（特种经济动物饲养专业论文）蜜蜂apis+mellifera+l幼虫级型分析差异蛋白质组分析.pdf

-1，j，i 。，一碉4 i，j_、。； t 驾 原创性声明 j i i i ii ii ii i i i i i iii iii iiij y 18 3 3 8 8 0 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者： 舅，稳 日期：五移f9 年岁月3 移日 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门 或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学 可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文 或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者： 舅、静 日期：p 9 年琴y j3 移日 _j 摘要 摘要 蜜蜂是社会性昆虫，具有典型的级型分化现象。蜂群中蜂王和工蜂虽然同为 雌性蜂，但只有蜂王具有生殖能力而工蜂没有，不同的级型蜂具有不同的蛋白质 组。因此，分析蜜蜂级型分化期发育蛋白质组的特点，比较其蛋白质表达谱的时 空差异，将对蜜蜂生物学研究和揭示蜜蜂级型分化的分子机理具有一定意义。 本研究利用双向电泳技术，分析比较蜂王和工蜂级型分化期的蛋白质组的 特点，利用生物信息方法鉴定部分差异表达蛋白质的功能，进而依其功能对鉴定 蛋白分类和生化通路分析。结果表明，在幼虫3 日龄和5 日龄时，蜂王分别表达 2 8 8 个和2 4 7 个蛋白质；而工蜂在3 日龄和5 日龄时分别表达了2 5 9 个蛋白质和 2 3 6 个蛋白质；到蛹1 1 日龄时，蜂王头部蛋白质组有3 1 1 个蛋白质，明显高于工 蜂头部表达的蛋白质数( 2 7 8 个) 。3 日龄时，两种级型蜂共有蛋白质为1 5 6 个， 而蜂王和工蜂的特异蛋白质分别为1 3 2 个和1 0 3 个；到幼虫5 日龄时，两级型蜂 共有蛋白质点为9 5 个，而蜂王特异蛋白质点为1 7 9 个，工蜂特异蛋白质点为1 4 1 个；到蛹1 1 日龄时，蜂王和工蜂头部共有蛋白质点为1 9 4 个，而蜂王的特异蛋 白质点为1 1 7 个，工蜂特异蛋白质点为8 4 个。蜂王和工蜂的蛋白质表达谱存在 显著差异，蜂王表达的蛋白质总数和特有蛋白质数都较工蜂多，说明蜂王的基因 表达较工蜂更加旺盛。发育中所表达的共有蛋白质可能是他们发育所必须的管家 蛋白质，但它们在级型中的表达模式却存在较大差异。在三个日龄中蜂王和工蜂 有大量差异表达的蛋白质，这表明在级型分化中，蜂王和工蜂需要不同的蛋白质 来调节各自的发育。 利用m a l d i t o f m s 对6 0 个蜂王和工蜂差异表达的蛋白质进行鉴定并依 照蛋白质在蜜蜂发育过程中行使的功能，将这些鉴定的蛋白质分为8 个功能类 别：碳水化合物代谢和能量产生类蛋白质( 3 5 ) 、蛋白质和脂肪酸代谢的蛋白 质( 1 7 ) ，抗氧化类蛋白质( 1 5 ) 、发育类蛋白( 1 2 ) 、营养储存类蛋白质 ( 1 0 ) 、具折叠功能类蛋白质( 6 ) 和转录翻译相关蛋白质( 4 ) 、及未知功 能的蛋白质( 1 ) 。 其中，代谢相关的蛋白质表达数量最多，说明幼虫期的两级型蜂代谢旺盛， 都需要大量的能量来完成生长发育，同时，对蜂王和工蜂在两个日龄差异蛋白质 表达量的聚类发现，蜂王在发育过程中，上调了较多碳水化合物代谢和能量生产 t 摘要 类蛋白质，这说明能量需求可能是导致幼虫进化为蜂王的一个原因。 将3 日龄和5 日龄的蜂王和工蜂6 0 个差异表达蛋白质进行生化通路分析发 现，2 4 个蛋白是在发育中起关键作用的节点蛋白，它们是：a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e ，a l d e h y d er e d u c t a s e ， a t ps y n t h a s eb e t as u b u n i t ，b e l l w e t h e r ， e n o l a s e ，p h o s p h o g l y c e r a t em u t a s e ，t r a n s k e t o l a s e ，l e o n a r d o ， 14 3 3p r o t e i n e p s i l o n ， a c t i n - 8 7 ei s o f o r m2 ， c a t h e p s i nd ，i m a g i n a ld i s cg r o w t hf a c t o r4 ， l e t h a l ( 2 ) 3 7 ，a r g i n i n ek i n a s e ，f a t t ya c i db i n d i n gp r o t e i n ，p r o t e a s o m es u b u n i ta l p h a t y p e5 ，p e r o x i r e d o x i n2 5 4 0 ，g l u t a t h i o n est r a n s f e r a s es1 ，t h i o r e d o x i np e r o x i d a s e 1 ，h e a ts h o c kp r o t e i nc o g n a t e3 ，e r p 6 0 ，l a r v a ls e r u mp r o t e i n2 ，t r a n s l a t i o n a l c o n t r o l l e dt u m o rp r o t e i n 。这些节点蛋白质不仅对于幼虫的生长发育必不可少，而 且为进一步研究和验证级型分化提供了目标蛋白质。 关键词：蜜蜂；级型分化；双向电泳；蛋白质组 i i a b s t r a c t a b s t r a c t t h eh o n e y b e e ( a p i sm e l l i f e r al ) i sae u s o c i a li n s e c tt h a th a st y p i c a lo ft h ec a s t e d i f f e r e n t i a t i o n i nt h ec o l o n y , t h eq u e e na n dw o r k e ra r eb o t hf e m a l e ，b u to n l yt h e q u e e nb e eh a sr e p r o d u c t i v ec a p a c i t y c o m p a r i s o no f t h ep r o t e o m ed i f f e r e c eb e t w e e n t h et w oc a s t e sw i l lh e l pu n d e r s t a n d i n gm o l e c u l a rm e c h a n i s mo fh o n e y b e ec a s t e d i f f e r e n t i a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a t2 8 8a n d2 7 4p r o t e i n sw e r ed e t e c t e di nt h ep r o t e o m e p r o f i l eo fq u e e nl a r v a so nd a y3a n dd a y5 ，r e s p e c t i v e l y , a n dw o r k e re x p r e s s e d2 5 9 a n d2 3 6p r o t e i n so nd a y3a n d5o l dl a r v a e ，r e s p e c t i v e l y a l s o ，i nt h eh e a do f11 一d a y p u p a e s ，e v i d e n t l yh i g h e rn u m b e ro ft o t a lp r o t e i n s ( 3 11 ) w a sd e t e c t e di nq u e e nt h a n t h o s eo fw o r k e r ( 2 7 8 ) o nt h et h i r dd a y , 15 6p r o t e i n sw e r ed e t e c t e di nb o t hq u e e na n d w o r k e rl a r v a e s ，w h i l e13 2p r o t e i n sw e r es p e c i f i ct oq u e e nl a r v a e ，a n d10 3p r o t e i n s w e r ee x c l u s i v et ow o r k e r sl a r v a e w h i l eo nt h ef i f t h sd a y , l a r v a e so fq u e e na n d w o r k e rh a d9 5s h a r e dp r o t e i n s ，17 9a n d141p r o t e i n sw e r es p e c i f i ct oq u e e nl a r v a e s a n dw o r k e rl a r v a e s ，r e s p e c t i v e l y a tt h ee l e v e n t hd a y , 19 4p r o t e i n sw e r ed e t e c t e d c o m m o n l yi nt h eh e a do fq u e e na n dw o r k e r s ，w h i l e117a n d8 4p r o t e i n sw e r eu n i q u e t ot h eh e a d so fq u e e na n dw o r k e r , r e s p e c t i v e l y s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sh a db e e nf o u n d i n t h ep r o t e o m eb e t w e e nq u e e na n dw o r k e rd u r i n gt h ep r o c e s so fc a s t ed i f f e r e n t i a t i o n w h i l et h ei n c r e a s e dn u m b e ro ft o t a la n ds p e c i f i cp r o t e i n si nq u e e n si sl i k e l yt h a tt h e m e t a b o l i cr a t eo fq u e e n si sh i g h e rt h a nt h a to fw o r k e r s t h ep r o t e i n sb o t hi nq u e e n a n dw o r k e rs u g g e s tt h a tt h e ys h o u l db ei n d i s p e n s a b l ef o rd e v e l o p m e n t ，b u tt h e i r e x p r e s s i o np a t t e r n sa r ed i f f e r e n tb e t w e e nt h et w ob e ec a s t e s am a s so fp r o t e i n s d i f f e r e n t l ye x p r e s s e da te a c ht i m e - p o i n ti n d i c a t et h a td i f f e r e n tc a s t ed e v e l o p m e n t a l s t a g e sn e e dd i f f e r e n tp r o t e i n st ob ei n v o l v e di n 6 0p r o t e i n sw h i c hd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e db e t w e e nt h ew o r k e ra n dq u e e nl a r v a e o nd a y3a n d5w e r es u c c e s s f u l l yi d e n t i f i e db ym a l d i - t o fa n dc a t e g o r i z e di n t o8 f u n c t i o n a lg r o u p s ，i e c a r b o h y d r a t em e t a b o l i s ma n de n e r g yp r o d u c t i o n ( 35 ) ，a m i n o a c i da n df a ta c i dm e t a b o l i s m ( 1 7 ) ，a n t i o x i d a n ts y s t e m ( 1 5 ) ，d e v e l o p m e n t ( 1 2 ) ， p r o t e i n f o l d i n g ( 10 ) ，t r a n s c r i p t i o n t r a n s l a t e ( 6 ) ，n u t r i t i o ns t o r a g e ( 4 ) a n d i i i a b s t r a c t u n k n o w n ( 1 ) t h el a r g e s tg r o u po f t h ei d e n t i f i e d p r o t e i n s w a s c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s ma n de n e r g yp r o d u c t i o n ，i n d i c a t i n gt h a tt h ed e v e l o p m e n t sb o t ho ft h et w o c a s t e sn e e dal o to fe n e r g yf o r t h el a r v a l d e v e l o p e m n t d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e d p r o t e i n sb e t w e e nt h ew o r k e ra n dt h eq u e e nl a r v a ew e r ec l u s t e r e d ，a n df i n d i n gt h a t q u e e nl a r v a eu p r e g u l a t em o r ep r o t e i n sr e l a t e dt oc a r b o h y d r a t em e t a b o l i s ma n de n e r g y p r o d u c t i o nt h a nw o r k e rl a r v a ei n d i c a t i n ge n e r g yr e q u i m e n ti sp r o b a b l yad r i v i n gf o r c e f o rt h el a v ab e c o m i n gaq u e e n w h e np l a c e dt h e6 0i d e n t i f i e dp r o t e i n st l l a td i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e db e t w e e nt h e w o r k e ra n dt h eq u e e nl a r v a eo nd a y3a n d5i n t ob i o l o g yn e t w o r k , 2 4k e yn o d e p r o t e i n sw e r ed e t e c t e d ，i n c l u d i n g ，a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ，a l d e h y d er e d u c t a s e ，a t p s y n t h a s eb e t as u b u n i t ，b e l l w e t h e r , e n o l a s e ，p h o s p h o g l y c e r a t em u t a s e ，t r a n s k e t o l a s e ， 14 3 3p r o t e i ne p s i l o n ，a c t i n 一8 7 ei s o f o r m2 ，c a t h e p s i nd ，i m a g i n a ld i s cg r o w t hf a c t o r 4 ，l e t h a l ( 2 ) 3 7 ，a r g i n i n ek i n a s e ，f a t t ya c i db i n d i n gp r o t e i n ，p r o t e a s o m es u b u n i ta l p h a t y p e5 ，p e r o x i r e d o x i n2 5 4 0 ，g l u t a t h i o n est r a n s f e r a s es1 ，t h i o r e d o x i np e r o x i d a s e1 ， h e a ts h o c kp r o t e i nc o g n a t e3 ，e r p 6 0 ，l a r v a ls e r u mp r o t e i n2 ，t r a n s l a t i o n a lc o n t r o l l e d t u m o rp r o t e i n t h e s ep r o t e i n sn o to n l ya r ei n d i s p e n s a b l ei nc a s t ed i f f e r e n t i a t i o no fb e e ， b u ta l s o h e l pt op r o v i d et a r g e tp r o t e i n s f o r f u r t h e r v e r i f i c a t i o no ft h ec a s t e d i f f e r e n t i a t i o n k e yw o r d s ：h o n e y b e e ( a p i sm e l l i f e r al ) ；c a s t ed i f f e r e n t i a t i o n ；t w o d i m e n s i o n a l g e le l e c t r o p h o r e s i s ；p r o t e o m e i v 目录 目录 第一章引言1 1 1 研究目的和意义+ l 1 2 研究问题的提出1 1 3 研究的背景2 1 4 文献综述3 i 4 i 蜜蜂级型分化在营养和激素方面的研究进展3 1 4 2 蜜蜂级型分化在分子和蛋白质组方面的研究进展4 1 5 研究方法6 1 6 论文结构安排6 第二章蜜蜂幼虫期蜂王和工蜂蛋白质组成及发育特点比较7 2 1 材料和方法7 2 1 1 试剂7 2 i 2 仪器1 1 2 i 3 取样1 2 2 1 4 幼虫期蛋白提取、蛋白质浓度测定及双向电泳( 2 - d e ) 1 2 2 1 5 图像分析1 2 2 2 结果1 3 2 2 i 蜂王和工蜂幼虫期蛋白质组图谱1 3 2 2 2 蜂王与工蜂3 日龄幼虫蛋白质组比较1 5 2 2 3 蜂王与工蜂5 日龄幼虫蛋白质组比较_ 1 5 2 2 4 蜂王与工蜂日龄间比较1 5 2 2 5 幼虫期蜂王与工蜂形态发育比较j 1 7 2 3 讨论1 8 第三章蛹期蜂王和工蜂头部蛋白质组成及发育特点比较2 0 3 1 材料和方法2 0 3 1 1 取样2 0 3 2 结果2 l v 目录 3 2 1 蜂王和工蜂蛋白质表达图谱分析2 1 3 2 21 1 日龄的蜂王与工蜂蛹头部蛋白质比较2 3 3 2 31 1 日龄的蜂王与工蜂蛹发育形态比较2 4 3 3 讨论2 5 第四章蜜蜂幼虫期级型发育蛋白功能鉴定与生化通路分析2 7 4 1 材料和方法2 7 4 1 - 1 试剂2 7 4 1 2 仪器2 8 4 1 3 胶内酶切和g i a l d i - t o f 质谱分析2 8 4 1 4 蛋白鉴定2 8 4 1 5 对蛋白质表达量聚类分析2 9 4 1 6 生物通路分析2 9 4 2 结果2 9 4 2 1 幼虫期蜂王和工蜂差异表达蛋白质质谱鉴定2 9 4 2 2 鉴定出差异表达蛋白质的分类和表达量聚类分析3 l 4 2 3 鉴定出的差异表达蛋白质生化通路分析3 6 4 3 讨论5 5 第五章结论5 7 5 1 阶段性成果及意义5 7 5 2 结论5 8 参考文献一6 0 第一章6 0 第二章6 2 第三章6 3 第四章6 4 个人简历与论文发表情况6 6 致谢j 6 7 v i 第一章引言 第一章引言 1 1 研究目的和意义 在对社会性昆虫的研究中，最古老且具挑战性的问题就是群落中生殖能力 不同的两种级型间的发育【l 】。蜜蜂是高度社会化的昆虫，蜂群中有蜂王和工蜂两 种级型的雌蜂。蜂王和工蜂都是由遗传信息完全相同受精卵发育而来，仅仅由 于生长环境的不同，而使它们在外表形态、生殖能力、生命周期、社会职能等 方面相差甚远【2 】。级型分化过程中涉及器官发育，营养调节，激素调控，和社会 分工等众多问题，这些问题的解读不但可以推动蜜蜂生物学的发展，而且有助 于社会行为学、神经生物学、行为遗传学、免疫学、发育生物学等学科的研究。 因此，级型分化是蜜蜂学研究中的热点，早在1 8 世纪科学家们就利用互换 培育试验，来研究蜂王和工蜂级型分化的特点1 3 j 。随着，蜜蜂基因组序列的完成 h ，蜜蜂级型分化在分子和蛋白水平的研究也更加便利。两级型蜂在营养水平， 激素水平和基因水平的差异都会一定程度地体现在蛋白质水平上，通过蛋白质 组的研究可以直接了解生命活动的进程。国内外已有对蜜蜂不同时期发育蛋白 质组的研究【5 】，这为利用比较蛋白质组学方法研究蜜蜂级型分化打下了基础。 本实验的研究目的是揭示蜜蜂级型分化的分子机理。首先，通过对蜂王和 工蜂在级型分化时期蛋白质组的分析比较，来寻找雌性蜜蜂级型间的差异蛋白。 之后，对这些差异蛋白质进行功能验证，并对结果进行生物信息学分析。最终 了解这些特异蛋白质在级型分化中所起的作用，从而推动蜜蜂级型分化的研究。 用比较蛋白质组学的方法研究蜜蜂级型分化，不但为在基因调控，激素诱 导等方面研究级型分化提供了证据和思路，也为从生化水平上研究级型分化开 辟了道路。对于推动蜜蜂生物学乃至昆虫学研究起到了积极的作用。 1 2 研究问题的提出 进入后基因组时代后，蛋白质组学方面的研究越来越受到关注，作为生物 体必不可少的大分子，蛋白质在生命活动中起着重要的调节作用，对于蛋白质 在生物体内功能性的研究方兴未艾。蜜蜂作为一种重要的模式生物，广泛用于 众多学科的研究领域刁】，级型分化是蜜蜂学研究的一个热点，但在蛋白质组学 1 第一章引言 方面的研究却较少。在蜜蜂级型分化过程中蜂王和工蜂由孵化后完全相同的小 幼虫，在营养环境的作用下慢慢发育为形态和器官各异的两种级型蜂。这个过 程涉及众多蛋白质的表达和调节，利用比较蛋白质组学可以直接、准确地发现 级型间蛋白质组的变化规律，对蜜蜂级型分化的研究有一定帮助。 1 3 研究的背景 蜜蜂在人类生活中扮演重要角色，它不但为人类提供众多营养丰富的食品， 而且对人类赖以生存自然环境也起着重要作用。植物需要授粉繁衍，而动物以 植物为食，因此蜜蜂是生态系统食物链中起的桥梁，是许多动植物生存的保障。 也是生命科学中重要的模式生物，蜂王和工蜂在寿命长短和发育进程中的差异 为研究衰老机制，神经发育提供了良好素材【引。 蜜蜂是典型的社会性昆虫，蜂群内由两种性别三种级型的蜜蜂个体组成， 即工蜂、蜂王和雄蜂。雄蜂由未受精卵发育而来，为单倍体，蜂王和工蜂都是 二倍体，由受精卵发育而来，蜂王和工蜂虽然都是雌性蜂，但只有蜂王具有生 殖能力而工蜂没有。蜂王和工蜂在外部形态、内部解剖、生理和行为上都存在 较大差异【9 】。从解剖学上看，蜂王通常有近2 0 0 个卵巢，每日可生产数千粒卵； 而工蜂仅有2 至1 2 个卵巢，一般不具有生殖能力【1 0 】。从外部形态看，蜂王身体较 工蜂重，体长是工蜂的1 3 3 倍。而且它们头部形状也不相同，正面观蜂王头部呈 心脏形，而工蜂的呈倒三角形，蜂王的上颚较工蜂略大，基部也更粗壮以便于 在羽化时能咬开茧衣出王台。在足部，工蜂的足除了行走外，还有采集和携带 花粉的特化器官，而蜂王的这些特化构造已退化【l l 】。这些都生理构造的差异与 它们的社会分工有关，蜂王生殖器官发育完全，专门负责产卵繁衍后代；工蜂 的特化器官则可以帮助工蜂在蜂群进行采集、哺育、建设、防卫和清扫等工作。 导致受精卵幼虫发育成蜂王或工蜂是营养调控的结果。蜂王和工蜂都是由受 精卵发育而来的雌性。出生在王台中的幼虫被连续饲以过量的王浆，渐渐发育 成蜂王；出生在工蜂巢房中的幼虫在被饲以三天工蜂浆就开始进食花粉和蜂蜜 从而慢慢发育为工蜂，所处营养环境的不同是造成幼虫发育为不同的级型的直 接原因【1 2 。1 3 1 。营养环境的不同也使两级型蜂在级型发育时激素的分泌有所不同 【1 4 】 o 在幼虫期，蜂王保幼激素的分泌量始终高于工蜂【1 2 1 3 】，蜂王发育n 5 日龄 2 第一章引言 后期时，所分泌保幼激素的滴度是同时期工蜂分泌保幼激素滴度的2 6 倍【l5 1 。咽 侧体分泌的保幼激素是一种多效性激素，在昆虫的生长，发育，繁殖和免疫反 应等方面都有影响，但它在级型发育方面作用更为显著。在幼虫期，保幼激素 可以提高卵黄原蛋白基因的转录水平，和卵黄原蛋白的合成速率，从而促进卵 黄，卵子，和生殖器官的成熟【9 】。同时蜕皮激素也参与了级型分化的调节，体 外实验表明，蜕皮激素浓度的变化与两种级型分化特征蛋白的表达量变化相一 致【1 6 j 。 现已证明造成两级型蜂的差异，是基因差异表达的结果，而不是遗传多态 性，蜂王和工蜂有相同的基因组，却有不同的基因表达模式，在发育过程中， 工蜂上调表达了较多发育基因，而蜂王在代谢相关的基因上的过表达的，表达 模式的不同最终导致蜂王和工蜂具有不同的蛋白质组。目前对蜜蜂级型分化已 从营养、激素和基因组方面进行了较为翔实的研究，但利用比较蛋白质组学方 法研究蜜蜂级型间发育的相关文献还未见报到。而近年来，国内外已对蜜蜂不 同发育时期的蛋白质组的研究垆 1 7j ，为研究蜜蜂级型发育蛋白质组学提供了打下 基础。 可本文通过分析蜂王和工蜂这两种级型蜂在不同发育时期蛋白质组的特点， 比较其蛋白质表达谱的时空差异，并对部分差异表达的蛋白质进行质谱鉴定和 代谢通路验证，分析这些蛋白质表达差异在级型分化中所起的作用，以期揭示 级型分化的分子机理。这可以为研究影响级型分化的因素提供参考，也从生化 水平上研究级型分化开辟了道路。 1 4 文献综述 1 4 1 蜜蜂级型分化在营养和激素方面的研究进展 级型分化是社会性昆虫的主要特征之一，即遗传基础相同的雌性分化为生 殖个体和非生殖个体。蜜蜂是典型的社会性昆虫，蜂王和工蜂虽然都是雌性蜂， 但只有蜂王具有生殖能力而工蜂没有。导致受精卵幼虫发育成蜂王或工蜂是营 养调控的结果，它们在幼虫期所处的营养环境决定了它们的发育方向。蜂王被 养育在王台中，而工蜂被养育在普通的巢房中，王台底部为圆型台口垂直向下， 容积比普通的巢房大【l 引。哺育蜂能区分这两种巢房，从而对蜂王和工蜂幼虫分 别饲以不同质和量的食物。在幼虫期，蜂王被连续饲以过量王浆，饲喂次数是 3 第一章引言 工蜂幼虫的1 0 倍以上【l 引。研究发现，卵孵化后的1 3 日内，饲喂蜂王幼虫的王浆 中总糖( 葡萄糖、果糖、蔗糖) 含量是工蜂浆的4 倍【2 0 】，到4 5 日龄的蜂王幼虫被 饲喂的食物中，含糖量会进一步提高【19 1 ，食物中的糖可以刺激蜜蜂幼虫取食， 有加快进食及发育的作用【2 m 2 1 。在工蜂浆加入一定比例的葡萄糖和果糖蔗糖饲 喂工蜂幼虫，可以培育出蜂王；当加入乳糖、半乳糖、海藻糖等其它糖时可培 育出和蜂王外貌相似的成蜂【2 0 l 。由此可见幼虫食物中的糖含量对蜜蜂级型分化 有重要的影响。除含糖量外，工蜂浆和王浆的成分也不同，哺育蜂上颚腺分泌 物的含量较高，而工蜂浆成分中，哺育蜂舌腺分泌物所占比例较大【l9 1 ，这也可 能是导致两级型蜂在体重、发育速度、生殖能力等方面，出现差异的另一个原 因。 营养启动幼虫的级型分化，使蜂王和工蜂产生不同的内分泌信号，从而分 泌不同的激素调节级型分化。研究发现，5 龄后期的蜂王幼虫分泌大量保幼激素 是同期工蜂的二十多倍l l 引，保幼激素可以帮助幼虫卵巢的发育，蜂王和工蜂在 生殖水平的差异，主要是由于9 5 的工蜂卵巢细胞退化造成的l 2 3 】，用保幼激素处 理在5 龄末的工蜂幼虫，会使其卵巢中细胞凋亡的现象明显减少。同时蜕皮激素在 两级型蜂中的表达情况也不同。蜜蜂前胸腺分泌蜕皮激素可作为一种级型分化 指示激素，在喀蜂级型分化时它的浓度变化与两种级型分化特征的蛋白 ( 2 9 k d a p 1 4 6 乘1 2 4 k d a p 1 5 2 - 5 5 ) 的表达量一致【2 4 j 。在预蛹期，蜕皮激素的单 一峰在蜂王中出现的较早，这可能与蜂王和工蜂的发育进程有关，蜂王比工蜂 提前进入蛹期。除了保幼激素和蜕皮激素之外，促前胸腺激素和生物胺如多巴 胺、去甲肾上腺素、章鱼胺和5 羟色胺，在幼虫阶段也对级型分化有调节作用 1 9j 。体外试验表明，章鱼胺和和5 羟色胺、章鱼胺类似物可增加工蜂幼虫后 期的咽侧体中的保幼激素的滴度，刺激保幼激素的释放【2 5 】。同时，外激素对级型 的发育也会有一定影响，对熊蜂中研究发现，受蜂王外激素影响的幼虫发育成 工蜂，而不受其影响的幼虫则发育成蜂王1 2 6 j 。 1 4 2 蜜蜂级型分化在分子和蛋白质组方面的研究进展 蜂群中，蜂王和工蜂都是由受精卵发育而来，具有完全相同的遗传物质， 但二者不仅在外表形态上差异巨大，而且具有截然不同的生殖能力，悬殊的生 命期限以及相差甚远的行为方式【9 】。为了解蜂王和工蜂在生殖、发育的分子机理 和信号转导通路，从上个世纪后期，就开始对级型间基因表达的差异进行分析。 4 第一章引言 第一次大规模研究级型间分子层次的差异是1 9 8 9 年蜂王和工蜂在幼虫和蛹 阶段中m r n a 的表达谱，发现在4 日龄末两级型蜂的m r n a 表达出现差异【1 9 】。之 后1 9 9 9 年，用扣除差异杂交法研究蜂王和工蜂幼虫基因组时发现，在蜂王和工 蜂有7 个差异表达的基因位点，它们属于至少5 个截然不同的进化和功能组别，7 个差异表达的基因位点中有两个位点是关于级型分化调控，一个是脂质和疏水 性集团( 包括视黄酸) 的绑定蛋白质基因：一个位点序列与的转录因子e t s 家族 结合域序列相似，其余5 个位点与下游基因的改变有关暖7 1 。同年发现在蜂王和工 蜂级型发育过程中，编码线粒体蛋白的基因和线粒体翻译启动子基因在蜂王幼 虫中的表达水平都较在工蜂中的高，认为蜂王幼虫高生长率、高呼吸率是通过 线粒体蛋白基因的高丰度表达来实现的【2 8 】。2 0 0 0 年，利用1 2 7 8 个基因芯片数据 分析3 类幼虫的基因表达谱：尚未分级型的幼虫，五日龄中期的蜂王和工蜂幼虫。 发现工蜂基因表达较保守，而蜂王在下调了一系列幼虫时表达的基因后又上调 了一些级型分化调控基因，蜂王上调的基因大部分涉及代谢，特别是代谢中的 酶；而工蜂上调有细胞色素c p 4 5 0 蛋白家族，六聚体营养储存蛋白和二氢二醇脱 氢酶和脂肪酸绑定蛋白的基因【2 9 1 。研究转录前的上游调控元件时发现，蜂王和 工蜂差异表达的基因大多涉及代谢过程，工蜂过量表达水解酶基因，蜂王在氧 化还原酶的表达上是过量的，这说明蜂王和工蜂有不同的代谢通路【3 1 1 。在2 0 0 7 年利用e s t s 和基因芯片技术对蜂王和工蜂在分化过程中2 4 0 个表达不同的基 因，分析级型发育中的工蜂上调表达了较多发育基因，而蜂王上调表达了较多 代谢相关的基因，这些基因可以通过调节机体的代谢来指导级型分化【3 2 1 。幼虫 发育为蜂王或工蜂与他们所处的营养环境有关，由于营养环境不同，使它们具 有不同的基因表达模式。2 0 0 8 年利用r n a 干扰技术使蜜蜂d n a 甲基转移酶表达 沉默，发现在蜜蜂体内，d n a 甲基化用于储存蜜蜂后天遗传信息，而后天遗传 信息的利用会因蜂王和工蜂幼虫所处的营养环境不同而有所差异【3 3 1 。 基因水平的差异最终也会体现在蛋白质水平，生命活动需要蛋白质来完成 【2 6 d 7 1 。对不同级型蜜蜂血淋巴液内蛋白质组分析发现，在蜂王血淋巴液中含有 大量与繁殖功能相关的蛋白质，而在工蜂血淋巴液中则没有，因此推断这些蛋 白质有促进卵母细胞的成熟的功能1 1 7 】。同时，类胰岛素肽在2 日龄的蜂王幼虫体 内高水平表达，而在2 日龄的工蜂幼虫体内的表达量很少【3 4 l ，这也许是因为蜂王 和工蜂具有不同的的胰岛素信号调节通路而造成的。 5 第一章引言 1 5 研究方法 本研究主要使用蛋白质组学方法，对级型分化不同时期的蜂王和工蜂蛋白 质组进行比较、鉴定、和分析。 首先，合理取样，通过奖励饲喂等手段，使蜂群强盛，结合文献和蜜蜂生 物学知识科学取样并对样品进行蛋白质提取。 其次，利用双向电泳的方法获得蛋白质图谱。并利用生物学软件对同一日 龄的蜂王和工蜂重复性较好的胶图进行比较分析，找出差异表达的蛋白质点。 之后，利用质谱技术对级型间差异表达的蛋白质进行功能鉴定。 最后，利用生物信息学软件对得到的数据进行检索、分析和归纳。 1 6 论文结构安排 第一章：引言，主要介绍研究的目的意义和选题背景、文献综述、研究方 法等方面的内容。 第二章：蜜蜂幼虫期蜂王和工蜂蛋白质组成及发育特点比较，与第三章： 蜜蜂幼虫期蜂王和工蜂蛋白质组成及发育特点比较，都是论文的主要的研究内 容。它们在时间上是顺承关系。在这两章中都是首先介绍本章的研究背景，其 次，介绍具体的试验方法和所用的试剂及仪器。之后，介绍取得的实验结果， 最后，对数据结果进行分析解读，阐明分析的结果和意义。 第四章：蜜蜂幼虫期级型发育蛋白功能鉴定与生化通路分析。是对第二章 的深入研究，对第二章的数据结果做进一步的鉴定实验，同时利用大量生物信 息学软件进行结果分析。章内结构与第二章，第三章相似。 第五章：结论是对论文整体最终和总体的结论。其中5 1 现阶段取得的成果 和意义是对论文研究成果，在本学术领域地位作用和意义的介绍。5 2 结论是对 论文结果的概括。 6 第二章蜜蜂幼虫期蜂王和工蜂蛋白质组成及发育特点比较 第二章蜜蜂幼虫期蜂王和工蜂蛋白质组成及发育特点比较 蜂王和工蜂都是由相同的受精卵发育而来，它们级型分化是从幼虫期开始 的【1 1 。蜜蜂在幼虫期发育速度很快，在孵化后的9 6 h 中，幼虫大约每隔2 4 小时就 蜕一次皮【2 】。在所有社会性膜翅目昆虫中，蜜蜂发育周期历时最短，从受精卵到 羽化，西方蜜蜂的工蜂需要2 1 天，蜂王仅需1 6 天；其中工蜂经历了6 天幼虫期， 而蜂王的幼虫期只需要5 天【3 】。它们发育时间的差异是由于后天所处的营养环境 不同造成的f 4 5 1 ，出生在王台的幼虫不但被饲喂的次数是出生在工蜂巢的幼虫的 数倍，而且被饲喂食物的含糖量也明显高于出生在工蜂巢的幼虫。 蜂王和工蜂的级型发育虽然是一个连续的过程，有些时期却是有两级型蜂 分化的“分水岭”。通过互换培育试验发现，小于4 龄末期的幼虫培育在王台中 可发育为蜂王，培育在工蜂巢脾中则发育为工蜂；而大于4 龄末期的工蜂幼虫即 使被移入王台中也只能发育成工蜂，说明只有小于4 龄末期的幼虫才具有双向发 育的能力【引，4 龄末期是一个级型分化的关键时期【眄】。因此本实验选取4 龄末期 前后( 3 日龄，5 日龄) 的蜂王和工蜂幼虫为代表，研究两级型蜂在幼虫期的发 育特点。 在幼虫期短短几天的时间里，蜂王和工蜂的体重就出现明显差异，其间有 大量蛋白质参与表达和调控，是蜜蜂级型发育的重要阶段。但前人对幼虫期级 型分化的研究大多集中在营养、激素和基因组方面，而在蛋白质组学方面却很 少。因此，本实验利用比较蛋白质组学方法，研究蜂王和工蜂在幼虫期的发育 特点，这有利于推动蜜蜂生物学的发展，为研究影响级型分化的因素提供了参 考。 2 1 材料和方法 2 1 1 试剂 双向凝胶电泳( 2 一d e ) 蛋白分子量标准、固相p h 梯度( i p g ) 胶条( p h 3 1 0 线性) 、b i o l y t e ( p h 3 1 0 ) 和矿物油均购于b i o - r a d 公司。 i r i s 碱、过硫酸铵( a p ) 、 十二烷基磺酸钠( s d s ) 、甘氨酸和尿素，均购1 1 1 s i g m a 公司。丙烯酰胺、甲叉 双丙烯酰胺、溴酚兰、考马斯亮兰( c b b ) g 2 5 0 、硫脲、c h a p s 、牛血清白蛋 7 第二章蜜蜂幼虫期蜂王和工蜂蛋白质组成及发育特点比较 白( b s a ) 和琼脂糖均购于a m r e s c o 公司。d t t 、碘乙酰胺，来l 刍m e r c k 公司。 其余化学试剂均产自北京化学试剂公司。 ( 1 ) 磷酸抽提缓冲液( p b s ) ( 3 2 5 m mk 2 h p 0 4 ，2 6 m mk h 2 p 0 4 ，4 0 0 m m n a c i ，p h7 6 ) k 2 h p 0 4 3 h 2 0 ( 2 2 8 2 2 ) k h 2 p 0 4 ( 1 3 6 0 9 ) n a c l ( 5 8 4 4 ) 超纯水溶解，最终定容至 4 。c 冰箱保存待用。 ( 2 ) 蛋白样品溶解缓冲液( 8 m t r i s b a s e ，3 0 m md t t ，0 5 b i o l y r e 尿素( 6 0 0 6 ) 硫脲( 7 6 1 2 ) c h a p s ( 6 14 9 ) t r i s ( 1 2 1 3 ) d t t ( 15 4 2 ) 超纯水溶解，最终定容至 0 3 7 9 0 0 1 7 9 1 1 6 9 9 5 0 m l 尿素，2 m 硫尿，4 c h a p s ，2 0 m m ( p h3 5 1 0 ) ) 9 6 1 9 3 0 4 4 9 o 8 9 o 0 4 8 9 0 0 9 2 9 2 0 m 1 分装为l m f 管，一2 0 。c 冰箱保存待用，临用前每管力1 4 0 b i o l y t e1 2 5ul ，剩 余4 。c 冰箱保存待用。 ( 3 ) b r a d f o r d 工作液 9 0 乙醇， 8 5 磷酸溶液 c b b ( 考马斯亮蓝) g 2 5 0 超纯水至 用前滤纸过滤，棕色瓶室温可存放一个月。 ( 4 ) 1 0 蛋白标准液 b s a ( 牛血清白蛋白) 超纯水至 分装出l m f 管x9 管，2 0 冰箱存放待用。 ( 5 ) 1 蛋白标准液 1