（特种经济动物饲养专业论文）丝素共混膜组方优化及细胞相容性研究.pdf

摘要 丝素蛋白是一种来源广泛的天然蛋白，富含1 8 种氨基酸，具有优良的 理化性能和生物相容性，这使丝素蛋白膜在生物医学材料方面的应用研究更 具优势和前景。然而纯丝素膜易碎、易溶于水，制约了丝素蛋白在生物医用 材料方面的研究和应用。采用具有较好物理机械性能和良好吸水性的壳聚糖 对丝素蛋白进行改性处理，同时添加戊二醛、甘油或者聚乙二醇，分别制备 成丝素壳聚糖戊二醛和丝素壳聚糖，聚k , - 醇共混膜。通过探讨制备工艺条 件对膜结构和性能的影响，确定了最佳制备工艺。进一步对共混膜进行了细 胞相容性研究，为丝素蛋白材料在生物医学上的应用提供依据。研究结果如 下： 1 丝素蛋白膜的共混比、温度、戊二醛及甘油对共混膜的物理性能均有 显著影响。随着壳聚糖含量的增加，溶胀度、热水溶失率、透气率、初始模 量、相对断裂强度及相对断裂伸长均呈现e 升趋势。而随着甘油浓度的增大， 各物理性状有减小的趋势。当烘干温度为4 0 c 时，各物理性状达到较好水平。 戊二醛对各物理性能也有显著影响。当戊二醛浓度为0 3 时，各物理性能较 好。 2 丝素蛋白膜的共混比、聚乙二醇浓度和两者的交互作用对共混膜的物 理性能均有显著影响。随着壳聚糖浓度的增大，溶胀度、热水溶失率、透气 率、初始模量、相对断裂强度及相对断裂伸长均有上升趋势。聚乙二醇浓度 为0 5 时，是各物理性能较好。 3 纯丝素膜的横断面均匀致密，纯壳聚糖膜的横断面明显凹凸不平。丝 素与壳聚糖质量比为5 5 ：4 5 ，甘油、戊二醛体积分数为0 3 的共混膜横截面 有明显的网络状折叠，而丝素与壳聚糖质量比为7 0 ：3 0 ，甘油、戊二醛体积 分数为0 3 的共混膜的横截面比较平滑，只有少量突起。 纯丝素膜、丝素与壳聚糖质量比为7 0 ：3 0 ，甘油、戊二醛体积分数为0 3 的共混膜、丝素与壳聚糖质量比为5 5 ：4 5 ，聚乙二醇体积分数为o 5 的共混 膜及丝素与壳聚糖质量比为8 5 ：1 5 ，聚乙二醇体积分数为o 7 的共混膜的表 面细密光滑。丝素与壳聚糖质量比为5 5 ：4 5 ，甘油、戊二醛体积分数为0 3 的共混膜表面凹凸不平。 4 红外光谱的比较分析表明丝素和壳聚糖只是物理混合，两者处于相容 v 状态。加入戊二醛后，共混膜在1 5 4 6c m _ 处的吸收峰向高波段移动，且吸收 强度增强。甘油的加入对共混膜的结构没有显著影响。发现加入聚乙二醇后， 共混膜结构由无规卷曲向d 折叠转变。 5 确定了三种丝素蛋白共混膜的组合条件。一是丝素与壳聚糖质量比为 7 0 ：3 0 或5 5 ：4 5 ，干燥温度为4 0 ，戊二醛、甘油体积分数均为o 3 ；二是 丝素与壳聚糖质量比为7 0 ：3 0 或5 5 ：4 5 ，聚乙二醇浓度为o 5 ；三是丝素与 壳聚糖质量比为8 5 ：1 5 ，聚乙二醇浓度为0 7 o 6 i v i t i 法测定的丝素共混膜的细胞毒性在2 、4 、7d 时都在0 、1 级。 细胞增殖率在8 5 - 1 0 5 之间，细胞附着率在2 4h 达到9 0 以上，本试验所 用的几种丝素共混膜符合生物材料的应用要求。 关键词：丝素；壳聚糖；共混膜；性能；细胞相容性 v i p r e p a r a t i o nt e c h n i q u e so fs ii kf i b r o i nb i e n dm e m b r a n e s a n dc e il c o m p a t i b iii t ys t u d y a b s t r a c t s i l l 【f i b r o i ni san a t u r a lp r o t e i nu s e da st e x t i l em a t e r i a lf o ral o n gt i m e ，c o n s i s t s o f18k i n d so fa m i n oa c i da n dh a se x c e l l e n tp h y s i c o c h e m i c a lc h a r a c t e r sa n d s u p e r i o rb i o c o m p a t i b i l i t y t h e s em a k es i l kf i b r o i nm e m b r a n eh a ss u p e r i o r i t ya n d f o r e g r o u n di nb i o m e d i c i n em a t e r i a l b u tp u r es i l kf i b m i nf i l mi sf r a n g i b i l i t ya n d c a nb ed i s s o l v e di nw a t e re a s i l y c h i t o s a ni san a t u r a lm a c r o m o l e c u l ec o m p o u n d a n dh a su n i q u ec h e m i c a ls m 1 c t u r e c h i t o s a nm e m b r a n eh a sb e t t e rp h y s i c a l m e c h a n i s m p r o p e r t ya n df a v o r a b l ew a t e ra b s o r p t i o n 。 i no r d e rt oi m p r o v es i l kf i b r o i nm e m b r a n e sc a p a b i l i t y , w eu s ec h i t o s a n 、 g l u t a r a l d e h y d e 、g l y c e r o la n dp e g t ob l e n dw i t hs i l kf i b r o i n , p a r t l yp m p a r es i l k c h i t o s a n g l u t a r a l d e h y d ea n ds i l k c h i t o s a n p e gb l e n dm e m b r a n e d i s c u s s i n gt h e e f f o r to fc o n d i t i o no fp r e p a r a t i o nt om e m b r a n e ss l u c t u r ea n dc a p a b i l i t y , a s c e r t a i n b e s tp r e p a r a t i o nt e c h n i c sa n ds t u d yb l e n dm e m b r a n e sc e l lc o m p a t i b i l i t y i ta f f o r d s t e s t i f yf o rs i l kf i b m i nm a t e r i a li nb i o m e s i c i n e t h em a i n r e s u l t sa l ea sf o l l o w s ： 1 b l e n dr a t i o ，t e m p e r a t u r e , g l u t a r a l d e h y d ea n d # y c e r i no fs i l kf i b r o i n m e m b r a n eh a v er e m a r k a b l ee f f o r tt ob l e n dm e m b r a n ep h y s i c a le x t p a b i l i t y 1 1 l e d e g r e eo f s w e l l i n gr a t e ，w a t e rs o l u b i l i t y , b r e a t h ef r e e l yr a t e ，m o d u l u s ，r e l a t i v eb r e a k s t r e s sa n dr e l a t i v eb r e a ks w a i ni n c r e a s ew i t ht h ei n c r e a s eo fc o n c e n t r a t i o n so f e h i t o s a n w h e nt h et e m p e r a t u r ei s4 0 ，p h y s i c a lc a p a b i l i t yi sg o o d w l e nt h e c o n c e n t r a t i o no f g l u t a r a l d e h d ei s0 3 ，i ti sat u l i l i i l g w i t ht h ei n c r e a s eo f g l y c e r i n , p h y s i c a lc a p a b i l i t i e sh a v ec u r r e n to f r e d u c e 2 b l e n dr a t i o ，t h ec o n c e n t r a t i o n0 fp e ga n di n t e r a c t i o ne f f o r to fs i l kf i b r o i n m e m b r a n eh a v er e m a r k a b l ee f f o r tt ob l e n dm e m b r a n ep h y s i c a lc a p a b i l i t y r 1 1 1 e d e g r e eo fs w e l l i n gr a t e ，w a t e rs o l u b i l i t y , b r e a t h ef r e e l yr a t e ，m o d u l u s ，r e l a t i v eb r e a k s t r e s sa n dr e l a t i v eb r e a ks t r a i nh a v ea ni n c r e a s i i l gt r e n dw i t ht h ei n c r e a s eo f c o n c e n t r a t i o n so f c h i t o s a n at u r r f i n gp o 硫o f p h y s i c a lp r o p m i 酗i so 5 c o n o m t t t - a t i o no f p b g v i i 3 t r a n s e c to f p u r es i l kf i b r o i nm e m b r a n ei sd e n s ea n du n i f o n t la n dl r a n s e c to f p u r ec h i t o s a nm e m b r a n ei se x h i b i tr o u g h n e s s 田t r a n s e c to fb l e n dm e m b r a n eo f 5 5 s i l kf i b r o i n ，4 5 c h i t o s a n ，o 3 g l u t a r a l d e h y d ea n dg l y c e r i nh a v ee v i d e n c e r e t i c u l a rf o l d i n g a n dt h et r a n s e c to fb l e n dm e m b r a n eo f7 0 s i l kf i b r o i n ，3 0 c h j t o s a n ，o 3 g l u t a r a l d e h y d ea n dg l y c e r i ni ss m o o t h ，o n l yh a v ep r o c e s s ms u r f a c eo fp u r es i l kf i b r o i nm e m b r a n e ，b l e n dm e m b r a n eo f7 0 s i l kf i b r o i n , 3 0 c h i t o s a n , 0 3 g l u t a r a l d e h y d ea n dg l y c e r i n , b l e n dm e m b r a n eo f5 5 s i l k f i b m i n , 4 5 c h i t o s a n , 0 5 p e ga n db l e n dm e m b r a n eo f8 5 s i l kf i b r o i n , 4 5 c h i t o s a n , 0 7 p e gi ss m o o t ha n dt h es u r f a c eo fb l e n dm e m b r a n e o f5 5 s i l k f i b m i n , 4 5 c h i t o s a n , o 3 g l u t a r a l d e h y d ea n dg l y c e r i ni se x h i b i tr o u g h n e s s 4 w ef o u n dt h a ts i l kf i b m i na n dc h i t o s a nj l a s ti sp h y s i c a lb l e n db yi n f r a r e d s p e c t r u mc o m p a r i s o n , a n dt h e y w e r ec o m p a t i b l ew i t he a c h o t h e r a d d i n g g l u t a r a l d e h y d en 出a b s o r p t i o np e a ki n 1 5 4 6m o v eh i g hw a v eb a n da n d a b s o r p t i o ni n t e n s i t yi se n h a n c e g l y c e r i nh a sn oe f f o r to nt h es t r u c t u r eo fb l e n d m e m b r a n e i ti n d i c a t e st h a tp e gt u r n st h es t r u c t u r eo fb l e n dm e m b r a n ei n t o 1 3 - s h e e t 。 5 w ec o n f i r m e dt h ec o m b i n ec o n d i t i o n so fc o m p o s i t e ：1 s i l kf i b r o i nc o n t e n t i s7 0 o r5 5 ，t e m p e r a t u r ei s4 0 ，b o t ho f t h ec o n c e n t r a t i o n so f g l u t a m l d e h y d e a n dg l y c e r o la r eo 3 2 s i l kf i b m i nc o n t e n ti s7 0 n , 4o r5 5 ，t h ec o n c e n t r a t i o n so f p e ga l e0 3 3 s i l kf i b m i nc o n t e n ti s8 5 a n dt h ec o n t e n to fc h i t o s a ni s1 5 ，t h e c o n c e n w a t i o n so f p e ga r e0 3 6 c e hc y t o x i c i t yo fs i l kb l e n dm e m b r a n eb y 肼m e t h o di s0o r1g r a d e w h e ni ti s2 ，4 ，7 d c e l lp r o l i f e r a t i o ni sb e t w e e n8 5 1 0 5 a n da t t a c h m e n tr a t i oi s m o l et h a n9 0 0 oa t2 4h o u r s 政b l e n dm e m b r a n eo ft e s to b t a i na p p l i c a t i o n r e q u i r e m e n to f b i o l o g i c a lm a t e r i a l k e y w o r d s ：s i l kf i b m i n ；c h i t o s a n ；b l e n dm e m b r a n e ；p r o p e r t y ；c e l lc o m p a t i b i l i t y v i i i 本文所用缩写说明 缩写英文中文说明 s s w r t w p r 燃 a u n o s p h e r i c a lp e r m e a t i v er a t e c e l s i u st e m p e r a t u r e c e n t i m e t e r d a y e n v i r o n m e n ts c a ne l e c u i cm i n o r s f o u r i e r ( r a n s f o n ni n f r a r e ds p e c t r a c h i t o s a a d a m l i ( r e m a r g i n m i l l i 黜 m i l l i l i t e r m i n u t e m o l h y d r o g e ap o w d e r r e l a t i v eh u m i d i t y s i ( f i b r o i n s u p e r f i c i a l s w e l l i n g r a t e t i m e w a t e r yp e r m e a t i v er a t e w a t e fs o l u b i l i t y i v 透气率 摄氏度 厘米 天 环境扫描电镜 傅立叶红外变换光谱 壳聚糖 克 升 同试样组合体两次质量差 毫克 毫升 分钟 摩尔 酸碱度 相对湿度 丝素 试样面积 溶胀度 试验时间 透水率 溶解率 哥裟岱：急盅耐盘趼 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所 取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个 人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同 意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：隧差毖 导师签名：鲤凰笪 山东农业大学硕士学位论文 第一章文献综述和立题依据 蚕丝是人类最早利用的天然蛋白质之一，作为一种性能优良的纤维，主 要应用于纺织品。近来蚕丝还应用于生物技术、医药、精细化工等诸多方面， 引起人们的广泛关注蚕丝具有纯度高、来源广等一系列优点尤其我国是 蚕丝的生产大国，生丝产量占世界一半，对其进行详细研究，无论从基础科 学还是从应用科学来看都是很有意义的 甲壳素( c h i d n ) ，又名几丁质，化学名称为( 1 ，咿2 - 2 酰胺2 脱氧1 3 - d 葡聚 糖，广泛存在于海洋无脊椎动物和昆虫、真菌、酵母等的甲壳、隔膜、表皮、 细胞壁或细胞膜中，在自然界中是一种产量最高的氨基多糖类，年生物合成 量约为1 0 0 多亿吨( 蒋挺大，1 9 9 6 ) ，是地球上仅次于纤维素的第二大再生资 源其分子量一般都在1 0 0 万以上，不溶于水、稀酸、稀碱或般有机溶剂， 可溶于浓无机酸。壳聚糖( c h i t o s a n ) 是甲壳素n 一脱乙酰化的产物，是自然 界唯一的碱性多糖( 蒋挺大，2 0 0 1 ) ，有其独特的物理化学性质和生物活性 ( m a j e t iny e ta l ，2 0 0 0 ) 目前，开发性能优异的单体已经越来越困难，而共混改性不仅可以显著 改善原聚合物的性能，形成具有优异综合性能的聚合物体系，而且可以极大 降低聚合物材料开发和研制的费用和成本，因此聚合物的共混改性对于获得 综合性能较为理想的高分子材料，提高材料的使用性能、改善加工性能、制 备新型材料满足某些特殊的要求、降低生产成本都具有非常重要的意义下 面主要论述了丝素、壳聚糖的最新研究进展 1 丝素蛋白 l 1 丝素蛋白结构及性质 ，蚕丝是典型的天然蛋白质纤维，包括丝素蛋白和丝胶蛋白( h j je ta l ， 2 0 0 3 ) 丝素蛋白除了包含c 、h 、0 、n 种元素以外，还含有k 、c a 、s i 、 s r 、p 、f e 、c u 等元素。丝素蛋白含量约占蚕丝的7 0 - 8 0 ，是由重链( h 链) 、 轻链( l 链) 及p 2 5 糖蛋白组成的复合体 丝素h 链分子量为3 9 1 k d a ，由5 2 6 3 个氨基酸残基组成，其中甘氨酸、 丙氨酸、丝氨酸，酪氨酸约占总组成的8 0 以上h 链包含个1 5 1 残基的 非重复n 末端序列( 信号肽) ，1 1 个短的无定型区( 重复序列编码4 3 个氨基 陈春花；丝索共混膜组方优化及细胞相容性研究 酸) 和1 2 个1 - 2 k b 长的结晶区交替出现以及个5 8 残基的c 末端序列。h 链1 2 个低复杂度的结晶域，占链总长的9 4 * , ，因此是非常容易结晶的肽链。 ( c o n g - z h a oz h o u 融a l ，2 0 0 1 ) l 链分子量为2 5 8 0 0 d a ，链中含有的三个胱氨酸残基中的2 个胱氨酸形 成分子内二硫键，第三个胱氨酸残基位于c 端较亲水区域内，和丝素蛋白h 链第5 2 4 4 号氨基酸形成链间二硫键，组装成丝素蛋白( m w a g ee ta l ，1 9 9 5 ) 。 p 2 5 蛋白是一种糖蛋白，分子量为3 0 k d a , 含有8 个半胱氨酸，形成4 个分子内二硫键。主要可能通过疏水作用、氢键诱导丝蛋白进行1 3 折叠，形 成规整的结构，可能与蚕的液晶纺丝机理有关( k a z u n o r i t a n a k a e t a l ，1 9 9 9 ) 。 丝素h 、l 链和p 2 5 的比例一般认为是6 ：6 ：l ，因此家蚕丝素蛋白的基本 单位是：6 h + 6 l + l p 2 5 丝素蛋白质分子肽链构象包括无规线团结构、a 一螺旋结构和b 一析叠链 结构三种。q 一螺旋是由链内氢键引起的，而1 3 一折叠是由链问氢键引起的 蛋白结构。但有研究表明，丝蛋白中还存在另一种由4 个氨基酸残基组成的 b 一转角结构。蚕丝构象中1 3 一折叠的含量最高，这种高含量的1 3 一折叠结 构可能是引起其高强度和高弹性模量的主要原因( 霍波等，2 0 0 2 ) 亲水以及 大侧链部分则构成了较为不规则的部分赋予蚕丝以较高的弹性和好的韧性。 在特定的处理条件下，丝素蛋白分子会发生无规卷曲结构与1 3 一折叠结构的 相互转变。 蚕丝通过脱胶、溶解、透析后得到的再生丝素蛋白一般分子量有所减少， 几乎只含有丝素h 链，是比较纯的蛋白材料。丝素h 链般认为有无规卷曲、 s i l ki 、s i l k 、s i l k 四种结构( v a l l u z z ir ，e ta l ，1 9 ；p , v a l l u z z ie ta l ， 1 9 9 9 ) 。丝素蛋白在浓溶液中容易形成s i l ki 结构，亲水性较好，所以丝素溶 液的浓溶液比较稳定，不易形成沉淀；而在稀溶液中容易形成s i l k i i 结构， 亲水性较差，反而容易结晶析出形成沉淀。另外，在中性偏弱碱性条件下也 容易形成s i l ki 结构，在更低温度冷冻时可以形成少量的s i l k u 结构。丝素在 高湿、高温、应力、加入糖、乙醇、甲醇、聚乙二酵等物质时容易形成s i l k u 结构 1 2 丝素在生物材料领域的应用 蚕丝是具有我国特色和优势的原料，约占世界总产量的7 0 0 , ，蚕丝中的 山东农业大学硕士学位论文 丝素是由1 8 种氨基酸所组成的天然蛋白，纯度相当高，具有许多独特的物理、 化学性质，尤其引人注目的是其具有良好的生物相容性。蚕丝蛋白在创面保 护材料、药物控制释放材料、细胞培养、接触眼镜等生物材料领域有极广泛 的应用前景，以丝素为素材的新型生物材料将发挥其更大的作用 1 工l 丝素在创面覆盖材料上的应用 目前得到应用的皮肤修复材料有两大类：一类是天然的皮肤( 包括自体 皮、异体皮和异种皮) 和动物组织( 羊膜、胎盘、渡膜等) ；另一类是人工皮肤， 原料包括天然高分子( 胶原、甲壳素等) 和合成高分子( 尼龙、涤纶、硅橡胶等) 天然皮肤和动物组织虽然有接近于患者皮肤的结构和功能，但存在有处理麻 烦、皮源不足、免疫捧异、病毒感染等问题( 李世普，2 0 0 0 ) 理想的创面覆盖物除必须具备无毒、无刺激性及低抗原性，易于消毒保 存，便于应用等性能外，还应具备良好的柔韧性，一定的透水透气性和刨面 粘合力，覆盖于创面后不易溶失，微生物不能穿透侵入等特点葛绳德等报 道烧伤创面由于毛细血管通透性显著增加，创面蒸发失水相对较多，而体液 的丢失以伤后2 4 h 内最为明显( 葛绳德等，1 9 8 5 ) 蚕丝蛋白是种良好的创面敷料材料其具有良好的生物相容性和力学 性能，而且还具有对皮肤的刺激小、能够防治感染、吸水性好、在体内的降 解产物无毒等有优点将丝素蛋白溶解提纯后，用流延法制得的再生丝素膜， 无毒性、无刺激作用，具有良好的生物相容性，且对成纤维细胞、皮肤表皮 细胞有良好的粘附性( w u c h e n y u ，n a l ，1 9 9 6 ；g o t o h y e t a l , 1 9 9 6 ) 丝素膜 除具有良好的透明度外，还有与断层猪皮相近的透水透气性及与自体皮相近 的创面粘合性，应用于创面后既可以避免体液的大量丢失。防止细胞脱水， 又不致产生膜下积液，使创面保持一定的湿度 t s u b o u c h i 发现以丝素为原料的创伤敷料能够促进康复，并且能够去皮而 不会破坏新形成的皮肤他以丝素、丝胶为原料制成了厚度仅为1 0 - 1 3 0 p r o ， 密度可1 1 0 0 - 1 4 ( o k g m 3 的创伤敷料b 曲曲曲i ，1 9 9 9 ) 苏州大学研制的丝素创面保护膜覆于创面后能与创面产生良好的初期粘 合，能起到促进创面愈合的效果( 黄伯高等，1 9 9 8 ) 李明忠采用冷冻干燥法 制得多孔丝素膜，并进行了微观结构研究，结果发现多孔丝素膜的透湿速率 较大。有利于膜内部和外界的物质交换。随着多孔丝素膜孔径的增大，其透 陈春花；丝素共混膜组方优化及细胞相容性研究 湿性、可压缩性和柔软性有所提高，强度和拉伸率有所下降，通过控制膜工 艺条件，可以控制多孔丝素膜的物理性能，以满足各种不同使用目的的要求 ( 李明忠，2 0 0 1 ) 。闵思佳研制了具有高柔韧性的多孔丝素材料，其在保湿的 治疗条件下不会与新生组织发生粘连，因而避免了可能发生的二次损伤，有 望用于大面积皮肤治疗，并促进皮肤愈合，减少疤痕( 肖国强等，2 0 0 6 ) 。张 幼珠等采用包埋法或共价法将具有广谱抗菌、药性稳定、与丝素相容性好、 杀菌浓度低的药物与丝素溶液溶合，制成药物丝素膜。这种药物膜不仅具有 单独丝素膜覆盖材料的保护作用，而且对于已被细菌感染的创口具有清除细 菌、治疗感染创面的功效( 张幼珠等，1 9 9 6 ) 。 1 2 2 丝索在隐形眼镜材料方面的应用 隐形眼镜的镜片材料必须有良好的人体适用性好的，氧气通透性好和光 透过性好等性能。再生丝素膜的透光性、透氧性较好，是制造隐形眼镜的理 想材料。一般认为用天然蛋白质的蚕丝做材料制成的隐形眼镜镜片，对人体 的适应性远远优于树脂镜片日本蚕昆所等将丝素水溶液蒸干后制成膜，再 经乙醇处理，制成氧透过性好的丝素膜，再将这种膜制作成隐形眼镜，其氧 透过系数与目前常用的h e m a 相同，能满足角膜细胞耗氧量的需求。将经化 学处理后的丝素水溶液凝固得到的块状物质用旋盘切削研磨，或者在丝素水 溶液中添加重合开始剂( 如甲醛等) 、乙烯基化合物等，使之发生重合反应， 可制得一种优质丝素膜，在含水状态下其透氧率与制隐形眼镜用的羟乙基异 丁烯酸酯化合物几乎相等，可见光透过率可达9 8 以上，它与软组织间具有 良好的生物相容性，现已开发出隐形眼镜、人工角膜等材料( 箕浦宪彦，1 9 9 5 ) 1 2 3 丝素在人造器官方面的应用 采用二氧化硫等离子体处理在丝素膜上引入磺酸基团，或丝素蛋白膜用 氨气等离子体处理后，利用l ，3 丙磺酸内脂与氨基的反应在材料表面接枝 磺酸基团均可使丝素蛋白膜的抗凝血性能显著提高。而这些材料成本低，从 而使丝素蛋白在人造血管的制造与应用方面有广阔的前景。 蚕丝的强度和弹性系数与生物体的肌腱有近似的数值，高分子量的丝素 粉末加热加压后容易成型，添加4 0 甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a ) 或甲基 丙烯酸甲酯( m m a ) 后，其强度与聚丙烯相仿蚕丝纤维埋入人体后可以 和骨头融合( 白俊良，1 9 9 7 ) 另外，研究者发现，在丝素蛋白中导入带电化 山东农业大学硕士学位论文 合物后，可加速其与钙、磷酸基团的凝集，迸一步将带有负电荷的羧基、磷 酸基导入丝素蛋白材料，可使其达到改性的要求( 张幼珠，1 9 9 9 ) 。 将丝素蛋白纤维制备成人工十字韧带( a c l ) 基质，能支持成人b m s c s 细胞的生长和扩散以及分化，蚕丝纤维被认为使制作人工韧带的良好支架材 料。 有人将丝素溶液用紫外线或y 射线处理后，在含钙的有机溶剂中固定成 膜，并利用加工技术调制其通气性，可以发展为生物的气体分离膜，作为人 工皮肤及人工肺的材料( 梁加龙，1 9 9 2 ) 1 2 4 丝素在药物缓释载体上的应用 丝素蛋白制成的膜或凝胶内部具有许多微空隙，能够吸附、填充各种药 物，加其生物亲和性，可用于药物缓释体胶囊等的研究。丝素膜具有一定的 p h 应答功能改变丝索膜外部p h 值，可以调控离子化药物在丝素膜上的透 过速度当丝素膜的荷电与药物离子荷电不同时，药物的渗透速度变慢；当 丝素膜酶荷电与药物荷电相弼时，药物的透过速度加快( c h 胁jy ，c t 出， 1 9 9 4 ) s t t o f m a n n ( s h o f m a 柚, e ta l ，2 0 0 6 ) 研究了丝素蛋白对多糖和蛋白 质的释放行为，发现丝素膜对多糖的释放速度跟结晶度有关系。甲醇处理后 的丝素膜结晶度明显提高，能持续释放分子量不等的多糖，而低结晶度的丝 索膜只能释放高分子量的多糖。另外，甲醇处理过的丝素膜在释放有些蛋白 质药物( 如溶菌酶素) 时会降低蛋白质的活性。因此，在利用丝素膜作药物 释放载体时，不仅要考虑到材料的结晶度，还要考虑到所释放药物的个别差 异。o s a y r a k 缸( o b a y r a k t a t , da l ，2 0 0 5 ) 介绍了交联丝素材料的药物释放能 力通过与热处理丝素膜相比，交联丝素( 二氯乙烷e d c 为交联剂) 具有很 高的成膜性，用不同方法涂抹于茶碱药片上，得出单涂、双涂和三涂的药物 释放速度分别为0 2 6 、o 1 9 和o 1 6 m i n 1 ，可见涂层方法可以用来调控药物释 放速度。 1 2 , 5 丝素在细胞培养基质上的应用 丝素大分子肽链上含有类似r g d ( a r g - g i y - a s p ) , t 葶列，它作为“配体”能 被细胞膜上的“受体”整合素识别，这种特异相互作用能引导细胞的粘附和 生长同时由于丝素蛋白质中含有赖氨酸、精氨酸、组氨酸等带正电荷的氨 基酸，与细胞间的静电作用较强，所以丝素膜对细胞的牯附性很好 陈春花：丝素共混膜组方优化及细胞相容性研究 m i n o i r a 等学者研究了小鼠成纤维细胞l - 9 2 9 在丝素膜上的接附和增殖 情况，表明在丝素膜上l - 9 2 9 细胞的接附、增殖情况是理想的。并证明丝素 与哺乳动物细胞有良好的相容性，适合作为哺乳动物细胞培养基质( m i n i m a s ，e ta 1 1 9 9 5 ) a c h i a r i n i 等把丝素蛋白涂在聚氨基甲酸酯( p c u ) 膜上制作 成细胞培养基进行成纤维细胞培养。结果表明与纯p c u 膜相比，涂有丝素蛋 白的p c u 膜可以促进正常人的原纤维细胞黏附、生长和进行特殊的代谢活 动，而不会引起一些细胞早期发炎( a c h i a r i n ie ta l ，2 0 0 3 ) h o u y e 等以胶原 基质作对照，研究了利用丝素膜培养动物细胞。5 天后丝素膜和胶原都呈现 相等的细胞生长率。丝素和丝胶在提供l - 9 2 9 纤维细胞粘附、扩散及增长等 的对比研究则表明脱胶丝是细胞和组织培养的良好基质( k i n o u y ee ta l ， 1 9 9 8 ) 。另外，s o f i a 等用完整识别多肽化学修饰丝素膜以提高粘附效应，体 外移植骨的诱导也可显著增强( s s o f i a e t a l ，2 0 0 1 ) 。大量试验表明，丝素蛋白 对多种细胞( 成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞、骨髓基质细胞等) 有良好 的细胞附着率和增殖率，且不影响细胞活性，与胶原蛋白。目前被认为是生 物相容性最好的物质，效果相当，优于聚乳酸等合成材料，是一种良好的细 胞培养基质。 2 壳聚糖 壳聚糖为甲壳素脱乙酰基产物，是一种天然的阳离子聚合物，无毒，易 生物降解，无免疫抗原反应，具有生物相容性，壳聚糖制备的生物膜具有较 好的物理机械性能和良好的吸水性在医用药用研究方面具有广阔的开发前 景。 2 1 壳聚糖的结构 2 1 i 壳聚糖的分子结构 壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的产物。完全脱乙酰化的壳聚糖为d - ( i - 4 ) 糖 苷键连接的争( 1 - 4 ) 2 - 贺c 基m 吡喃葡聚糖( 图1 1 ) 分子结构中由于含有大 量羟基、氨基及部分乙酰氨基等电负性基团，在分子内及分子f 司存在大量氢 键( 图1 2 ) ( 蒋挺大，1 9 9 6 ) 。这些氢键和分子间范德华力的存在，使壳聚糖 长链间形成非共价结合的聚集体( s a m u c i s r j ，1 9 8 1 ) 山东农业大学硕士学位论文 甩1 1 箍藏躲的化学培氍斌 僻分子一椭坪一曩t 傍分予黼f n f , i 曩l 工盎素撼分予冉和分子拜氯 互1 0 壳聚糖的晶体结构 壳聚糖分子链规整性大，具有刚性，并形成分子内和分子阃很强的氢键， 有利于晶态形成。蹦十线衍射结果表明，壳聚糖存在洳、p 、仨种晶型i 脚吣 陈春花：丝豢共混膜组方优化及细胞相容性研究 se ta l ，1 9 9 4 ) o - 壳聚糖具有紧密的组成，多晶区多呈逆平行( a n t i - p a r a l l e l ) 链状排列，p 壳聚糖的多晶型呈平行链状排列，而卜壳聚糖则是两条链之间 上下排列。 2 2 壳聚糖及其衍生物在医学上的应用 国内外研究者对甲壳素进行了深入的研究和广泛的开发利用，特别是在 医学领域，更引起极大的关注。医学研究表明，甲壳素及其衍生物具有非常 突出的生物相容性，在体内被溶菌酶降解为对人体无毒的n 一乙酰氨基葡萄 糖( 陈西广等，1 9 9 7 ) 。小白鼠口服壳聚糖的l d s o 1 6 9 k g ，大于蔗糖( m u z z a r e u i r ，1 9 9 4 ) 壳聚糖的急性毒性实验经口腔、皮下和腹腔给药，大黑鼠、老鼠 试验证明毒性极低。亚急性毒性实验连续投药三个月未发 ( a s p e n d t j , e ta l ，1 9 9 7 ) ，因此甲壳素，壳聚糖是一类非常有 然生物材料壳聚糖及其衍生物本身就具有促进伤口愈合、防止组织粘连、 促凝血、抗凝血、降脂、降胆固醇、抗溃疡作用、抗肿瘤作用等( 潭淑英等， 1 9 9 5 ) 同时甲壳素和壳聚糖衍生物用傲药物载体，医用敷料，- t - - 术缝厶线， 手术防粘连材料等的研究也非常广泛下面对壳聚糖的研究现状作了简单概 述。 2 2 1 壳聚糖的抗菌作用 。 壳聚糖具有广谱抗菌性。壳聚耱对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌如大肠 杆菌，金黄色葡萄球菌，链球菌，绿脓杆茵，荧光假单胞菌，普通变形杆菌 和枯草杆茵等均有抑制作用朱爱民等报道，壳聚糖对金黄色葡萄球茵的最 小抑菌浓度加c 5 0 达到0 0 4 m g l ，最小杀菌浓度m b c , 卯达到0 2 5 m g l ( ：朱爱 民等，2 0 0 1 ) 。u s o o k 等报道分子量为1 8 万的壳聚糖在浓度为5 0 0 p p m 时，对 s a u r e u s 和e c o i l 的杀灭率几乎为1 0 0 ( y uj i a - h u i ，e ta l ，2 0 0 1 ) 。 目前有比较公认的壳聚糖的两种抗菌机理：类是y o u n g 等提出的以细 菌带有负电荷的细胞膜为作用靶的机理( y o u n gdi t , e ta l ，1 9 8 3 ) 壳聚糖分 子中带正电荷的质子化黩- 1 , r a 撅附带有负电荷的细菌细胞壁和细胞膜，导 致其负电荷分布不均，干扰细胞壁的合成，使细胞壁趋向于溶解，细胞膜变 形破裂。这种假设的主要证据是可以观察到细胞的内容物如水、蛋白质等渗 出( n i k a i d o , h ) 一类是h a d w i g e r 提出的以细菌分子中d n a 为作用靶的抗 菌机理。壳聚糖( m w = 8 0 0 0 ) 吸附细菌后，穿过细胞壁进入到细菌细胞内 山东农业大学硕士学位论文 与d n a 形成稳定的复合物，干扰d n a 聚合酶或r n a 聚合酶的作用，通过 阻碍d 1 q a 或r n a 的合成抑制细菌的繁殖( m u z z a r d l ir ，e ta l ，) 。研究者用 扫描电镜观察分子量为2 7 4 l o 的壳聚糖对大肠杆菌的作用，发现壳聚 糖使菌体凹陷变形，并伴有自溶现象( 杨东芝等，2 0 0 0 ) 。目前为止，壳聚糖 的抗菌机理尚无定论。通常认为，高分子量的壳聚糖抗菌以第一种机理为主， 而低分子量以第二种为主( im h d a n d c - r , e ta 1 2 0 0 1 ) 。 壳聚糖的抗菌活性与氨基含量和氨基质子化以及相对分子质量大小有 关。脱乙酰度越高，环境酸性越强( 即氨基质子化程度越明显) ，其抗菌活性 越强。有研究者发现可溶性衍生物在在中性条件下也表现出抗菌活性，可能 与对某些金属离子的吸附有关( r o l l e rs 。e ta l ，1 9 9 9 ) 分子量对抗菌活性的 影响则比较复杂，而且菌种不同，影响也不一样夏文水等以大肠杆菌为试 验菌株，发现随分子量上升抑菌效果逐渐下陬夏文水等，1 9 9 6 ) 。郑连英认 为对革兰氏阴性菌，第二种机理是主要的对革兰氏阴性菌第种机理是主 要的( 郑连英等，2 0 0 0 ) 。 2 2 2 壳聚糖的抗病毒作用 壳聚糖本身具有光谱的抗病毒作用( a n d e r s o nde e ta l ，1 9 9 7 ) ，硫酸酯 化壳聚糖的抗病毒作用更加明显。h o r t o n 和j u s t 发现c 2 氨基被硫酸酯化的壳 聚糖对白血病病毒、仙台病毒和孢疹病毒具有抑制作用当硫酸酯化壳聚糖 浓度为7 l 时，能竞争性抑制h i v - 1 逆转录酶活性，从而抑制h i v 病毒的 复制( k a n a m e k , e t a l ，1 9 9 9 ) 。n i s h i m t u a 等发现硫酸化壳聚糖对h i v 病毒的 抑制作用依赖硫酸酯基团的存在及其位置通常没有硫酸化的壳聚糖不存在 抗h i v 病毒活性，而与抗凝血活性不同的是，q 氨基和c 3 羟基上的硫酸酯 基团是抗h i 病毒的必要条件，而c 6 羟基上的硫酸酯基团的存在使硫酸酯 化壳聚糖的抗凝血活性上升，在爱滋病临床治疗上反而不利另外，在其它 硫酸酯多糖的研究中发现，引入亲脂性的长链烷基可提高多糖与病毒膜脂双 层的作用，提高活性。硫酸酯化壳聚糖引入亲脂性的长链烷基也应该有同样 的效果 2 2 3 壳聚糖促进愈合的作用 软骨组织能促进创面愈合，其活性的强弱决定于所含乙酰氨基葡萄糖浓度 的高低，而乙酰氨基葡萄糖是甲壳素、壳聚糖的生要成分，因而人们将甲壳 陈春花；丝素共混膜组方优化及细胞相容性研究 素、壳聚糖作为创面愈合的促进剂进行了大量的研究。结果发现甲壳素、壳 聚糖及其衍生物具有止血、止痛、抑制微生物生长等作用，而其对巨噬细胞、 成纤维细胞等的调节作用，更是可能的直接作用机制( b u f f o n if e ta l ，1 9 9 3 ； m u z z a r d l i ，e ta l ，1 9 9 9 ) 。 壳聚糖促迸伤口愈合的机制主要是：( 1 ) 加速多形核细胞( p m n ) 细胞 渗出到伤口区；( 2 ) 刺激巨噬细胞移行；( 3 ) 刺激成纤维细胞增生和型胶 原纤维产生( 何净，2