（茶学专业论文）茶叶γ氨基丁酸富集方法及其检测方法的研究.pdf

中文摘要 y 氨基丁酸( 又称4 氨基丁酸，? - a m i n o b u t y r i ea c i d ，简称g a b a ) 是一种非蛋白 质天然氨基酸，具有良好的保健功效。茶鲜叶具有g a b a 生物合成基础，是天然g a b a 的良好来源。目前，g a b a 在茶叶中的富集方法较为单一，成本相对较高，本研究以 茶鲜叶为材料，按普通烘青绿茶生产工艺，采用多种逆境处理方式研究富集g a b a 的方法，旨在探索新的g a b a 富集方式；并采用o d s c 1 8 色谱柱h p l c 法，利用2 、 4 二硝基氟苯( 2 ，4 d i n i t r o 1 f l u o r o b e n z e n e ，简称d n f b ) 柱前衍生，进行茶叶中的 g a b a 与l - 谷氨酸( l g l u t a m i ea c i d ，简称l g l u ) 的精确定量方法研究，为茶叶源 g a b a 的检测提供一种准确的、成本相对低廉的分析手段。 采用d n f b 柱前衍生，以o 0 5 m 乙酸钠缓冲液( p h = 6 5 ，含1 0 m l ln ，n 二甲 基甲酰胺) 和5 0 乙腈( v ) 为流动相，建立了茶叶源g a b a 和l g l u 的h p l c 检测方法，并与w a t e r s a c c q t a g 法进行了对比。同时考察了d n f b 试剂的用量，衍 生产物的稳定性及检测波长。结果表明：g a b a 与l g l u 浓度在0 0 3 m m 一- , 2 0 m m 范 围内，峰面积与浓度之间有良好的线性关系，相关系数r 2 均为1 ；各样品丫氨基丁 酸、l 谷氨酸含量r s d ( ) 分别为0 9 1 - - - 2 0 1 和o 9 4 1 9 l ，加标回收率分 别为9 5 8 2 - - 9 9 3 3 和9 5 8 3 - - - 9 9 8 8 ；1 0 m l l d n f b 乙腈溶液添加量l m l ；避 光保存一周内，衍生物稳定性良好；衍生物检测波长为3 6 0 n m 。 获得h p l c 色谱条件：s h i m a d z ul c 2 0 a d 液相色谱仪，l c s o l u t i o n 液相色谱工 作站；色谱柱：大连e l i t eh y p e r s i lo d s c 1 8 柱( 2 5 0 m i n x 4 6 m mi d ，5 1 m a ) ；流动相a ： 0 0 5 m 乙酸钠缓冲液( p h = 6 5 ，含1 0 m l ln ，n 二甲基甲酰胺) ：流动相b ：乙腈水 f v = 1 ：1 ) ：流速：1 0 m l m i n ；柱温：2 8 c ：进样量：5 此；检测波长：3 6 0 n m 。 采用充c 0 2 、充n 2 、真空、水浸渍、冷冻、紫外线照射等方式对茶鲜叶进行g a b a 富集处理，并以常规绿茶加工为对照，对处理过程中g a b a 和l g l u 的含量变化进行 考察。结果表明：常规的绿茶加工过程中，o a b a 含量介于0 0 4 m g g o 0 5 m g g ，g a b a 不会富集；c 0 2 厌氧处i ! g a b a 在茶鲜叶中富集，其含量从0 0 4 m g g 升至2 9 0 m g g ， 并g a b a 与l g l u 呈现出明显的消长关系，l g l u 含量从起始的1 5 7m g g 降至0 4 2 m g g ；充n 2 厌氧处理过程中，亦呈现出类似规律，g a b a 含量从0 0 4 m g g 升至2 4 3 m g g ， l - g i u 贝j j 从起始的1 5 7m g c g 降至o 4 3m g g ；真空度o 0 4 0 1 m p a 范围内，鲜叶q b g a b a 的富集并不明显，g a b a 含量峰值仅为0 4 7 m g g ，而l - g l u 在处理始末含量却有所增加； 水浸渍处理过程中，g a b a 与l g l u 也呈现消长关系，但不明显，g a b a 峰值仅为 0 8 1 m g g ，l o l u 最低值为1 2 2 m g g ；冷冻和紫外线照射处理均未能使得鲜叶中g a b a 的总量有所增加，l g l u 含量始末变化不大。 为了更好的明确逆境处理条件，本研究考察了光照条件对c 0 2 厌氧处理和水浸渍 处理的影响。结果发现：光照条件对不同逆境处理介质的影响不相同。光照处理g a b a 峰值分别比暗处理条件下高出0 6 8 m g g ( c 0 2 厌氧处理) 和o 5 2m g g ( 水浸渍处理) 。 c 0 2 厌氧处理光照条件下，g a b a 在厌氧处理阶段富集，在有氧阶段呈下降；水浸渍 处理光照条件下，g a b a 在有氧阶段富集，在水浸渍阶段下降。c 0 2 厌氧光照处理使 得l 。g l u 消耗的更多；水浸渍光照处理对l g l u 的变化趋势有影响，但l g l u 最终含量 在增加。 各处理g a b a 富集效果依次为：光照c 0 2 厌氧处理( 峰值2 9 0 m g g ) 、光照n 2 厌氧 处理( 峰值2 4 3 m g g ) 、遮光c 0 2 厌氧处理( 峰值2 2 2 m g g ) 、光照水浸渍处理( 峰值 1 3 3 r a g g ) 、遮光水浸渍处理( 峰值0 8 1 m g g ) 、真空处理( 峰值0 4 7 m g g ) 、冷冻处理 ( 峰值o 1l m g g ) 和紫外线照射处理( 峰值0 0 7 r a g g ) 。 通过分析检测、香气成分分析和感官审评，考察了富集g a b a 处理对茶样主要化 学成分和品质的影响。结果表明：咖啡碱和儿茶素总量与对照组相比，变化不大：对 照样茶多酚含量总体变化不大，充c 0 2 、充n 2 、真空、紫外线照射处理对茶多酚含量 影响不大，水浸渍处理使得茶多酚总量有所增加，含量达到了3 0 以上，冷冻处理过 程中，茶多酚总量减少了5 4 7 。除了冷冻处理含量基本不变，其余各处理氨基酸总 量均有不同程度的增加：对照组氨基酸总量增幅达2 7 8 ，紫外照射处理结果与对照 组相近，充c 0 2 、充n 2 也有1 3 4 - 1 6 5 的增幅，真空处理增幅达n 2 5 2 ，水浸泡 处理也有较小增幅。各处理可溶性糖呈现无规律变化。处理间香精油组分差异较明显， 主要香气物质种类和数量不尽一致，但同一处理介质( a 、b ，g 、h ) 间无明显差异。 茶样感官审评结果表明，g a b a 茶的加工方式对于成茶的品质有很大的影响，g a b a 的提高伴随着成茶品质的下降。 关键词：茶鲜叶，y 一氨基丁酸，富集处理，2 、4 - - 硝基氟苯，高效液相色谱法 l i a b s t r a c t 7 - a m i n o b u t y r i ca c i d ( r e f e r r e dt oa so 鼻d 3 a ) i san a t u r a ln o n p r o t e i na m i n oa c i dw h i c h h a sg o o dp e r f o r m a n c ea th e a l t hc a r e a n dt e al e a v e s ，w h i c hh a v eb i o s y n t h e s i sa b i l i t yo f g a b a ，a r en a t u r a ls o u l c eo fg a b a b u tt h e r ea r eo n l yf e we n r i c h i n gw a y so fg a b ai n t e al e a v e s ，a n dt h ec o s ti sh i g h t h i sw o r km a i n l yf o c u s e do nt h es t u d yo fg a b a e n r i c h i n g w a y si nt e al e a v e s ，a n dt h e np r o c e s s e dt h el e a v e st ob eb a k e dg r e e nt e a i no r d e rt o q u a n t i f yg a b aa n dl g l u t a m i ca c i d ( r e f e r r e dt oa sl g i u ) o ft e as a m p l e sp r e c i s e l y , a q u a n t i f i c a t i o nm e t h o do fg a b aa n dl g l ui nt e aw i t hh p l cw a se s t a b l i s h e d i nt h e m e t h o d ，t h eo d s c i 8c o l u m na n d2 , 4 一d i n i t r o - 1 一f l u o r o b e n z e n e ( r e f e r r e dt oa sd n f b ) p r e - c o l u m nd e r i v a t i z a t i o nw e r ei n v o l v e d c o m p a r e dw i t hw a t e r sa c c q t a g ，am e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fg a b aa n d l - g l ui nt e ab yu s i n gh p l cw a sd e v e l o p e d d n f bw a st a k e na st h ed e r i v a t i v er e a g e n t , w h i l e0 0 5 ms o d i u ma c e t a t eb u f f e r s o l u t i o n ( p h = 6 5 ， 、i n l10 m l l n ，n - d i m e t h y l f o r m a m i d e ) a n d5 0 a c e t o n i t r i l es o l u t i o n ( v v ) w e r eu s e da st h em o b i l e p h a s e a n dw ec o m p a r e dt h er e s u l t sw i t h 啊1 ef a c t o r ss u c ha sd e t e c t i o nw a v e l e n g t h , a m o u n to fd n f ba n ds t a b i l i t yo fd e r i v a t i v e da m i n oa c i d sw e r es t u d i e d r e s u l t ss h o w e d t h a tt h ep e a ka r e ao fg a b aa n dl - o l uh a dag o o dl i n e a rr e l a t i o n s h i pw i t ht h e i r c o n c e n t r a t i o n sr a n g ef r o mo 0 3 m mt o2 0 r a ma n dt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t sw e r eb o t h1 t h er s d ( ) o fg a b aa n dl g l ui ne a c hs a m p l ew e r e0 9 1 t o2 0 1 a n d0 9 4 t o 1 9 1 ，a n dt h er e c o v e r i e sw e r e9 5 8 2 t o9 9 3 3 a n d9 5 8 3 t o9 9 8 8 ，r e s p e c t i v e l y o t h e rr e s u l t sa r e ：t h ea d d i t i o nv o l u m eo fio m l ld n f bi na e e t o n i t r i l es o l u t i o nt ot e a i n f u s i o ni slm l ；p r e s e r v e di nd a r k ，w i t h i no n ew e e k ，d e f i v a f i v e da m i n oa c i d sh a dg o o d s t a b i l i t y ；t h ed e t e c t i o nw a v e l e n g t ho f d e r i v a t i v e si s3 6 0 n m 刃 eo p t i m a lh p l cc h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n sa r ea sf o l l o w s ：s h i m a d z u l c 2 0 a dh p l cw i t hl c s o l u t i o nw o r k s t a t i o n ；d a l i a ne l i t eh y p e r s i lo d s - c l sc o l u m n ( 2 5 0 m mx4 6 m mi d ，5 0 m ) ；m o b i l ep h a s ea i s0 0 5 ms o d i u ma c e t a t eb u f f e r ( p h = 6 5 ， c o n t a i n i n g 10 m l ln ，n - d i m e t h y l f o r m a m i d e ) ；m o b i l ep h a s ebi sa c e t o n i t r i l e w a t e r ( v = 1 ：1 ) ；f l o wr a t ei s1 0m l m i n ；c o l u m nt e m p e r a t u r e ：2 8 ；i n j e c t i o nv o l u m ei s5 p l ； d e t e c t i o nw a v e l e n g t hi s3 6 0 n m t h ee n r i c h m e n to fg a b ai nt e al e a v e sw a sc o n d u c t e db yt h et r e a t m e n t so fc 0 2 ，n 2 ， v a c u u m , w a t e rs o a k i n g ，f r e e z i n ga n du v - i r r a d i a t i o n , r e s p e c t i v e l y mc o n v e n t i o n a l p r o c e s s i n go fg r e e nt e aw a st a k e na sc o n t r o lt om o n i t o rt h ec h a n g e so fg a b aa n dl - g l u c o n t e n t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tg a b a w a sl e s se n r i c h e da n di t sc o n t e n tw a si nr a n g eo f i o 0 4m g g - 0 0 5m e g gd u r i n gt h ec o n v e m i o n a lg r e e nt e ap r o c e s s i n g g a b aw a se n r i c h e d i nt h ef r e s ht e al e a v e st r e a t e db yc 0 2a n di t sc o n t e n tw a si n c r e a s e df r o m0 0 4m g 儋t o2 9 0 m g g l g l uc o n t e n tw a sd e c l i n e df r o m1 5 7m e g gt oo 4 2m g gi nt h ef r e s ht e al e a v e s t r e a t e db yc 0 2a n ds h o w e dac l e a rr e l a t i o no fg r o w t ha n dd e c l i n ew i t hg a b a as i m i l a r r e s u l tw a sd e t e c t e di nt h ea n a e r o b i ct r e a t m e n tb yn 2 g a b ac o n t e n tw a si n c r e a s e df r o m 0 0 9m g gu pt o2 4 3m e g ga n dl - o l uc o n t e n tw a sd e c l i n e df r o m1 5 7m g gt oo 4 3m g 儋 t h ee n r i c h m e n to fg a b aw a sn o ta p p a r e n td u r i n gt h ev a c u u i nr a n g eo f0 0 4 0 1 m p a , i t s c o n t e n ti so n l yo 4 7m g ga tt h ep e a ka n dl g l uh a dal i t t l ei n c r e a s ei n t h ew h o l e p r o c e s s i n g t h ec o n t e n t so fg a b a a n dl g l ua l s os h o w e dar e l a t i o n s h i po fi n c r e a s ea n d d e c l i n e ，a l t h o u g hn o to b v i o u s l yi nt h ew a t e rs o a k i n gp r o c e s s g a b ac o n t e n tw a so 8 1 m g g a tt h ep e a l 【w h i l el g l uc o n t e n tw a s1 2 2m e g ga tt h eb o t t o m t h ef r e e z i n ga n d u v 二i r r a d i a t i o nt r e a t m e n td i dn o ti n c r e a s e dt h et c i t a lg a b ac o n t e n ti nf r e s ht e al e a v e sa n d d i dn o tc h a n g e dt h el - g l uc o n t e n te i t h e r i no r d e rt ou n d e r s t a n dt h ee f f e c to ft h ea d v e r s ee n v i r o n m e n tb e t t e r ，w ei n v e s t i g a t e d t h ei m p a c to fl i g h tc o n d i t i o n so nc 0 2a n dw a t e ri m p r e g n a t i o nt r e a t m e n t t h er e s u l t s s h o w e dt h a tl i g h tc o n d i t i o n sh a dd i f f e r e n ti m p a c t so nd i f f e r e n ta d v e r s ee n v i r o n m e n t s t h e g a b ac o n t e n tw a si n c r e a s e db yo 6 8m e g g ( i nc 0 2a n a e r o b i ct r e a t m e n t ) a n do 5 2m g 儋( i n w a t e rs o a k i n gt r e a t m e n t ) c o m p a r e d 、j l ，i n ld a r kc o n d i t i o n s i nt h ec 0 2a n a e r o b i ct r e a t m e n t u n d e rl i g h tc o n d i t i o n s ，g a b aw a sc o n c e n t r a t e di nt h ea n a e r o b i ct r e a t m e n ts t a g ea n d d e c r e a s i n gi nt h ea e r o b i cp h a s e ；i nt h ew a t e rs o a k i n gt r e a t m e n tu n d e rl i g h tc o n d i t i o n s ， g a b aw a sc o n c e n t r a t e di nt h ea e r o b i cs t a g ea n dd e c r e a s i n gi nt h ew a t e rs o a k i n gp h a s e l g l uw a sc o n s u m e d m o r ei nt h ei l l u m i n a t i o nc 0 2a n a e r o b i ct r e a t m e n ta n di t sc o n t e n tw a s a l s oi n f l u e n c e di nt h ew a t e ri m p r e g n a t i o n 、) i ，i t l ll i g h tt r e a t m e n t ，b u tt h ef i n a lc o n t e n to f l g l uw a so nt h er i s e t h ee f f e c to ft h et r e a t m e n t si ng a b ae n r i c h i n ga sf o l l o w s ：a n a e r o b i ct r e a t m e n tb y c 0 2u n d e rl i g h t ( p e a ka t2 9 0 m g g ) ，a n a e r o b i ct r e a t m e n tb yn 2u n d e rl i g h t ( p e a ka t 2 4 3 m g g ) ，a n a e r o b i ct r e a t m e n tb yc 0 2u n d e rs h a d i n gl i g h t ( p e a ka t2 2 2 m g g ) ，w a t e r s o a k i n gu n d e rl i g h t ( p e a ka t1 3 3 r a g g ) ，w a t e rs o a k i n gu n d e rs h a d i n gl i g h t ( p e a ka t o 8 1 m g g ) ，v a c u u mp r o c e s s i n g ( p e a ka t0 4 7 m g g ) ，f r o z e n ( p e a k a t0 1 l m g g ) a n d u v 二i r r a d i a t i o nt r e a t m e n t ( p e a ka t0 0 7 m g g ) 1 1 ：l i sp a p e re x p l o r e dt h ei m p a c to fg a b ae n r i c h i n gp r o c e s s i n go nt h eq u a l i t ya n d c h e m i c a lc o m p o s i t i o no ft e as a m p l e sb ya n a l y z i n gt h ec o m p o n e n t so fa r o m a , a n ds e n s o r y e v a l u a t i o n t h er e s u l t ss h o wt h a tt o t a la m o u n to fc a f f e i n ea n dc a t e c h i n sh a v el i t t l e d i f f e r e n c ec o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p ；t h et o t a la m o u n to ft e ap o l y p h e n o l sh a sn o o b v i o u sc h a n g ew i t h i nt h ec o n t r o lg r o u p ，a d d e dt r e a t m e n t ss u c ha sf i l l i n gc 0 2 ，c h a r g i n g n 2 ，v a c u u ma n du v - i r r a d i a t i o np r o c e s s i n gt ot e as a m p l e sh a v el i t t l ee f f e c to na m o u n t so f t e ap o l y p h e n o l s b u tw a t e rs o a k i n gm a k e sa ni n c r e a s ei nt o t a lp o l y p h e n o l sc o n t e n t ( m o r e t h a n3 0 ) a tt h es a m et i m e ，t h ea m o u n to ft e ap o l y p h e n o l sr e d u c e d5 4 7 a f t e r r e f r i g e r a t i o np r o c e s s t h ei n t e r v e n t i o nm e a s u r e sm e n t i o n e da b o v em a k et h et o t a la m o u n t o fa m i n oa c i df o rt e as a m p l e si n c r e a s i n gt os o m ee x t e n te x c e p tr e f r i g e r a t i o np r o c e s sw i m l i t t l ec h a n g e ，f o re x a m p l e ，t o t a la m o u n to fa m i n oa c i dw i t ht h ei n c r e a s eo f2 7 8 i nt h e c o n t r o lg r o u pa n dw i t hs i m i l a ri n c r e a s ei nu v - i r r a d i a t i o n ，w i t hg r o w t ho f1 3 4 0 0 1 6 5 b y f i l l i n gc 0 2a n dc h a r g i n gn 2 2 5 2 i n c r e a s ea f t e rv a c u u mp r o c e s s ，b yc o m p a r i s o n ，w a t e r s o a k i n gm a k e si n c r e a s eal i t t l e m e a s u r e sa b o v et ow a t e r - s o l u b l es u g a rd i dn o ts h o wa n y r e g u l a rc h a n g e i nt h ep r o c e s s i n go fe a c hi n t e r v e n t i o nm e a s u r e s ，c o m p o n e n t so ft h e o lh a v e o b v i o u sd i f f e r e n c e s ，b e c a u s et h em a i nt y p ea n dq u a n t i t yo ff r a g r a n c em a t e r i a la r en o t c o n s i s t e n t ，w h i c hd on o ts h o wa n yd i f f e r e n c ei nt h es a m em e a s u r e si n t e r v e n e d ( a 、b ，g 、 i - i ) s e n s o r ye v a l u a t i o no ft h et e as a m p l e ss h o w st h a tg a b a t e ap r o c e s s i n gm e t h o dh a sa g r e a ti m p a c to nq u a l i t yo ft h et e a , e s p e c i a l l y , m a k i n gt h eq u a l i t yo f t e ad e c l i n e d k e yw o r d s ：t e al e a v e s ，7 - a m i n o b u t y r i ca c i d , e n r i c h i n g ，2 , 4 - d i n i t r o 一1 - f l u o r o b e n z e n e ， h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：时间：年月 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 时间： 年 月日 时间： 年月 e t 1 文献综述 1 1y 氨基丁酸概述 p 氨基丁酸( 又称4 氨基丁酸，y - a m i n o b u t y r i ea c i d ，简称g a b a ) 是由l 谷氨酸 ( l g l u t a m i ca c i d ，简称l g l u ) 脱羧生成的一种非蛋白质天然氨基酸，它是哺乳动物 中枢神经系统非常有效的抑制性神经递质，参与脑循环生理活动【l 】，对人体具有抗心 律失常等多种生理功能。作为药品，g a b a 临床上可用于改善大脑血液循环、增加氧 气供给、改善大脑细胞代谢。此外，g a b a 还有助于治疗和缓解因脑中风、头部外伤 和脑动脉硬化后遗症等产生的诸如头疼、耳鸣和意识模糊等病症【2 捌。据报导f 4 】，g a b a 在改善内脏( 肝、肾) 功能、抑制自律神经失调、治疗因脑内缺少g a b a 所引起精 神焦虑不安以及治疗初期老年痴呆症等具有一定的功效。g a b a 对降低血压有直接的 作用，它可以通过扩张血管，维持血管的正常功能，从而使血压下降。另外，g a b a 还具有促进酒精代谢、改善高脂血症、预防肥胖和消除体臭的作用。事实上，几乎所 有植物组织中都存在g a b a 5 1 。在厌氧条件下，g a b a 能在植物 6 - 9 1 、藻类【1 0 】和哺乳 动物脑组织【l l 】中富集。植物中g a b a 的富集，已经被证实可以在许多胁迫条件下完 成，比如，厌氧【1 2 1 、胞液p h 值下降【5 1 、冷应力【1 3 1 、热应力【1 4 】等。 1 1 1 结构、性质7 g a b a 分子式为c 4 h g n 0 2 ，结构式如图1 1 所示。相对分子量1 0 3 1 2 ，在2 5 时 h 2 n 1 0 h 0 圈1 - 1g a b a 结构图 f i g 1 - 1m o l e c u l a rs t r u c t u r e o f g a b a n h 2 o o0 h 型坚h 旷佣 u 图1 - 2l g l u 脱羧反应 f i g 1 - 2d e c a r b o x y l i cr e a c t i o no f l g l u 解离常数k a = 3 7 x 1 0 。1 l ，k b = 1 7 x 1 0 1 0 。g a b a 常规条件下是白色结晶或结晶性粉末， 易溶于水，p h6 5 7 5 ，微溶于热乙醇，不溶于其他有机溶剂。熔点1 9 7 c 2 0 4 c ， 在熔点温度以上分解形成毗咯烷酮和水。生物体中，g a b a 是谷氨酸在谷氨酸脱羧酶 ( g a d ，e c 4 1 1 1 5 ) 的作用下脱羧的产物( 图1 2 ) 。 1 1 2 高等植物中g a b a 的代谢机理 1 1 2 1 生物体中的g a b a 支路 ( 1 ) g a b a 支路的发现 高等植物中g a b a 的合成代谢主要来自l g l u 的脱羧反应，这一反应由g a d 催化。 g a d 是一种吡哆醛类裂解酶，能专一的催化l g l u 进行a 脱羧反应，生成g a b a 和c 0 2 。 近年来，富含g a b a 的食品具有较高的保健和医疗功能，g a d 也成为研究的热点。已 经有高产g a b a 的乳酸菌的报导，表明其有较高的g a d 活性【”】。在植物中，g a d 活 力的高低已用来衡量种子的发芽能力和出苗率等【1 6 1 。n a y l o r 与t o l b e r t 1 7 】首先于1 9 5 6 年推测高等植物中存在g a b a 支路，这一推测于1 9 6 1 年被d i x o n 和f o w d e n 1 8 】的实验所 证实。他们的研究发现，用【1 4 c 标记的g a b a 孵育豌豆叶盘和花生线粒体，1 0 r a i n 后 标记物出现在天冬氨酸、丙氨酸和谷氨酸中，6 h 后进入到三羧酸循环的中间体，l o h 后有近一半的1 4 c 以1 4 c 0 2 的形式释放出来。1 9 7 2 年，s t r e e t e r 和t h o m p s o n t 9 1 9 】在给萝卜 叶片喷施 1 4 c 】标记的l g l u 后，叶片内有大量【1 4 c g a b a 形成。随后，t o k u n a g a 等 2 0 1 向大豆愈伤组织培养基中加入 m c 】标记的g a b a ，2 4 h 后也有近一半的标记物以 1 4 c 0 2 形式释放出来。此外，在茶叶上，t s u s h i d a 和m u r m 1 2 】给茶叶喷施5 0 i i l 】m 【1 n 标 记的l g l u ，并在厌氧条件下培育6 h 后，茶叶中有大量 1 砷g a b a 生成。这些实验证 明植物体内有g a b a 支路存在和g a b a 来源于l g l u 的脱羧。 ( 2 ) g a b a 支路的构成 g a b a 支路的存在已经得到证实。在细菌和哺乳动物大脑中，g a b a 首先在g a b a 转氨酶( g a b at r a n s a m i n a s e ，g a b a t ，e c 2 6 1 1 9 ) 的催化下和a 酮戊二酸发生转氨作 用，生成琥珀酸半醛和l g l u ，然后琥珀酸半醛在琥珀酸半醛脱氢酶( s u c c i n i c s e m i a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ，s s a d h ，e c l 2 1 1 6 ) 的作用下，氧化成琥珀酸进入三羧酸 循环。上述这些反应和g a d 催化l g l u 脱羧的反应一起构成0 【酮戊二酸转化为琥珀酸 的支路，称之为g a b a 支路( 图1 3 ) 。该支路中有3 种酶存在：g a d 、g a b a 翻铂s s a d h 【2 1 1 。其中，g a b a t 是以g a b a - 丙酮酸转氨酶和g a b a 0 【酮戊二酸转氨酶2 种形成存 在的【1 9 1 ，两者最适p h 均为8 9 ；s s a d h 以n a d 为辅酶，能将s s a 催化氧化为琥珀酸， 最适p h i9 0 9 5 1 2 2 1 。 1 1 2 2g a b a 在高等植物中的逆境富集机理 ( 1 ) c e + c a m 水平调控 植物中g a b a 富集与 其所处的逆境条件下的应 激反应有关。大量研究表 明，g a d 是g a d 3 a 唯一来 源酶，l g l u 是它的直接作 用底物。植物源g a d 在其 羧基端有一个钙调蛋白 ( c a m ) 结合部位，受c a z + 水平调控，目前只在植物 源g a d q 丁发现该部位【捌。 夭冬蠢鼍 革哦乙t c o , 图1 3g a b a 支路与其他代谢途径的关系f 2 5 l f i g 1 3t h eg a b as h u n ta n di t sr e l a t i o n s h i pt oo t h e rm e t a b o l i cp a t h w a y s 2 b a u m 等【2 4 】认为矮牵牛g a d 是一个c a m 结合蛋白。体外实验表明：矮牵牛g a d 重组体 可以很容易的通过其羧基端与矮牵牛或者哺乳动物的c a m 结合，但是单一的c a 2 + 并不 能激活该酶。s n e d d e n 等【2 5 l 用不含c a m 的矮牵牛g a d 重组体进行实验时发现，在p h 7 o 、无c a 2 + 或c a m 的条件下，纯化的分子量为5 8 k d 的g a d 没有活性，但加入 c a m ( k o s = i s m m ) 和c a 2 + ( 硒5 = o 8 m m ) 可以激活该酶。同时，s n e d d e n 等t 2 6 1 发现，大豆 g a d 的最适p h 为5 8 ，此时，加入c a 2 + 和c a m 均不能增加g a d 的活性；在p h 7 0 时，其 活性仅为p h 5 8 的1 2 ，然而，在加入5 0 0 p m c a 2 + 和2 0 0 “m c 洲后，不同大豆植株组织 来源的g a d 活性均可增加2 8 倍，但这种激活作用被c a m 的拮抗剂( w 7 ，t r i f l u o p e r a z i n e ) 所抑制，这证明t c a 2 + c a m 可以激活大豆g a d 。l i n g 等 2 7 】的实验也表明，同时加入 c a 2 + 和c a m ，大豆中部分纯化的g a d 的的活性可以得到大幅提高。 a u r i s a n o 等【2 s 】发现，在有氧条件下，, 用c a 2 + 通道的阻遏剂( r rv e r a p a m i ) 以及c a m 的拮抗体( w 7 ，t r i f l u o p e r a z i n e ) 预处理水稻根l h 后，再厌氧处理3 h ，结果呈现g a b a 的富集受到抑制，而c a 2 + 载体( a 2 3 1 8 7 ) 可以解除这种抑制。c h o l e w a 等 2 9 】的实验表明， 冷胁迫诱导芦笋叶肉细胞合成g a b a 是细胞质中c a 2 + 浓度上升所致，并不是细胞质p h 值下降的缘故。荧光指示剂显示冷胁迫2 s 就可以使细胞质中c a - + 浓度上升，l m l n 就能 检测到g a b a 的富集。c a 2 + 浓度增加先于g a j 3 a 的富集。冷胁迫条件下，c a 2 + 通道的 阻遏剂( l a 3 + ) 和c a m 的拮抗体( w 7 ) 能阻止该条件诱导的g a b a 富集。不进行冷胁迫处 理，c a 2 + 载体( a 2 3 1 8 7 ) 同样能使细胞质中c a 2 + 浓度增加，富集g a b a 。这一证据表明， 植物体内的c a 2 + c a m 能够调节g a d 活性。另有报道指出，机械刺激和低温处