（有机化学专业论文）褐藻糖胶提取纯化、结构分析及抗氧化研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 本文通过提取纯化和分离褐藻中的褐藻糖胶，并对褐藻糖胶的理化性质、多 糖结构和体外抗氧化等方面对进行了比较系统的研究，主要获得如下结论： ( 1 ) 通过对褐藻糖胶四种提取工艺( 热水浸提、超声波辅助提取、微波辅 助提取和复合酶酶解法提取) 的对比研究，确定了最佳得提取工艺为复合酶酶解 法提取工艺：1 0g 藻粉料水比为l ：4 0 ，胶体磨处理，先在9 0 。c 搅拌1h 预处理， 冷却到实验要求的温度，用磷酸盐缓冲液调节p h 值为3 5 ，加入l 复合酶，3 0 进行酶解1 5h 。酶解结束后，升温到9 0 c ，并且恒温提取3h 。提取混合液离 心，藻粉再以1 ：4 0 料液比9 0 搅拌提取lh 。 ( 2 ) 分离纯化时，使用s e v a g e 法脱蛋白，对褐藻糖胶分离纯化进行了研究， 比较好的分离条件是：d e a e - s e p h a r o s ef f 离子交换分离得到的两个褐藻糖胶组 分f 1 和f 2 ，通过s e p h a d e x - g 1 5 0 葡聚糖凝胶柱层析和醋酸纤维素膜电泳鉴定为 均一组分。 ( 3 ) f 1 和f 2 都具有还原能力和淬灭脂质过氧化能力这两种能力都随着 褐藻糖胶的剂量的增加而增加。且f l 能力要比f 2 要强，除了f 1 分子量大些之 外还可能是因为f l 的硫酸根含量要高。 ( 4 ) 对褐藻糖胶组分f 1 和f 2 的理化性质研究得到：f 1 和f 2 的分子量分 别为1 2 0 2 2 6 4 和1 3 1 8 2 5 。且f 1 和f 2 均为硫酸酯化多糖，f 1 的硫酸根含量比 f 2 要高5 6 。 ( 5 ) 对褐藻糖胶组分f l 和f 2 的结构分析得到：f 1 和f 2 都是a 构型的吡 喃糖环，单糖组成都为：d - 葡萄糖、d 一木糖、d 甘露糖、d 半乳糖、l 广岩藻糖 和l 广鼠李糖。s o d 2 。的存在岩藻糖上的c 4 上，并且是和糖环上垂直的羟基相联。 关键词：褐藻糖胶；酶解法；提取和纯化；抗氧化；结构分析 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nt h i sa r t i c l e f u c o i d a n sw e r ee x t r a c t e da n dp u r i f i e df r o mt l l eb r o w ns e a w e e d 1 1 1 e p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e s 、g l l a l c t u r ea n da n t i o x i d a n tp r o p e r t i e s i nv i t r oo f f u c o i d a nw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e da sf o l l o w i n g ： ( 1 ) f u c o i d a n sw e r ei s o l a t e df r o mt h eb r o w ns e a w e e db yh o tw a t e re x t r a c t m e t h o d 、u l t r a s o n i cw a v ea s s i s t e dm e t h o d 、m i c r o w a v ea s s i s t e dm e t h o da n d m u l t i e n z y m ee n z y m o l y s i sm e t h o d t h em o s tr a t i o n a lm e t h o do b t a i n e db yc o n t r a s tw a s m u l t i e n z y m ee n z y m o l y s i sm e t h o d ：1 0gb r o w ns e a w e e dp o w d e rw e r es o a k e dw i t h 4 0 0m lw a t e r ( w c i g h to fm a t e r i a l ：w e i 【g h to fw a t e r = l ：4 0 ) ，a n dg r m e db yc o l l o i d m i l l ，p u ti nw a t e ro f9 0 cf o r1ha sap r e t r e a m a e n t , c o o lt or o o mt e m p e r a t u r e ，a d j u s t p hv a l u et 0 3 5b yt h eb u f f e rs o l u t i o no fp h o s p h a t e 。a d dm u l t i e n z y m e ( 1 w e i g h to f b r o w ns e a w e e dp o w d e r ) ，e n z y m o l y s i si nw a t e ro f3 0 cf o r1 5h t h e nt e m p e r a t u r e w a l - mt o9 0 q u i c k l ya n de x t r a c ti nt h et e m p e r a t u r ef o r3h i n t e r m i x t u r ew e r e c e n t r i f u g a t e d ，a n dt h ep o w d e rw e r es o a k e dw i t h4 0 0m lw a t e r ( w e i g h to fm a t e r i a l ： w e i g h to fw a t e r = - i ：4 0 ) ，e x t r a c t e di nw a t e ro f 9 0 cf o r1h ( 2 ) d u r i n gt h ep u r i f i c a t i o no fc r u d ef u c o i d a n ，r e r f l o v et h ep r o t e i ni nt h ec r u d e f i l c o i d a nb ys e v a g em e t h o d t h em o s to p t i m u me l u t i o nc o n d i t i o ni np u r i f i c a t i o no f c r u d ef u c o i d a nu s i n gd e a e s e p h a l o s ef fi s0 2m o l ln a c if o r2h 0 4m o l ln a c l f o r2h ，0 6m o l ln a c if o r2h ，0 8m o l ln a c if o r2ha f t e re l u a t i o n gw i t l lt r i s h c i ( p h = 7 0 ) b u f f e rs o l u t i o nf o r2 0r a i n t w of u c o i d a n sw e r ec o l l e c t e da n dt h e i rp u r i t y w e r ei d e n t i f i e db yg l ca n ds d s p a g em e t h o d s n c yw e r en a m e df ia n df 2 ( 3 ) f 1a n df 2b o t hh a v ea b i l i t i e so fr e d u c t i o na n db l o c k i n gp e r o x i d a f i o no f p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i df r o my o l kl i p o p r o t e i ni n d u c e db yf e r r o u si o n a n dt h e a b i l i t i e so ff 1a r es t r o n g e rt h a nf 2 s ，t h em o s tp r o b a b l ef a c t o r sa l et h a tf 1 sm o l e c u l a r w e i g h ta n dt o t a ls u l f a t ec o n t e n ta r em o r et h a nf 2 s ( 4 ) d u r i n gt h es t u d yo ff u c o i d a n s p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e s ，m o l e c u l a rw e i g h t o ff 1a n df 2a 佗1 2 0 2 2 6 4a n d1 3 1 8 2 5r e s p e c t i v e l y b o t hf ia n df 2a r es u l f a t e p o l y s a c c h a r i d e s ，e v e nt h et o t a ls u l f a t eo ff li s5 6p e r c e n tm o r et h a nf 2 s 浙江大学硕士学位论文 ( 5 ) d u r i n gt h es t u d yo ff u c o i d a n s s t r u c t u r e , b o t hf ia n df 2w e r em a d eu po f d g a l a c t o s e 、d - m a n n o s e 、d - r h a n m o s e 、d x y l o s e 、l - f u c o i d a na n dl - g l u c o s e s u l f a m g r o u p sl i et oc ao ff u c o s e ，a n dl i et oa x i a lp o s i t i o no fs a c c h a r i d er i n g sh y d r o x y g r o u p k e y w o r d s ：f u c o i d a n ；e n z y m o l y s i s ；i s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n ；a n f i o x i d a t i o n ； s t r u c t u r a la n a l y s i s 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 多糖及其研究趋势 多糖是自然界含量最丰富的物质之一，在生物体内的高聚物中，糖是最后被 研究的领域。糖、脂肪和蛋白质并列为三大营养物。蛋白质构成酶和骨骼结构， 脂肪构成细胞膜，而糖并没有吸引太多的关注。起初人们只把糖当作为能源物质 来看待【l 】。多糖是由二十多个到上万个单糖基以糖苷键结合而成天然大分子物 质，我们容易注意到它的名字来自“碳水化合物( c a r b o h y d r a t e ) ”，由于其分子 式( c h 2 0 ) 。使得它看起来像是用碳和水做成的。多糖不是一种纯粹的化学物质， 而是聚合程度不同的混合物，多糖具有复杂的结构，从而具有装载丰富生物信息 的能力。核酸中的核苷酸和蛋白质中的氨基酸都只有一种链接方式，而多糖中的 糖单体则有多种链接点，从而形成不同构型的直链和支链的结构【2 】。譬如，4 种不同的单糖形成同分异构体的可能性为3 5 5 6 0 种，而4 种氨基酸只能形成2 4 种同 分异构体1 3 j 。多糖也能依据分子量、分子间氢键的不同而形成不同的高级结构。 组成多糖的单糖可以相同也可以不同。自然界中的多糖可分为离子型多糖和非离 子型( 中性) 多糖。非离子型多糖依据其组成单糖种类又分为均多糖和杂多糖两大 类。由相同的单糖组成的多糖成为均多糖( h o m o p o l y s a c c h a r i d e s ) ，如以d 葡萄 糖为主链的淀粉、纤维素和糖原；以不同的单糖组成的多糖成为杂多糖 ( h e t e r o p o l y s a c c h a r i d e s ) ，如阿拉伯胶是由戊糖和半乳糖等组成【4 】。均多糖主要 有d 一葡聚糖、d 半乳聚糖、d 甘露聚糖、d 木聚糖和d 岩藻聚糖等几种，其中 以d 一葡聚糖在自然界中最为常见。d 一葡聚糖又分为q ( 1 2 ) 、1 3 ( 1 2 ) 一、 - ( 1 3 ) - 、1 3 - ( 1 3 ) - 、d - ( 1 4 ) 一、b - ( 1 4 ) 一、- ( 1 6 ) 、b 一( 1 6 ) 一等几 种形式。近年来，人们惊奇地发现多糖及其缀合物对多种危害人类健康的疾病， 如免疫紊乱、癌症、糖尿病、高血压、肝炎、血栓等，都具有显著的疗效【量6 ”。由于分子生物学的发展，人们逐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的 生物功能，并且相继多次召开了有关“糖生物学和糖工程”的专题会议，1 9 5 3 年3 月，亚洲分子生物学组织( a m b 0 ) 还在日本举办了“糖生物学和糖工程” 培训班噶】，也就是说，“糖生物学的时代正在加速来临”。多糖是一类天然大分 子化合物，多糖作为药物始- 于1 9 4 3 年【9 】。但是在较长时间内没有得到足够的重视。 5 0 年代随着化学和生物学的发展和分离技术的提高人们才开始认识到多糖的结 浙江大学硕士学位论文 构是非常复杂多样的”其生物学功能也决非仅仅是能量和结构上的功能。6 0 年代 前后【l 研多糖作为广谱免疫促进剂引起人们极大的兴趣，逐渐发现多糖具有复杂 的、多方面的生物活性和功能。7 0 年代以来，随着免疫物质、生物膜和各种生物 活性物质研究进展表明，发现糖类在体内具有各种关键的生物功能。8 0 年代以后， 人们得到了有关糖的结构和功能的越来越多的信息，特别是近十年来人们对糖的 认识有了质的飞跃，认识到糖是除核酸和蛋白质之外另一重要的生命物质【1 ”， 涉及到特别是多细胞生命的全部时间和空间。但是到目前为止，与蛋白质和核酸 的研究相比还有很大的差异，还不够深入，这主要反映在以下几个方面：( 1 ) 多糖的结构与功能的关系至今仍是多糖研究的薄弱环节，大多还是凭科学家们的 分析和推测，而对多糖的溶液构象和晶体结构的研究还是较少。( 2 ) 多糖的结 构测定方法还远未达到像核酸和蛋白质结构测定那样自动化、微量化和标准化。 由于多糖分子中每个多糖残基都有多个反应点，这使糖苷键具有多种连接的可能 性，而构型又有q 和b 两种，这使得多糖的结构测定远比蛋白质和核酸结构测定 来得困难。虽然近来有人用质谱和核磁共振以及毛细管电泳等技术来测定多糖的 结构，但局限性较大，还未形成成熟的可靠的体系。( 3 ) 多糖的合成( 目前实 际上只是寡糖的合成) 也远比多肽和多聚核苷酸的合成困难和复杂。( 4 ) 多糖 在体酶的作用机制还未十分明了。尽管对多糖的研究还存在上述这些问题，但是 多糖的应用前景表明了多糖研究的强大生命力。当今，天然多糖化合物己成为一 种免疫剂用于肿瘤、肝炎等疾病的治疗和康复，而艾滋病的肆虐更使天然多糖化 合物，特别是它的衍生物，如硫酸化多糖已引起科学家们的高度重视【1 2 1 。 1 2 功能性多糖分类 现已从天然产物中分离出3 0 0 多种功能性多糖类化合物，具有一定功能性的 天然多糖按照来源可大致分为五大类：植物多糖：同中药的研发相结合，目前 主要亚洲国家研究较多，如当归多糖、南瓜多糖、茶叶多糖、枸杞多糖、人参多 糖和大枣多糖等。藻类多糖：自1 8 1 8 年英国人s a n f o r d 从褐藻发现了褐藻胶 以来，褐藻工业( 实际上是生产褐藻多糖) 大为发展。后来从各类海藻中陆续分 离出各种多糖，例如从褐藻中分离出褐藻胶、褐藻糖胶等。现行研究较多的藻类 多糖包括：紫菜多糖、红枣多糖、海带多糖、多管藻多糖、螺旋藻多糖、羊栖菜 多糖等【1 ”。真菌多糖：真菌是我国天然药物资源和中草药的一个极为重要的 2 浙江大学硕士学位论文 组成部分，1 9 5 1 年美国人g e i n yh 首次发现担子菌有抑瘤活性。在真菌多糖方 面，日本的研究较深入，并且有数种多糖应用于临床。截至1 9 7 7 年，在专利文 献中可查到，人们已试验筛选出1 6 9 种担子菌的多糖有抗癌活性。如今国内研究 比较多的有：香菇多糖、灰树花多糖、银耳多糖、茯苓多糖、猪苓多糖、灵芝多 糖以及木耳多糖、虫草多糖、酵母葡聚糖等等。但就我国已着手开展的多糖课题 中，真正研究的比较清楚的只有香菇多糖等少数几种“4 5 l 。动物多糖：主要 是来源于多种哺乳动物的多糖，如壳聚糖、硫酸软骨素b ( d e r m a t a ns u l p h a t e ) 、 肝素多糖，这些多糖的生物活性作用主要是抗凝血性。细菌类多糖：肺炎球菌 ( p n e u m o c o c e a l ) 荚膜多糖、脑膜炎球菌荚膜多糖、流感杆菌假膜多糖等，这一 类多糖主要是作为疫苗研究。其中肺炎球菌多糖等在美国已经应用于临床，该类 多糖的研究国内还不多。 1 3 功能多糖 近几十年来，由于相关研究包括膜的化学功能、免疫物质的研究以及对新药 物资源的寻找等，人们发现多糖在生物体中不仅是作为能量资源或结构材料，更 重要的是他参与了生命科学中细胞的各种活动，具有多种多样的生物学功能。已 发现不少多糖物质及其衍生物具有药用价值，多糖的研究日益受到重视，由于多 糖在h i v 或其他致病源于细胞结合过程中扮演了重要的角色，它成为免疫系统 控制和癌症治疗的最重要的线索之一。现简单叙述一下几类功能多糖研究近况。 1 3 1 调节免疫功能类多糖 多糖主要通过启动免疫细胞，如启动t 淋巴细胞、b 淋巴细胞，激活巨噬细 胞( m p ) 、自然杀伤细胞( n k ) 、细胞毒t 细胞( c i l ) 、淋巴因子激活的杀伤 细胞( l a k ) 等，还能促进细胞因数生成活化补体，从而实现对机体的免疫调节 功能。 此类多糖研究最多，多种多糖已经应用于临床。如香菇多糖、云芝多糖等。 该类多糖以免疫增强为基础，表现多种活性。其中，多糖的抗肿瘤活性发现研究 都比较早，目前国内研究最多的就是这一类多糖，但对其作用的机理还不甚明了， 只是认为该类多糖通过激活非特异性免疫物质发挥作用。在此类多糖中，葡聚糖 同抗肿瘤活性的构效关系研究较为彻底【1 6 】。多糖的主链组成对抗肿瘤活性的影 响较大，对于葡聚糖，大多活性多糖都是具有b 一( 1 ，3 ) 一苷键主链的葡聚糖。具有 浙江大学硕士学位论文 生物活性的b 一( 1 ，3 ) - d 一葡聚糖的分支度范围很广：在0 0 1 5 - 0 7 5 0 之间都有分布。 但其主要分布在0 2 0 0 3 3 之间，该段的多糖活性也相对更强。b l a s e h e k ( 1 9 9 2 ) ， f a b r e ( 1 9 8 4 ) ，k o j i m a ( 1 9 8 6 ) 研究发现，分子的大小是多糖具备生物活性的必要 条件，这可能同多糖分子形成的高级构型有关。其中相对分子质量在1 0 0o o o 2 0 00 0 0 之间的多糖活性最强。同时研究中发现，来源相同、相对分子质量范围 为50 0 0 1 00 0 0 的多糖，都不具备生物活性。而相同来源的多糖其结构具有类似 性，多糖的构象是上述多糖基本结构作用的整体结果。由于多糖结构的复杂性， 目前多糖的结构研究大多还局限于一级结构上，大多高级构象还不甚明了。但多 糖作为一个大分子，根据目前研究，可以肯定的是多糖的高级结构对于多糖的活 性的发挥起着更为重要的作用。一些含蛋白质或肽键的糖蛋白或多糖肽有比多糖 本身更强的抗肿瘤活性。目前此类多糖有：云芝多糖、从香菇( le d o d e s ) 中分 离的甘露聚糖肽等。梁忠岩对树舌多糖进行衍生化研究后得出结论：当糖链相 同时，与蛋白相连者活性高，分枝短的糖链活性高。如螺旋藻多糖为水溶性多糖， 当与蛋白质形成糖蛋白，与脂质形成脂蛋白时，其生物功能更加突出。溶解度对 活性的影响有时也很显著。如具1 3 一( 1 ，3 ) - d 葡聚糖的c u r d l a n 不溶于水，部分羧甲 基化后水溶性提高，活性也显著提高，s a s a k i 、u s u i 等的研究也得到相同结论。 1 3 2 抗凝血多糖 目前报道具有抗凝血作用的多糖有：肝磷脂( h e p a r i n ) 、硫酸软骨素 ( d e r m a t a ns u l p l h a t e ) 、海藻糖化的硫酸软骨素( f u c o s y l a t e dc s ) 、茶叶多糖、猴 头子实体多糖等。抗凝血作用的机理现在认为可能有：同抗凝血酶结合，诱 导其改变构型，从而对其进行激活；对一种血清蛋白酶抑制因子( 肝素辅因子1 i ) 的激活【1 7 j 。肝素的抗凝血活性发现相对比较早，研究比较彻底。肝素的作用主 要通过激活抗凝血酶产生作用。n i s h n o 等的研究发现，褐藻多糖硫酸酯的抗凝 血活性依赖于其硫酸根含量，硫酸纤维素钠也具有抗凝血活性，对一给定分子大 小的硫酸纤维素钠，其抗凝血活性随硫酸取代基的增加而增加，在取代度一定时， 活性随相对分子质量升高而降低。除肝素外，其它一些类似的硫酸聚氨基葡糖类 似物也具有抗凝血活性，如： n ，o 一硫酸化聚氨基葡糖、0 硫酸n 一乙酰化聚氨 基葡糖、硫酸化o 一羧甲基聚氨基葡糖等，其中半氨基己糖中的6 - 0 硫酸基可能是 其主要活性位点。3 0 一硫酸基并非必须，但其能增强6 旬硫酸基活性作用。该类 4 浙江大学硕士学位论文 多糖的抗凝血活性同相对分子质量也具有相关性，活性依次为：0 一硫酸n 一乙酰 化聚氨基葡糖( 2 60 0 0 ) 肝素( 2 1o o o ) n ，o 硫酸化聚氨基葡糖( 1 20 0 0 ) 硫酸 化o 一羧甲基聚氨基葡糖( 5 4 0o o o ) 堋。 1 3 3 抗病毒多糖 对于多糖及其衍生物的抗病毒活性的研究，主要有硫酸多糖、中性多糖及糖 复合物( 脂多糖、糖蛋白及糖肽) 。而硫酸多糖的研究已成为当今多糖研究中的一 个热点，如硫酸葡聚糖，硫酸戊聚糖、硫酸香菇多糖等9 1 。其中研究比较多的 为多糖的抗h i v 功能。其作用机理可能在于：大多数多糖的大分子能够机械 性或化学性地结合到 玎一1 的g p l 2 0 分子上，遮盖了病毒与细胞的结合位点，从 而竞争性地封锁了病毒感染细胞；抑制感染细胞h i v 的复制2 0 】；增强机体 免疫功能。硫酸根对抗h i v 病毒目前认为是必须的，并且其抑制h 的作用同 分子中硫酸盐含量有关。含量愈高，其抗h i v 的作用愈强。近年来，许多研究者 半合成了一系列具有体外抗h i v 活性的硫酸多糖，如p e n t o s a np o l y s u s f a t e 、m a t l n a i l s u l f a t e 、h o e 8 a y 9 4 6 、c u r d l a ns u l f a t e 、c u r d l a na r a b i n o s es u l f a t e 、o l r d l a ng a l a c t o s e s u l f a t e 等。这些多糖在硫酸化前或者没有抗h i v 活性，或者活性较低，硫酸化后 具有或增强了活性1 9 1 。分子大小对多糖抗病毒活性也有影响，硫酸葡聚糖抗h i v 病毒活性随着相对分子质量的增加而增加，相对分子质量1 00 0 0 时达到最大，1 0 0 0 0 5 0 00 0 0 之间保持最大活性。多糖的烷基化对硫酸多糖的抗h i v 活性有促进作 用。u r y u 等人( 1 9 9 2 ) 合成了对h i v 有抑制活性的硫酸烷基寡糖，如硫酸十八烷麦 芽醇己糖苷，硫酸十二烷昆布戊糖苷和硫酸十二烷昆布寡聚物，未烷基化的寡糖 显示抗h i v 活性，烷基化后活性显著提高。作用机理可能是烷基与病毒囊膜脂 双层作用，破坏其囊膜。 1 4 多糖的构效关系 多糖的构效关系就是指多糖的一级结构和高级结构及理化性质与其生物活 性的关系，是当前糖化学和糖生物学共同关注的焦点问题。从总体上看，对于多 糖构效关系的研究很不完善，这可能是因为多糖的结构过于复杂。研究多糖的生 物活性与结构的关系可以从以下几方面考虑。 1 4 1 多糖一级结构与生物活性的关系 5 浙江大学硕士学位论文 1 4 1 1 多糖的糖组成和糖苷键类型的影响 多糖的糖组成和糖苷键类型对其生物活性有一定的影响，如从菌体中提得的 活性多糖一般由葡萄糖组成，而且葡聚糖主链上的b - ( 1 ，3 ) 甙键和支链上的1 3 一( 1 ，6 ) 甙键为必须。如香菇多糖的具有b ( 1 ，3 ) - d 毗喃葡聚糖主链，c 6 上带有分 支侧链，1 3 - ( 1 ，3 ) 和1 3 ( 1 , 6 ) 结合的侧链共存是抗肿瘤活性所必不可少的例。如 奇果菌属分离出的具抗肿瘤活性的奇果菌多糖( g r i f o l a n ) ，基本结构是1 3 ( 1 ，3 ) 结合的直链葡萄糖，3 分子中有1 分子的1 3 ( 1 , 6 ) 侧链葡聚糖2 ”。核盘菌分离得到 的抗肿瘤多糖s s g 其结构以b - ( 1 ，3 ) d 葡聚糖为主干，每两个葡萄糖单元有一个 b ( 1 ，6 ) - d 一葡聚糖支链捌。从香菇中提得的抗肿瘤多糖，也由1 3 - ( 1 ，3 ) 结合的直 链葡聚糖构成，以5 个分子上有2 个分子的比率，在6 位有8 结合的侧链葡萄糖分 子田】。酵母菌中提取到葡萄甘露聚糖，其活性好象与d 一葡萄糖的含量和键合方 式有关凹j 。云芝多糖( p s k ) 是由每个葡聚糖单位含有一个带1 3 - ( 1 ，6 ) p l 喃糖甙支 链的b 一( 1 ，4 ) 葡聚糖。其中还有一些残糖基，它也是近年来引人注目的肿瘤免疫 药物。 1 4 1 2 官能团的影响 多糖一级结构对其生物活性影响的第二个方面是多糖中的一些官能团。多糖 中的官能团的种类或有无对其生物活性有极大的影响，如糖链上硫酸基、乙酰基、 烷基和羧甲基等的取代位置和含量及络合元素的种类决定了多糖有何活性及活 性大小。而这些官能团往往可以通过一定的化学方式进行添加或消除，所以多糖 中官能团的改造已成为研究多糖构效关系的有力手段。通常可以通过降解、羧甲 基化、硫酸酯化、乙酰化、烷基化、磷酸酯化、二乙基氨基乙基化、碘化、氨化 等改造多糖官能团的方法有目的地得到高活性的多糖片段或寡糖。而对不同的多 糖来说，不同官能团改造方法对其生物活性的影响各不相同：大多数通过硫酸酯 化的多糖具有明显的抗病毒作用、抗肿瘤和抗凝血等活性，如硫酸葡聚糖，硫酸 戊聚糖、硫酸香菇多糖等瞄】。硫酸根对抗h i v 病毒目前认为是必须的，并且其抑 制h i v 的作用同分子中硫酸根含量和位置有关。硫酸多糖能有效地抑制h 的感 染和复制，对其他具囊膜病毒也有明显的抑制作用。硫酸多糖还能抑制h 诱导 的合胞体的形成1 2 0 q 。在对硫酸葡聚糖的研究中发现，聚合链长不变，硫酸根含 量分别为4 8 ，9 1 和1 8 1 时，1 8 1 的抗h i v 1 活性最高，在1 0u g m l 时可 6 浙江大学硕士学位论文 完全起到保护作用，而不含硫酸根或硫酸根含量低( 4 8 ) 的葡聚糖无明显作用。 香菇多糖在浓度5 0 0u g m l 时，对h i v 也无抑制作用，但硫酸酯化后，1 0u g m l 时就能强烈抑制h i v 抗原的合成。硫酸褐藻淀粉能抑制v 1 和h i v 2 感染m t _ 4 细胞和p b m c ，但脱去硫酸根后的褐藻淀粉无此活性。卡拉胶对h i v 等病毒有显 著的抑制作用，脱去硫酸根后活性也消失。卡拉胶中硫酸根的数目和位置对其抗 病毒、抗凝血活性有着显著的影响，如 卡拉胶中n - d 半乳糖2 ，6 位的两个s 0 4 。在其抗凝血活性中起决定作用1 2 7 。在对硫酸化甲壳质和硫酸化羧甲基甲壳质研 究中发现，o 一硫酸化壳聚糖具2 5 的肝素活力；n 一硫酸化壳聚糖无活力；c 6 硫酸 化一n 羧甲基壳聚糖具有4 5 的肝素活力，可见，c 6 位上的- c h 2 0 s 0 3 基团可显 著提高其活性【翻。1 9 9 2 年，u r y ue ta 1 对寡糖进行分子修饰，引入烷基和硫酸 根，发现其修饰产物具有抑制h i v - 1 的能力。硫酸化烷基寡糖可能从两个方面抑 制h i v - 1 ，一方面其寡糖部分与h i v 的囊膜糖蛋白有高度亲和性，这与其他硫酸 化多糖一致；另一方面其烷基部分与表面活性剂类似，可与病毒囊膜脂双层作用， 破坏其囊膜。其抗h i v 能力在烷基脱去后明显降低。 多糖乙酰基的数量和位置对多糖活性也有显著的影响。0 3 位具乙酰基时， 多糖抗肿瘤活性最强；0 - 5 位具乙酰基时活性明显减弱：在0 位上全部乙酰化时， 活性消失。原因是乙酰基能改变多糖分子的定向性和横向次序，从而改变多糖的 物理性质，乙酰基的引入使分子的伸展变化，最终导致多糖羟基基团的暴露，增 加其在水中的溶解性，因此对其活性产生影响【2 9 】。如地衣类多糖石脐素是b4 1 ，6 ) d 一葡聚糖，因部分乙酰化而具有溶解性，表现为抗肿瘤活性，当脱乙酰化或全 乙酰化后其溶解性降低，就丧失抗肿瘤活性。壳聚糖在有机相中，其分子中的氨 基( 一n h 9 可与酸酐进行乙酰化反应，可得到溶于甲酸等有机溶剂的酰基化产物。 这些产物可用于皮肤烧伤、创伤治疗和药物包被材料等例。 1 4 2 多糖的高级结构与生物活性的关系 多糖的高级结构的研究还较少，但许多科学家认为多糖的高级结构对功能的 影响比一级结构重要得多。多糖的特定空间构像是其产生生物学活性所必需的， 如具有抗肿瘤活性的香菇多糖呈三股螺旋结构，多糖药物裂褶多糖也能形成类似 三股螺旋的对称螺旋结构。但k r a u s 等人从多种植物中分离出一种b 一( 1 ，3 ) 邝 - ( i ，6 ) - 1 ) - 葡聚糖结构的多糖，没有规则的空间构像，却也显示出较强的抗肿瘤 7 浙江大学硕士学位论文 活性口”；这似乎一定程度上否定了空间构像在多糖活性上的决定地位。尽管如 此，多数研究认为生物学活性较强的多糖( 尤其是葡聚糖) ，一般都具有规则的 空间构像。对于水溶性b ( 1 ，3 ) 一d 葡聚糖，只有相对分子质量在9 00 0 0 以上才 能形成三股螺旋结构。具有三股螺旋结构的葡聚糖大多都具有多糖的免疫活性 口2 】。1 9 8 6 年g o j i m a 报道相对分子质量大于1 0 00 0 0 的高分子裂褶菌多糖能形成类 似的三股螺旋构型，并且只有具有该构型才具有活性。其抗肿瘤活性同水溶液中 三螺旋结构所占的比例有关。如果三螺旋结构低于5 0 ，就不具有强的抗肿瘤 活性。x 一衍射分析表明，香菇多糖及裂褶多糖均具b 三股绳状螺旋型立体结 构，在香菇多糖加入尿素或二甲亚砜，其活性就丧失，这二者多糖在水溶液的比 旋光度不同在尿素或二甲亚砜中的旋光度，暗示在尿素或二甲亚砜中，多糖立体 构型改变了，从而引起活性的丧失【3 3 】；向水不溶的裂褶多糖中添加尿素或氢氧 化钠，则可诱导产生规则的空间构像，从而表现出抗肿瘤活性【3 3 】。但是主链结 构有b 一( 1 ，3 ) 又有p ( 1 ，6 ) 侧链的葡聚糖，有些具有强的活性，而有些却无活性， 如茯苓多糖( p a c h y m a n ) ，化学结构虽与香菇多糖相似，而无抗肿瘤活性，若将其 中的一些b - ( 1 ，6 ) 侧链用类似高碘酸氧化和s m i t h 降解的方法将其切去，结果获 得了具有强烈抗肿瘤活性的多糖，x 射线分析表明此时己形成三重构造】。这 些都表明立体构型对多糖活性的显著影响。但s a i t o 等人分离出具有单股螺旋构 像的多糖，并证实其活性比具有三股螺旋结构的多糖活性更强1 3 5 。相对而言， 具带状立体结构的多糖，如a ( 1 ，3 ) 一d 一葡聚糖活性很低。有人研究发现由 m i r c r o e l l o b o s p o r i ag r i s e a 提取的葡甘聚糖位于侧链的q d ，m a n 在分子抗肿瘤 活性中起着重要作用。在对卡拉胶构效关系研究中发现，无规则卷曲卡拉胶糖链 的屈伸度在抗病毒活性中起着重要作用，糖链的屈伸度下降，卡拉胶的抗病毒活 性增强【蚓。总之，多糖的高级结构( 尤其是空间构像) 与活性的关系由于受到多糖 空间结构测试手段的限制，目前研究较少，还有待进一步研究。 1 4 3 多糖理化性质与生物活性的关系 1 4 3 1 多糖的溶解度的影响 多糖的溶解度对生物活性的影响也很大。多糖溶于水是其发挥生物学活性的 首要条件，如从茯苓中提取的多糖组分中，不溶于水的组分不具有生物学活性， 水溶性组分则具有突出的抗肿瘤活性。降低分子质量是提高多糖水溶性从而增 8 浙江大学硕士学位论文 加其活性的重要手段，一种真菌多糖，不溶于水，在大鼠体内仅有微弱的抑瘤活 性，5m g k g 剂量时抑瘤率为5 7 ，降低分子质量后，完全溶于水，1m g k g 剂 量可使抑瘤率达到1 0 0 。向多糖引入分支可在一定程度上削弱分子间氢键的相 互作用，从而增加其水溶性，如具有q 葡聚糖构型的灵芝多糖，不溶于水，羧 甲基化后溶解性提高，在体外也表现出一定的抗肿瘤活性，经红外色谱分析，经 羧甲基化后，d 一葡聚糖在3 4 0 0 c m - 1 处的羟基伸缩振动峰变窄，且向高波长方 向振动，说明分子间的氢键在引入羧甲基分支后被破坏口”。如b ( 1 ，3 ) d 葡 聚糖不溶于水，将其部分羧甲基化后，水溶性提高，则它的抗肿瘤活性也明显提 高【3 踟。有些含有疏水分支的多糖不溶于水，经过氧化还原成羟基多糖后才溶于 水，从而产生生物学活性。由此可见，降低分子质量、引入支链或对支链进 行适当修饰，均可提高多糖溶解度，从而增强其活性。 1 4 3 2 多糖的分子量的影响 b l a s c h e k ( 1 9 9 2 ) ，f a b r e ( 1 9 8 4 ) ，k o j t m a ( 1 9 8 6 ) 研究发现，分子的大小是 多糖具备生物活性的必要条件，这可能同多糖分子形成的高级构型有关。如分子 量为90 0 0 左右的右旋糖具有一定活性，其活性随分子量大于和小于此值而迅速 降低一般来说，把较高分子量的多糖降解为较低的分子量，能显著提高其活性。 有报道，硫酸化多糖的抗病毒作用与分子量也有很大关系，其分子量为l0 0 0 时， 能有效的抑制h 2 诱导的合胞体的形成，硫酸葡聚糖的抗h i v 1 活性随分子 量的增加而增加，在分子量为1 0 0 0 0 时最大，1 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 之间保持最大活 性。硫酸葡聚糖抗其它囊膜病毒能力也有近似的趋势【加】。u n e t e a u m 等从真菌植 物疫霉的细胞壁中分离的具支链的葡聚糖的免疫调节与分子量有关，具有较高聚 合度的葡聚糖有最佳活性。实验表明，肝素分子量在4 0 0 0 1 2 0 0 0 时抗凝血活 性最好【4 ”。多糖分子质量越大，分子体积越大，不利于多糖跨越多重细胞膜障 碍进入生物体内发挥生物学活性。肝素经过降解后的低分子质量组分能克服肝素 原有的出血和诱导血小板减少等不足，还具有抗血栓活性强、生物利用率高、体 内半衰期长和口服易吸收等优点；用化学降解方法获得的分子量为6 4 2 0 的肝 素，能有效地抑制h 和人体巨细胞病毒的复制，且抗凝血活性比其它多糖好， 被认为是理想的爱滋病候选药物。裂褶多糖起初由于分子量太大，影响临床应用 效果，经过超声降解后，分子量有所降低，临床应用效果大为改善。但也并不是 浙江大学硕士学位论文 多糖分子量越低越好，因为分子量过低，无法形成产生活性的聚合结构 4 2 1 ：在 对海洋多糖卡拉胶构效关系研究中指出，卡拉胶抗病毒活性在一定范围内随分子 量增加而增强。a l b a n 等人研究了分子质量与硫酸化凝结多糖抗凝血活性的关 系，认为抗凝血活性与相对分子质量呈哑铃型曲线关系4 3 】；g a o 等人报道，硫 酸化凝结多糖在相对分子质量为( 7 1 1 ) x 1 0 3 内，随着相对分子质量升高，其抗 凝血活性有增强的趋势】，这说明存在满足多糖活性的最佳相对分子质量范围， 从细菌中分离的某种果聚多糖i e v a n s ，相对分子质量达到2 1 1 0 5 时抑制肿瘤生 长的活性最强【4 习；由此可见，不同的多糖产生生物学活性的最佳相对分子质量 的范围不同。 1 4 3 3 多糖黏度的影响 多糖的黏度主要是由于多糖分子间的氢键相互作用产生，还受多糖分子质量 大小的影响，它不仅在一定程度上与其溶解度呈正相关，还是临床上药效发挥的 关键控制因素之一，如果黏度过高，则不利于多糖药物的扩散与吸收。通过引入 支链破坏氢键和对主链进行降解的方法可降低多糖黏度，提高其活性。如向纤维 素引入羧甲基后，分子间的氢键发生断裂，产物黏度从0 1 5p a s 降至0 0 5p a s 4 0 3 ； 裂褶多糖起初由于黏度大而无法在临床上使用，后来采用超声技术在不破坏其结 构的前提下使其发生降解，从而降低其黏度，而抗肿瘤活性保持不变，生物利用 率大大提高j 。另外，多糖分子中的游离羟基对活性也很重要，y a m a d a 发现将 车前子多糖过氧化后，其活性下降甚至消失，但当氧化物还原成多羟基后又显示 出活性。 1 4 3 4 多糖的电荷密度的影响 生物活性大小同电荷密度作用密切相关。其具有的负电荷密度愈高，同蛋白 质的结合力就愈强。减少肝素的羧基基团数目，电荷密度降低，抗凝血活性出现 降低。如肝素的抗凝血活性发现相对比较早，研究比较彻底。肝素的作用主要通 过激活抗凝血酶产生作用。肝素为酸性分子，其表面基团的密度一定程度上可能 决定其与蛋白质的结合。对肝素中未经硫化的糖醛酸残基进行高碘酸氧化，使其 电荷密度降低，抗血脂功能不变，而抗凝血活力也出现降低。按照电荷密度和相 对分子质量对肝素进行分级，去除相对分子质量和电荷密度对其的影响，肝素的 抗凝血活性随羧酸基团硫酸基团的比例的增大而升高。由此可得出结论，决定 1 0 浙江大学硕士学位论文 抗凝血酶活力的肝素同抗凝血酶作用的大小同聚合物主链上电离强度的调节息 息相关。对肝素的羧酸基团进行酯化，掩蔽其电荷，也可影响其抗凝血活性。茶 叶多糖( t p ) 含有大量的葡萄糖醛酸，在生理p h 值下带负电，推测可能具有肝素 样的作用。对海洋多糖甲壳胺在其甲壳胺分子上引入一s 0 3 h 或使之与带有 s 0 3 h 、c h 2 c o o h 的聚阴离子多糖相互作用，所形成的聚电解质复合物具有 类似肝素的结构，也可具抗凝血作用棚。 多糖的结构和理化性质都与其活性紧密相关，然而两因素并不是孤立地影响 多糖的活性，结构决定理化性质，从而影响活性，因此，在多糖构效关系的研究 中，除了单独考察各级结构和理化性质分别对多糖活性的影响外，还应研究由于 结构与理化性质之间、各级结构之间以及各种理化性质之间的相互制约对多糖活 性产生的综合效应。 1 5 多糖结构研究方法 1 5 1 多糖的结构层次 多糖的结构分类沿用了蛋白质和核酸的分类方法。单糖是多糖的组成单元， 单糖之间脱水形成糖苷键，并以糖苷键线性或分支形成寡糖或多糖。多糖的结构 也可分为一级、二级、三级和四级 删。多糖的一级结构是指多糖的单糖残基的 组成、排列顺序、相邻单糖残基的连接方式、异头物的构型及糖链有无分支、分 支的位置和长短等m 5 0 1 ；二级结构指多糖骨架链间以氢键结合所形成的各种聚 合体，关系到多糖分子中主链的构象，不涉及侧链的空间排布矧；三级结构是 指多糖链一级结构的重复顺序，由于糖残基中的羟基、羧基、氨基以及硫酸基之 间的非共价相互作用，导致有序的二级结构空间形成有规则而粗大的构象5 1 1 ； 四级结构是指多糖链阃非共价键结合形成的聚集体瞪2 1 。 1 5 2 多糖的提取与纯化 ( 1 ) 提取 多糖的提取可分为以下三种：脱脂后水提、直接水提和用碱性水液提。对于 动物多糖和脂类含量比较多的一般采用丙酮、乙醚和乙醇进行预处理，目的是脱 脂 5 3 1 。植物多糖一般用直接水提，不需要前处理，有人用聚苯乙烯树脂来除去 色素、蛋白和酚类物质，也有人用有机溶剂来除去一些小分子物质碉。此外 1 l 浙江大学硕士学位论文 有人用碱性水溶液作为提取溶剂，张兰杰等就用稀碱来提取百五味子果实中的果 糖冈，所得的多糖提取液有的可直接过滤或者用离心法除去不溶物。 ( 2 ) 多糖的沉淀分级、 多糖可用乙醇来沉淀回收，由于不同性质或不同分子两的多糖沉淀所需乙醇 浓度不同，它同样可以用于样品中不同多糖组分的分级分离钢。除了乙醇之外， 还有十六烷三甲基溴化铵( c t a b ) 或十六烷啶酸盐( c p c ) 也常用来沉淀酸性 多糖，从而把中性多糖与酸性多糖分开，加入少量的硫酸钠有助于多糖与c t a b 或c p c 形成复合沉淀，得到的多糖复合物用浓n a c 域k c l 溶液溶解，再加入乙醇 沉淀，解离后的c t a b 或c p c 可随上清液除去，也可用有机溶剂( 如正丁醇、戊 醇、氯仿等) 萃取。 ( 3 ) 除蛋白 多糖中的游离蛋白质可用蛋白质沉淀剂如三氯乙酸、鞔酸等除去铜，少量 蛋白质则用s e v a g 法除去，9r 删。大部分粘多糖是与蛋白质结合的，需要用酶降解 蛋白质部分或用碱液使多糖蛋白质问的键裂开以促使粘多糖在提取时的溶解，在 碱性提取的同时用蛋白酶处理组织，可将提取过程简化6 。 ( 4 ) 去离子 分级得到的多糖，溶于少量的水，然后进行去离子，去离子是为以后进一步 纯化及色谱分析作准备，最古老的去离子方法是透析，必须选择一种规格合适的 透析膜以免样品损失，透析方法不仅能去盐也可以除去各种小分子物质。使用柱 离子交