（有机化学专业论文）南海红树林真菌xylaria+sp2508＃培养条件及几株南海海洋微生物代谢产物的研究.pdf

摘要 本文第一部分对海洋微生物活性代谢物的研究进展及研究方法进行了综述， 阐明了海洋微生物活性代谢物的研究对药物开发的意义。由于海洋微生物代谢物 的奇特新颖以及工业上的可持续发展性，进行此研究对开发我国海洋药物资源及 加深海洋生态系统的研究有莫大的益处。 本实验室已经从鹿角菌2 5 0 8 # 的代谢产物中发现了8 个新的缩酮类化合物和 结构奇特的连烯类化合物。由于发酵条件对微生物的代谢有显著影响，为了增加 2 5 0 8 # 菌的代谢产物，本实验第二部分从其产物中分别选取x y l o k e t a la 和e w l b - 5 作为考察目标对鹿角菌2 5 0 8 # 的培养条件进行了研究。以高效液相跟踪代谢物 的产生情况，实验表明，2 5 0 8 # 菌的培养基组成以葡萄糖2 8 6 、蛋白胨o 7 8 、 酵母膏0 3 5 、起始p h 值为8 、海盐浓度2 5 为最佳。在室温静置培养条件下， 2 5 0 8 # 菌的延迟期为2 3 天。4 天后进入对数生长期并可持续7 天左右，培养2 5 夭后取样分析，x y l o k e t a la 和e w l b 5 的产量比培养基条件优化前分别增加 2 0 2 2 和14 7 0 。 本实验第三部分对来自中国南海的海洋放线菌5 0 # 、2 2 1 # 、2 1 9 荐、6 # 与海洋 真菌3 9 4 3 # 、4 3 7 7 # 、5 6 # 进行人工发酵培养，经过初步的提取与分离，从中发现 多种海洋微生物中常见的代谢产物，但暂时未发现具有新结构的化合物。 作者在进行实验研究工作的同时，还参与编写林永成教授主编的海洋天然产 物手j l | ，该书收录了从1 9 7 0 年到现在发现的几乎所有来自海洋生物的天然产物， 全面介绍了它们的生物来源、分子结构、理化性质、波谱数据和药理活性。 关键词：海洋微生物代谢产物培养条件 s t u d i e so nc u l t u r ec o n d i t i o no f t h em a n g r o v e f u n g u s s t r a i n x y l a r i as p e c i e s # 2 5 0 8 a n dm e t a b o l i t e so f s e v e r a l s p e c i e s o fm a r i n em i c r o o r g a n i s m sf r o mt h e s o u t hc h i n as e a a b s t r a c t t h e p r o g r e s sa n di m p o r t a n c eo f r e s e a r c h e so na c t i v em e t a b o l i t e sf r o mt h em a r i n e m i c r o o r g a n i s mw e r ea p p r a i s e di nt h ef i r s tp a r to f t h i st h e s i s t h em e t h o d so fs t u d y i n g t h em e t a b o l i t e so fm a r i n em i c r o o r g a n i s mw e r ea l s oi n t r o d u c e db r i e f l y b e c a u s em a n y m e t a b e l i t e sh a v eu n u s u a l s t r u c t u r e sa n d p o s s i b i l i t i e s t ob e u s e d c l i n i c a l l y a s a g r o c h e m i c a l s ，a n t i b i o t i ca n da n t i t u m o ra g e n t s ，t h er e s e a r c h o nt h e mi ss i g n i f i c a n tf o r m e d i c i n ea n de c o l o g y t h em a n g r o v ef u n g u ss t r a i nx y l a r i as p e c i e s # 2 5 0 8w a sf o u n dt op r o d u c er i c h s e c o n d a r ym e t a b o l i t e s ，w h i c hm a i n l yi n c l u d e de i g h tk e t a la n da l l e n o l i d ec o m p o u n d s w i t hn e ws t r u c t u r e f o rg r o w i n ge n v i r o n m e n tc o u l ds t r o n g l ya f f e c tt h ep r o d u c t i o no f m i c r o o r g a n i s m ，s t u d i e so nt h ef e r m e n t a t i o nm e t h o do f s t r a i n2 5 0 8 # ，w e r er e p o r t e di n t h es e c o n dp a r t r e l a t i o n s h i pb e t w e e nc o n d i t i o n so ff e r m e n t a t i o no f s t r a i n # 2 5 0 8a n d t h ey i e l d so f x y l o k e t a la a n de w l b 5w a sd e t e c t e dw i t ht h eh p l cm e t h o d r e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m a lm e d i u mf o rx y l o k e t a laa n de w l b - 5p r o d u c t i o nb ys t r a i n 2 5 0 8 # w a sc o m p o s e do fg l u c o s e2 8 6 p e p t o n eo 7 8 ，y e a s te x t r a c tp a s t eo 3 5 ， b a y s a l t2 5 a n di n i t i a lp hv a l u e8 w h e ns t r a i n2 5 0 8 # w a sg r o w ni n5 0 0m lf l a s k s c o n t a i n i n g3 0 0m l m e d i u mo nt h es t a t i o n a r yc u l t u r ec o n d i t i o na tr o o mt e m p e r a t u r e ， t h el a gp h a s ew a s2 - 3d a y s ，t h e na f t e r7d a y se n t e rt h el o g a r i t h m i cp h a s ea n dl a s t e d f o r7 - 8d a y s x y l o k e t a laa n de w l b 一5w e r et e s t e da f t e r2 5d a y s ，t h ec o n t e n to f t h e m i n c r e a s e d2 0 2 2 a n d14 7 0 s e p a r a t e l yt h a nt h a to ft h eo r i g i n a lc u l t u r ec o n d i t i o n i nt h et h i r d p a r t ，t h r e em a n g r o v ef u n g i ( 3 9 4 3 # ，4 3 7 7 # ，5 6 # ) a n d f o u r a c t i n o m y c e t e s ( 5 0 撑，2 2 1 # ，2 19 # ，6 撑) f r o mt h es o u t hc h i n as e aw e r ef e r m e n t e da n d t h e i rm e t a b o l i t e sw e r ee x t r a c t e da n di s o l a t e dp r e l i m i n a r i l y m a n yc o m m o nc o m p o u n d s i nm e t a b o l i t e so fm a r i n em i c r o o r g a n i s mh a v eb e e ng o t ，b u tn on e wc o m p o u n dw a s i l f o u n da tp r e s e n t a d d i t i o n a l l y ，t h ea u t h o ro f t h i st h e s i sa l s oc o n t r i b u t e st ot h eb o o k m a n u a lb o o k o fm a r i n en a t u r ep r o d u c t s ”d i r e c t e db yp r o f e s s o rl i ny o n g c h e n g t h i sb o o ks e t sc u t t o g i v eac o m p r e h e n s i v ea c c o u n to fm a r i n en a t u r ep r o d u c t sw i t hd o c u m e n t sf r o m 19 7 0 s t i l l2 0 0 3 ， i n c l u d i n g t h e i r b i o l o g i c a l s o u r c e ， m o l e c u l e s t r u c t u r e ， p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t y , s p e c t r o s c o p i cd a t aa n dp h a r m a c o l o g i c a la c t i v i t y k e y w o r d s ：m a r i n em i c r o o r g a n i s m ，m e t a b o l i t e s ，c u l t u r ec o n d i t i o n l l 中山大学博士后研究工作报告 1 1 引言 第一部分前言 从远古时代，人们就认识到天然产物的药用价值，尽管这方面主要的科技发 展大都集中在化学合成，但从天然产物衍生出药物仍旧对药物的发现有着无尽的 贡献。对化学疗法药物及其来源的分析显示，超过6 0 的被核准的药物是从天 然产物衍生而来的【”。由于对陆生生物资源的长期开发利用，从中发现新的有药 用价值的天然产物的机会越来越少，人们逐渐把目光投向了相对较神秘的海洋生 物资源。国际上海洋活性物质的研究熟潮自2 0 世纪6 0 年代开始，7 0 、8 0 年代开 展了大规模筛选，其中海洋微生物代谢产物的研究是一个重要方向。 海洋占有地球表面积超过7 0 ，海水占了地球总水量的9 0 海洋中有丰富 的生物种类与数量，其数目尚难确定，有人认为海洋生物多样性的丰富程度与地 球物种最丰富的地方一一陆地热带雨林接近，更有人认为海洋拥有世界3 0 0 0 万 种物种中的9 9 1 3 l 。海洋的环境包罗了高压，低营养，低温f 特别是深海) ，无光 照，以及局部高温，高盐等所谓生命极限环境。这种生态环境使海洋生物发展出 多样、复杂和特殊的代谢方式，从而产生的海洋天然产物也具有多样性、复杂性 和特殊性，这正为寻找海洋生物活性物质提供了丰富的源泉。 与一些已经长期开发、频临灭绝的生物相比，海洋微生物的发现和开发利用 极少，其中被分离鉴定的仅有1 左右，因此。海洋微生物基本上是一块未开垦 的处女地。研究人员已从海洋细菌、海洋放线菌、海洋真菌中分离出众多的新化 合物，有些结构类型以前从未在陆生生物中发现过。到1 9 9 0 年代后期，大约有 4 0 种来自海洋的新抗生素被报道，近一半是从来自海洋沉积物的放线菌中得到， 这说明从海洋放线菌中得到新抗生素的几率要大于其它的微生物【4 】。另一方面， 超过1 3 的来自海洋的微生物活性产物是从与海洋动物，特别是海洋无脊椎动物， 和海洋植物相关的细菌中得到这些共生或共栖的微生物，在许多情况下，组成 了宿主的正常菌群，它们产生次级代谢产物在保护自己的微环境的同时也保护宿 主免受致病性微生物的侵害。_ 个典型的例子是靛红，由与虾p a l a e m o n m a c r o d a c 炒l u s 共生的海洋细菌a l t e r o m o n a ss p 产生，它保护虾卵免受致病性真菌 第一部分前言 l a g e n i d i u mc a l l i n e c t i s 的侵害一j 。 很多文献说明，以前认为是其它海洋生物产生的结构独特，有强的生理活性 的天然产物，其实是它们所带的海洋微生物的次级代谢物，例如河豚毒素，海葵 毒素等等，均是微生物产生的，而人工培养繁殖微生物则是大量获取这些珍贵的 活性物质的有效途径因此。海洋微生物是寻找额的特效药物的天然宝库【3 】。 从微生物角度来探索的自然环境，深海是地球上最后一个没有被人类大量涉 足的领域，尽管约6 0 的地球表面被超过2 0 0 0 米深的海水覆盖，但人类对深海 微生物的了解却是极度贫乏的。深海海床是独特的，在这个环境下，生物受到的 最小的压力也有2 0 0 个大气压，还有其它极端环境包括低温、无光照、盐浓度和 氧浓度变化大等等。调查发现，深海沉积物，甚至来自最深的海底，也含有大量 微生物，但很少有研究去分离、培养和鉴定它们”】今天所研究的海洋微生物大 多集中在海水表层和浅海大陆架，已经得出了丰硕的研究成果，如果开发深海这 个生态环境截然不同的微生物资源，相信一定也能带来巨大的收获。 1 2 海洋微生物代谢产物提取分离技术 要找到有用的活性代谢产物，其可能性取决于用于筛选的样品数量，因而选 取活性筛选实验应着眼于快速、经济和典型的基本实验。但就这点来看，由于获 得纯化合物的量一般都很少，所以仅有很少的生物物质被检测过。化学合成可能 可以部分解决问题，但非常不经济，利用生物发酵技术培养海洋微生物生产活性 代谢物是比较可行的方法一旦着手处理活性生物物质，就必须收集大量的样品， 以获得进行生物活性和结构测定所需的最少量的纯化合物【6 1 。 分离海洋微生物活性产物的策略与其它天然产物分离提纯的方法相似。不同 之处在于需要先处理大量非常稀的水溶液，这是因为大部分有意义的代谢产物都 是微生物分泌物，存在于培养液中，并且浓度很稀，因而如何从大量的含各种培 养物质和盐分的培养液中提取出所需要的微量代谢产物成为研究工作的关键1 7 1 。 分离过程是先把微生物培养物过滤得到菌体和培养液，对于大量的培养液可 以使用真空蒸发、薄膜蒸发或真空冷冻干燥进行浓缩，这一过程工作量大，耗时 较多。然后用溶剂萃取法，即由足够的溶剂( 通常是甲醇、乙酸乙酯或丙酮) 进行 萃取，这种方法的特点是需要大量的有机溶剂。分离出活性产物的第一步通常是 中山大学博士后研究工作报告 用不同溶剂按极性梯度进行分离，不同极性的化合物包含在不同的极性部分中。 如果是分离活性成分，则可以由活性测试来确定活性成分所在的部分。水溶性有 机物一般是由正丁醇萃取出的生物碱、氨基酸、多羟基固醇、皂甙等：c h 2 c i 2 含 有中等极性化合物如肽类；在己烷和四氯化碳部分则只有低极性的代谢物f 烃类、 脂肪酸、a c e t o g e n i n 、萜类化合物等) 【6 】。 在对粗提物进一步分离纯化的过程中，用于天然产物分离提纯的现代方法均 可用于海洋微生物的研究，例如重结晶、溶剂萃取和各种色谱方法。对于低和中 等极性含有亲脂性有机物的部分，用标准的正相或反相的柱层析或中压液相色谱 法分离，最后用h p l c 得到单个化合物。对含有水溶性有机物的高极性部分，常 常先除去其中的氧化钠和其它的金属盐类，借助非离子树脂( a m b e r l i t ex a d ) 可以 容易办到然后用s e p h a d e x 柱色谱来分离这些有机物，再避一步用逆流色谱 h p l c ( c i8 或氨基、氰基柱) 得到活性产物1 6 】。 在最近的海洋微生物文献中常用的分离提纯方法是结台生物活性检测的各种 层析方法( 主要是硅胶柱层析、反相柱层折、快速柱层析、h p l c 、g c 、s e p h a d e x l h - 2 0 柱层析和制各t l c ) 的综合运用，以及反复循环高效液相色谱 ( r e c y c l e d h p l c ) 等，而对于近年来发展起来的新技术如高速逆流色谱( h s c c c ) 、 超临界流体色谱( s f c ) 、高效毛细管电泳和胶柬电动毛细管层析( h p c e 和m e c c ) 、 微柱液相色谱( m i c r o l c ) 的运用，则比较少见。 使用吸附剂的方法也偶会看到。比如s h i g e m o r i 等在研究海洋酵母 a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s 代谢物时，先将培养滤液离心得上清液，然后过d i a i o n h p - 2 0 柱，随后用甲酵洗脱，甲醇洗脱组分再用乙酸乙酯水分配萃取后进一步纯 化，得到两个新的二酮哌嗪( 1 和2 ) 及一个新的l ，3 二羟基苯醇衍生物( 3 ) s l 。当然 进一步的分离纯化仍需上面所提到的色谱分离技术。 g h h p h hh 另外，利用分子识别作用的包结分离法在中草药有效成分提取分离方面获得 洲妓 第一部分前言 了应用1 9 ) ，相信此法也可用于海洋微生物代谢产物的分离。总之，由于海洋微生 物代谢产物化学性质的多样性，必须根据具体情况采用不同的提取分离纯化方法。 1 3 海洋微生物代谢产物结构鉴定技术 化合物结构鉴定技术的迅速发展使得生物活性代谢产物的研究取得飞速进 展，过去常用的结构鉴定技术如i r 、u v 、n m r 、m s 等，现在已经发生了巨大 的变化，随着多种新技术的应用，以及与计算机技术的结合，使化合物结构解析 工作趋向高度的自动化和高效率。其中最具影响的是质谱新技术与核磁共振新技 术的出现，大大方便了天然产物结构的鉴定工作，使快速、准确地测定化合物的 结构成为可能f l o 。1 2 l 。 1 3 1 质谱新技术的发展和运用 自从5 0 年代后期以来，质谱就成为有机物结构鉴定的重要方法。随着离子化 方法的不断创新和发展，近年来发展起来并广泛运用的有快速原子轰击( f a b ) 、 液体二次离子质谱( l s i - m s ) 、电喷雾电离( e s i ) 和基质辅助激光解吸电离( m a l d i ) 等。后两种方法由于可以得到完整的分子电离产物，特别有利于生物大分子的研 究，进而催生了生物质谱学这一新的学科。另外，接口( i n t e r f a c e ) 技术的开发和不 断完善，很大程度上扩展了质谱技术的应用，如g c m s 、l c m s 、m s m s 等。 通过这些技术，在寻找新的海洋微生物活性代谢物的过程中，可以实现对大量化 合物的跟踪筛选。 1 3 2 核磁共振新技术的发展和运用 从常规的一维核磁共振谱发展到二维核磁共振谱后，在推导有机化台物结构 方面形成了更客观、更可靠的方法。在海洋微生物代谢产物的结构鉴定过程中， 近年来的文献几乎都运用了各种二维核磁共振技术( 2 dn m r ) 。常见的2 dn m r 技术有d e p t 、同核1 h 1 h 相关谱( 1 h t hc o s y ) 、同核n o e 谱( n o e s y ) 、旋转坐 标系的n o e 谱( r o e s y ) 、双原子滤波相关谱( d q f - c o s y ) 、全程相关谱( t o c s y ) 和异核的异核相关谱( 1 3 c = l hc o s y ) 、氢检测的异核多量子相干相关谱( h m q c ) 、 远程偶台c - h 相关谱( c o l o c ) 、氢检测的异核多键连接相关谱( h m b c ) 。这些技 术已基本满足有机化合物的结构鉴定。 2 dn m r 技术为解决大量复杂天然产物的结构提供了有效的手段。但是若 中山大学博士后研究工作报告 分子量增大到一定程度时，2 dn m r 图谱上存在相关峰严重重叠以致无法解析与 归属的现象，因而在蛋白质等生物大分子的结构解析上存在一定的困难。将两组 2 d 脉冲序列巧妙地组合，并在2 dn m r 基础上导入第三维脉冲频率，可极大地 减少谱峰重叠提高信号的分辨率，即3 d n m r 技术。近年来，3 d n m r 脉冲序 列发展十分迅速，应用较多的有同核n o e s y - n o e s y 、t o c s y - n o e s y 和 t o c s y - t o c s y ，异核h m q c c o s y 、h m q c - n o e s y 、h m q c 。h o h a h a 和 h s q c - t o c s y 、h s q c - n o e s y 等。3 dn m r 主要用于生物大分子的序列指认， 同时也得到其它信息如蛋白质分子在溶液中的二级结构，对确定复杂天然产物结 构提供了更有效的手段。 1 4 培养条件对海洋微生物的影响 海洋是地球上早期生命的诞生地，环境十分独特，包罗了高压、低营养、低 湿、无光照，以及局部高温、高盐等等所谓生命极限的环境，从海洋分离到 的微生物往往具有嗜盐、嗜碱、嗜热、嗜压等生理特性，所以绝大多数海洋微生 物不能在目前应用的培养基中生长繁殖，必须在特定的极端环境条件下才能生存 繁衍，它们与常见的微生物很不一样，大部分是前所未见的新种属。例如从福建 沿海海泥和深海海泥中分离到一批嗜冷和嗜碱的微生物它们的生长需要极碱性 的环境( p h l o 或以上) ，也需要低的温度( 零度则能生长，2 0 就生存不下去) 。这 些微生物能产生各种活性物质，包括淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等，而这些酶具有 独特的性能，即在低温和高碱性的环境里，酶的活性特别刮1 3 1 。 微生物的种类和数量都明显地随着环境的不同而变化，环境条件越多样化， 越能造就生存繁衍的微生物种类的多样化，越有可能分离到新种属的微生物。以 近海来讲，虽说所生存的微生物有可能来自陆地，但由于长期适应海洋的环境， 从而倾向于形成新种属。即使有一部分从经典的分类意义上与一些陆栖微生物菌 属十分相似，但由于适应了海洋环境，既显示出一系列待殊的生理性状，也具备 有不同的遗传背景，构成新的亚种。例如一些放线菌的抗菌活性只在海水配制的 培养基中才有，这种现象可能就是对海洋环境的适应【】。 如何把更多的海洋微生物分离并培养出来是很多科学家期待解决的问题。由 于各种微生物所需要的培养条件极不相同，任何一种培养基或培养条件，都不可 第一部分前葺 能满足海洋样品中哪怕很小的微生物群落的需要。因此，分离培养基成分和条件 的设计，是培养方法中最关键的因素。尽管如此，人们在海洋微生物研究方面已 经有了很多经验，已经获得了很多种类的海洋微生物，并进行了大量的研究，取 得了丰富的成果。海洋微生物的分离培养条件与陆生菌有所不同，需要根据海洋 的各种生态环境、海水的营养组成、生境的理化条件等，设计不同的培养基和培 养条件，以获得所需种类。 海洋微生物的多样性为海洋微生物生物活性物质的开发提供了基础，而生长 环境不同时，同一微生物往往可能发展出不同的代谢途径，导致产生不同的代谢 产物。多位学者注意到，海洋微生物生物活性物质的产生是受培养基组分及培养 条件影响的。有学者研究培养基营养成分的浓度及菌种的培养条件对1 2 株海洋放 线菌的抑菌活性的影响结果表明，用海水( 含3 5 n a c i ) 制各的高氏i 号培养基 ( p h7 2 1 、2 2 培养时，能表现抑菌活性的菌株数最多；但减少培养基的营养成分， 改变氮源、n a c i 浓度、p h 和培养温度，部分菌株可表现新的抑菌活性，或使原 有的抑菌活性有较大的提商i s s | 1 5 产活性物质海洋微生物的筛选 微生物次级代谢产物提供了具有新颖结构和有效生物活性的大量资源，很多 产物或经过化学改造的产物用于人和动物的疾病治疗。经过几十年的对大约数百 万微生物密集的筛选，得到了这些产物。文献已经报道了数千个化合物，这些过 去的成就使得从微生物中得到新的活性代谢产物变得更加困难。但因为菌株的种 类巨大，仍然有新的微生物活性代谢产物不断被发现i j “。 然而，不是所有的微生物都具有同等的产生活性代谢产物的能力。在进行筛 选工作时会遇到两个问题，一是大量的微生物需要筛选，二是它们产生活性次级 代谢产物的潜能1 1 7 l 。 对于筛选的目标微生物，其次级代谢产物受到营养成分和培养条件的极大影 响。一个早期的例子是在赖氨酸存在时青霉素的生物合成受到抑制f i7 1 。丽改变氮 源，就可以使p n e u m o c a n d i n s 一抗真菌药c a n c i d a s 的前体，产量提高l o 到2 0 倍f 1 8 】。然而在预先不知道何种代谢物会被检测到时，这种办法就难以应用。通常 的方法是对每一个菌株都使用几个生长条件( 包括培养基变化、培养时间和其它因 6 中山大学博士后研究工作报告 素) 来研究i 博1 ，但在实际中它限制了对每一个微生物培养条件研究的数量，通常 对每个菌株只有有限的3 到5 个条件进行研究1 2 0 l ，这样效率低下，并有可能降低 次级代谢物的产率。有研究报道利用h p l c - - d a d ( d i o d e - a r r a yd e t e c t i o n ) 来协助研 究不同菌株产生次级代谢物的培养条件，可以提高所研究的菌株和培养条件的数 量，大幅提高筛选的效率【”l 。应用分子生物学技术能够大大提高从样品中捡测和 分离需要的微生物菌株的效率。例如应用遗传媒介e s a c ( e c o l i s t r e p t o m y c e s a r t i f i c i a lc h r o m o s o m e ) 帮助从样品中检测和分离放线菌【i 。 微生物产生次级活性代谢产物的潜力的检测，需要筛选它们产生的大量不同 的化合物，并且设计各种实验来检测它们的药理活性。现在，筛选大多使用高通 量筛选( h t s ) 。h t s 的大量运用得归功于巨大的化合物库以及通过基因组序列测 定获得的大量的目标物，因而确定颏的生物活性物质的关键在于化含物库的质量 以及用来筛选的实验1 1 6 l 。高效液相色谱与质谱联用技术( h p l c - m s ) 早已应用于天 然产物的分析测定，但标准的h p l c m s 通常只能用于测定比较纯的样品，对于 微生物代谢产物的粗提物则由于信号过于混杂而无能为力，现在有研究通过改进 样品处理方法使得h p l c m s 可以从粗提物中鉴定出目标活性物质【2 ”。 1 6 结语 近年来，关于海洋微生物生理活性物质的研究进展迅速，这一资源产生新药 的巨大潜力不容忽视。而我国迄今拥有自主知识产权的创新药物极少，加入w t o 更迫使我国科研工作者必须通过源头创新。来发现新型结构和特殊功能的天然产 物，开发有自主知识产权的创新药物，种类繁多且数量巨大的海洋微生物为此提 供了丰富的研究对象。 海洋微生物所产生的生物活性物质，能通过发酵进行胞外生产，与现代的微 生物技术相结合，较容易实现工业化生产。在这方面，其不像来源于其他海洋生 物( 如海绵、珊瑚、海兔等) 的生物活性物质生产不同程度地要受到天然资源难 再生的限制。由于发酵生产，如果再通过分子的化学改造或在发酵过程中进行生 物改造，则可能获得许多更加高效、更加安全的新药。 对于海洋微生物生物活性物质的研究，可以有以下几个方面：继续通过加深 对海洋微生物尤其是非可培养微生物的生态分布规律及其多样性的了解，寻找和 第一部分前言 发现新型化合物；确定影响活性物质的初级和次级代谢的遗传、营养和环境因素， 作为开发新的、高级产品的基础：鉴定具有生物活性的化合物，并确定它们的作 用机理和活性功能，为新的活性物质在医药和化工上的应用提供导向1 2 ”。 目前国际上对海洋微生物新资源的开发研究几乎都在同一起跑线上，本试验 室在林永成教授的带领下，已经在海洋微生物活性代谢产物研究方面取得大量成 果，在国际上产生较大的影响，并在国内海洋活性物质研究领域确立了领先地位。 我国是海洋大国，拥有渤海、黄海、东海、南海四大海域，面向广阔的太平洋 地理条件差异大，海洋微生物资源极其丰富，充分利用我国海洋微生物的资源优 势研究开发具有我国自主知识产权的海洋微生物天然产物，不仅具有必要性和 紧迫性，而且具有美好的应用前景。 中山大学博士后研究工作报告 2 1 引言 第二部分x y l a r i as p 真菌2 5 0 8 # 培养条件的研究 大部分的海洋真菌都可以在红树林里找到，来自红树林的真菌构成了最大的 海洋真菌的生态亚组。虽然对红树林真菌的研究才短短几年，但是从中已分离到 数十个有意义的新化合物，这些工作表明红树林真菌具有产生新化合物的潜力， 因此海洋真菌特别是红树林内生真菌近年来受到人们的重视。 红树林是热带和亚热带沿海地区特有的植物群落，一般生长在海岸及河口潮 - r 间带泥地，处于海洋与陆地的交界地带，为大量的生物如鱼类、虾类，甲壳动物， 鸟类提供了栖息场所，形成了特殊的生态环境。由于受到陆地降雨的冲刷，加之 沉积着许多动植物的尸体，与大洋海水相比有较多的微生物生长所必需的营养， 因此是一个藻类、浮游生物，细菌和真菌的丰富的聚集地。寄生在红树林内的红 树林内生真菌( e n d o p h y t i cf u n g i ) ，是生长在植物的组织间，但不会对所在宿主植 物引起伤害的真菌，它们与植物宿主之间存在着拮抗平衡。 本实验室在林永成教授带领下，于国内率先开展了红树林内生真菌的代谢物 研究工作，从南海红树林内生真菌中发现了许多具有抗菌、抗癌活性的化合物i ”? 2 4 o 特别是在红树林内生真菌x y l a r i as p 2 5 0 8 # 中发现的代谢物更多，已经从中发 现了一系列新的聚酮类化合物和结构奇特的连烯类化含物2 5 ，2 6 1 。 2 2x y l a r i a 属真菌的研究进展 x y l a r i a 称为鹿角菌，也叫炭角菌，它能长出像鹿角一样的子座，和冬虫夏草 等同属子囊菌门。x y l a r i a 在自然界的分布很广，在倒下的树木，落下的果子和 叶子里都有可能发现它的存在。鹿角菌生命力很强，在同其它真菌竞争的过程中， 它能形成一层假菌核型的菌丝界面，阻止其它真菌的入侵2 。近年来对此类菌的 研究才热门起来，但对于海洋x y l a r i a 属真菌代谢物的研究还未见报道。 s i n g h 等从x y l a r i as p 中分离到一个雅槛蓝烷类化合物“) ，是h i v - l 整合酶 9 第二部分x y l a r i as l x 真菌2 5 0 8 # 培养条件的研究 催化的独特抑制剂，能够以3 l o u m 的浓度抑制由h i v - 1 整合酶催化的3 - e n d 过 程、链交换和蜕变反应f 2 引；从来自北美东部的l i q u i d a m b a rs t y r a c i f l u a 落下的果 实中分离到的x y l a r i ap e r s i c a r i a 培养物中，得到两个与( 4 ) 结构类似的物质 x y | a r e n a la ( 5 ) 和b ( 6 ) ，能够与神经肽y ( n e u r o p e p t i d ey n p y ) y 5 受体结合，是 n p y 的竞争性抑制剂，遗传学和药理学研究认为y 5 受体与调节食物摄取和体重 有关【2 9 1 。 56 松胞菌素是一种对哺乳动物的细胞有极强毒性的毒素。从x y l a r i ao b o v a t a 中 得到两个松胞菌素( c ”o c h a i 够i n ) ( 7 ) 和( 8 ) ，具有较强细$ 毒性p o j 。x y l a r i ah y p o x y l o n 来自含有腐烂木屑的泥土，从中也分到9 个松胞菌素类化合物，其中6 个是没有 从其它微生物中得到过的【3 。 7r = a e 8r - h 另外还有一些关于从x y l a r i a 属中分离得到新的化合物以及它们生物合成研 究的文献报道。 o 中山大学博士后研究工作报告 2 3 鹿角菌2 5 0 8 # 代谢产物研究情况 鹿角菌2 5 0 8 # 的菌种是由香港城市大学的e b gj o n e s 教授和l l p v r i j m o e d 博士提供，来自香港梅陂( m a i p o ) 的一种红树( a n g i o s p e r m ) 的种子，经鉴定为鹿角 属，是一个新种，种名未定。吴雄字博士、尹文清博士和冯爽硕士对鹿角菌2 5 0 8 # 的代谢产物进行了研究，从中发现了8 个新的缩酮类化合物( 9 ，1 0 ，l l ，1 2 ，1 3 ，1 5 ) 和结构奇特的连烯类化合物( 1 6 ，1 7 ) ，初步药理试验显示，x y l o k e t a la ( 9 ) 有抑制乙 酰胆碱酯酶的作用( 1 5 1 0 一m o l l ，p o 0 1 ) t 2 6 3 2 , 3 矾。 淤一 9x y l o k e t a la1 0 x y l o k e t a lb 11 x y i o k e t a lc 墨三墅坌垄塑坐翌：墨堕! ! ! ! ! 苎鲞苎堡竺堡塞 吴雄宇博士和冯爽硕士研究发现，鹿角菌2 5 0 8 # 在静置培养时呈块状，长老 后菌体会长出发达的子座，有分支如鹿角，有些是白色，有些上部白色而底座为 青黑色；静置培养时菌体若浮在水面上则溶液易成为红色，否则很长时间颜色都 没有大的变化。从分离到的化合物中也发现可能代谢过程中该菌产生较大量的酚 类化合物，所以易氧化变成红色。采用发酵罐进行工业培养时，真菌为珍珠状， 淡粉红色。培养液是红色的；鼓风通气，风量为每小时4 4 立方米，培养时间比 静置培养说短九到十倍。约为8 6 小时，因而推测该菌嗜氧( 3 3 1 。 2 4 鹿角菌2 5 0 8 # 发酵条件研究 在前面的研究中，对鹿角菌2 5 0 8 # 的发酵条件只进行了静置和通气培养的初 步比较，已经获得多个有意义的化合物，分为连烯化合物和缩酮化合物两大类。 本研究将从2 5 0 8 # 菌发酵液中这两类化合物含量的角度出发，考察发酵条件对它 们产量的影响。 结构独特的x y l o a l l e n o i d a ( 1 7 ) 中间部分是肉桂酸，它广泛存在于高等植物和 真菌中，具有抑制植物生长和孢子发芽的作用，而它的连烯醚却具有抗 c l a d o s p o r i u mc l a d o s p o r i o i 咖5 真菌的活性1 3 ”。在2 5 0 8 # 菌所产连烯化合物中，以 e w l b 5 ( 1 8 ) 产量最多，它的结构中也含有肉桂酸和连烯醚，因而采用e w l b 5 ( 1 8 ) 作为代表考察发酵条件对连烯化台物产量的影响。 1 8e w l b 一5 从海洋天然产物发现的很多缩酮类化合物具有强烈的生理活性，例如从萏藓 虫中分离的b r y o s t a t i n1 ，从海绵得到的h a l i c h o n d r i nb 和i s o h o m o h a l i c h o n d r i nb 都含有缩酮基，有很强的抗癌活性，在欧美已进入二期临床试验。2 5 0 8 # 菌所产 x y l o k e t a l s 结构异常新颖而且资源易得，开发它们的药物用途极具吸引力1 3 。本试 验以x y l o k c t a la ( 9 ) 为代表考察发酵条件对缩酮化合物产量的影响。 中山丈学博士后研究工作报告 2 4 1 材料与方法 2 4 1 1 试静l 与实验仪器 葡萄糖为化学纯，蛋白胨b r ，酵母膏b r ，粗海盐( 微生物养殖用) ，异丙 醇为分析纯，其它实验用试剂均为市售a r 试剂。 a g i l e n t1 1 0 0 型高效液相色谱仪：w a t e r s 5 1 5h p l c 泵：w a t e r s2 4 8 7 双波长检 测器：浙江大学n 2 0 0 0 双通道色谱工作站。 2 4 1 2 培养基 ( 1 ) 菌种保存用斜面培养基 葡萄糖 1 o 酵母膏0 1 蛋白胨0 2 p h 值 7 5 n a c i3 琼脂1 5 2 o ( 2 ) 种子培养基 葡萄糖 1 0 酵母膏 o 1 蛋白胨o 2 p h 值 7 5 粗海盐3 ( 3 ) 基础试验培养基 葡萄糖 2 0 蛋白胨0 6 p h 值 7 5粗海盐o 2 5 5 0 0 m l 三角瓶中装3 0 0 m l 培养液。 2 4 1 3 菌体生长的测定 从斜面培养基上挑取生长良好的菌体，接入经1 2 1 ( o 1 m p a ) 高温灭菌l 5 m i n 的种子培养基，培养7 天后接入同样经高温灭菌的基础试验培养基，接种量5 。 在不同的培养基中培养一定- 时间后取出菌体，4 0 0 0 r p m 离心5 r a i n ，倾去上层 培养液，蒸馏水洗涤后再次离心，称量得菌体湿重。根据不同的菌体湿重判断菌 体生长状况。 2 4 1 4x y l o k e t a la 与e w l b - 5 含量测定 取上述离心所得上层培养液，定容至3 0 0 m l ，o 4 u m 微孔过滤后取3 m l ，加 入5 0 0 l 异丙醇甲醇溶液( o 4 1 8 7 8 l ) ，然后再补加3 m l 甲醇，微量进样器取1 0 0 9 l 进行h p l c 分析。色谱条件：8 0 甲醇一水溶液( v v ) ，w a t e r sc 1 8 分析柱，柱温 2 8 ，流动相流速0 5m l m i n ，检测波长2 2 0 n m 。 以内标法测定x y | o k e t a l a 与e w l b 5 含量，内标物为异丙醇，x y l o k e t a l a 和 e w l b 5 对异丙醇的相对校正因子分别为o 5 2 8 8 和1 3 6 0 9 ，图2 1 分别是采用乙 酸乙酯溶解x y l o k e t a la 、e w l b 5 纯品和异丙醇的h p l c 色谱图，以及测定样品 的色谱图。 图2 1x y l o k e t a la 、e w l b - 5 与异丙醇的h p l c 图谱 f i g 2 - lh p l cs e p a r a t i o nc h r o m a t o g r a mo f x y l o k e t a l a e 、l b 一5a n d i s o p r o p a n o l 2 4 1 5 培养条件对鹿角菌2 5 0 8 # 产x y l o k e t a la 与e w l b - 5 的影晌 在基础实验培养基的基础上，分别改变碳源、氮源、起始p h 值、盐浓度、 碳源和氮源浓度，5 0 0 m l 三角瓶装3 0 0 m l 培养基，室温( 2 8 3 2 c ) 静置培养2 5 天， 中山大学博士后研究工作报告 考察它们对2 5 0 8 # 菌的生长及产x y l o k e t a l a 与e w l b 5 的影响，确定最佳的培养 条件。每组实验重复三次，结果取平均值，正负误差线表示实验数据与平均值的 差距。 碳源：分别以葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉、丙三醇、糊精、 单硬腊酸甘油酯代替基础培养基的碳源，浓度为2 。对2 5 0 8 # 菌进行培养。 氮源：分别以蛋白胨、酵母膏、尿素、干酪素、硝酸钠、硫酸铵代替基础实 验培养基的氮源，浓度为0 2 ，对2 5 0 8 # 菌进行培养。 起始p h 值：改变基础实验培养基的p h 值，用n a o h 和h c i 调节p h 值为4 、 5 、6 、7 、8 、9 、1 0 ，对2 5 0 8 # 菌进行培养。 盐浓度：改变基础实验培养基的盐浓度，分别为0 、0 1 、0 3 、o 5 、1 5 、 2 5 、3 4 、4 、6 、1 0 ，怼2 5 0 锚菌进行培养。 碳源和氮源浓度：在前面所作改变碳源和氮源实验基础上，选择合适的碳源 和氮源，改变它们的浓度，对2 5 0 8 # 菌进行培养。 碳源和氮源组台：采用响应面分析法，确定最佳的碳源和氮源组成。 培养时间：采用已经确定的培养基条件，接种后每4 天取样测定，确定2 5 0 8 # 菌在室温下静置培养的时间。 2 4 1 6 表面活性剂对鹿角菌2 5 0 8 # 的影响 在实验1 4 1 5 确定的培养基中添加不同浓度的t r i t o nx 1 0 0 、t w e e n8 0 、s p a n 6 0 ，对2 5 0 8 # 菌进行培养，考察它们对鹿角菌2 5 0 8 # 的影响。 2 4 2 结果与分析 2 4 2 1 碳源对鹿角菌2 5 0 8 # 声：x y l o k e t a la 与e w l b 5 的影