（野生动植物保护与利用专业论文）西洋参果皂苷成分研究.pdf

捅要 本文利用常压、中压、s e p h a d e xl h 2 0 凝胶、高速逆流色谱等手段，对西洋 参( p a n a xq u e n q u i f o l i u ml ) 果的皂苷成分进行了分离及结构鉴定研究。为西洋 参非药用资源的高效开发及可持续利用提供理论及方法学参考。主要进展如下： 1 首次应用高速逆流色谱( h s c c c ) 对西洋参果中人参皂苷r e 和r g l 进行了制 备性分离。以乙酸乙酯正丁醇水( 4 ：1 ：7 ) 为溶剂系统，转速8 10 r m i n ，流速 2 m l m i n ， r e 和r g l 保留时间分别为1 4 0 , - - - 1 6 5 和1 9 5 2 2 8 m i n ，经h p l c 检测， 纯度分别达9 8 5 5 和9 8 4 2 。 2 采用( 常压、中压) 柱色谱对西洋参果提取物过大孔吸附树脂的3 5 、5 0 乙醇洗脱部分进行层析分离，得到七个化合物a 1 、a 2 、a 3 、a 4 、a 5 、a 6 、a 7 ， 经理化和有机波谱鉴定，确定7 个化合物分别为：2 0 ( s ) 人参皂苷r h 2 ( 2 0 ( s ) g i n s e n o s i d e - r h 2 ) 、人参皂苷r e ( g i n s e n o s i d e r e ) 、人参皂苷r c ( g i n s e n o s i d e r c ) 、 人参皂苷r b 2 ( g i n s e n o s i d e r b 2 ) 、人参皂营r d ( g i n s e n o s i d e r d ) 、人参皂苷r b l ( g i n s e n o s i d e r b1 ) 、人参皂苷r g l ( g i n s e n o s i d e r 9 1 ) 。 3 通过氧化镁和活性炭以及氧化镁加入量、加热温度和加热时间三因素对西 洋参果脱色效果的研究，表明氧化镁更适合西洋参果浸膏的脱色，初步确定加入 3 倍量氧化镁较为适宜，而加热时间和加热温度影响很小。 本文创新点： 1 首次采用中压柱层析色谱技术对西洋参果皂苷成分进行制备性分离研究， 并建立二氯甲烷甲醇中压梯度洗脱模式。 2 。首次采用h s c c c 分离制备西洋参果人参皂苷r e 和r g l 。 关键词：西洋参果，人参皂苷，h s c c c t h i ss t u d yr e s e a r c h e do nt h e a m e r i c a ng i n s e n gb e r r yj u i c e ( a a b s t r a c t s e p a r a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fs a p o n i n sf r o m g b j ) t h es e l e c t e dm a c r o p o r o u sr e s i n s ，o r d i n a r y a n dm i d d l e - p r e s s u r e c h r o m a t o g r a p h y ，s e p h a d e xl h 2 0a n dh s c c ct e c h n i q u e s w e r eu s e do nt h ei s o l a t i o no fe x t r a c ta f t e rt h ed e c o l o r i z a t i o n t h er e s e a r c hl a i da t h e o r e t i c a la n d m e t h o d o l o g i c a lf o u n d a t i o nf o re f f e c t i v ee x p l o i t a t i o na n d s u s t a i n a b l eu t i l i z a t i o no fa g b j t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： i g i n s e n o s i d er ea n dr g a w e r es e p a r a t e df r o ma g b jb yh s c c cf o rt h e f i r s tt i m e w i t h a c e t o a c e t a t e n b u t a n 0 1 w a t e r ( 4 ：1 ：7 ) a st h es o l v e n ts y s t e m t h ef l o w r a t ei s2 0m l m i na n d r o t a t e r a t ei s810r r a i n t h er e t e n t i o n t i m eo fr ea n d r g tw e r e1 4 0 1 6 5a n d1 9 5 2 2 8 m i n ，r e s p e c t i v e l y t h eh p l cc h r o m a t o g r a mw i t hu va t2 0 3 r i ms h o w e dt h a t t h ep u r i t yo fg i n s e n o s i d er ea n dr g iw e r e a b o v e9 8 5 5 a n d9 8 ，4 2 2 t h es a p o n i n si na g b jw e r ei s o l a t e da n dp r e p a r e db ym a c r o p o r o u sr e s i n sa n dc h r o m a t o g r a p h yu n d e r o r d i n a r ya n dm i d d l e p r e s s u r e t h ee x t r a c t s w i t h i n3 5 a n d5 0 e t h a n o lp a r t o f m a c r o p o r o u sr e s i n s w e r ei s o l a t e d b y o r d i n a r ya n dm i d d l e p r e s s u r ec h r o m a t o g f a p h y s e v e nc o n s t i t u e n t sw e r eg a i n e da n di d e n t i f i e da s 2 0 ( s ) 一g i n s e n o s i d er h 2 ，g i n s e n o s i d er e ，g i n s e n o s i d er e ， g i n s e n o s i d er b 2 ，g i n s e n o s i d er d ，g i n s e n o s i d er b l ，a n dg i n s e n o s i d e r 9 1 b yp h y s i c a l - c h e m i c a la n do r g a n i cs p e c t r o s c o p y 3 t h ee f f e c t so fm g oa n da c t i v a t e dc a r b o no nd e c o l o r i z a t i o n o fa g b jw e r ea l s os t u d i e db y c h a n g i n ga m o u n to f m g o ，h e a t i n gt e m p e r a t u r ea n d h e a t i n g t i m e w ec o n c l u d e dt h a tm g ow a ss u i t a b l ef o r t h e d e c o l o r i z a t i o n o f a g b ja n dm g os h o u l db e3t i m e so fa g b je x t r a c td r y w e i g h t t h eh e a t i n gt e m p e r a t u r ea n dh e a t i n gt i m eh a dl i t t l ei n f l u e n c eo nl o s so fs a p o n i n s t h el n n o v a t i o n so ft h i s s t u d y ： 1 i ti st h ef i r s tt i m et h a tm i d d l e - p r e s s u r e c h r o m a t o g r a p h yw a su s e d t or e s e a r c hc o n s t i t u e n t so fa g b ja n dt h e g r a d i e n te l u t i o nm o d eo fd i c h l o r o m e t h a n e m e t h a n o lb ym i d d l e p r e s s u r ec h r o m a t o g r a p h yw a ss e tu p 2 h i g h s p e e dc o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h yw a su s e df i r s tt i m et os e p a r a t ea n d p r e p a r eg i n s e n o s i d er ea n dr g li na g b j k e yw o r d s ：a m e r i c a ng i n s e n g ，b e r r yj u i c e ，s a p o n i n s ，h s c c c n 英文缩略表 英文缩写英文全称中文名称 s f e m a e s b e h s c c c h p l c u v n m r m s g c t l c h p c e s u p e r c r i t ic a lf l u i de x t r a c t i o n m i c r o w a v e a s s is t e de x t r a c t i o n s e m i b i o i l i ce x t r a c t i o nm e t h o d 超临界流体萃取 微波提取 半仿生提取法 h i g hs p e e dc o u n t c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y高速逆流色谱 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y高效液相色谱 u l t r av i o l e t n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c es p e c t r o m e t e r m a s ss p e c t r o m e t e r g a sc h r o m a t o g r a p h y t h i n 一1 a y e rc h r o m a t o g r a p h y 紫外光谱法 核磁共振法 质谱法 气相色谱法 薄层色谱 h i g h p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s高效毛细管电泳法 is u fu i t r af i l t r a t i o n 超滤技术 v 独创性l 声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国 农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示 了谢意。 研究生签名：王蕾 时间： 2 d o 矿年6 月f7 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即： 中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同 意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的 全部或部分内容。 研究生签名：互彗 铷躲啮 时间：矽。扩年舌月77 日 时间：2 口口罗年多月1 7 日 中国农、出科学院硕 二学位论文 第一章弓l 言 ! 曼! 皇曼! 曼曼! 曼! ! 曼曼! 曼曼曼曼! 皇i i 曼曼蔓! 曼 第一章引言 西洋参( p a n a xq u e n q u i f o l i u ml ) 又名西洋人参、洋参、花旗参、广东人 参，为五加科人参属植物。主产于美国、加拿大及法国。西洋参味苦，性凉，入 心、脯、肾经，功能以补益为主，可滋阴降火，益气生津。西洋参皂苷类成分共 分离鉴定出4 9 种，其中：达玛烷型皂苷3 2 种，新近发现的人参皂营f l ；齐墩果 酸型皂苷3 种；奥克梯隆醇型皂苷2 种；其它类皂苷成分12 种，新发现的人参皂 苷r 9 6 和r 9 8 ；西洋参中还含有脂肪酸类、聚炔类、糖类、氢基酸类、甾醇类、 黄酮类、无机元素类及挥发油类等活性成分。西洋参除传统的药理活性外，最新 药理实验证明，西洋参果特别具有清除自由基的功能，而产生抗氧化作用；并在 抗肿瘤、降糖降血压、止吐及保护神经等方面具有良好的功效。 1 1 西洋参化学成分研究进展 1 。1 1 皂苷类成分 皂苷类成分根据其母体结构主要分为3 类：达玛烷型( d a m m a r a n e ) ，齐墩果酸 型( o l e a n a n e ) ，奥克梯隆醇型( o c o t i l l 0 1 ) ，目前已分离出4 9 种，包括新发现的人参 皂营f 1 、r 9 6 和r 9 8 。见表卜l 。 1 1 2 糖类 从西洋参中分离出5 种具有降血糖活性的多糖，k a r u s a na 、b 、c 、d 和e ； 从茎叶中分离出一种酸性杂多糖和一种中性多糖，分别为p a n a x a n sl - 1 ( p l 1 ) 和p a n a x a n sn ( p n ) 。单糖类有葡萄糖、果糖和山梨糖：低聚糖类有人参三糖、麦芽糖 和蔗糖，总含量为2 2 9 3 4 7 ；总糖( 包括淀粉、果胶、单糖和低聚糖) 含量 为6 5 2 7 7 3 9 8 。 1 1 3 氨基酸类 从西洋参中分离出特殊的氨基酸三七素，是三七中的主要活血成分；张甲生 等测定了西洋参果汁含有1 6 种以上氨基酸，其中1 0 种为人体必须、半必须的氨基 酸，含量分别占总氨基酸含量1 3 和1 2 。李向高等从西洋参果中分离鉴定出色氨 酸( t r y p r o p h a n e ) ，丁之恩等( 1 9 9 9 ) 从西洋参果实中分析出7 种人体必需游离氨 基酸。 1 1 4 脂肪酸类 从西洋参根中鉴定出10 种，西洋参及加工品中脂肪酸类化合物已鉴定出i5 种，分别是己酸、庚酸、辛酸、壬酸、8 甲基癸酸、十四碳酸、1 2 甲基十四碳酸、 中罔农、i p 科学院硕l ：学位论文 第一章引言 十五碳酸、十六碳酸、十七碳酸、十八碳酸、十八碳烯酸、9 ，1 2 十八碳二烯酸、 9 ，1 2 ，15 一十八碳三烯酸及棕榈酸；从西洋参叶中鉴定出4 种；西洋参种子油中鉴 定出9 种；西洋参果中鉴定了3 个脂肪酸酯组分及油酸糖苷。 表l - 1 西洋参不同部位的人参皂苷 t a b 1 - lg i n s c n o s i d e si n p q u i n q u e f o l i u ml 2 0 ( s 一 m r b l ，m r k ，m - r c ， 原人参二 m r d ，r b - ，r b 2 ，r b 3 ， 醇型 r c ，r d ，r 9 3 ，r g l ，q - r 蔫 r a o , f w 2 , 盘批 烷 2 0 ( r ) 型 原人参二一 醇型 2 0 ( s ) 原人参三 醇型 2 0 ( r ) 原人参三 醇型 r c ，r g j ，f i ， r 9 2 ，r h l r o ，q r 3 ，q - r 4 r b l ，g b 2 ，r b 3 ，r c ，m r b l ，r b l ，r b l ，r b 2 ， l ，f 2 ，r g l ，r h 3 ，r 9 3 ，g g t ，r b 3 ，r c ， q r i ，r a o ， r b 2 ，g b 3 ， r d m a j o r o s i d c - f 1 ， r c ，r d ， o y 1 x ，g y x ， q - f l q l l ，l 2 ，l 3 r e ，r g l r r ，r h l p f 1 1 p - f 1 1 ，p - r t 5 r g e ，r g s ，q i v ，2 4 ( r ) l i n a r i o n o s i d ea 假人参皂苷r t 5 ，2 4 ( r ) 一假人参皂苷f 1 l r b l ， r b 2 ， r b 3 ，r c ， r d ，r 9 3 r 9 3 ，r g l ，一r 9 3 r e ，g g l ， r 9 2 r 9 2 ，r h l r e ，p g j ， r 9 2 ，r h l r or o r e ，r g l r 9 2 p f l l 口d 吡喃木拟人参皂 - 糖基( 1 - 6 ) 一苷f l l 口，1 3 - 毗喃葡 萄糖基f 1 6 ) - 卢一阻吡喃葡 萄糖苷，人参 皂苷r a 。，拟 人参皂苷r t s ，西洋参皂苷 f 1 ，胡萝1 - 苷 1 1 5 聚炔类 这类化合物具有挥发性，有很强的抗白血病细胞( l 1 2 i o ) 的细胞毒活性。f u j 2 齐醇果酸型 奥克梯隆醇型 其它 中国农、毗 ： 学院硕_ i 学化论文第。章弓l 言 i m o t oy a s u o 等( 19 9 1 ) 从西洋参根中分离出3 种新的细胞毒聚乙炔：1 0 甲氧1 - 烯4 ，6 二炔3 ，9 二醇；十七烷1 烯9 ，l0 环氧4 ，6 二炔3 ，8 一二醇；3 氧 代9 ，1 0 。环氧十七烷1 烯一4 ，6 二炔( 3 氧代人参烷) 。f u j i m o t oy a s u o 等( 1 9 9 2 ) 从西洋参干燥根中分离出2 种新的c l7 多炔和1 种c 1 4 多炔：c h 2 = c h c 一( c 兰c ) 2 一c h 2 一c h = c h ( c h 2 ) 6 c h 3 ；c h 2 = c h - c h 一( c 蓍c ) 2 - c h = c h - c h = c h ( c h 2 ) 6 c h 3 ；h c 兰c - c 兰c c h 2 c h = c h ( c h 2 ) 5 c h = c h 2 。19 9 4 年， 该作者又从西洋参根中分离出两种新的细胞毒聚乙炔：h o c h 2 c h 2 c o ( c 三c ) 2 c h 2 c h = c h ( c h 2 ) 6 c h 3 。m s a t o h 等( 19 9 7 ) 从西洋参中分离得到c 1 4 聚乙炔， 其绝对构型被证实为( 6 r ，7 s ) - 6 ，7 一e p o x y t e - t r a d e c a 1 ，3 一d i y n e 。 1 1 6 挥发油 沈宁等( 19 9 1 ) 从吉林栽培的西洋参中鉴定出3 7 种化合物，并测定了各成分 的相对含量，其中倍半萜类化合物有2 6 种，约占总挥发油7 5 ，为西洋参中挥发 物的主要成分。孟祥颖等( 2 0 0 1 ) 从西洋参花蕾中分离鉴定了3 9 种化合物；郑友 兰等( 19 9 3 ) 从话洋参中分离鉴定了4 2 种化合物。 1 1 7 甾醇类 现已从西洋参根和茎中分离得到胡萝卜苷( d a u c o s t e r 0 1 ) ；从根中亦得到豆 甾烯醇( s t i g m a s t e n 0 1 ) 和豆甾一3 ，5 一二烯一7 一酮( s t i g m a s t 一3 ，5 一d i e n 一7 o n e ) 。 从西洋参果中鉴定出豆甾5 烯醇( s t i g m a s t 5 - e n 3 - o l ，c 2 9 h 5 0 0 ) 。 1 1 8 黄酮类 西洋参中的黄酮类化合物亦有报道。从西洋参叶中分离2 种黄酮单体。孟祥 颖等( 2 0 0 2 ) 首次发现根和果中黄酮的存在。 1 1 9 其它成分 西洋参不同部位含有lo 2 4 种无机元素。此外，还有维生素a 、b 、b 2 、b 6 以及酶，活性多酚类如咖啡酸和氯原酸等成分。 1 2 西洋参药理活性研究进展 西洋参具有中枢神经系统抑制作用；抗缺氧作用，抗疲劳作用，抗应激作用， 保护肝损伤功能作用，抗高血脂作用，降血脂作用，抗利尿作用，具有增强免疫 作用，止血作用和抗血栓作用，西洋参皂苷对动脉粥样硬化有防治作用。除此之 外，近几年国内外研究的热点主要集中在抗肿瘤、抗氧化和降糖及降血压等方面。 3 中同农业科学院硕i ：学位论文 第一章引言 皇曼! 曼曼曼曼! 曼i | i| = i =i i 曼曼曼曼曼! ! 皇曼! ! 曼曼! 寰曼曼曼! 曼曼舅曼! ! 曼曼曼曼! 曼皇! ! 曼! ! 曼曼曼! 曼曼曼曼! 曼! ! 曼曼舅! ! 曼 1 2 1 抗肿瘤及其构效关系研究 体内和体外实验研究证明西洋参果总皂苷，3 种游离脂肪酸组及单体化合物游 离色氨酸和十八碳酸均具有抗肿瘤活性；游离色氨酸的芳香共轭系统结构能够产 生光敏效应，受光照射产生光敏增效作用，抗肿瘤活性增强，这对其新药开发具 有实际应用价值；两种单体化合物的抗肿瘤活性提示具有吲哚杂环取代的a 氨基 酸结构和长链( c 16 c 2 3 ) 饱和脂肪羧酸酯结构特征的植物化学物质与抗肿瘤活性 有关；西洋参总皂营未显示出较高的抗肿瘤活性，但不排除对特殊单体成分进行 筛选和深入研究。 r o s e m a r y 等( 19 9 9 ) 证明西洋参有辅助治疗胸腺癌的作用；l a u r alm u r p h y 等( 2 0 0 1 ) 证明人参皂苷r 9 3 是抗癌活性成分，w a n gcz 等( 2 0 0 6 ) 证明西洋参 果蒸煮后，人参皂营r 9 3 含量增加，对人体结肠直肠癌细胞抗增殖作用随之增强。 1 2 2 抗氧化 d a v i dd k i t t s 等( 2 0 0 0 ) 实验结果表明西洋参提取物具有有效的抗氧化作 用，其机理是金属离子螯合作用和自由基清除作用。s h a ozh 等( 2 0 0 4 ) 证明 了西洋参果提取物具有清除心肌细胞氧自由基的功能；同时果提取物比根提取物 能够产生更多的保护作用，这种保护作用被氧自由基清除功能所调节。s a n g e e t a r 等( 2 0 0 6 ) 证明西洋参果提取物及其中的活性多酚类成分咖啡酸和氯原酸，有 助于保护心肌细胞。x i ejt 等( 2 0 0 6 ) 的实验结果表明了人参皂苷r e 有抗鸡 心肌细胞氧化作用，这种保护作用主要来自对h 2 0 2 和o h 一的清除功能。于静华 等( 2 0 0 5 ) 表明西洋参果总皂苷对心肌细胞缺氧和缺氧复氧损伤有保护作用。卢 爱萍等( 2 0 0 6 ) 证明西洋参果总皂苷可降低心肌冠脉阻力，增加冠脉流量，减少 心肌耗氧量，具有保护缺血心肌作用。 1 2 3 降糖及降血压 v l a d i m i rv u k s a n 等( 2 0 0 0 ) 及( 2 0 0 1 ) 表明西洋参能够降低食后血糖水平， 控制糖尿病的代谢和生理，对治疗糖尿病有l 临床价值。x i ojt 等( 2 0 0 2 ) 和( 2 0 0 4 ) 证明了西洋参果中分离的多糖部分对患有糖尿病o b o b 鼠的具有抗血糖作 用和治疗肥胖作用。x i e ，t 等( 2 0 0 4 ) 证明西洋参叶提取物有降血糖和生热活 性，以上均对2 型糖尿病的预防和治疗具有重要的临床价值。p m a r ks t a v r o 等 ( 2 0 0 5 ) 表明西洋参有中等强度的降血压作用。 1 2 4 止吐作用 m e h e n d a l es r 等( 2 0 0 4 ) 利用老鼠异食癖模型，证明了西洋参果的抗氧化作 用对顺铂诱导的恶心和呕吐具有潜在的削弱作用。m e h e n d a l e s r 等( 2 0 0 5 ) 证明 珏洋参果提取物和有效成分人参皂营r e 对于化学疗法诱发的恶心和呕吐有潜在的 4 中用农业科学院硕i j 学位论文 第一章引言 治疗作用。 1 2 5 抗惊厥和神经保护作用 w ucf 等( 2 0 0 3 ) 证明西洋参皂p f l l 能够预防由去氧麻黄碱引起的神经 障碍。l i a nxy 等( 2 0 0 5 ) 证明部分西洋参皂甙有神经保护作用。l i a nx y 等( 2 0 0 6 ) 证明了人参皂苷r b 混合物是最有效的抗惊厥剂，人参皂苷同时还具有 神经保护作用。 1 2 6 其他作用 j a n e te m c e l h a n e y 等( 2 0 0 4 ) 表明西洋参提取物c v t - e 0 0 2 有预防急性呼 吸道疾病的作用。c h e n g c h e nh s u 等( 2 0 0 5 ) 西洋参有削弱肌酸激酶的作用，并 减少骨骼肌细胞损伤等。 1 3 本研究的目的意义 西洋参果为西洋参( p q u i n q u e f o l i u ml ) 系五加科人参属植物西洋参的成 熟果实，西洋参果含有人参皂苷、多糖、挥发油、氨基酸、脂肪酸、聚炔类、黄 酮、无机元素以及甾醇等多种化学成分，其中人参皂苷是其主要化学成分，含量 也最为丰富：张崇禧等( 1 9 8 7 ) 表明西洋参r b 。含量明显高于人参。辽宁栽培西洋 参不同生长部位总皂苷含量为花蕾( 1 3 2 7 ) 叶( 11 0 8 ) 果实( 9 0 6 ) 根茎( 8 4 7 ) 须根( 8 4 0 ) 侧根( 4 8 7 ) 主根( 4 0 6 ) 茎( 2 2 9 ) 。魏 春雁等( 1 9 9 2 ) 测定西洋参果汁干浸膏中人参皂苷的含量分别为r b l 3 7 0 8 ，r b 2 5 1 6 ，r e 3 5 4 ，r d 7 6 8 ， r e 7 2 8 ， r g l3 3 6 ，r 9 2 2 1 0 2 。所以西洋 参果是宝贵的人参皂苷资源。 大孔吸附树脂7 0 年代末开始应用于中草药成分的提取分离，目前已成功应用 于皂苷、生物碱、黄酮、多肽、糖类化学成分的富集、分离。大孔吸附树脂对于 西洋参果的初步分离效果良好，因此筛选出一种特别适合分离西洋参果的大孔吸 附树脂是必要的。本文以西洋参果总皂苷吸附量和。7 0 乙醇洗脱率为指标对十种 大孔吸附树脂的筛选研究，结果表明l s a 1 0 型大孔吸附树脂适用于西洋参果化 学成分的初步分离。另外，由于西洋参果中化学成分复杂，特别是色素类含量较 高，严重制约了人参皂苷等化学成分的分离制各，因此，本文首先利用活性炭和 氧化镁对西洋参果进行了脱色研究，为两洋参果中单体成分的分离制备奠定了基 础。结果表明利用氧化镁对西洋参果脱色是可行的。 研究西洋参果人参皂苷分离制备的方法尤其必要：传统的植物天然成分单体 化合物的分离多采用常规溶剂提取，柱层析方法分离制备，填科常选用硅胶、氧 化铝、聚酰胺等。以上方法工艺复杂，周期长，能耗高，毒性大等；采用现代分 离技术，如h p l c 等分离制各，成本较高，一般单位无法承受。本研究应用常压 柱层析、中压柱层析、高速逆流色谱三种方法对珏洋参果人参皂菅进行了分离纯 5 中国农、世科学院硕 j 学位论文第一章弓i 言 化。中压色谱具有生产周期短，单位时间分得的化合物量大；分离效果好，同时 避免不稳定化合物在开口柱上由于长时间暴露而导致分解；溶剂安全；操作工序 及劳动强度小及回收率高等优点。本文主要采用中压色谱法对5 0 大孔吸附树 脂部分的人参皂苷进行了快速分离制备，为现代工业化的扩大生产提供了有参考 价值的分离工艺。 同时，建立了高速逆流色谱一次性分离制备西洋参果高纯度人参皂苷r e 及 r 9 1 的方法，此方法具有分离成本低、重现性好、试剂消耗少、方法简单等优点， 而且，由于h s c c c 不使用固体填料，因而不存在对样品的吸附，得率较高。高速 逆流色谱对于西洋参果人参皂苷r e 及r 9 1 的分离是首选的一种方法。 6 中同农业科学院硕i 二学位论史 第一章人参皂苷r e 和r g ；高速逆流色谱制餐t 艺研究 第二章人参皂苷r e 和r g l 高速逆流色谱制备工艺研究 高速逆流色谱( h i g h s p e e dc o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ，简称n s c c c ) ， 由i t o 于1 9 6 6 年提出，以单向流体动力学为工作原理，使两相互不相溶的溶剂在 高速旋转的螺旋管中单向分布，其中一相为固定相，由恒流泵输送载有样品的流 动相穿过固定相，利用样品在两相中的分配系数不同实现分离，而成为一种较新 型的液一液分配技术，不用任何同态的支撑物或载体。 h s c c c 技术适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低，因而， 在中药有效成分分离、制备中应用越加广泛，现已成功应用于生物碱、黄酮、多 酚类、皂苷、香豆素、木脂素、萜类等天然植物有效成分的分离。 2 1 实验材料与仪器 2 1 1 材料与试剂 西洋参果粗提物 人参皂苷r e 及r g l 对照品 甲醇( 分析纯) 氯仿( 分析纯) 正丁醇( 分析纯) 异丙醇( 分析纯) 甲醇( 色谱醇) 超纯水 2 1 2 实验仪器 高效液相色谱 高速逆流色谱仪c c c 一1 0 0 0 l c l o p 液相泵 8 8 2 3 a u v 紫外检测仪 3 0 7 5 便携式记录仪 f o x yj r 部分收集器 超声清洗器 大型旋转蒸发仪 小型旋转蒸发仪 薄层观察分析仪 s y n e r g y l 8 5 型超纯水器 y a z d 不锈钢电热蒸馏水器 u v 一2 4 5 0 紫外分光光度计 7 自制 中国药品生物制品检定所 天津市标准科技有限公司 天津大茂化学试剂厂 天津大茂化学试剂厂 莱阳市双双化工有限公司 天津协和吴鹏色谱科技有限公司 自制 日本岛津h p l c 色谱仪 b a l t i m o r em a r y l a n du s a 大连江申分离科学技术公司 北京市新技术应用研究所 四川仪表厂 i s c o 江苏张家港市超声波仪器厂 h e i d o l p h b u c h i 长沙克罗玛医药 m i l l i p o r e 上海东星建材试验设备有限公司 s h i m a d e i j 中国农、毗科学院硕l ：学位论文 第一二章人参皂苷r e 年1 1 r g i 高速逆流色谱制备t 艺研究 2 2 实验方法 2 2 1 样品预处理 西洋参果取籽后的果渣1 0k g 用7 0 乙醇浸泡过夜，超声提取3 0r a i n ，反复 提取三次，合并提取液，过滤浓缩至无醇味，i l s a 1 0 大孔吸附树脂进行洗脱， 3 5 乙醇洗脱得浸膏5l g 。经m g oj 挠色及正丁醇一乙酸乙酯( 1 ：1 ) 萃取后，取其 上层液，减压浓缩得浸膏2 0g 。 2 2 2 溶剂系统筛选 溶剂系统的选择是高速逆流色谱应用的关键，本文主要采用薄层色谱结合紫 外光谱对高速逆流色谱的溶剂系统进行了筛选，结果见表2 1 。实验结果表明： 乙酸乙酯一正丁醇一水( 4 ：l ：7 ) 为最佳溶剂系统，确定相保留率6 5 7 ，分配系 数1 8 2 。按下列公式计算： 固定相保留= ( 柱外流通管的死体积一管柱中推出的流动相体积) 管柱总 体积 分配系数= 溶质在固定相中的浓度c s 溶质在流动相中的浓度c m 表2 1h s c c c 溶剂系统筛选 t a b 2 1t h es e l e c t i o no fh s c c cs o l v e n ts y s t e m g i n s e n o s i d er ea n dr g l 2 2 3 转速和流速的选择 转速和流速对分离度有很大的影响，在高流速时，分离度会随流动相流速的 提高两提高，随转速的提高而提高，达到最佳点之后开始下降；在低流速时则相 反。本研究选择了转速为6 0 0r r a i n 、6 5 0r m i n 、7 0 0r m i n 、7 5 0r m i n 、8 1 0r m i n 、9 0 0r m i n 及流速为0 5m l m i n 、1m l m i n 、1 5m l m i n 、2m l m i n ，分 8 中圉农业科学院硕卜学位论文 第：i 章人参皂苷r e 和r g ，高速逆流色谱制蔷t 芝研究 鼍曼! ! 曼曼曼鼍i= ：i 曼曼曼曼! 曼! 曼! ! 曼! ! ! 曼曼! 曼! 曼! ! ! 罡曼! 曼! 曼曼曼罡曼曼! 曼! ! 曼曼曼 别进行了多次实验最后选定：转速8 1 0r r a i n 、流速2m l m i n 为最佳分离条件。 2 2 4 温度对分离效果的影响 对两相溶剂来说，两相之间的相互溶解度随着温度的升高而升高，而溶液的 粘度随温度的升高而降低。这些变化会对同定相保留值和分离效率造成影响。这 种温度变化对非水相两相溶剂体系的影响较大，对含水的溶剂体系，在等梯度洗 脱下，温度的变化对分离重现性的影响不大。但是，对线性或梯度洗脱的重现性 的影响较大。本试验是含水相的等度洗脱，所以温度对其分离效果不会有太大影 响，因此方法适用范围较广。 2 2 5h s c c c 分离 ( 1 ) 溶剂系统的配制 室温下配制乙酸乙醣正丁醇一水( 4 ：l ：7 ) 2 0 0 0m l ，置分液漏斗中振摇，放 置过夜，使其充分平衡，备用。 ( 2 ) 样品制备 取浸膏4g 以上下相l ：1 ( v ：v ) 2 0m l 溶解。 ( 3 ) 高速逆流色谱分离 将固定相( 上相) 以9 9m l m in 的流速由首端向尾端注入管路中，当固定相 充满后，调整主机转速为8 1 0r m i n ，主机正转，同时以2m l m i n 的流速泵入流 动相( 下相) ，待流动相流出后，两相溶剂在柱中达到平衡状态，计算固定相保留 率，通过进样阀进样，进样量5 og ( 2 0m l ) ，流出液用紫外检测器进行检测， 同时用记录仪记录色谱图，记录仪灵敏度范围为1a ，量程10 0m v ，纸速6c m h ，根据色谱图待样品组分流出时，用组分收集器收集流分，收集间隔2 5r a i n 。 ( 4 ) 薄层色谱定性 将各流分按色谱峰出峰情况，分别取少量连同人参皂苷r e 和r g l 标准品一起 点于g p 2 ，4 薄层板( 长1 2 锄) 上，配置人参皂苷经典展开剂氯仿一甲醇一水( 6 5 ： 3 5 ：1 0 ，下层) ，待展开荆饱和后，在室温下，展开。u v 2 5 4i 1 1 1 1 1 下进行观测。 2 2 6h p l c 检测纯度 将高速逆流色谱收集组分通过薄层色谱鉴定推测为单一化合物的组分，测得 人参皂菅r e 为1 7 5 2m g ，得率为1 17 ；人参皂苷r g l 为6 0 7m g ，锝率为0 4 l ，分别通过h p l c 检测其纯度。 标准溶液的配置精确称取人参皂苷r e 及r g l 对照品各1 0m g ，加入甲醇 溶解，定容至1 0 0 0m l 容量瓶中，配制成浓度为o 。lm g m l 的对照品溶液。 样品溶液的配置取两种结晶各0 0 0 5g 甲醇溶解，定容至l o 0 0m l 容量瓶 中， 取西洋参果萃取浸膏0 5 0 0g 甲醇溶解，定容至1 0 0 0m l 容量瓶中，配制 9 中同农业科学院硕一l j 学位论文第二章人参皂苛r e 和r g l 高速逆流色谱制各t 岂研究 曼i m 一i n n 。曼曼! ! 曼苎! 曼! 曼曼! 曼! ! 皇! 曼曼 成浓度为0 5m g m l 的样品溶液。 色谱条件色谱柱：s h i m a d z uo d s ，5p m ，( 4 6m m 2 5 0r a m ) ；流动相：a 乙腈，b 水，检测波长2 0 3l l m ；流速lm l m i n ；柱温2 5 ；进样量1 0p l 。 0 3 0 m i n a 2 0 4 0 b 8 0 6 0 3 0 7 5 m i na 4 0 6 0 b 6 0 4 0 7 5 9 0 m j n a 6 0 2 0 b 4 0 8 0 2 3 实验结果 ( 1 ) 通过h s c c c ，转速为8 1 0r r a i n ，主机正转，同时以2m l m i n 为流速，以 乙酸乙酯一正丁醇一水( 4 ：1 ：7 ) 为溶剂系统来分离西洋参果人参皂苷r e 及r g l 效 果最佳。r e 及r g l 出峰时间分别为19 0 - - 2 2 5 m i n 和1 4 0 - - 一16 5 m i n ，固定相保留率 6 5 7 ，高速逆流色谱图如图2 1 。 1 0 0 0 88 0 0 c 叠6 0 0 象4 0 0 乏2 0 0 0 q姆零零零带拶带带窜 t ( m i n ) 图2 - 1 西洋参果正丁酵乙酸乙酯1 ：1 萃取物高速逆流色谱2 0 3 n m 色谱图 f i g 2 lh s c c cc h r o m a t o g r a mi n2 0 3n mo fa g b je x t r a c t i o nb y n - b u t a n o l a n de t o a c ( 1 ：1 ) ( 2 ) 薄层色谱定性结果 以氯仿甲醇水( 6 5 ：3 5 ：l0 ，下层) 作为展开剂，1 0 硫酸乙醇溶液显色， 对分离出的组分与人参皂苷r e 和r g l 标准品进行薄层检测，合并流份。t l c 色 谱图见图2 2 ，图2 3 。 1 0 l 型型型些尘：i ：鹜! ：鎏些! 些鎏坠塑：坚：垒： 物稿瓣辅锵 il li i 】i vv 目22 i - v 高速逆流色谱19 0 2 2 5 m i n 人 目2 - 3 】v 高速& e 谱14 0 i6 5 参皂苷r e 、v 【_ 参皂苷r e 标、：35 粗 人参皂苷r g jv 【人参皂苷r g 】标品、v 提物t l c 围 3 5 粗物t l c 目 f 。g2 2t l c o fh s c c c19 0 2 2 5 iog ins o sd c f i g2 3t l co f i i s c c c4 0 i6 5 m in rc t i5 ) 、s a n d ar dg l n s c n os i d er e g ins c f l 0 5 i d ep 9 1 ( 1r 5 ) 、s t a n d a r dg i i d e o n d35 cr u d lr a “ r g 】a n d35 d t r a c t 3 ) 高效液相色谱检测结粜 高速逆流色普分离的化台物经与标准晶对照，纯度分别达9 85 5 雨l9 8 4 2 ，f i p l c 色潜目址圈2 - 4 矧2 - 5 蝌2 6 和图2 7 。 囤2 - 4h s c c c 制备的 参皂苷r e 的h p lc e 镕目 f i g2 4 h p l cc ht 0 m a t o g r s mo f 9 1 l d er e 目2 - 5h s c c c 制备的人参皂苷r 8 i 的h p l c 自谱目 f l g2 - 5h p l cc hr o m a t o g r a mo fg i ns e n o s i d e r g l 中嗣农业科学院硕_ | 学位论文 第二章人参皂苷l k 和r g 高速逆流色谍制备t 芝研究 图2 - 6 人参皂苷标品( r g i 、r e 、r f 、 r b l 、r c 、r b 2 、r d 、r g s 、r 9 1 ) h p l c 图谱 f i g 2 - 6h p l cc h r o m a t o g r a mo f s t a n d a r d g i n s e n o s i d er g i 、r e 、r f 、 r b l ，r c ，r b 2 ，r d ，r 9 3 ，r g l ( 4 ) 重复性检验 图2 - 7 西洋参果正丁醇乙酸乙酯1 ；1 萃取物的h p l c 图谱 f i g 2 7h p l cc h r o m a t o g r a mo fa g b j e x t r a c t i o n b yn - b u t a n o l e t o a c1 ：1 采用上述溶剂系统及分离条件进行重复性试验，重复三次，人参皂苷r e 和r g l 出峰时间、固定相保留率、纯度见表2 - 2 ： 表2 - 2 重复性试