枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化.doc

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化采用改进的Spizizen法进行，详述如下：A，试剂SPI-A Salts Solution：0.4% 硫酸铵（NH4）2SO4 1322.8% K2HPO43H2O 2281.2% KH2PO4 1360.2% Trisodium Citrate Dihydrate（柠檬酸三钠-2-水）即二水合柠檬酸三钠 210121 20min灭菌（每次用完要灭菌）SPI-B Salts Solution：0.04%MgSO4*7H2O 120121 20min灭菌（每次用完要灭菌）100CAYE solution : 2% Casamino acid（酪蛋白水解物） 10% Yeast Extract121 20min灭菌（灭菌一次，每次在超净台取样）100EGTA solution：10mMol/L EGTA (NaOH调pH 至8.0)SPI Medium（20ml）SPII Medium（6 ml）9.8 ml SPI-A Salts Solution5.88ml SPI Medium9.8 ml SPI-B Salts Solution60ul 50mM CaCl2200ul 50% Glucose（0.1g）60ul 250mM MgCl2200ul 100 CAYE solution注：SPI、SPII 量比较少，容易干，确保大肠转化成功再配。B 感受态细胞的制备和转化1.前一天晚上挑取宿主菌（单菌落）接种于一支5mlLB液体摇瓶，37摇床过夜2. 第二天早上取100ul过夜培养的菌液，接种于50ml离心管配好的5ml SPI Medium中，37摇床培养，3h后开始测OD600（一般不用测），当培养物声场到对数末期时，快速取200ul接种到2ml SPII Medium中， 37100rpm 1.5h3. 加20ul100EGTA溶液，37100rpm 10min， 用1.5ml离心管分装成500ul每管4. 向管中加入适当的质粒，5-10ul，轻轻混匀与37100rpm 30min5. 将离心管转移到250rpm，37，1.5h6. 以4000rpm离心收集菌体。弃部分上清，留100ul重悬菌体，涂布于响应的抗性平板。37过夜。离心管选用10ml或者50ml带螺帽的底部尖的离心管。感受态细胞不能保存，因此，需要现做现用大肠的抗性（Amp），枯草的（Kan）枯草芽孢杆菌感受态的制备与转化（1）挑取枯草芽孢杆菌168单菌落与3mL液体LB培养基中，37过夜培养（2）取100ul过夜培养物，接种于5 ml SPI培养基中，37，200rpm震荡培养，当培养至对数期末期，快速取200ul接种于2ml的spII培养基， 37，100rpm震荡培养，培养1.5h（3）加入20ul100EGTA溶液，37，100r/min震荡10min（分500ul/管）（4）向管中加入适量质粒1-5ul，混匀，37，100r/min，震荡30min。（5）调整摇床转速，250r/min继续培养1-2h（6）取适量体积的细胞，涂布在含有相应 抗生素的LB平板上，过夜培养枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备（可保存的）1. LB平板上，37过夜培养2. 挑单菌落，接种于5 ml GM 溶液，30 125rpm，摇床过夜培养3. 次日，取2ml转接到18ml GM 中，37， 250rpm， 3.5h4. 再取10mL上一步骤的培养液转接到90mL GM 中，37，125rpm，1.5h， 5000rpm 10min5. 用10mL原培养液上清液轻轻旋复浮菌体，即为感受态细胞6. 加30% 的灭菌甘油至终浓度10%（500ul/管）10最低盐溶液（100mL）K2HPO4 14gKH2PO4 6g（NH4）2SO4 2gNa3C6H5O72H2O 1g（二水合柠檬酸三钠）MgSO47H2O 0.2g氨基酸溶液 2mg/ml，贮存于棕色瓶内，113灭菌30min，用黑纸包裹GMGM 1最低盐溶液 95mL1最低盐溶液 97.5mL50% 葡萄糖 1mL50% 葡萄糖 1mL5% 水解酪蛋白 0.4ml5% 水解酪蛋白 0.08ml10% 酵母汁 1mL10% 酵母汁 0.04mL2mg/mL 氨基酸溶液 2.5ml0.5M MgCl2 0.5mL0.1M CaCl2 0.5ml2mg/mL 氨基酸溶液 0.5ml枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化方法1. 挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37过夜培养；接种量1%至growth medium（LB含有0.5M山梨醇），37培养至OD600nm为0.85-0.95；2.冰上预冷10min后，转至预冷的50ml离心管，4，5000rpm 离心5min；用冰冷的EM（electroporation medium, 0.5M 山梨醇；0.5M甘露醇 36.434g；10%甘油），洗四次，将培养液中的成分全部去除；3.将沉淀悬于1/40体积冰冷的EM中，使细胞终浓度为1-1.31010cfu/ul，即得到感受态细胞（无需液氮处理，可直接存储于-70）4.将80ul感受态细胞与1ul整合质粒（浓度1-5ug/ul），以不加质粒的感受态细胞作为阴性对照。5.转至预冷的电转杯中，冰上放置5min6. 1mm电转化杯，采用2000v/mm，4.5-5.9ms电击；2mm电转杯，采用2500V/mm，4.0-5.9ms电击一次7.立即加入500ul Recovery medium(