 ) 2 # l a t p ( i om m o l ) 1hld n t p s ( 1 0 m m 0 1 ) 0 。5 l d n t p s ( 1 0 m m 0 1 ) l 0h l e c o r ia d a p t e r m i x 1 t t l m s e i p r i m e r ( 5 0 n g nl ) 0 5u l m s e i p r i m e r ( 5 0 n g pl ) 1 0 h l m s e ia d a p t e r m i x1u l e c o r l p r i m e r ( 5 0 n g “l ) 0 5 1 1 l e c o r i p r i m e r ( 5 0 a g ul ) 3 ue c o r le n z y m e ( f i n a l ) 0 2ul t a q ( s w1 1l)02 i t l t a q ( 5 u ul ) 3 um s e i e n z y m e ( f i n a l ) 1 u t 4d n a l i g a s ef 蠹n a l ) 补足d d h 2 0 总体积2 5n l 补足d d h 2 0 总体积2 0 n l 补足d d h 2 0 总体积2 0 1 1l 1 2 ，3a f l p 扩增步骤中实验条件的优化 1 2 3 1 双酶切 膈e c o r i 和k l s e i 疆辞酶进行酶螺。酶凌过程l ；选了d n a 模扳鲶骜( 2 5 0 5 0 0 n g ) ，结果显示澈论在预扩墙还是选择洼扩增中都能得戮很好的结粜，酶切 时如果d n a 量如果稍小于2 5 0 n g 也不会对实骏结果产生明鼹影响，因此建议为 了节约d n a ，在做隳叨时可适当减少d n a 量，本实验选用瓣切时模板d n a 为 四川大学坝士学位论文 3 0 0 n g 。酶切产物的检测：取5 u l 酶切产物在1 琼脂糖中电泳，然后照相。 1 2 3 2 连接 e c o r i 接头的结构是： 5 一c t e g 蕈a g a e t g c g t a c c c a t c t g a c g c a t g g t t a a 一5 m s e i 接头戆缝鹣是： 5 一g a c g a t g a g t c c t g a g t a c t c a g g a c t c a t - 5 在室温下连接过夜。连接产物分一部分用0 1 豫按1 ：1 0 的比例稀释后用米作 下一步试验，剩余部分保存在一2 0 。c 冰箱中备用。 1 2 3 3 预扩增 ( 1 ) 预扩瑾号l 魏 预扩增引物包括三部分：5 端的核心序列与接头互补，限制性酶切位点的 磐弼以及3 鞴的选襻佳碱蒸( 1 个) 。以下是e c o r i 和m s e i 预扩增弓 物的组成： 核心序列 酶切位点选择性碱基 e c o r i - o ： 5 - g a c t g c g t a c ca a t t ca 一3 g s e l o 5 一g a t g a g t c e t g a gt a ac - 3 ( 2 ) 预扩增程序 疆扩辔复藏条 串必：髓交蕊2 m i n ，9 4 。c 交缝3 0s ，5 6 退炎3 0 s ，7 26 c 甄伸i m i n ，3 0 个循环厢7 2 延伸5 m i n ，p c r 反殿结束厝，置4 。c 保存。 ( 3 ) 预扩增产物检测 取5 # l 预扩增产物进行1 琼脂糖凝胶电泳，将合格预扩增产物臻释1 0 倍后可鬣4 保存待阁。 1 2 3 4 选择性扩增实验条件的优化 ( 1 ) 选择 生扩灞g l 嵇 a f l p 选择性扩增引物包括三部分：5 一端的核心序列与接头互补，限制性 酶切位点的序列，3 一端的遗择性碱基。以下是e c o r i 和m s e l 引物的组成： 核心序列酶切位点选搔性碱撼 e c o r i ：5 一g a c t g c g t a c ca a t t ca n n 一3 髓s e i ：5 一g a t g a g t c e t g a gt a ac n n 一3 3 端的碱撼数可以为1 、2 或3 个，选择性碱基数的选择与分析的材料的 墓强缰大小寿关，一般来涎，蘩嚣缓较蠢、，逶合逮鬻l 一2 令选择性碱基戆弓l 妨， 而撼因组较大则应选用2 3 个选择性碱基的引物。表1 3 是本研究种采用7 个e c o r l 弓i 耪帮7 个m s e l 弓l 物豹亭剜。 ( 2 ) 选择性扩增退火温度的选择 选择性扩增设计了5 5 、5 5 5 。c 以及5 6 三个退火温度来进行扩增。 表 3 选择注扩增g l 物瘁到 t a b l e ，38 e l e c t i ￥ea m p l l f l o a t l o np r l 睫rs e e 瞰e n o e $ ( 3 ) 选择性扩增引物的筛选 袋攒衷1 。3 的g l 貔序列，硗定了惩予选择睦扩增黪4 9 个弓l 物缝合。在确定 了选择性扩增最适条 牛后，接下来从4 9 对引物缀合中筛选出合适的引物组合。 实验中，并不怒每个萼l 秘组合都麓扩增警丰富条带，需要对这篷弓l 秘缝合邈行 筛选。被选出的引物组合至少必须满足两个条件：一是能扩增出丰富而均匀的 带；另一个是扩增出的带要疑有一定的多态往。 为了筛选燃合适的弓l 物缌合，采用了蕊步法进行赡选。第一步怒恩一个个 体的d n a 做模椴( 保诞筛选引物过程中祭件一致) ，用4 9 个目 物组合进行选择 强川大学硬学倪论文 性扩增，每个组合做两管相同的p c r ，以避免由于实验操作失误而不能扩增出 产物。扩增结束焉进行变往聚雨烯酰胺凝胶电泳梭测，观察银染结果，记录能 扩域出清啦面均匀的条锩的引物组合缡号。 经过第步筛选出的引物组合还需要进行第二次筛选，最终筛选剐具有多 态墼羔懿弓l 物缝合。方法翅下；分剩垮8 个麓嚣兹每个个体酶d n a 取2 鼙l 漫会， 用8 个居群的混合d n a 作模扳，用第一步筛选得到的引物组合进行选择性扩增， 然嚣迸雩亍电泳裣濒，遗懑具有多态佳的弓i 韵组合。 1 2 3 5 选择性扩增 将所蠢样晶个体按上述所赡选的最优豢l 牛进行酶切、 ：奚扩壤秘选择性扩蜷。 扩增出来的产物可保存在冰箱中或立即进行电泳。 1 2 3 6 扩增产物的变性聚雨烯酰胺凝胶电泳分析 ( 1 ) 裁菠 1 ) 用i o n a o h 清洗玻璃，自来水冲洗，去懑子水漂洗，然后用纸巾将水 擦干，用绦镜纸蘸无水己醇撩洗玻璃，待干了之稻，取6 0 0ul 潦和硅烷在无耳 玻璃上，翅攘镳纸涂匀，再取5 0 0 p l 反亲秘硅烷在毒耳玻璃上，鼹擦镶纸涂匀。 2 ) 放边条，两玻璃板左右两边和下端对齐，两边用夹子夹紧，然后用医用 荻窍骜黢，越努嚣捶入筏子捡查紧密凄。 3 ) 凝胶配制：6 丙稀酰胺凝胶配方如下【2 6 1 ： 2 0 丙稀酸胺1 8 m i ( 1 9 9 丙稀酝胺+ l g 双甲叉，热水定窖歪l o o m l ) 5 x t b e1 2 m l 尿素 2 5 2 9 l o a p s8 0 0 u l t e m e d5 0 6 0 u 1 憨体积6 0 m l ，1 0 a p s 帮t e m e d 在灌胶之裁麴天。 4 ) 将封好的玻璃板倾斜3 0 。c ，从玻璃板的一角开始灌胶，胶灌好后小心 平推入梳子，不要产警气泡，胶凝2 小时以上。 ( 2 ) 预电泳 胶凝好以后，拔去梳子，去除杂质，瞅下医阁胶柿。将玻璃板放入电泳槽， i 4 西川大学顿上学铖论文 插上固定挡板固定好玻璃板。导入1 8 0 0 m l 的1 t b e ，装上咆极，通电源，7 0 w 僵功率颈电潦4 5 m i n 。 ( 3 ) 电泳 1 ) 制样：取选择性扩增产物5 u l ，加入等量上样缓冲液( 9 8 甲酰胺， t o m m e d t a ，0 2 5 溴盼蓝) ，9 5 。cp c r 仪中处理5 m i n ，使d n a 变性，立即冰浴 1 0 m i n 以上，m a r k e r 也骰糖藏处疆。 2 ) 点样：预电泳结束后，用枪清除气泡和尿素，将梳子插入界面一点，每 个点样孔上样5 7ul ，用l o o b pl a d d e r 作为d n a 分子量m a r k e r 。 3 ) 窀泳：7 0 w 壤功率邀溶1 ，l 、对5 0 分镑。 ( 4 ) 锻染 i ) 固定：用剪刀从一角将玻嫡板轻轻分开，将胶放入2 l 固定液( 2 0 0 m l 甲 醇，l o m l 冰乙酸，1 7 9 0 m l 水) 中固定l o m i n 。 2 ) 染色；熬入4 9 矗舒0 3 ，染色3 0 m i n ；瑟矮蒸馏承漂洗l o s 。 3 ) 取出胶板，水洗数秒。( 4 ) 放入显影液( 6 0 9n a o h ，1o m l 甲醛，1 9 9 0 m i 水) ，到出现清晰祭带。 4 ) 取爨肄洗i m i n ，在室滋中风予。 5 ) 用数码相机照相。 1 2 3 7 数据分析 邋转将a f l p 扩爝产物每个条精玛税为一令分子标记( m a r k e r ) ，代表一令 引物的结合位点。按凝胶同一位鼹上d n a 带的肖无进行统计，有带( 包括弱带) 的记为“l ”，无带的记为“0 ”的格式输入构成的a f l p 表型数据矩阵用予进 步弱分辑。 采用p o p g e n e 软件对全部稻群和各个单殿群分剐进行遗传参数分析 研：分 别计算了多态位点酉分率( p p b , p e r c e n t a g eo fp o l y m o r p h i eb a n d s ) 、联群总 遗传多样性( h t ，t o t a lg e n ed i v e l l s i t y ) 、鼹群内遗传多样性( 取g e n e d i v e r s i t yw i t h i np o p u l a t i o n ) 、各屠群闽的遗传分识指数( 国 ，c o e f f i c i e n t o fp o p u l a t i o nd i f f e r e n t i a t i o n ) 、基因流( t h el e v e lo fg e n ef l o w ) 、 n e i s 揍因多样性( 船) 和n e i s 遗传距离( d ，g e n e t i cd i s t a n c e ) 。s h a n n o n s 绥惑糖数( h o , s h a n n o n si n f o r m a t i o ni n d e x ) 逛毅矮聚硷溅饕体遗传多辑 趣| 川大学颐上学位论文 性水平。o = 一p i l 0 9 2p i ，p i 为第i 条带的表型频率。根据n e i s 遗传距 离，按不搁掇残对黪术平均法( u p g m a ) 建立祭绞聚类分棱樾状圈。 a m o v a ( a n a l y s i so fm o l e c u l a rv a r i g n c e ) 分析：利用a m o v a1 5 5 l “1 的 程序将i s s r 表型数据进行等级分子方差分析，等缴部分包括两个不同的屡次： 不同地区屠群闯( a f n o n gp o p u l a t i o n s ) 和同一地区居群内( w it h i np o p u l a r i o n s ) 懿遗传分亿。嚣著瞧稔溺采薅诗冀撬挨攒实验数攥1 0 0 0 次螽将所褥豹籁率分蠢 与原有数据进行比较来进行估计。 m a n t a l 相关性梭验：为了检测居群间遗传距离和地理距离的相关性，运用 n t s y s p c 款 孛 z 9 - 3 0 l 避嚣了m a n t a l 涎试君鞋主般分分捱。 2 结果与分析 2 1a f l p 条件优化 2 ，1 。1 添汪毒鑫基d n a 魏攫取 s d s 法和传统c t a b 法不适窟岷江柏d n a 提取，其氯仿抽提后样液颜色为深 褐色，且不能得到d n a 沉淀，本文对原c t a b 法进行了改良：在裂解液中加入 1 0m m o l ln a 2 s 。0 ；撬氧晓裁，餐裂的d n a 量多热浅，懿整l 。2 颠示，瑟爨取基 因组d n a 主带清新，d n a 片段大小在3 0k b 以上，无降解，无r n a ，样品间均 匀。紫外分光光度计测定结果a 2 6 8 0 值在1 8 2 0 之间范围内。 2 0 0 0 b p 豳1 2 ：改良o t a b 法提取娠江柏的总d n a 电泳检测 f i9 1 2 ：t h ee ie c t r o p h o r e s iso fg e n o m icd n ao f 盆c h e n g i a n ab ym o d l f l e d0 l a 8e x t r a c t l o f t 琶q 川火学颂：t 学位论文 2 1 2 时间对酶切效果的影响 为了确立逶台女蔑江獭d n a 麓酶鞠时闻与酶谣体系，设计了以“f 酶切时闯： 3 ，4 5 ，6 和7 5h 。如图l 。3 ，结果发现6 h 和7 j h 的酶切较为充分。3 h ，酶 切不完全，d n a 主带未消失：4 ，5 h ，部分酶切片断较大，酶切也不完全； 6 h 积7 。5 h ，酶切完全，片凝大小在1 0 0 0 b p 以下，符合a f l p 酶切的技术鼹求。考 虑到实验效率问题，我们采用了6 小时作为酶切时阙。 阂1 3 ：岷江柏d n a 双酶切电泳检测 1 q 分剐爨3 、4 5 、6 、7 5 h 酌酶甥效巢 f i 9