2010年生物化学实验设计报告 弱盐碱法提取酵母细胞RNA.doc

2010年生物化学实验设计报告 弱盐碱法提取酵母细胞RNA一. 要求: 从生物材料中提取生物大分子-核酸(DNA或RNA),并加以鉴定 二. 实验目的1. 掌握常规的生物分子提取,分离与鉴定技术,熟悉常用生物大分子的定性定量分析,为进一步学习和掌握复杂的,综合的生物化学技术打下扎实的基础.2. 了解并掌握盐碱法提取RNA的原理和方法3. 了解核酸的组分并掌握其鉴定方法.三. 文献综述RNA是生物存在的物质基础,其最大用途是经核酸酶降解,脱氨转化成具有强烈增鲜效果的肌苷酸和鸟苷酸.同时获得尿嘧啶核苷酸和胞嘧啶核苷酸,用于医学研究上;在农业上,核酸及水解物可促进植物生长,是不可多得的生长素4.从微生物中提取RNA是工业上最实际和最有效的方法.含RNA的各种微生物类群广泛,其中酵母细胞中的RNA含量比较丰富,因此从酵母中提取RNA比较方便.当前在核酸提取方面,主要采用弱碱盐法1-2,食盐法与超声波技术结合法3,盐,碱,SDS混合法4,微波浸提技术5稀碱法6.本综述主要对这几种核酸提取方法进行比较细致的研究比较,结合学院实验室设备条件,确定自己的实验方案,并确定核酸提取的最佳工艺条件,为酵母核酸的提取鉴定提供理论依据.1 弱碱盐法1-21.1 原理利用盐改变酵母细胞的渗透压,利用碱改变细胞壁的通透性,使酵母细胞内的核糖核酸充分释放出来,然后采用紫外吸收法测定核糖核酸的样品纯度.1.2 提取与测定10%左右的酵母溶液-加入一定的氯化钠-用氢氧化钠调节PH-搅拌提取-离心分离上清液-调节PH至等电点-酒精沉淀-得到核糖核酸-水定容100ml-取1ml适当稀释,调PH为7.0-分别测吸光度A260和A280,并计算A260/A280的值260nm波长下,每毫升含1微克核糖核酸溶液的消光值为0.024,所以测定未知浓度的核糖核酸溶液的O.D.260nm值,即可计算提取的核糖核酸的浓度,进而可以计算核糖核酸的提取率与纯度.1.3 影响因素实验考察了氯化钠用量,PH,抽提时间,抽提温度,酵母浓度等对弱碱盐法提取核糖核酸的影响,经过控制单一变量法实验分析,得出核糖核酸的最佳工艺提取条件为氯化钠用量6%,PH为7.5,抽提时间为3h,抽提温度在85,酵母浓度为10%.2 低浓度的食盐法结合超声波技术32.1 提取5.0g药用酵母-加入50ml 5%的氯化钠溶液,使酵母形成悬浮液-加入20ml 5%的氯化钠搅匀-100W,CQ2200型超声波清洗器,抽提45min-离心至室温-转入离心杯,3000r/min,离心30min-上清液漏斗过滤于150ml烧杯-冰水浴冷却20min-离心15min,弃去上清液-沉淀用70%乙醇洗涤两次-95%乙醇洗涤两次-干燥-得到核糖核酸 2.2 RNA组成分析 戊糖的检出-0.5ml水解液,加1ml苔黑酚试剂,加热至沸腾1min,溶液呈蓝绿色 磷酸的检出-取2ml水解液-加浓氨水成微碱性-加100 g/l硝酸溶液呈酸性为止-加1ml钼酸铵溶液-水浴中加热-可观察到有黄色磷钼酸铵沉淀 嘌呤碱的检出-2ml水解液-加浓氨水和10g/l硝酸银溶液各1ml-放置1min-看到白色嘌呤银化合物的絮状沉淀3 盐,碱,SDS混合法43.1 原理盐,主要用于改编酵母细胞渗透压,增大细胞壁通透性,并且还能破坏核蛋白中核酸与蛋白质之间的作用,使核蛋白失稳解离;碱主要能使细胞壁化合物水解,从而释放核酸,SDS为核酸工业中常用的去污剂,其作用除可以破壁外还可以解聚核蛋白并具有一定的核酸酶抑制作用. 3.2 提取与测定 酵母湿菌体,配成10%菌悬液-加入相应的氯化钠,氢氧化钠,SDS-一定温度水浴-冷却至室温-离心,弃去蛋白质和菌体-测上清液RNA含量,计算抽提率3.3 影响因素 本实验中核糖核酸的提取率主要受温度,时间,氯化钠浓度,氢氧化钠浓度,SDS浓度的影响,通过单因素和正交试验研究,得出最佳提取条件为氢氧化钠浓度1.5%,SDS浓度为2%,氯化钠浓度为4%,抽提温度为90,抽提温度为3小时.4 微波浸提技术5 4.1 原理 微波频率介于300MHz和300GHz之间,利用微波场将电能转化为热能,可使细胞内温度上升,液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破,形成孔洞,进一步加热,孔洞或裂纹的存在使细胞外溶剂容易进入细胞内,溶解并释放出细胞内的核酸等物质.4.2 核酸含量的测定离心后的上清液-稀释到适宜浓度-测定在260nm处的紫外吸收值-计算上清液中核酸含量.-得到总核酸含量.4.3 影响因素微波浸提技术提取核糖核酸主要受以下几个因素的影响:微波功率,微波时间,水浸提时间,水浸提温度,料液比.根据多元线性回归正交组合设计实验的综合对比,最佳提取条件为,料液比1:30,微波功率800W,微波时间5min,微波温度80, 浸提温度100,浸提时间3.5小时.5 稀碱法65.1 提取 4g干酵母-加0.2%氢氧化钠溶液20ml-沸水浴加热30min,经常搅拌-冷却后加入乙酸数滴-离心1015min-上清液倒入三角瓶-加入95%乙醇10ml,边加边搅拌-静置,完全沉淀-倒离心管,离心10min -得到核糖核酸钠粗制品5.2 鉴定水解: 核糖核酸钠-加入5%硫酸4ml-玻璃棒搅匀-一如干净的试管中-沸水浴加热不断搅拌10min核糖鉴定-0.5ml水解液-加入3,5-二羟甲苯试剂1ml,煮沸1min-观察颜色变化嘌呤碱的鉴定-0.5ml 15% 硝酸银溶液-逐滴加10%氨水,使沉淀刚好溶解为止-逐滴加水解液-观察现象磷酸的鉴定-0.5ml水解液-加入维生素C-钼酸铵溶液1ml-摇匀,放置10min-观察现象-将溶液加热-观察变化6. 分析比较弱碱盐法与以往的浓盐法,碱法提取核糖核酸的工艺相比,用盐量和用碱量大大降低,而且也降低了消耗和产品成本,减少了氯化钠和氢氧化钠溶液的排放,且核糖核酸的提取率及纯度较高. 盐碱和SDS混合法,比国内目前报道的啤酒酵母核酸提取率和纯度都有较大的提高. 低浓度食盐法结合超声波萃取技术,不仅可以避免RNA变性,还可以节约时间,提高提取率,比较快速,高效,适用于工业生产. 微波浸提技术,与传统方法相比,提取时间短,提取效率高,也适用于应用在工业生产中,可以省时间,省人力物力,应用前景非常广泛.经过对文献资料的分析比较,结合自身对学科知识的掌握与了解,以及对实验室设备的应用,本实验设计决定采用弱碱盐法提取RNA.对RNA的鉴定,将分别鉴定磷酸,嘌呤碱,和核糖.四. 实验设计(一) 实验依据酵母中RNA的含量比较丰富,而DNA的含量较少,因此从酵母中提取RNA比较方便.RNA溶于碱性溶液,利用盐改变酵母细胞壁的渗透压,利用碱改变酵母细胞的通透性,使酵母细胞内的核糖核酸充分释放出来经乙醇沉淀,即可得到RNA粗制品. RNA中含有核糖,嘌呤碱,嘧啶碱,和磷酸,.从水解液中,可用定磷,定糖,等一些颜色反应和沉淀的方法测出组分的存在,完成鉴定.(二) 实验路线 1. RNA的提取10g酵母配成10%的酵母溶液-加入6%的氯化钠溶液- 用0.05ml的氢氧化钠溶液调节PH至7.5-在85下抽提3小时-离心分离-取上清液,加入95%乙醇10ml,边加边搅拌-静置,使完全沉淀-倒入离心管,离心10min-用无水乙醇洗涤两次,每次10ml-用布氏漏斗抽滤-得到酵母RNA的粗制品2. 核酸的水解取一定量提取的核酸,加入5% 硫酸4ml,用玻璃棒搅拌,在沸水浴上加热不断搅拌10min制成水解液.3. RNA成分的鉴定.(1) 核糖的鉴定: 0.5ml 水解液-加入3,5-二羟甲苯试剂1ml-煮沸一分钟(2) 嘌呤碱的鉴定: 0.5ml 15%硝酸银溶液,-逐滴加入10%氨水-使沉淀刚好溶解为止-逐滴加入水解液(3) 0.5ml水解液-加入维生素C-钼酸铵溶液1ml-摇匀-放置10min-观察现象-再将溶液加热-观察现象(三) 实验材料1. 试剂酵母粉或者干酵母, 6%的氯化钠溶液, 0.05ml的氢氧化钠溶液, 95%乙醇, 无水乙醇, 5%硫酸, 10% 氨水, 5%硝酸银溶液, 2.5%钼酸铵溶液, 维生素C-钼酸铵溶液, 3,5-二羟甲苯试剂2. 器材离心机, 10ml离心管4支, 锥形瓶, 试管, 恒温水浴锅, 电炉, PH计或PH试纸五. 预期结果1. 水解液与3,5-二羟甲苯试剂,反应后溶液变为绿色,说明水解液中含有核糖2. 水解液于硝酸银反应产生灰褐色的絮状沉淀,说明水解液中含有嘌呤碱3. 水解液中加入维生素C-钼酸溶液后,溶液变为蓝色,说明水解液中含有磷酸.经过上述几种组分鉴定,基本可以确定所提取物质为核糖核酸RNA,完成鉴定六. 注意事项1. RNA提取时中要注意调节溶液的PH值,PH过高或者过低都会影响RNA的提取率.2. 抽提时间和抽提温度也应该控制在最佳条件下.3. 水解组分鉴定时,应将试管清洗干净,否则会影响现象的观察.4. 此实验中提取的RNA为变性的RNA,可用于RNA组分鉴定及单核苷酸制备,不能用作RNA生物活性实验材料.七. 参考文献1 徐慧,刘建军,赵祥颖,李静,等.弱碱盐法提取核糖核酸工艺的研究D.酿酒,2008(5):60632 缪存美,庄廷杰,王志江.盐碱法提取酵母核酸的工艺研究.广东微量元素科学,2010(17):42453 匡云艳,张鲁雁,张剑霞.酵母中RNA的提取和鉴定.大学化学,200