（物理化学专业论文）荧光探针的制备及表征.pdf

学位论文版权使用授权书 l i lllli ii it l l l l l ll l l l l l l l t l l l l l l y 18 9 5 12 7 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文 的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后适用本授权书。 不保密。 学位论文作者签名：乃蜕 加l f 年月f 日 指剥币躲弦又却 争df f 年6 月习 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：石1 冼纥 日期：沙l ，年6 月r 日 ， 江苏大学硕士学位论文 摘要 荧光检测技术具有方便快捷、灵敏度高、选择性好等优点，因此荧光识别 检测成为选择性检测特定物种的良好选择。近年来对于与生命、环境相关的阳离 子( 主要是金属离子) 的分子荧光传感器已经被广泛研究，在环境化学、生物化 学以及细胞生物学等方面的应用也取得了一些进展。 本文主要对生命体系中一些重要金属离子目标底物，重点做了以下三方面 的工作： 首先通过微乳法一步合成了s i 0 2 包覆f e 3 0 4 的磁性纳米颗粒并通过硅烷偶 联剂将表面氨基化，进一步通过化学成键将荧光分子葸修饰到氨基化的纳米粒子 表面，制得l 1 。采用x r d ，t e m ，f t i r 等实验方法对该粒子进行一系列的表 征，该纳米粒子直径约为9 n m ，常温时具有超顺磁性，通过外加磁场，能够使粒 子从溶液中简单有效地分离。该粒子在溶剂中具有较好的分散性，荧光实验表明， 对锌离子有好的金属离子选择性，在锌离子存在下基于p e t ( p h o t o i n d u c e d e l e c t r o nt r a n s f e r ) 机理，粒子荧光强度显著增强，检测下限为2 8 5 7 1 1 0 巧m o l l 在上面研究内容的基础上，先用8 氨基喹啉与异氰酸丙基三乙氧基硅烷反 应，得到的物质再水解包裹f e 3 0 4 ，制备出一种对铜离子具有荧光猝灭响应的磁 性纳米粒子l 2 ，在1 0 m o l l 1 0 4 m o l l 范围内有较为明显的荧光响应，所以该 分子可以被用来检测c u 2 + 。同时也采用x r d ，t e m ，f t i r 等实验方法对该粒 子进行一系列的表征，该离子同样在常温时具有超顺磁性，通过外加磁场，能够 使粒子从溶液中简单有效地分离。 最后利用席夫碱反映原理设计合成了基于9 葸醛的新型铜( i i ) 荧光分子探针 名称l 3 ，运用红外、核磁等手段进行了结构表征，考察了其对不同金属离子的 荧光性质。结果表明，其对c u 2 + 有很好的选择性，并在3 3 1 0 - 51 2 3 1 0 4 m o l l 范围内有较为明显的荧光增强响应，所以该分子可以做为增强型c u 2 + 的检测传 感材料。 关键词：锌离子，铜离子，荧光，超顺磁，纳米粒子，葸 荧光探针的制备及表征 i i 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t d u et ot h eh i g hs e n s i t i v i t ya n de x c e l l e n ts e l e c t i v i t yo ff l u o r e s c e n c et e c h n i q u e ， f l u o r e s c e n tm o l e c u l a rr e c o g n i t i o nh a sb e c o m eo n eo ft h em o s ta t t r a c t i v em e t h o d sf o r d e t e c t i o no fs p e c i f i cc o m p o u n d s r e c e n t l y ，t h em o l e c u l a rf l u o r e s c e n ts e n s o r sf o r c a t i o n s ( m a i n l yt h em e t a lc a t i o n s ) ，w h i c ha r e e s s e n t i a lt of o rl i f es c i e n c ea n d e n v i r o n m e n t a ls c i e n c e ，h a v eb e e nw i d e l ys t u d i e d t h i st h e s i si sf o c u s e do nt h ei n v e s t i g a t i o no ff l u o r e s c e n tr e c o g n i t i o no fe s s e n t i a l m e t a li o n si nb i o s y s t e m s ，a n dt h r e ep a r t sw e r ei n c l u d e da st h ef o l l o w i n g ： f r i s t l y ，s i l i c a - c o a t e di r o no x i d em a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s ( m n p ) w e r es y n t h e s i z e d b yo n e - s t e pm i c r o e m u l s i o nm e t h o da n dt h es u r f a c ew a sa m i n a t e dt h r o u g ht h e a m i n o s i l a n ec o u p l i n ga g e n t s u b s e q u e n t l yf l u o r e s c e n tm o l e c u l a ra n t h r a c e n ew a s g r a f t e dt ot h es u r f a c ev i aa na m i d eb o n d t h ea n t h r a c e n em o d i f i e dn a n o p a r t i c l e s ( a m n p ) w e r ec h a r a c t e r i z e db yx r d ，t e ma n df t i r t h en a n o p a r t i c l e ss h o w e da s u p e r p a r a m a g n e t i cp r o p e r t ya tr o o mt e m p e r a t u r ew i t h t h ed i a m e t e ro f 9 i l 】【i la n dc a n b ee a s i l ys e p e r a t e df r o mt h es o l u t i o ni nt h ep r e s e n c eo fa ne x t e r n a lm a g n e t t h e p a r t i c l e sh a v eg o o dd i s p e r s i o ni ns o l v e n ta n df l u o r e s c e n c ee x p e r i m e n t ss h o w e dt h a t t h ep a r t i c l e sh a de x c e l l e n ts e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t yf o rz i n ci o n s t h ep a r t i c l e s e x h i b i t e df l u o r e s c e n c ei n c r e a s eu p o nt h eb i n d i n go ft h ez n + b a s e do nt h ei n h i b i t i o n o ft h e p h o t o i n d u c e de l e c t r o n t r a n s f e r q u e n c h i n gm e c h a n i s m t h e f l u o r e s c e n c e d e t e c t i o nl i m i tf o rz i n ci o n si s2 8 5 7 1 1 0 - 5 m o l l o nt h eb a s i so fa b o v er e s e a r c h ，a n o t h e rm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sw i t hf l u o r e s c e n t p r o b e f u n c t i o n w e r e p r e p a r e d 8 - a m i n o q u i n o l i n e w a sr e a c t e dw i t h 3 - i s o c y a n a t o p r o p y l t r i e t h o x y s i l a n ef i r s t l y ，t h e nh y d r o l y z e di nt h ep r e s e n c eo ff e 3 0 4 t o g e tt h ec o r e s h e l ls t r u c t u r e t h e s ep a r t i c l e sa l s oh a v eg o o dd i s p e r s i o ni ns o l v e n ta n d f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yq u e n c h e de v i d e n t l ya tt h ec o p p e ri o n sc o n c e n t r a t i o nb e t w e e n 10 。5 m o l la n d10 4 m o l l x r d ，t e m ，f t i ra n do t h e re x p e r i m e n t a lm e t h o d sw e r e u s e dt oc h a r a c t e r i z et h e s en a n o p a r t i c l e s i na d d i t i o n ，t h e yh a v es u p e r p a r a m a g n e t i c p r o p e r t yr o o mt e m p e r a t u r ea n dc a nb es e p a r a t e ds i m p l ya n de f f e c t i v e l yf r o mt h e s o l u t i o nb yt h ee x t e r n a lm a g n e t i cf i e l d i i i 荧光探针的制备及表征 l a s t l y ，as i m p l em o l e c u l ee n q u i nh a v eb e e nd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e da st h e f l u o r e s c e n th o s t su s i n gm e t h o do fs y n t h e s i z i n gs c h i f f - b a s e i tw a sc h a r a c t e r i z e db yi r a n dn m r f l u o r e s c e n te x p e r i m e n tr e s u l t ss h o w e dt h a ti th a sg o o ds e l e c t i v i t yf o r c o p p e ri o n sa n df l u o r e s c e n ti n t e n s i t yi n c r e a s e dw h e n t h er a n gb e t w e e n3 3x10 5a n d 1 2 3 1 0 4 m o l l k e yw o r d s ：z n 2 + ，c u 2 + ，f l u o r e s c e n c e ，s u p e rp a r a m a g n e t i c ；n a n o p a r t i c l e s ； 江苏大学硕士学位论文 目录 第一章绪论1 引言1 1 1 研究进展l 1 1 1 喹啉类2 1 1 2 葸醛类3 1 2 荧光探针6 1 2 1 荧光探针简介6 1 2 2 荧光基础理论6 1 2 3 荧光探针的选择8 1 2 4 荧光探针技术在高科技中的应用9 1 3 分子荧光探针的分子识别机理1 1 1 3 1 光诱导电子转移1 1 1 3 2 电荷转移1 2 1 3 3 激基缔合物( e x c i m e r ) 1 2 1 3 4 荧光共振能量转移1 2 1 3 5 基于其他原理设计的荧光分子探针1 2 1 4 磁性纳米材料一13 1 4 1 磁性纳米材料的性质1 3 1 4 2f e 3 0 4 磁性纳米粒子的分散及表面修饰13 1 4 3 荧光磁性纳米复合物1 4 1 4 4f e 3 0 4 荧光磁性复合粒子在生物中的应用1 5 1 5 课题主要研究内容及创新点15 1 5 1 本课题主要研究内容15 1 5 2 课题创新点1 6 第二章 f e 3 0 4 s i 0 2 a n 磁性纳米荧光粒子的制备及对锌离子的识别1 7 2 1 引言17 2 2 实验部分18 2 2 1 实验试剂1 8 2 2 2 实验仪器18 2 2 3 实验方法：。1 9 2 3 结果与讨论2 0 2 3 1 红外测试分析2 0 2 3 2t e m 2l v 荧光探针的制备及表征 2 3 3x r l ) 2 2 2 3 4 磁性分析2 3 2 3 5 荧光检测2 4 2 4 结论。2 6 第三章基于8 氨基喹啉的新型c u ：+ 磁性荧光分子探针的合成、表征及荧光性能 的研究2 7 3 1 引言2 7 3 2 实验部分2 8 3 2 1 实验试剂2 8 3 2 2 实验仪器2 8 3 2 3 实验方法2 9 3 3 结果与讨论3 0 3 3 1 红外测试分析3 0 3 3 2t e m 3 1 3 3 3x r d 3 2 3 3 4 磁性分析。3 3 3 3 5 荧光测试3 4 3 3 结论3 7 第四章基于9 葸醛的新型c u 2 + 荧光分子探针的合成、表征及荧光性能的研究 ：；8 4 1 引言3 8 4 2 实验部分3 8 4 2 1 实验试剂及仪器3 8 4 2 2 实验方法3 8 4 3 结果与讨论3 9 4 3 1 红外分析：3 9 4 3 2 核磁4 1 4 3 3 荧光性能测试4 l 4 4 结论4 4 第五章结论与展望4 5 参考文献4 7 致谢5 7 攻读硕士学位期间发表的学术论文5 9 江苏大学硕士学位论文 引言 第一章绪论 光学探针【l 】作为分析化学、有机化学、光物理化学和超分子化学等多学科交 叉的重要研究领域，在生化检测、环境监控、疾病诊断和药物筛选等领域发挥着 重要的作用。随着2 1 世纪生命科学的迅猛发展，在揭示和了解生命的奥秘、疾病 的诊断与治疗、环境监测等重要科学研究领域，对光学探针技术提出了大量崭新 的课题，目前主要集中在蛋白质、核酸和多肤等生物大分子分析，生物药物分析， 超痕量和超微量生物活性物质分析等。 它是一类能特异性识别目标分子并适合直接检测或带有可检测标记物的高 效探测试剂。光学探针一般具有两个特性：一为化学活性；二是光学活性。化学活 性是指探针含有易与待分析物发生反应( 包括配位、包合和基团反应等) 的活性基 团；光学活性则指探针与待分析物作用后其光学响应( 包括波长、强度等) 产生变 化。 与一般测定方法相比，光学探针技术具有专一性好、灵敏度高和快速准确等 特点。性能优良的光学探针，应同时考虑其灵敏度、选择性和实用性。光学探针 的灵敏度取决于待分析物与光学分子作用后对光学响应的改变程度。理想的光学 探针是其本身无光学响应，与待测分子作用后则产生强的光学信号。 由于大多数生物分子本身无荧光或荧光较弱，为使其高灵敏地检出，常利用 光学探针与待测物进行反应，生成具有高荧光强度的物质来进行检测，从而达到 对生物活性氧和某些具有重要功能的生物分子的原位、适时和动态的表征。近年 来，人们在光学探针的研究方面取得了长足的进展，开发并商品化了一系列的光 学探针。尽管目前已经有一部分商品化的探针试剂，但其远未能满足医学和生命 科学研究的需要。因此，努力设计开发选择性好、灵敏度高且适合更多目标物的 探针分子，并为日常检测所应用仍然是研究目标。 1 1 研究进展 本文主要考察了以蒽环为母体和以喹啉为母体两类荧光团： 荧光探针的制备及表征 1 1 1 喹啉类 喹啉及其衍生物【2 】，常见类型包括氨基喹啉和羧基喹啉及其衍生物类，使用 最广泛的类型是以8 氨基喹啉和8 羟基喹啉为基体，其中几种具有代表性的探针 分，别是t s q ，z i n q u i n a ，q q b ，d a n q u i n 和t a e a i r 一7 8 0 等。 t s q ( 见图1 1 所示) 【3 j 是源于1 9 8 7 年最初用于神经细胞中锌的荧光成像，是 生物荧光技术发展史上的一个里程碑t s q 和z n 2 + 结合后激发和发射波长分别位 于3 8 0 n m 和4 9 5 n m 荧光强度增强1 0 0 倍，但t s q z d + 络合物的结构和稳定常数 ( t s q z n 2 + 可能以1 ：1 或2 ：1 的形式络合不确定) ，还有络合物的荧光强度在不 同介质中变化较大，所以用t s q 进行z d + 的定量分析还有待进一步的研究。 为了提高t s q 的水溶性和透膜性z a l e w s k i 等在t s q 的6 位上引进了酯基， 生成z i n q u i n ( 见图1 2 所示) 【4 】。z i n q u i n 能检测的z n 2 + 浓度范围在1 0 0 p m o l l 1 0 n m o l l 之间，z i n q u i n 在酶的作用下水解生成羧酸根阴离z i n q u i n a ( 见图1 2 所 示) 后可以长时间停留在细胞内，从而考察z n 2 + 在细胞生长规律中的作用，对 细胞f l z d + 动力学进行研究其激发和发射波长分别为3 7 0 n m 和4 9 0 n m 。 c h ， e t 0 2 c 图1 1t s q ( 入e m = 4 9 5 n m ，图1 2 ( i ) z i q u i n ( 至) z i n q u i na c i d 入e x = 3 3 4 n m ) 同样是为了提高t s q 类荧光探针的水溶性，刘育等【5 1 将水溶性的1 3 环糊精引 入至u t s q 分子的设计中合成了分子1 ( 见图1 3 所示) 。该探针分子已经被用于巨 噬细胞d p z n 2 + 的荧光成像。 江苏大学硕士学位论文 o 图1 3 分子1图1 4q q b 吴红梅等【6 】设计合成了q q b ( 见图1 4 所示) 。该探针与z n 2 + 结合后荧光发射 光谱由4 0 5a m 红移至u s l 0a m ，且荧光强度增强，具有较高的检测灵敏度。 以上几种荧光探针的激发光都是紫外光，而紫外激发容易对生命细胞产生伤 害，也会产生z n 2 + 动力学活动的假象。在氨基喹啉的基础上，添加一个1 二甲基 胺基萘5 一磺酰，即可合成由可见光激发的荧光指示齐l j d a n q u i n ( 见图1 5 所示) 【7 】， 其激发和发射波长分别为3 9 5a m 和4 6 5 n m 。 图1 5d a n q u i n ( 入e x = 3 9 5 n m ，入= 4 6 5 n m ) 图1 6t a e a i r 7 8 0 唐友云等【8 】以三碳菁近红外荧光染料i r 7 8 0 为原料，合成了一种用于检测 z n 2 + 的近红荧光探针t a e a i r 7 8 0 ( 见图1 6 所示) 。t a e a i r 7 8 0 的激发和发射 波长分别位于6 8 3 n m 和7 5 0a m ，其检测下限达1n m o l l ，其在活体细胞内的表现 尚不明确。 1 1 2 蒽醛类 b e n c i u l 等9 1 基于光诱导电子转移p e t ( p h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ) 过 程机理，设计合成出了分子2 ( 见图1 7 ) ，当与z n ( i i ) 配位鳌合以后，抑制了邻 二氮菲对葸环的p e t 过程，蒽环的荧光得以恢复，从而荧光加强，所以对于z n ( i i ) 有较好的选择性。 3 荧光探针的制备及表征 l n i 【，n h 图1 7 分子2图1 8 分子3 d e s i l v a 等1 0 l 也是基于p e t 过程机理设计合成了分子3 ( 见图1 8 ) ，研究表明 当有足够多的氧原子构成一个环状骨架后，碱金属k + 加入后就会出现较好的荧光 增强现象，实现了对k + 较好的识别效果。 p a r k e r 等设计合成了分子4 ( 如图1 9 ) ，当z n 2 + 进入中间的腔体后，使腔 体由于配位而收缩，将四个萘环的距离拉近，出现了荧光强度的增强，实现了对 z n ：+ 的识别： 图1 9 分子4 n a k a m u r a 等1 2 1 设计合成了复杂分子5 ( 见图1 1 0 ) ，当c a 2 + 与柔性主体分子 结合后，使柔性链发生折叠，将两个荧光团葸环的距离拉近，呈现出荧光增强， 实现了对c a ：+ 的识别。 4 江苏大学硕士学位论文 图1 1 0 分子5 化合物6 ( 见图1 1 1 ) 【1 3 】中有两个不同的荧光团，分子中的叔胺能够通过p e t 过程淬灭葸的荧光。在酸性条件t o j n i - r ) 后，该p e t 过程被抑制，但葸被激发 后其荧光强度并未增强，而是将能量转移给查耳酮使其发射荧光，查尔酮呈现出 荧光增强，这一过程即为荧光共振能量转移。 图1 1 1 分子6 h e n n r i c h 等【1 4 】合成了一种对汞离子具有选择性化学反应的荧光分子探针，在该探 针的乙睛溶液中加入汞离子后荧光显著增强( 3 4 倍) 并红移，进一步研究发现这 是一类不可逆的化学计量性的识别分子，分子7 ，见图1 1 2 。 s n 人n hh n h + h g ( i i ) ，h 2 0 - h g s 图1 1 2 分子7 o n 人n hh n h 荧光探针的制备及表征 1 2 荧光探针 1 2 1 荧光探针简介 荧光探针i l 纠( f l u o r e s c e n c ep r o b e s ) 就是荧光染色试剂，是能在外在光源激发 下发射出一定波长可见光的一类有机化合物。荧光分子经过特殊的设计，能够选 择性识别待测物，再将这种识别信息转换成荧光信号传递给外界，具有这种功能 的分子就是荧光分子探针。也就是说在一定体系内，当某种物质或体系的某一物 理性质发生变化时，该分子的荧光信号能发生相应的改变，这种分子就可以称为 某一物质或物理性质的荧光分子探针。这种探针是建立在分子识别和荧光技术两 者有机结合的基础上的，既含有分子识别过程，又包含了荧光的相关知识的分子， 而且在与特定的客体目标结合过程中，实现了分子识别而得到分子的相关信息， 并通过相应的荧光信号传导机制将这种分子结合信息转换成为易于检测的荧光 信号，实现单分子水平上的原位实时检测。 荧光现象很早就已为人所知。荧光探针分子在受到紫外或可见光照射( 光致 激发) 后，电子跃迁至不稳定的单重激发态，当电子通过跃迁回到基态而将多余 能量以辐射方式释放出去的可见光就是荧光( f l u o r e s c e n c e ) 。如果照射停止，荧光 即行消失。因此对用于作为探针化合物所具有的光物理特性、荧光影响因素及其 测定机理需进行进一步的研究探讨。 产生荧光的条件是：物质分子必须具备吸收特征频率的生色基团的结构。 1 2 2 荧光基础理论 在描述荧光探针时常用到下述的一些基本概念，在选择使用荧光探针时应予 以考虑。 ( 一) 荧光的激发波长和发射波长， 荧光探针大多是含有共扼双键体系的有机化合物，容易吸收近紫外区或可见 光区的激发光，而发射出可见光区的光。荧光探针只能吸收或发射一定波长范围 内的光。探针的发射波长总是大于其激发波长，该波长差值称为s t o k e s 位移。 激发光谱指某种荧光物质在不同波长的激发下所测得的同一波长荧光强度 6 江苏大学硕士学位论文 的关系，即不同激发波长的相对效率。而发射光谱指该物质在某一固定波长激发 下所测得的不同波长荧光强度的关系，即不同发射波长的相对效率。激发光谱的 长波部分和发射光谱的短波部分常重叠，这是分子内部能量转换的结果。如图 1 1 3 所示，相应于不同波长( e x l 、e x 2 和e x 3 ) 的激发并不改变荧光的发射光谱，但 其发射光( e m l 、e m 2 和e m 3 ) 强度与激发光强度有关。 l压 k? _一f 厂义 图1 1 3 荧光探针激发与发射波k s t o k e s 位移不恿 ( 二) 荧光强度 荧光强度是表示荧光相对强弱的参数，它决定了检测的灵敏度。其表达式为： f = k q i 。( 1 一e 一曲。) 式中，f 为荧光强度；k 为仪器常数；q 为荧光量子产率；i o 为激发光的强度； 为摩尔吸收系数；b 为样品池的光径( 样品厚度) ；c 为样品浓度。 摩尔吸收系数e 指染料吸收激发光的能力，而量子产率q 在数值上等于发射 量子数与吸收量子数的比值，它与发射强度直接相关，由于荧光物质发射的荧光 光子数总是小于其吸收激发的荧光光数，所以q 0 4 时才有实用意义 ( 三) 荧光寿命 荧光寿命又称激发态寿命，指荧光探针分子在激发念的平均停留时间( t ) 。 大多数荧光探针的荧光寿命在纳秒级。例如，f i t c 的t 值为4 n s 。荧光寿命短则 可提高灵敏度。 ( 四) 荧光探针的环境因素 适宜的溶剂极性、合适的p h 值、淬灭剂浓度及其与探针分子的亲和性以及 环境温度等环境因素都会影响到荧光探针的产率。因此，应根据实验要求选择合 7 荧光探针的制备及表征 适的探针和使用条件。 ( 五) 荧光探针的性能评价 通常荧光探针分子的性能评价指标为：灵敏度、选择性、实时性和原位检测 性能。 1 2 3 荧光探针的选择 一般情况下，探针的选取，应考虑以下几个方面： 1 激发波长：应根据实验系统所附带的激光器波长加以选择。 2 发射波长：应根据所拥有的滤光片的波段来选择。 3 荧光探针的光稳定性和漂白性：在荧光定量和动态荧光监测时，要选择 光稳定性较高的荧光探针，同时在实验时减少扫描次数或降低激光强度，来减少 光漂白的程度。 4 荧光的定性或定量：定性研究一般选择单波长激发探针；而定量研究最 好选择双波长激发的比率探针，以利于制作标准曲线。 5 荧光探针的特异性和毒性：根据实验目的，尽可能的选择毒性小，特异 性高的探针。 6 荧光探针适用的p h - 一般情况，细胞的p h 处于生理条件下，但是，当探 针被用于非生理条件时，应根据p h 值作出相应选择，同时，配制溶液时也应该 注意这个问题。 如图1 1 4 是f t t c 激发强度曲线，f t t c 是微阵列探测经常用到的荧光探针。 从图中可见，在4 9 4 n m 处有一个最大吸收峰值，而峰值两侧曲线很陡。在5 1 8 n m 处有一个最大发射峰。两峰值处波长相差2 4 n m ，这一现象在微阵列使用的染料 中较普遍。 8 江苏大学硕士学位论文 。 雠 羽 智 翼 图1 1 4f 1 r c 发射和激发光谱曲线( 发射光谱在4 0 0 n m 波长激发测量) 初看此图，人们可能认为：f t t c 可在5 1 0 n m 处激发，会发射4 7 5 5 l o n m 波长 的荧光。事实并非如此，发射波长总是比激发波长要长，激发曲线和发射曲线( 如 图1 6 2 ) 并不是同时绘制的，只是为了便于观察而绘制在同一坐标上。激发曲线 的绘制过程是，在单一波长下，变换激发波长在不同波长下测定荧光强度发射， 发射荧光曲线的绘制过程则是在最长激发激发波长下开始增加波长，测定不同波 长下的荧光发射强度。 1 2 4 荧光探针技术在高科技中的应用 最早在科学研究中利用光化学探针或荧光探针的方法【1 6 1 ，是在对生物高分 子如蛋白质、核酸等的检测或结构研究中出现的。蛋白质是由不同的氨基酸所组 成，它们之所以具有天然荧光是因为它们中存在着某些带有芳基发色团的氨基 酸，如色氨酸、丙氨酸和酪氨酸等，见图1 1 5 。 一c 0 0 h 2 色氨酸 丙氨酸 酪氨酸 图1 1 5 色氨酸、丙氨酸和酪氨酸的分子式 将荧光探针化合物连接到生物高分子，可采用一系列有效而简便的反应，来 9 荧光探针的制备及表征 实现生物高分子的标记化或探针化。一个早期常用的探针化合物是丹磺酰氯 ( d a n s y l c h l o r i d e ) 。丹磺酰氯不仅具有很活泼的酰氯基团，能和多肽化合物中的氨 基等活泼基团发生反应而连接于生物高分子上，见图1 1 6 。 r 1 0 10 - i - h 2 n c h _ c 一卜 j h j 一 丹磺酰氯多肽丹酰氯n 端氨基酸 图1 1 6 而且从丹磺酰氯的结构可以看出，它是一种分子内共扼的电荷转移化合物， 因此它不但能发出强烈的荧光，而且其荧光的峰值波长会随外部环境极性的变化 而变。因此丹磺酰氯作为生物探针至今仍得到广泛的应用。上面的例子表明，作 为一种实用性的探针化合物必须应具备活性的反应基团，才能方便地使探针化合 物连接于拟研究的底物之上。 从美国分子探针公司( m 0 1 e c u l a rp r o b e s ，i n c ) 出版的“荧光探针及研究化合 物手册( h a n d b o o ko ff l u o r e s c e n tp r o b e sa n dr e s e a r c hc h e m i c a l s ) 可以看出， 由他们所提供的探针化合物都带有能和底物分子相反应的活性基团，如一 s 0 2 c l 、一c o c l 、- - n = c = o 、- - n = c = s 等。虽说手册的分类有一定的原则， 如按不同用途或不同底物等，但通过探针与底物相连接的反应分类，显然是分类 中一个重要的方面。 荧光化合物所以能用来研究一系列不同体系在不同条件下发生的物理或化 学过程，以及不同体系的结构和其物化特征，主要是和作为探针化合物所具有的 光物理特性有关，如已知荧光化合物在不同极性介质中有着不同的光谱特征，不 同的发光峰值波长，不同的荧光量子产率和荧光寿命等。因此，如利用荧光峰值 波长的位移及发光量子产率的变化，就有可能探知荧光分子所处环境介质的极性 及其他有关性质。又如，荧光分子可因体系中引入另一分子而发生荧光淬灭，而 光化学家通过对荧光淬灭机理的研究知道，猝灭是因发生了分子间的能量转移或 电子转移所致。单重态间的能量转移一般均是长程的分子偶极一偶极共振转移机 理，这种转移过程的速率常数仅仅依赖于能量给体分子d 与能量受体a 间的距离， 1 0 江苏大学硕士学位论文 即和二者间距离r m 6 次方的倒数相关，而和介质的教度无关。因此，利用长程的 能量转移现象，可以研究和搞清高分子固相体系中不同物种或不同微畴的空间分 布状况，因而有重要的研究价值。此外，荧光淬灭的电子转移机理和能量转移机 理二者在淬灭常数上有很大的差别，因而通过对它们淬灭常数的测定，就可以很 方便地判别出荧光淬灭的反应机理。从上面简单的叙述可以看出，利用荧光探针 来研究高分子科学问题，不论是研究固体体系或是溶液体系，都可提供出许多有 价值的信息，使我们对所研究的问题能有一个在分子水平层次上的深入了解。 1 3 分子荧光探针的分子识别机理 按照荧光团与受体的连接方式和荧光信号表达的类型的不同，荧光探针分子 的识别机理主要分为以下几类：光诱导电子转移( p e t ) 、电荷转移( c t ) 、激 基缔合物( e x c i m e r ) 、电子能量转移( e e t ) 及其它类型。 1 3 1 光诱导电子转移 应用光诱导电子转秽r 7 。1 9 】( p h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ，p e t ) 原理设计的 荧光分子探针常用来检测金属阳离子的识别，特别是对碱金属、碱土金属和氢离 子，通常都可以设计成荧光增强型的探针。典型的p e t 荧光探针体系由三部分构 成：具有电子给予能力的识别基团r ( r e c e p t o r ) 、连接基团s ( s p a c e r ) 和荧光 基团f ( f l u o r o p h o r e ) 。这三者中荧光团是光吸收和产生荧光的场所，识别基团 则用于结合客体，荧光团与识别基团既被连接基团分隔开，又靠连接基团将其相 连而构成了一个超分子体系。在这类探针中，识别基团与荧光团之间的识别信息 与荧光信号之间的转化是靠光诱导电子转移完成的，具体工作过程如下：识别基 团( 具有给电子能力) 能够将它自身处于最高能级的电子转入激发态荧光团，荧 光团的电子由于被紫外或可见光照射激发而空出电子轨道，这些轨道又被识别基 团新转入的电子所占据，使激发的电子无法直接返回原基态轨道而不能发射出荧 光，导致荧光团的荧光强度的降低( 淬灭) ：然而，当识别基团与客体结合后， 识别基团的电子由于与客体配位而使其给电子能力降低，转入荧光团的电子数目 减少，空出了电子轨道，使被激发的电子能够返回原基态轨道，此时荧光团的荧 光得以恢复而表现出荧光强度增强。因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧 荧光探针的制备及表征 光，或荧光很弱，而一旦受体与客体相结合，荧光团就会发射出强荧光。 1 3 2 电荷转移 电荷转秽1 7 】( c h a r g et r a n s f e r ，c t ) 机理又可分为分子内电荷转移 ( i n t e r m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ，i c t ) 和扭曲的分子内电荷转移( t w i s t e d i n t e m a lc h a r g et r - a n s f e r ，t i c t ) 。而这其中又以研究i c t 的文献报导居多。这 一类型的荧光探针分子是由荧光团与识别基团直接相连而成，在荧光团上分别还 连有供电子基团( 电子给体) 和吸电子基团( 电子受体) ，形成了一个推一拉电 子体系。该分子被光激发后会增加从供电子基团向吸电子基团的分子内部电荷转 移。当识别基团与客体结合时，会对荧光团的推一拉电子体系产生作用，减弱或 强化电荷转移，从而导致荧光光谱的变化。一般情况下，i c t 荧光探针对荧光强 度的影响不像p e t 荧光探针那样显著，而主要表现在光谱的蓝移或红移上。 1 3 3 激基缔合物( e x c i m e r ) 这一类荧光分子一般都具有两个相同的荧光团，它们之间靠一个柔性链连 接，这个柔性链又同时充当了识别基团。当柔性链与客体结合( 形成激基缔合物 【1 7 1 ) 以后，使两个荧光团间的相对距离发生改变，从而导致荧光分子的荧光强度 发生变化，来进行金属离子的识别。常将萘、葸和芘等荧光团( 容易形成激基缔 合物) 用作荧光团主体，设计此类探针。 1 3 4 荧光共振能量转移 荧光共振能量转移【1 7 】( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ，f r e t ) 也 称为非辐射能量转移( n o n - r a d i a t i o ne n e r g yt r a n s f e r ) ，即处于激发态的荧光活 性物种将多余能量转移给处于基态的荧光活性物中的过程。 1 3 5 基于其他原理设计的荧光分子探针 除了上述几种设计原理以外，也有一些荧光分子探针是按照其它原理设计。 h e n n r i c h 等【1 4 】合成的一种对汞离子具有选择性化学反应的荧光分子探针，在该探 1 2 江苏大学硕士学位论文 针的乙睛溶液中加入汞离子后荧光显著增强( 3 4 倍) 并红移，进一步研究发现 这是一类不可逆的化学计量性的识别分子。 1 4 磁性纳米材料 1 4 1 磁性纳米材料的性质 磁性微球的研究始于2 0 世纪7 0 年代，国内在2 0 世纪8 0 年代以来同渐活跃。过 去的二十多年，生物医药领域出现了大量不同尺度、形状和复合的磁性纳米粒子， 很多应用依赖于氧化铁粒子( f e 2 0 3 或f e 3 0 4 ) ，且粒子直径从几个纳米到几百纳 米可调【2 0 l 。 f e 3 0 4 纳米粒子一般分布在5 l o o n m 左右，由于小尺寸效应和表面效应而使得 它具有常规晶粒所不具备的磁特性，当粒径小于1 6 n m ，便产生了超顺磁性【2 1 1 。 从四氧化三铁粒子的晶体结构来看，它是尖晶石构型，可表示成 f e ( i i i ) f e ( i i ) f e ( i i i ) 0 4 ，属立方晶系，晶格是复杂的面心立方，氧原子构成密集 的面心结构，f e 2 + 和f d + 离子通过氧离子的超交换作用而使得四氧化三铁粒子产 生亚铁磁性。 目前，关于磁性f e 3 0 4 纳米粒子的制备方法已有大量文献报道，常用的方法 有：共沉淀法【2 2 1 、氧化法【2 3 】、m a s s a r t 水解法【肄2 5 1 、微波合成法【2 6