重组子的筛选与鉴定.ppt

第七章重组子的筛选与鉴定,第一节遗传学检测法第二节核酸分子杂交检测法第三节电泳检测法第四节免疫化学检测法第五节核酸序列分析及其他方法,将目的DNA片段与载体连接形成重组子，然后通过各种方法将重组子导人宿主细胞。得到所需要的带有重组DNA的转化子是基因工程的目的所在。转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。在转化反应中，并非所有的细胞都转入重组DNA分子，即使所有的受体细胞都变为转化体，所获得的转化子仍是多种类型的DNA分子，因为在连接产物中既有裁体和一个或数个串联目的基因的连接，也有载体的自连，还有目的DNA分子的自连，更多的是未发生连接反应的载体和目的DNA片段。,因此在成千上万个转化子中，真正含有期望的重组DNA分子的比例很少，为了将含有外源DNA的宿主细胞和不含外源DNA宿主细胞分开，以及将含有正确重组子的宿主细胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开。这就需要设计出容易于筛选重组子克隆的方案并加以验证，这就是我们这一章要讨论的内容。,阳性克隆的筛选与鉴定可以从不同的层次、利用不同的方法进行。总的来说，重组子的鉴定可以从直接和间接两个方面分析，可以从DNA、RNA和蛋白质三个不同的水平进行鉴定。,第一节遗传学检测法,1根据栽体表型特征的筛选2根据插入基因遗传性状的筛选,1根据栽体表型特征的筛选,根据载体分子所提供的表型特征，选择重组体DNA分子的遗传选择法，可适用于大量群体的筛选，因此是一种比较简单而又十分有效的方法。,含有一个选择标记:实际操作中，最典型的方法是使用抗药性标记的插入失活作用，或是半乳糖苷酶基因的显色反应，将重组体DNA分子的转化子同非重组的载体转化子区别开来。对噬菌体的置换型载体来说。噬菌体头部外壳蛋白容纳DNA的能力是有一定限度的。其包装能力应控制在野生型DNA长度的75一105之间(3651kb)，这样才能形成噬菌斑。因此，包装限制这一特性，保证了体外重组所形成的有活性的重组体分子，一般都应带有外源DNA的插入片段，噬菌斑的形成本身就是对重组体的一种筛选特征。,1.1抗药性标记及其插入失活选择法,在PBR322质粒上有两个抗生隶抗性基因，Tetr上有插入位点BamHI和SalI;Ampr上有插入位点PstI。,四环素：,氨苄青霉素抗性基因：,产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。,抑制细菌生长，但不杀死细菌。,杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。,环丝氨酸：,当外源DNA限制片段插入pBR322质粒的BamHI和SalI位点时，抗四环素基因失活，重组体转化子必定具有AmprTets表型。将转化菌先涂布在含有Ampr的琼脂平板上并将存活的Ampr菌落原位影印到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在Ampr平板上生长，而不在Tet平板亡生长的菌落，就必定是已经插入了外源DNA限制片段的重组质粒转化子克隆。,（1）四环素抗性插入失活,如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。,Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。,（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程,如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。,1.2-半乳糖苷酶显色反应选择法,1.2.1.原理：载体上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。,Xgal,半乳糖,5-溴-4-氯靛蓝,-半乳糖苷酶,载体上LacZ的5端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ的合成。不能互补。,2根据插入基因遗传性状的筛选,重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞之后，如果插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表达，而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成互补，那么就可以利用营养突变株进行筛选。,营养缺陷型（auxotroph）是指原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某些物质的能力，必须在培养中外源补加该营养物质才能生长的突变型菌株。例如当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时，将该基因重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中，在仅仅缺少亮氨酸的基本培养基上筛选，只有能利用表达产物亮氨酸合成酶的菌株存活。,第二节核酸分子杂交检测法,1原理2核酸杂交检测方法,利用碱基配对的原理进行分子杂交是核酸分析的重要手段，也是鉴定基因重组体的常用方法。杂交的双方是待测的核酸序列和由插入片段基因制备的DNA或RNA探针。这些方法都是通过一定的物理方法将菌落(噬菌斑)或提取的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后同液体中的探针进行杂交。菌落(噬菌斑)或DNA从平板或凝胶向滤膜转移的过程称为印迹，故这些杂交又都称为印迹(blotting)杂交。,1.1核酸杂交,1、原理：,重组克隆与探针杂交。,1.3识别标记,32P或3H35S。,（1）放射性同位素,1.2检测用的探针,与外源DNA插入片断互补的序列。,（2）非放射性标记,荧光素,根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固体支持物上的不同，核酸杂交主要有菌落印迹原位杂交斑点(dot)印迹杂交Southern印迹杂交Northernblotting,2、核酸杂交检测方法,2.1Southernblotting,Southern印迹杂交是由ESouthern于1975年首先建立并使用的，故名之。它是根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA片段。Southern印迹杂交是针对DNA分子进行的印迹杂交技术，有时又称为DNA印迹杂交或SouthernDNA印迹杂交等。,Southernblotting过程,将进行DNA电泳分离的琼脂糖凝胶，经过碱变性等预处理之后平铺在用电泳缓冲液饱和了的两张滤纸上，在凝胶上部覆盖一张硝酸纤维素滤膜，接着加上一叠干燥滤纸或吸水纸，最后再压上一重物。在80下烘烤1-2h,使DNA片段稳定地固定在硝酸纤维素滤膜上。,由于干燥滤纸或吸水纸的虹吸作用，凝胶中的单链DNA便随着电泳缓冲液一起转移，一旦同硝酸纤维素滤膜接触，就会牢固地结合在它的上面，这样在凝胶中的DNA片段就会按原谱带模式吸印到滤膜上。,然后将此滤膜移放在加有放射性同位素标记探针的溶液中进行核酸杂交。这些探针是同被吸印的DNA序列互补的RNA或单链DNA。一旦同滤膜上的单链DNA杂交之后，可以牢固结合。漂洗去除游离的没有杂交上的探针分子，经放射自显影后，便可鉴定出与探针的核昔酸序列同源的待测DNA片段。据此可以将含有外源DNA片段的重组子筛选出来。,酶切前,酶切后,插入片断,载体,Southernblot筛选结果,2.2菌落印迹原位杂交,是直接把菌落或噬菌斑印迹转移到硝酸纤维素滤膜上，不必进行核酸分离纯化、内切酶酶解及电泳分离等操作，而是经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合，再与特异性DNA或RNA探针杂交，筛选出含有插入序列的菌落或噬菌斑。由于生长在培养基平极上的菌落或噬菌斑，是按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，然后在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用，所以菌落杂交或噬菌斑杂交隶属原位杂交范畴。以菌落原位杂交为例，操作步骤如下:,将硝酸纤维素滤膜铺放在生长着转化菌落的平板表面，使其中的质粒DNA转移到滤膜上。作好标记，小心取出滤膜，将吸附菌体的一面朝上放置在预先被强碱溶液浸湿的普通滤纸上进行溶菌和碱变性处理。强碱可以裂解细菌，释放细胞内含物，降解RNA，并使蛋白和DNA变性。将滤膜转移至预先被中性缓冲液浸湿的普通滤纸上，中和NaOH。将滤膜转移到清洗缓冲液中短暂浸泡，洗去菌体碎片和蛋白质。,取出滤膜晾干，置于80下干燥，使单链DNA牢固地结合在硝酸纤维素滤膜上。将滤膜转入探针溶液中，进行杂交反应。杂交反应结束后，清洗滤膜，除去未特异性杂交的探针，然后晾干。将滤膜与X线片压紧置于暗箱内曝光，由胶片上感光斑点的位置，在原始平板上挑出相应的阳性重组子菌落,特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,2.3斑点印迹杂交,如果只要检测克隆菌株、动植物细胞株或转基因个体、器官、组织提取的总DNA或RNA样品中是否含有目的基因，则可采用斑点印迹杂交(dotblotting)或狭线印迹杂交(slotblotting)进行检测，它们是在Southern印迹杂交的基础上发展的两种相似的快速检测特异核酸(DNA或RNA)分子的核酸杂交技术。,斑点杂交法与菌落原位杂交的原理一样，但方法更简单、迅速，可直接将噬菌体的上清液或是由转化子提取的DNA(RNA)样品直接点在硝酸纤维素滤膜等固体支持物上，与探针进行分子杂交。通过放射自显影，从底片中找出黑点即为阳性斑点。此方法常用于病毒核酸的定量检测。,2.4Northernblotting,Northern印迹杂交是指将RNA分子变性及电泳分离后，从电泳凝胶转移到固相支持物上进行核酸杂交的方法，又称为NorthernRNA印迹杂交等。该法是在Southernblotting杂交基础上发展起来的，主要针对RNA分子的检测，基本步骤与Southern印迹杂交相似。但RNA分子与DNA分子有所不同，一般不能采用碱变性处理，同时，在RNA电泳时必须解决两个问题：一是防止单链RNA形成高级结构，故必须采用变性凝胶电泳；二是电泳过程中始终要有效抑制RNase的作用，防止RNA分子的降解破坏。,用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。,主要检测插入片断是否被转录。,从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。,第三节电泳检测法,1直接凝胶电泳检测法2切酶酶切片段电泳分析法3PCR扩增检测法,利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。,1、直接电泳检测法,从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。出现滞后，称滞后现象,分子量Marker,载体,重组克隆,2限制性核改内切酶酶切片段电泳分析法,2.1原理：,根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。,或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。,A,B,A或B,不同克隆的酶切结果,筛选过程,3、PCR扩增检测法,3.1原理,PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。,3.2过程,（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。,（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。,（3）电泳PCR产物。,（4）检查是否有PCR产物。,（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。,第四节免疫化学检测法,免疫化学检测法是一种间接的筛选方法，它利用特异性抗体与外源DNA编码的抗原的相互作用进行筛选，特别适用于检测不为宿主提供任何检测标志的基因。使用该方法的前提是插入的外源基因必须在受体细胞中表达，必须具有目的蛋白质的抗体。常见的有放射性抗体检测法、免疫沉淀检测法、wetem印迹分析法等,第四节免疫化学检测法,1放射性抗体检测法2免疫沉淀检测法3酶联免疫吸附测定（ELISA）4western印迹分析法,利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。,根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：,1.1抗体与产物的结合方式,对表达产物的检测。蛋白蛋白“杂交”,1放射性抗体检测法,待测基因产物蛋白,一抗,二抗,125I标记的二抗结合蛋白,固相支持滤膜,待测基因产物蛋白,一抗,125I标记的二抗,固相支持滤膜,待测基因产物蛋白,一抗,固相支持滤膜,固相支持滤膜,待测基因产物蛋白,一抗,二抗,125I标记的二抗结合蛋白,125I标记的二抗,1.2基本原理及操作步骤,首先将长有转化子菌落的琼脂平板影印复制，备用。把原平板放置在氯仿蒸汽中，使细菌菌落裂解，释放出抗原。将吸附有抗体的固体支持物聚乙烯薄膜轻轻放在先前裂解的菌落上，相互接触，以利于个别菌落的抗原吸附到抗体上，形成抗原-抗体复合物。取出含有抗原-抗体复合物的聚乙烯薄膜，放入预先用同位素125I标记的抗体溶液中温浴，薄膜上的抗原就会与125I标记的抗体相结合。最后经放射自显影，显示出抗原与125I标记的抗体结合的位置，并由此确定复制平板上能够合成抗原的菌落，即重组体菌落,1.2.放射性抗体检测法过程,1.3.Broome-Gilbert双位点检测法,质粒基因A,插入基因B,表达,质粒蛋白A,外源蛋白B,融合蛋白,检测融合蛋白。,既检测外源基因产物又检测载体基因产物。,固相支持滤膜,抗A抗体,125I标记的抗B抗体,质粒蛋白A,外源蛋白B,质粒蛋白A,外源蛋白B,固相支持滤膜,抗A抗体,发光，底片曝光,将补加有抗体和溶菌酶的琼脂，小心倾注到菌落的上面，并使之凝固。在溶菌酶的作用下，菌落表面的细菌发生溶菌反应，逐步释放出细胞内部的蛋白质。如果有某些菌落的细胞能够分泌出目的基因编码的蛋白质，它们就会同包含在琼脂培养基中的抗体发生反应，在菌落周围产生白色的沉淀圈。,2.1.原理,抗原抗体凝集反应。,是在平板培养基上直接进行免疫反应，以鉴定产生蛋白质的重组菌落，检测分泌型产物。,2.2.方法,2、免疫沉淀检测法,对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。,Enzyme-linkedimmunosorbantassay,3.1.原理：,一抗（primaryantibody）:与目标分子的特异结合。二抗（secondaryantibody）：与一抗的特异性结合。酶连（enzyme-linke）：二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。,3酶联免疫吸附测定（ELISA）,待测基因产物蛋白,一抗,二抗,酶,待测基因产物蛋白,一抗,二抗,无色的底物,有色的产物,比色观察,酶,19,3.2.ELISA检测的一般步骤,（1）固定样品,将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiterplate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。,孔底,加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。,（2）一抗结合,一抗,加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。,二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。,（3）二抗结合,二抗,加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。,（4）显色反应,在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。,（5）比色,3.3.ELISA的局限性,有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。必须与其他方法一起综合考虑。,最好用单克隆抗体（monoclonalantibody）,临床检验常用的单抗,4.1.原理：,在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。,（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。,SDS:,（SDS-PAGE）：,4免疫印迹（westernblotting）法,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：,（Polyacrylamidegelelectrophoresis）,在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。,电泳buffer,电泳buffer,点样,电泳方向,蛋白质电泳的分子量标准,已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。,商品化供应,Da,道尔顿(质量单位,等于一氧原子质量的十六分之一。一克约为61023道尔顿,Dalton,SDSPAGE,凝胶中的蛋白质染色：,考马斯亮蓝：灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可褪色回收。,硝酸银：灵敏度高、可检出2-5ng/带。,2）转到膜上进行染色。,1）直接染色,直接染色电泳结果,（2）Westernblotting,电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。,Western（转膜）,胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。,膜,胶,蛋白,Western装置,Blotting,原理与ELISA相同。,待测蛋白,硝酸纤维素膜,一抗,二抗,辣根过氧化物酶,底物,产物，并发出光,PAGE胶,待测蛋白,底片曝光,辣根过氧化物酶：HRPO,1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与膜上的蛋白结合。,2）洗去未结合的一抗。,3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。,4）清洗掉未结合的二抗。,5）用HRPO的底物浸泡膜。,6）暗室里曝光，冲洗胶片。,Blotting过程,ImmunoBlotting,结果,多克隆抗体Blotting的结果,单抗bl