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甘暑抗氧化物质的分离提取及其生物活性的研究 甘薯抗氧化物质的分离提取及其生物活性的研究 研究生：黄洪光 指导教师：王关林教授 学科专业：植物学 摘要：甘薯的营养价值雨l 益寿抗癌功能得到了营养学家羽i 医约学家的肯定。为深废开发 薯类农产品，本论文旨在从抗氧化角度考察甘薯提取物的分离提取及生物活性，为甘薯 产品的充分利用提供一条新的思路。 在对甘薯酚酸提取的研究中，选择乙醇作为提取溶剂。对影响酚酸提取的各种因 素通过正交实验和单因素实验进行了考察，结果表明乙醇浓度、温度、提取时间、料 液比、粉碎程度等因素都对提取有较大影响。最后，确定的提取条件为：提取溶剂5 0 乙醇i 时间2 h ；温度为6 0 ；料液比1 ：1 2 ；甘薯粉碎处理5 m i n ；重复提取3 次 淀粉生产过程中排放火量废水。这些废水中有许多成分可以进行回收利用。用火孔 吸附树脂对甘薯淀粉废水中的酚酸类物质进行了提取研究结果表明在p h 、预处理、 吸附流速、洗脱剂浓度及用量适当条件下，树脂对于废水中酚酸的吸附牢和洗脱率都达 到了8 5 以上，产物纯度达到2 6 5 5 。 1 酚类化合物是一族结构中古有酚的化合物。广泛存在于植物中，由于其羟基取代 的高反应性和吞噬自由基的能力而有很好的抗氧化活性。本研究结果发明甘薯酚酸提 取物对如和o h 很好的清除作j ；i ，并且清除率与提取物的浓度呈一定的重效关系。同 时对由o h 引发的皮肤脂质过氧化也有抑制作用。 对于由过氧化氢诱导的红细胞溶血过程甘薯酚酸具有很好的保护作i _ i j 。红细胞 中加入过氧化氢后溶血量显著高于对照组此时红细胞膜受氧化损伤，物质外流。 甘薯酚酸可显著抑制溶血的发生。当酚酸提取物浓度为9 0 m g m l 时。溶血抑制率可以达 到2 8 41 。表明茸薯酚酸可抑制氧化损伤，保护红细胞膜。 对高龄小鼠注射酚酸提取物后，小鼠血液中的s o d 的活力有显- 簧的提高在小鼠皮 肤实验中，涂酚酸一侧的皮肤中，s o b 活力明显高于来涂酚酸一侧的皮肤 关键词：甘薯酚酸大孔吸附树脂抗氧化 甘薯抗氧化物质的分离提取及其生物活性的研克 第一章文献综述 1 甘薯的营养价值及经济地位 甘薯又名番薯，红薯原产美洲约在, 5 0 0 年前传入我国。忖薯在植物分类上属1 ：旋 花科甘薯属甘薯种草本植物若生k 狂热带地区，四季长绿开花结籽，为多年生。若 生k 在温带地区，茎n 1 经霜冻桔死，成为一年生植物。由1 ：他具有高产稳定，抗火能力 强，适应性广，容易栽培等特点，深受j - 1 大人民群众欢迎，很快酱及到我国南北各 地，现在我国北至辽0 ，南至海南都种植甘薯，常年种植面积在6 7 1 0 h 一以上。成 为仅次于水稻小麦。玉米之后的粮食作物。 1 1 甘薯的营养成分和功效 经现代化学分析，每1 0 0 克鲜甘薯中含碳水化台物2 9 克，蛋白质2 3 克，脂肪 0 2 克粗纤维0 5 克胡萝h 素1 3 1 克，硫胺素0 1 2 毫克，核黄索0 0 4 毫克，尼 克酸0 5 毫克，灰分0 9 克，钙1 8 毫克磷2 0 毫克，铁0 4 毫克。甘薯含1 6 种氨基 酸，其中人体必须的氨基酸8 种都有每1 0 0 克鲜甘薯的热能为6 1 3 2 千焦耳。 按中医学理论，甘薯昧甘。性平，无毒，功效为补中，和血，益气生津，宽脾胃 通便，适量食用可去虚乏。益气力，健脾胃，强肾阴。根据现代药物化学和医学理论。 甘薯含有“粘性蛋白”是一种多糖体与蛋白质的混合物。经分析。含服碱。多酚氧化 酶。甘露聚糖植醴反式巴豆酸，八马亭，谷甾醇，另含有矢车菊素一3 ，f i - 二葡萄糖 苷。锦葵案一3 一龙胆二糖5 一鼠李糖苷等。 人类多食甘薯能够保持心血管壁弹性，防止动脉粥样硬化及肝脏，肾脏器官结缔 组织的萎缩同时还能保持消化道呼吸道以及关节囊。血管腔的润滑作刚。我国台湾 陆之琳教授指出；甘薯是一种“生理碱性食品”。他能中希j 米面内蚩等所产生的酸性物 质，起着维持健康人体血液的弱碱性作用，长期食用甘薯，可使脸色红润容光焕发。 延年益寿。明代医学家李时珍早就对食用甘薯进行了评价。曾说；“海中之人多寿而 食甘薯固也”。所以，甘薯自古以来就有“跃命食品”之称。 5 甘暑抗氧化物质的分离提取厦其生物活性的研究 当今癌症仍是威胁人类健康的头号杀手，许多国家都投入巨资和高科技在研究癌 症，力争在短期内攻克它。世界各国的医药学家在研制抗癌新药的同时，想方设法在寻 找纯天然的抗癌食物。不久前日本国内癌症研究所，公布了从高到低2 0 种蔬菜对恶 性肿瘤的有显著抑制效应的排行榜：熟红薯9 8 7 生红薯9 4 4 ，芦笋9 3 7 ，花椰 菜9 2 8 卷心菜9 l4 ，菜花8 8 ，欧芹8 3 7 ，茄子皮7 4 o ，甜椒5 5 蹦，胡萝p 4 6 5 ，金花菜：j 7 6 荠菜3 5 4 ，雀滥3 4 7 芥菜3 2 9 ，雪里红2 9 8 ，需茄 2 3 8 ，人葱1 6 3 ，人蒜1 5 ，9 黄瓜1 4 3 ，人南菜7 4 。很显然，”薯的抗癌功娥 名列榜首。美国肿瘤专家雷南说：“肿瘤的芙键是预防首先从食物开始，适肖的饮食 有助】：阳j r 癌舯的发生雨i 促进癌肿的转。”闪此，台理调整日常的膳食结构。注意饮 食多样化雨i f 轻度贫凼”粗细粮混食，改变成年类月人米，白面一贯的饮食习惯，适当 食_ i l j 甘薯等抗癌食物对癌症舫治有着十分重要的意义。“1 1 2 甘著的生产利用现状和开发前景 我国除青海，西藏等高寒地区外，其他地区均有栽培按气候条件平栽培方式，人 体上分为5 个栽培区域；( i ) 北方春薯区( 2 ) 黄淮流域春夏薯区( 3 ) 跃江流域夏薯区 ( 4 ) 南方夏秋薯区( 5 ) 华南秋尔薯区。就全国来说，春薯的种植面积- 4 0 左矗。：| 薯占5 0 ，秋磐i 与1 0 【1 6 左右。具体来说，华北，华寐及龋南各省为主蟹产区。在本世纪 5 0 一7 0 年代，粮食比较紧张的时期，群众乐意多种甘薯，1 9 6 3 年，全嗣甘薯种植面积刨 历史最高记录选9 6 4 0 7 3 公埙，占粮食播种面积的蹦，确实解决了许多人的温饱阔 题。进入8 0 年代以米甘薯种植面积有所减少但由于科按力量的投入，优质高产的 甘薯良种不断更新，多种先进技术的推广应_ h ，甘薯的单产有了明显的提高近年，每 年稳定在6 0 0 多万公顷，总产1 亿吨左右，折合谷物粮食2 0 0 0 3 吨左右。 目前我国对甘薯的利用仍以供人们食用或做家畜饲料为主也有一部分用米生产淀 粉和粉丝或用傲生产白酒和酒精的原料。国内利用甘薯生产淀粉的大型厂报少。多数悬 小型厂很乡镇村办个体的土粉厂。单甘薯淀粉与谷类淀粉相比独具一些优点， 例 如，甘薯含蛋白质脂肪较少，刚它生产淀粉时，酶的液化较容易，因此甘薯仍是一种 6 甘著抗氧化物质的分离提取及其生物活性的研究 生产淀粉的良好原料，甘薯淀粉深加二【：可制成可溶性淀粉，蝴精，葡萄塘，乳酸钙，丙 酮和甘露醇等产品。改革开放以来，随着食品】：业蓬勃发展和人比生活水平的的逐步提 高，各地相继开发了许多以甘薯为主要骧料的新型食晶。甘薯作为充饥度荒食鼎的肘代 已经过去，但是他的营养价值很益寿抗癌功能得到了营养学家和医约学家的肯定。当今 研制开发具有益搿抗癌功能的甘薯食鼎已提上日程，定将充分提高甘薯的附加值，有着 光辉的前景，为之提供原j 习的村薯种植业，仍有其r 阔的发腱前途 2 甘薯有效成分的研究进展 2 1 甘薯凝集素的研究 余萍”1 等对甘薯凝集素进行了 i j f 究。从抗时薯蔓割痫 j 翦叶片组纵浸取液，经硫酸 铵分级沉淀甲壳索牲层折及葡萄糖凝胶过滤，得到种狂p a g e 或s d s p a g e 上均曾现 单一蛋白质的甘薯凝集索，该凝集索没有血型专一性及被测动物红细胞专一性，其凝集 素活性可被n 一乙酰葡萄糖胺或岩藻糖所抑制。该凝集素在7 5 c 加热1 0 分钟，即丧失全 部活性，其凝集素活性依赖于c a 2 + 和m 矿，m n ”则没有作刚。经s e p h a d e x g 1 0 0 和s d s p a g e 测定，凝集素相对分子量为6 3 0 0 0 中性糖古量为6 2 1 ，该凝集索对蔓割病曲有 抑制作用，是一种酸性糖蛋白。 实验中发现该凝集索对蔓割病菌有抑制生长的作 = | ，对其孢子有凝集作_ i ；1 而在 对感病品种岩。凝集素的实验中发现，对蔓割病菌没有抑制作用“1 由此- 7 5 植物凝集 索对其病原菌的抑制作用与抗病晶种和感病品种有关，即抑菌活性与晶种的抗病性里j ：e 相关，这是根有意义的。因此，还需对他的性质进行深入的研究，特别是对病原菌的作 用以及对自身的保护抵抗病原茵的生理功能等。 2 2 黄酮类成分的研究 黄酮类化食物具有多方面的功能。在植物中分布锻广，有文献估计。约有2 0 9 6 中草 药含有黄酮类化合物主要存在于芸香科，腊形科，豆科伞科，银杏科与菊科等“1 。 黄酮类化台物有强心。扩张冠状动脉，降血压，降血脂，减低毛细管通透性】脆性促 进细胞增生，祛痰。镇嗑，平喘及减少糖醇堆积，有利于白内障防泊等功效“1 。鉴于 ， 7 甘薯抗氧化物质的分离提取厦其生物活性的研究 此，黄酮类化台物在医药上已获得“泛的应用。除此之外，黄酮类化合物还是颇具广阔 前景的天然食晶抗氧化剂，因为黄酮类化合物兼具抗氧化高效性与低毒性两大优点。可 做合成抗氧化剂的替代物，以避免合成抗氧化剂致畸、致癌之虞。 邹耀洪对国产甘薯时中的黄酮类化台物进行了分析经波谱分析分别鉴定为：槲 皮素一3 0 一b d - 葡镝糖一( 6 1 ) 一0q 一2 一鼠李糖苷( 1 ) 4 7 一二甲氧基山奈酚 ( 2 ) ，槲皮素一3 0b d - 葡萄糖= f j ：( 3 ) 利橼皮素( 4 ) 。刘法锦等从胥薯藤1 1 1 分离山 一种黄酮类化含物干两种有机酸，这种黄酮类化台物经鉴定为7 ，3 ，4 一三甲氧基槲 皮素。向仁德等“引种的巴西甘薯n i 的乙醇提取物中，用拄层忻雨l 力口压枉层析的方法 得到8 个化台物，其中有5 个已确定为黄酮类化合物，它们分别是槲皮替山奈素 4 7 - 二甲醚。商陆黄素槲皮素，槲皮素一3 ，4 。7 - - - 甲醚。谭桂山等“也从引种 的巴西甘翦叶中分离山槲皮素。y a h i j w ac h u 从台湾产红薯叶中分离出6 和杨梅黄 酮，并且含量还相当丰富，达到1 4 3 7 8 m g k g 年“1 5 5 8 7 m g k g 。 2 3 甘薯糖蛋白的研克 糖蛋白是一类由糖类同多肽或蛋白质以共价键连接而成的结合蛋白质。它是细胞 膜细胞闻基质血浆黏液，激素等的重要构成成分。甘薯糖蚩白大量存在丁甘薯 淀粉生产的废水中，若采_ i 适当的手段将其分离提取山米，进行保健作_ l ； 方面的应_ i i 研 究，将产生显著的经济效益和社会效益。李贬娜等“”得到甘薯糖蛋白纯牖( 白色粉末状 固体) ，其中蛋白质含量约为1 0 7 1 5 ，糖禽量约为8 0 0 6 得率约占鲜熏的0 2 5 。动 物实验表明，高衄船症火鼠注射s p 6 后，能同时降低t c 和t g 的含摄和t c t g 的比值 与高脂组相比，差异显著。i 胄i 剂鼙组效果更为明显，t c 卜降率从3 9 7 升高到7 5 8 9 6 ； 与此同时，高中剂量组能明显地增加h i ) l - c 的浓度，与高脂组、对照组比较分别增加 了5 4 1 和7 7 8 9 6 。同时减少了h d l _ c 的浓度。使 i 明显降低。 脂肪乳荆能促进肝脏t c 增加。肝脏t g 蓄积。与正常组相比p 4 ，5 一 d c o a c h a 新绿原酸。 刘翔等“研究表明，阿魏酸钠对糖尿病患者内皮蘩( e t ) 水平具有显著影响。泊疗 组治疗前后的e t 值，与对照组相比e t 值均有显_ 黄降低。朱秀琴等1 应用流式细胞仪 检测技术考察了阿魏酸钠对人e b l 一7 4 0 4 斛癌细胞的影响，结果表明。s f 组凋亡细胞为 1 4 甘暑抗氧化物质的分离捉取及其生物活性的研究 1 0 5 ，而对j i l ；f 组为5 9 ，凋亡被上调，在g o g - j i i j 前出现了亚二二倍体峰住细胞周期 的s 期。s f 组d n a 的百分比明显低于对照组，在g z 朋期，s f 组d n a 的卣分比明显i 自i 于 对照组。 2 6 5 6 薯类酚酸的研究进展 o n y e n e h o 雨la e t t i a r a c h c h y “报道过美国托达科塔州马铃薯皮中酚酸的抗氧化活 性，并片j 逆向i t p l c 雨lt l c 裣出提取物中包古倍酸、原几茶酸、对羟苯酸、龙艟酸、咖 啡酸、香草酸、绿原酸、香豆酸、丁香酸、水杨酸、阿魏酸、反内桂酸等1 2 种酚酸。 s o s u ls k i “”等用g l c l i s 测出加拿大n e t t e dg e n 去皮马铃薯中含可计馘的绿原酸、反 香豆酸，反刚魏酸，咖啡酸。在对不同酚酸抗氧化活性强弱的研究中，o n y e n e h o 等“ 曾考察过标准酚酸按下列顺序递减：原儿茶酸 绿原酸 咖啡酸 对羟苯酸 龙胆酸 阿魏 酸 香草酸 丁香酸 香豆酸。詹沛鑫”1 对甘薯及马铃薯提驭物的抗氧化活性进行了研 究，通过在犬豆油中添加提取物，然后簧于活性氧条件下，9 小时后检测油脂的过氧 化物价。结果表明该提取物具有强抗氧化性仅略差_ i rb h a b t l t 。马铃磐块茎中的总 酚含量以干重计在0 1 一0 3 之间”1 。芽中的含量高达0 8 ，其中约9 雌是绿原酸。其 它的包括芥子酸咖啡酸阿魏酸，单宁花青索。酪氮酸，香豆酸，7 一羟基一6 一甲氧 基香豆素，6 一羟基一7 一甲氧基一7 一甲氧基香短素及黄酮“”1 。施j ； j 钾肥。土壤温度及其有 机质含量都能影响马铃薯中绿原酸的含量，酚类化台物主要存在于马铃薯的皮乖1 皮层 之问，约有5 0 存在于皮及邻近的组织中约靠近茎的中心，它的浓度越低”。 3 本论文的目的意义 ( 1 ) 目前甘薯除了直接食i ；i 外。士要j i ；f j 术生产甘薯淀粉，其它方面的利j i j 还较 少。本论文从抗氧化角度对甘薯提取物从分离提取及其生物活性方面进行初步探索 目的在于丰富甘薯的利用价值。 ( 2 ) 甘薯淀粉在生产过程中产生大量的废水，直接摊放会对环境造成污染。同 时，在淀粉废水中含有大拦的有机物质可以重新利朋。目前对与甘薯淀粉废水的利 用还较少，本论文利用树脂法从甘薯淀粉废水中提取酚酸类物质。通过对各种影响因 1 5 甘暑抗氧化物质的分离提取及其生物活性的研究 素的考察，确定适宜的提取手段，为甘薯淀粉废水的充分利_ i i ；j 提供一条新的途径。 ( 3 ) 酚酸类化台物在植物界分布报广，一些酚酸如绿原酸已成为某些中药质量控 制的指标之一，但系统的约理药效研究尚未开展。本论文对甘薯酚酸的抗氧化作 ；f 进 行了较详细的考察，目的是为此类化合物有关约物的研究提供一点依据。 i 6 甘薯抗氧化物质的分离提取厦其生物活性的研究 第二章甘薯提取物抗氧化活性成分的分析及提取 活性氧自由基诱导的氧化损伤一直被认为是引起某些疾病及衰老的重要原因之一。 人l4 合成的抗氧化剂存在的毒副作川等多方面的缺陷使得近米人们将注意力转向 植物中存在的大然抗氧化荆。 本章内窖主要是对甘薯中的抗氧化物质进行初步的研究对其活性成分进行r 定性 检测。并对由溶荆提取该类化台物的符种影响因素进行了详细的考察。 1 材料与方法 1 1 材料 甘薯，由辽宁师范人学重点实验室提供，块根，蔓，叶，洗去泥寸：，备用 1 2 仪器 组织匀浆器，7 5 2 紫外分光光度计，布氏 i i ；斗，离心机旋转蒸发仪 1 3 试剩 9 5 z , 醇，甲醇，丙酮，乙酸乙酯，均为国产分析纯 1 4 方法 1 4 1 样品的准备 将去掉泥士洗净晾干的新鲜f i q 块根、蔓、卧切碎，块根部分分成皮部( 形成层以外 的部分) 和肉部( 形成层以里的部分) 两部分，加上蔓、叶部分共分四个样品。每个 样品精确称重1 0 9 ，加入5 0 m 1 9 5 乙醇，置组织匀浆嚣中匀浆。l o 分钟后，将制得的匀 浆液盛入烧杯中封口，室温下过夜。次日，过滤。收集滤液，滤涟再加入5 0 m 1 9 5 乙 醇，封口，过夜。再次过滤，合并两次得到的滤液浓缩得到甘薯提取物。备用。 1 4 2 甘薯提取物抗氧化活性的检测 1 4 2 1 样品处理 将提取物溶于9 蹦乙醇，j _ l 新华滤纸层析。溶剂系统为蒸馏水，层柝后在紫外灯下 划出荧光区和非荧光区，用剪刀将这两个区域剪碎后。分别用9 5 l 醇提取，提取物浓 1 7 甘著抗氧化物质的分离提取厦其生物活性的研宄 缩后，溶丁适量蒸馏水中，配簧成一定浓度的样品供检测州。 1 4 2 2 抗氧化活性检测 采用邻苯三酚自氧化法测定，具体方法步骤见第四章 1 4 3 提取物中抗氧化活性物质的定性分析 1 4 3 1 滤纸分离 提墩物溶于9 5 乙醇，_ i j 新华滤纸层析，溶剂系统为止j 1 醇一乙酸一水( 4 ：1 ：2 ， p a w ) 1 7 7 o 层析后吹干，取一些滤纸在紫外灯f 观察，画山荧光区。 1 4 3 2 荧光区中物质的简易识别 滤纸荧光区刚8 0 7 醇提墩，用新华滤纸层析对前述的b a w 层析吹千后分别 ；i jf 列发色剂观察颜色的变化；( 1 ) 熏n m 气前后( 紫外灯f 观察) ；( 2 ) 喷i f e c i a 溶 液；( 3 ) f e c l ，唯，f e ( c n ) 。试剂：( 4 ) 重氮化对硝基苯胺( d p n a ) = ( 5 ) h o e p f n e r 试荆。 1 4 4 酚酸含量的测定； 纸层析一紫外分光光度法“。得到的滤液枉3 2 0 h m 下，以绿原酸为标准物，按照吸 收系数为( 占点) = 5 2 6 。根据测得的吸收值计算酚酸的含量 1 4 5 提取方法的建立 以辽师l 号块根为原料，有机溶荆为提取溶剂，确定甘薯酚酸提取的条件 1 4 6 影响酚酸提取的正交实验 以温度，时间，料液比3 因素作为考察对鲰，每个因索选用3 个水平采用b ( 3 ) 表，并安摊实验。 1 4 7 影响酚酸提取的单因素实验 在正交实验的前提f ，采用不同设计方案，对影响酚酸提取的各种因素分别加以 考察。 2 结果 2 1 甘薯提取物抗氧化活性检测蛄果 8 甘薯抗氧化物质的分离提取及其生物活性的研究 jt 0 驰 m ：i _ 拍 害n z 01 5 n1 0 帖 u 瞰2 一ih 薯攫取韵抗瓴i t 活性幢涮 + 一酬帖埘雌 - h 一* m “棚眦 翱 篁* 光鹾鞋啦 韵 一*冉郴荧光区越 耻特 * _ 出抖蹙光娃搬 耻蝣 闰2 一l 所示为甘薯各部分提取物的抗氧化活性检测结果。曲线斜率表示抗氧化活性 的强弱。圈中显示，各部分提取物经纸层析后，荧光区都具有抗氧化活性，而非荧光区 没有抗氧化活性，因此我们对荧光区物质进行定性分析。 2 2 提取物对酚试荆的颜色反应 荧光区提取物对一些酚试剂的颜色反应如表一1 表2 一i 提憋塑些垄丝化后对些酚试剂的龋色反应 。l u b l o2 一i c u l u u rr u h cl i 帅盯d i sl j l ls u b s t m l c ea n d5 呻ep h e n u lr 性壮n l 从表2 - i 可以知道，甘薯提墩物荧光区的物质为酚酸类化合物，颜色反应确定甘薯中的 酚酸类化合物为以下四种：异绿原酸，新绿原酸，4 - o 一咖啡酰奎尼酸和绿原酸。 2 3 甘薯不同品种及不同组织，器官中酚酸的含量 1 9 甘薯抗氧化物质的分离提取厦其生物活性的研究 我们考察了8 种甘薯中酚酸的含餐，并对每一种甘薯中酚酸在不同组j ： 、器官的含 量都做了考察，表2 - 2 为得到的实验结果。 寝2 - 2 甘薯酗酸的分却段不1 日品种甘瞄醴占t 的比较 r a b l 0 2 2 0 i sl r i b u t i n gu fp h e n o la c i dt m d d r i s i o no lc u n l c nlu r p h u m f lt l c i di a v b r yk i n dl ，ts - o o ll m t a t ( j 我们测定了8 种甘薯中酚酸在不同组织、器官中的含蛀，结果她表2 2 。从表中可 以看出，酚酸在甘薯组织、器官中的含量按皮部、内部、蔓、叶的顺序递减在八个品 种当中都是如此，只是备组织、器官酚酸占总酚酸含量的百分比有所差别。从表中还可 以看出。不同品种酚酸含量差别很大，含量高者如辽师l 号皮部酚酸含量可达到 0 1 5 3 9 1 0 0 9 甘薯，低者如黄2 0 皮部酚酸禽蠡【只有0 0 8 2 9 1 0 0 9 甘薯 酚酸是一类弱极性分子，较易溶于有机溶荆，在热水中有较人的溶解度。实验中考 虑到试剂的价格和实际操作过程中的可行性本研究对不同浓度的四种有机溶剂及水对 于甘薯酚酸的提取情况进行了探讨 2 4 不同浓度的乙醇对酚酸提取率的影响 不同浓度的乙醇对酚敬的提取效果如表2 - 3 ，闰2 - 2 ( 紫外检测) 。可以看山，随着 乙醇浓度的增加，酚酸的提取率逐渐升高，达到5 0 浓度以后，提取率变化不大，为了 2 0 甘薯抗i m & 物质的分离提取厦其生物活性的研究 探讨5 0 乙醇在酚酸提取方面与其他浓度乙醇的差别，我们进行了多重比较分析 ( l s d ) ，结果如表2 3 所示。 从多重比较的结果可知，除1 0 和3 0 乙醇外，5 0 7 , 醇对酚酸的提取率与其他浓度 乙醇之间没有显著的著异，图2 2 是紫外灯下对提取液纸层析后的结果，从图中可以看 出5 0 一9 0 浓度的乙醇提取效果相似，并且都比前两者的效果要好。因此，选用5 0 乙 醇做为提取剂是比较理想的。 2 5 不同浓度的甲醇对酚酸提取率的影响 不同浓度的甲醇对甘薯酚酸的提取率的影响见图2 - 3 ，。由图2 - 3 可以看出，甲醇对 于酚酸提取率的影响和乙醇相似，也是随着浓度的升高提取率也在增加。在5 0 甲醇浓 度时达到最高，随后提取率也变化不大，同一浓度甲醇与乙醇比较，显然 表2 - 3 乙醇浓度影响的多重比较 1 a b l e 2 3 m u l t l p l ec o 呻盯i s o no f e f f e c to f e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n e x t r a c t i q n 注：l s d n ) = o0 3 ；l s d ( ) 卸拥：kx “x x ：，x z ，x 1 分别表示5 0 ，7 0 ，9 0 9 5 3 0 4 1 0 己醇3 次重复提取率的平均 值 图2 - 2 乙醇浓度对提取结果的影响 f i g t u r e2 - 2e f f e c t o fe t h a n o lc o n c e n t r a t i o no l le x t r a c t i o n 2 l 甘著抗氧化物质的分离提取及其生物活性的研宛 乙醇的提取效果要比甲醇的提取效果好。 2 6 不同浓度的丙酮对甘薯酚酸提取效果的影响 不同浓度的丙酮对甘薯酚酸提取效果的影响见i j i2 - 3 。由幽2 - 3 可以看山，随着丙 酮浓度的增加，酚酸的提取率升高但是当浓度达到7 0 以后，它的提取率却随着丙酮 浓度的升离而不断下降。酚酸的溶出受到明显的抑制。 0 um 01 4 李2 ； 羞一 0 。 00 2 0 1 07 u9 09 5 - 1 1 - - - 一一搿 * 一一己一 湃新娘虚) 龋2 0 1 t 鲫硪班曲静捌时琳t 鞋瞬曛攀盼t 璃 啦2 3 日d 时，阱n k 蛐缸o f f i s o n h 州o f _ h i d 2 7 不同浓度的乙酸乙酯对甘薯酚酸的提取率的影响 不同浓度的乙酸乙醣对甘薯酚酸的提取效果豹影响见幽2 3 。由幽2 3 可以看出， 乙酸乙酯对酚酸的提取率的影响与前面三种有机溶剂明显不同，随着乙酸乙蘸浓度的升 高，它的提取率却逐渐的f 降，推测在提取过程中。由于乙酸乙酗的糖溶性较强。因 此，它将甘薯中的一些脂类物质也提取出米可能因此影响了甘薯酚酸的溶出。 2 8 水对甘薯酚酸的提取率的影响 在使用有机溶剂对甘薯酚酸提取进行考察的同时，也选择了使用比较方便和经济 的水作为甘薯酚酸的提取溶荆。我们设计了p h 分剐为3 5 ，5 5 、7 5 、9 5 。1 0 5 五种水 溶液作为酚酸的提取荆其他条件与前面相同。提取结果见幽2 - 4 。在提取过程中我们 发现。随着水溶液p h 的增加溶液的黏度增人，湃液变的异常浑浊得到的结果与有 机溶剂提取相比，提取率较低在p h = 5 5 时，提取率为0 o ? 8 9 l o o g 甘薯- 而在 甘薯抗氧化物质的分离提取及其生物活性的研究 p h = 1 0 5 时，提取率只有0 0 4 3 9 1 0 0 9 甘薯。这可能是因为_ l j 水做提取荆与用有机溶荆 做提取剂相比，一方面，酚酸是弱极性分子，在水中溶解度不人，另方面用水做提敷 溶剂，提取液的性质发生了改变，水溶性物质增多，溶液粘稠，不利r 酚酸的溶出。 o 营o0 6 ：00 4 _ 、 i655750 5i o6 “1 删2 _ 41 h i m 的木碹掖埘酌地取的蟛响 以上实验分析结果表明，不同浓度乙醇，甲醇，丙酮，乙酸乙酯平不同洲的水溶 液对甘薯酚酸的提取率都有显著的影响，每一种溶剂都存在一较佳的浓度，即5 0 的乙 醇，5 0 的甲醇，7 0 的丙酮等，且它n j 的提取效果都比水溶液好。由以上结果可知作 为安全无毒又相对便宜的乙醇是对甘薯酚酸理想的提取剂f 面我们就以乙醇为! | 拜 剂对酚酸的提取做进一步的探讨。 2 9 影响酚酸提取正交实验 前面通过实验对从甘薯中提取酚酸所需溶剂进行了比较分析，发现各种溶剂对酚醴 的提取率均有一定的影响，其中6 0 9 6 的乙醇对酚黢的提取率最人。在此基础上我们对 影响从甘薯中提取酚酸的其他几个重要因素时间，温度。料液比安捧了正交实验 以便获得这些因素对酚酸提取率影响的犬致变化趋势，井考察各因素对提取率影响的主 次顺序。 为此采用h ( 3 4 ) 设计表安排了上e 交实验。因素水平见表2 4 ，实验结果见袭2 5 从正交实验的结果与计算可以看到，最佳的组合为9 号，提取条件为a 幽c “即温度为 8 0 ( 2 ，时间为3 h ，料液比为1 ：2 0 ，最差组合为7 号。另外，箨因素的各个水平之间 2 3 ! 墨垫塾垡塑堕塑坌苎! ! 墨垒苎生塑童些塑竺垄 衰2 + dj e 叟实验幽索木平地弹 t a b l e2 - 4f a c t i j r sa n dl e v e lo f o rl h o g o ll a | “j sl 丧2 5j i ：盘实啦绐粜与汁掉 t u b l e 2 + 5i hl i l o g t h i n iu x l r i m u l l 实验号 l e s tn o 时闻 l i _ 料液比b强度c ( )鼢触得串 s t o c km t “j恤e r ；l t u r 。( g i u o g ) y i d d s i 1l 301 2 4 2 2l i00 8 6 3 31z 00 0 3 4 i2 201 2 4 522 3n 1 3 1 6：j2 1 00 9 7 7l 3i 00 5 5 8 232 0 1 2 2 933 30 1 5 3 k 1 03 1 3m3 0 3 02 4 8 k 203 3 9 03 5 20 3 3 9 k 3 03 4 303 5 4 04 2 2 n00 3 0 嘶10 0 7 4 也都存在这样的关系：k i k 2 r s ，即温度极差最大，其次是料液 比，为前者的6 9 ，时间因素最小，仅仅为温度因素的4 0 5 。料液比因素的5 9 。 2 1 0 单因素实验分析 在正交实验的基础上，通过单因素实验对各因素的影响进行了更加深入的探讨。 2 10 1 温度对酚酸提取率的影响 图2 - 5 ，2 - 6 ( 紫外检测) ，给出了不同温度对酚酸提取的影响。可以看出，酚酸的 提取率随温度的升高而不断增加，从室温到6 0 5 c ，酚酸的提取率增加明显，而7 0 c 以 后，提取率与6 0 时的提取率相比变化不大，反映在曲线上就是这一段曲线比较平 缓，因此，确定6 0 。c 为提取酚酸的较佳温度。 温度( h g2 - 5 e b o f - t h ey i e i do f 帅i 2 10 2 提取时间对酚酸提取率的影响 圈2 _ 6 不同温度对醇酸提取的髟响 f i g 2 - 6e f f e c t s o ft e 叩e r a t u r e so i lt h e y i e l do fp h e n o la c i d 提取时间决定者生产的周期，是生产工艺研究中一个重要的影响因素。图2 7 ，2 8 ( 紫外检测) 给出了提取时间对酚酸提取影响的结果( 溶剂为5 0 的乙醇，水浴 甘薯抗氧化物质的分离提取及其生物活性的研究 01 6 01 _ ! 2 甚1 8 窖u0 g 馨o0 4 00 2 r + 一 提取时间( 吣 图2 q 时间对酚酸提取的影响 图2 - 7 时间对酚融提取率的影响 f i g 2 76 f k m f e n c t i a t h ei d d o f f i g2 - 8e f f e c t o fe x t r a c t i o nt in t eo n c o a 温度为6 0 ) 。可以看出，随着提取时间的 延长，酚酸的提取率不断的提高，尤其是从0 5 h 延长到2 h 时，酚酸的提取率提高幅度 最大，而2 h 到5 h 处理之间酚酸的提取率呈现出缓慢上升的变化趋势。 2 10 3 不同料液比对酚酸提取效果的影响 图2 - 9 ，2 - 1 0 给出了用5 0 乙醇提取时，采用不同料液比对酚酸提取率的影响。可 以看出，随着溶剂量的增加酚酸的提取率逐渐升高。到1 2 倍比时提取率达到最高， 以后的变化不大。一般说来，料液比越高提取率也越高。但溶剂量的增加也相应增加了 处理时间。在本实验中，酚酸的提取率随料液比的增加逐步升高，到1 2 倍比时达到最 高值，随后则变化不大。因此，1 2 倍比时为较佳的料液比。 2345 科液地 图2 - 1 0 不同料液比对酚酸提取的影响 弼2 4 不周料醚比对盼袋提取串的影响 飚2 4 8 “兰裟器”“” 2 10 4 提取次数对酚酸提取效果的影响。 f i g 2 - 1 0e f f e c t s o fr a t i o o f s o l v e n t t o m a t e r i a l0 nt h ey i e l do fp h e n o la c i d g一霈s崔女 甘薯抗氧化物质的分离提取及其生物活性的研究 反复多次提取有利于植物体中天然产物的提取。但从j ：作量，生产成本等多种因素 考虑，必须确定个较为合理的提取次数。以上对影响甘薯中酚酸提取率各因素的研究 中，都采用了3 次提取的做法，且各个影响因素中较佳水平的处理的绝对提取率都达到 了8 0 以上。 2 1 0 5 粉碎程度对酚酸提取效果的影响 按单因素分析所得山的优化条件( 乙醇浓度5 0 ，提取时间2 h 。温度6 0 c ，料液 比1 ；1 2 ) 对不同粉碎程度的甘薯进行了提取。表2 - 6 给出了实验结果。 表2 6 甘薯粉碎1 5 l 应对酗酸提取的膨响 t u b l t2 6e r ie c l so fs w e e tp o t a t o is mt h ey i o l d 【l i - p l l u n o h c i d 甘薯糟碎程度酚酸料率g l 叫g 匀浆im i n 匀浆5 z i r l 00 2 3 0l 捌 匀浆 0 m j n o1 5 5 从表中可以看山，随着匀浆时间的延良，酚酸的提取率增加。由丁在5 m i n 与 1 0 z i n 时，甘薯的粉碎程度相差不多因此两者的酚酸提取率也相差不多 3 小结 采用邻笨三酚自氧化法对甘薯各部分提取物进行抗氧化检测，结果表明经纸层折 后，荧光区提取物具有抗氧化活性；定性分析表明。荧光区物质为酚酸类化合物。 将正交实验和单因素实验相结合，运用多重比较等统计方法，对影响甘薯盼酸提取 率的主要因素进行分析的结果表明，从甘薯中提取酚酸的相关工艺参数确定为提取溶剂 5 0 9 l 乙醇；时间2 h ；温度为6 0 c ；料液比l ；12 ；甘薯粉碎处理5 m i m 重复提取3 次。其中。温度为最主要的影响因素，其次为料液比，最后是时间。 2 7 甘薯抗氧化曲质的舟离提取及其生物活性的研宄 第三章树脂法从甘薯淀粉废水中提取酚酸的研究 目前，我国对甘薯的利j = = | 仍已供人食用或做家葺饲料为主，也有部分用来生产淀 粉和粉丝。淀粉是种非常重要的 ：业原料，它不仅应_ l ； j 在食品i ：业领域，而且在制 酒、制药、纺织、化i ：等行业也被j l 泛的麻蹦。在甘薯淀粉生产中产生人量废水。该废 水中含有高浓度的有机化台物及悬浮物质。易腐败发酵，排入江河消耗水中的氧气，促 进藻类及水生植物繁殖，量大时河流严重缺氧，发生厌氧腐败，散发臭味，造成鱼、 虾、贝类等水生动物的死亡。”采用快速、高效、低耗的淀粉废水处理控术及如何使其 变废为宝是当前研究的一个重要方向。“在对甘薯淀粉废水进行无害化处理的同时如 何充分利用废水中的有机物质，将这些有机物质提取出米，使其变废为宝。这是本文想 要解决的一个问题。哭文j 1 等从淀粉废水中提墩蛋自，获得了营养丰富的蛋白饲料而 且使废水的s s 和c o d , 。去除率达到8 0 黼l ： “以上减轻了后续生物处理的负荷“。前 面一章已提到在计薯中订可计量的酚酸存在在1 1 薯淀粉生产过程。p 。毫无疑问，一部 分酚酸已转移到了淀粉废水中。本章研究的内容就是如何把淀粉跋水中的这一部分酚酸 给提取出来。 大孔吸附树脂是7 0 年代以后发展起来的有机高聚吸附剂具有较好的吸附性能。 它的化学结构与离子交换树脂类似，区别在于后者可引入进行离子交换的酸性或碱性基 团。它的吸附作用是通过表面吸附、表面电性或形成氨键。多用于工业生产中。此外 也_ i _ i j 于临床化验以及作为气相色谱的载体。目前，在中草约化学成分的分离、富集中的 应用越来越受到人们的重视。” 用人孔吸附树脂处理含酚废水已多有报道。在一】：业生产中作为舫治污染的有效措施 “”。本研究借鉴此原理将吸附树脂_ i i 于对淀粉废水中酚酸类有机物的选择性吸附，通 过对p h 洗脱剂，洗脱剂用量等条件的筛选，找到令人满意的提取手段。 甘薯抗氧化物质的分离提取及其生物活性的研究 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 甘薯： 为辽宁师范大学蘑点实验室提供 1 1 2 主要仪器： j j 一2 型组织匀浆器( 江苏国华仪器厂) ，紫外分析仪( 北京市新技术应t 【l ；l 研究 所) ，7 5 2 紫外分光光度计( 上海第三分析仪器厂) ，旋转蒸发器( 上海亚荣生化仪器 厂) ，层析柱( 巾5 0 1 5 c m ) 1 1 3 树脂： a b - 8 大孔吸附树脂南开人学化：【：厂产品 1 2 方法 1 2 1 甘薯淀粉废水的制备： 甘薯洗去泥十切成小块，加适量水置组纵匀浆器中匀浆。纱布过滤弃甘薯残 渣得浆液。浆液离心，淀粉沉降，上清液即为淀粉废水。测c 0 1 ) 。，为6 5 1 3 m g l 。 1 2 2 树脂的预处理 1 ) 先向吸附柱内加入相当于装填树脂体积0 2 - 0 3 倍的乙醇然后将新树脂投入柱 中，使其液面高于树脂层并浸泡2 4d , n , 1 。 2 ) 用2 b v 乙醇，以2 b v h 的流速通过树脂层。并浸泡4 - 5 小时。 3 ) i l = l 乙醇以2 b v h 的流速通过树艏层，洗至流山液加水不星白色浑浊为止。再用水以 同样流速洗净乙醇。 4 ) 用2 b v 的5 g t c l 溶液。咀4 - 6 b v h 的流速通过树脂层，并没泡2 - 4 小时。而后用水 以同样流速洗至漉出液的p h = 7 。 5 ) 用2 b v 的2 n a o b 溶液，以4 - 6 b v , b 时的流速通过树脂层，并没泡2 - 4 小时而后 用水以同样流速至流出液的p i t = ? 。 2 9 甘薯抗氧化物质的分离提取及其生物活性的研究 l ，2 3 动态吸附实验 湿树脂2 0 m l ，装柱进行动态吸附实验，采j l ； 5 m l n l i n 8 m l m i n 。l l m l m i n 三种流速 过柱吸附，每隔定体积测定流出液的吸光度，以体积为横坐标酚酸浓度为纵坐标 绘制曲线。 1 2 4 静态吸附实验 量敬邂树脂l o m l ，2 0 m 1 3 0 m l ，分别装入1 0 0 0 m l 的烧杯中加入等量的淀粉废水井 震荡进行静态吸附每隔定时间测一r 上清液的吸光度井计算浓度，以时间为横坐 标酚酸浓度为纵坐标。绘制曲线。 1 2 5c o d ；的测定： 重铬酸钾法测定c o d 。“。 1 2 6 酚酸含量的测定： 纸层析一紫外分光光度法以绿原酸为标准物，按绿原酸c m - n 的吸收系 ( e 盘) 为5 2 6 “”计算含量 1 2 7 酚酸分离基本流程 淀粉废水叶预处理上清液加树脂吸附+ 蒸馏水冲洗洗脱浓鲴 一干燥叶晶 啡c 加型嗡黼铲枷。 蝴c 牒羰矧燃圳。 2 结果与分析 2 1 提取淀粉用水的p h 对废水中酚酸含量的影响 在不破坏淀粉质量的前提下，考察了提取淀粉用水在p h 为2 2 、3 2 、4 2 、5 2 、 6 2 、7 2 时与废水中酚酸含量的关系，结果见圈3 - 1 。 甘暑抗氧化袖质的分离捉取及其生物活性的研究 、 、- _ 一 zz 3 212 j2 n272 p 脚3 j 水舶口h 斟瞬麓每毕响 f i j 1 e r r u c ri j hu r _ h jv u n nlh u o i du fp h e j l o in c l d 可以看到，当p h = 2 2 ，4 2 利5 2 时废水中酚酸含挝较高，这可能是因为甘薯中 的多酚氧化酶( p p o ) 的活性在p h = 3 5 季g ，5 处的活性较高1 ，对酚馥有较人的破坏作 用。因此，在这隔个p h 值附近，酚酸的含量很低而在p h = 2 2 、4 2 和5 2 时酶活性 受到抑制酚酸没有被破坏，因而含量较高。同时，实验中我们也发现，随着p h 的增 加，溶液变锝粘稠，在非多酚氧化酶的活性区酚酸的含量也较低，这可能是因为随着 p h 的增加，溶性杂质增多溶液粘稠，影响了酚酸的溶山，从而导致废水中酚酸音量 的降低。 2 2 动态吸附实验结果 泄露曲线见图3 - 2 。从i ! i l 中可以看出，吸附液的流速对树脂吸附酚酸有微人的影 响随着吸附液流速的增加，泄藤点提前。这是因为，随着吸附液流速的增加，树脂对 于酚酸还没有来得及吸附，吸附液就已经漉出了树脂拄。扶紫外监测韵结果也证实了这 种结果。( 图3 - 3 a b c ) 。 2 b 岫蚰0l 0 l oi 。o i 叩0 i 船0 巍m 蕞悻* ( - l 3 y 疆曲避 f 1 y3 - 2i q a k i n = c u r e 一_，_# 甘薯抗氧化物质的分离提取厦其生物活性的研究 圈3 - 3 髓对树腊暇附酚酲的髟响 f i g3 3e f f e c t s o f c u r r e n tv e l o c i t yo na d s o r p t l c no fp h e n o la c i d 2 3 静态吸附实验结果 如图3 4 、3 - 5 。由图中可以看出，在静态吸附条件下，树脂对于酚酸的吸附明显 变慢，吸附曲线也变缓。在其它条件固定的情况下随着树脂使用最的增加，树脂对于 酚酸的吸附速率加快，由曲线上反映出的就是吸附曲线变陡。在条件允许时，适当增加 树脂的使用量，有利于酚酸的吸附效率的提高。 田3 - 4 静杏曩辩曲蛙 f i g 3 - 4s t a t ea “f o t l o n “h _1_)堪鬟#叫 甘薯抗氧化物质的分离提取度其生物活性的研究 圈3 5 静态吸附的紫外检测 f i g3 5s t a t ea d s o r p t i o n 2 4 废水的预处理对树脂吸附性能的影响( 动态法) 淀粉废水中的一些物质会污染树脂，降低树脂的使用寿命，为了减轻淀粉废水对树 脂的污染，延长树脂的使用周期。提高酚酸的纯度，进行吸附前需要预处理。本实验采 用0 1 c a c l 。、0 i f e s 0 4 作为凝聚剂，对吸附前的废水进行预处理结果见表3 1 。 表3 - l废水的预处理对树脂吸附洗脱性能豹影响 t a b l e 3 - 1e f f e c t o fp r e t r e a t m e n tm e t h o d so nr e s i n sa d s o r p t i o n c a p a c i t