（发育生物学专业论文）中华补血草遗传转化体系的建立及补血草nkcc基因沉默的功能研究.pdf

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加绷s pk u n t z c ) 为白花丹科( p m m 6 昭p n 口c 0 补血草属 ( 三f 研鲫m 朋) 多年生泌盐草本植物。它具有特殊的泌盐结构一盐腺，可将吸收到体内的盐离 子排到体外，从而避免盐分胁迫的伤害。中华补血草可以使盐土脱盐，改善土壤结构， 被誉为盐碱地改造的”先锋植物”。中华补血草是一种鲜切花栽培种，又是理想的天然干 花材料，俗称“星辰花”、勿忘我”，在世界许多地区商业栽培。但中华补血草具有大量 的不孕枝，同时又具有同型杂交不孕的特性，种子结实少，限制了专业化生产的发展， 可以考虑利用转基因技术来改良补血草品种。 通过对补血草赫腺泌盐过程和泌盐机理的研究，盐腺的形态构造及其泌盐过程和规 律已有初步了解，但是中华补血草之所以具有较高抗盐能力的关键因子是什么? 至今还 不太清楚。要研究该问题，基因敲除或r n a i 技术无疑是强有力的工具，这就需要建立 中华补血草的高效遗传转化体系。 本研究是在已建立的中华补血草再生体系的基础上，对农杆菌介导的中华补血草 叶圆盘转化体系中各相关影响因子进行了实验研究，研究发现： 山东师范人学硕士学位论文 1 ) 补血草叶片对卡那霉素是敏感的。5 0 m l 的卡那霉素浓度作为补血草叶片转化受体的 筛选浓度比较适宜。 2 ) 头孢曲松钠和特美汀的抑菌效果不同。4 0 0 i i l l 的特美汀就能有效抑菌，三到四周转 接一次即叮，且不影响外植体的分化，既减少了工作量，又提高了转化率。 3 ) 接种e h a l 0 5 菌株时，补血草的转化率远远高于接种l b a 4 4 0 4 和g v 3 1 0 1 菌株，可 达1 5 。 4 ) 对于长至l l c m 左右的补血草无菌苗叶片，侵染时重悬菌液浓度以o d 6 0 0 = 0 7 1 o 为宜， 转化率可达1 5 。 5 1 3 d 和4 d 共培养天数的处理对补血草转化率的影响不大，以4 d 的共培养效果稍好，有 1 5 的外植体可以分化出芽。 本试验中构建了 w c c 基因的沉默载体，并实现了对中华补血草的遗传转化，获得 了转基因植株，并得到了分子证据。转基因植株的分子生物学检测如下： 1 ) 各转基因株系中，均能通过p c r 扩增出n p t i i 基因7 9 5 b p 的特异性条带，初步表明印t i i 外源基因已整合到受体植物基因组中。 2 1 s o u t h c m 杂交结果进一步证实外源基因已整合到补血草的基因组中。 3 1 r e a lt i m e p c r 结果显示，随机选取的叫个转基因株系的嬲c 转录水平会发生不同程 度的下降。进一步说明a 0 r c c 基因的反向重复片段整合到奉卜血草的基因组后已正常转 录，并引起了m 犯c r n a 的降解。 关键词：中华补血草农杆菌遗传转化朋k 1 cr n a i 分类号：q 7 8 山尔师范大学硕士学位论文 e s t a b i i s h m e n to f 爿g 加6 仃甜盯胁m m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n s y s t e m o f 上，自吁l d h 也w j 村5 f 以删s pa n dt h ei - u n c t i o n a lr e s e a r c ho f ，旷 j ( ? cg e n es i i e n c e z h a i l g x i a ( s c h o o lo fl i f es c i e n c e ，s h a r l d o n gn o m l a lu n e r s t t y j i n a n2 5 0 0 1 4 ) a b s t r a c t p 1 a n t sa r ei n e v i t a b l et os u f f e rf b me n v i r o 砌e n t a ls t r e s s e sd u r i gt h e i rw h o l e1 i v e s s t r e s s e sm i 曲ti m p e d em en o m a l 黟o w ma n dd e v e l o p m e n to fp l a i l t sa i l dl e a dt om ed e c r e a s e o fp r o d u c t s q u a i l t i t y ，q u a l i t ya n de c o n o m i cv a l u e s r e s e a r c h e sa b o u tt h em e c h a n i 锄p l a n t s r e s p o n dt os t r e s s e sa r eo fg r e a ti i i l p o r t a l l c ef o rp e o p l et oa v o i dt h ea d v e r s ee f f e c to fs t r c s s e s o np l a 王l t sa i l di m p m v et h ea 鲥c u l t u r a lp r o d u c t i o n ，h i 曲s a l i n i t yi ns o i li sac o m m o ns t r e s s f a c t o ra f l dc a nh i n d e rp l a l l t sg 叭ha n dd e v e l o p m e l l ts e r i o u s l y ，w h i c he v e n t u a l l yr e s u l t si n t h ed e c r e a s eo fp r o d u c t sq u a l i t ya n dq u a n t i t y s a l ts t r e s si sc l o s e l yc o r r c l a t e dt om ei o n t r a l l s p o r ti np l a n t s t h e r e f b r e ，i ti sq u i t em e a n i n g f u lt os t u d yt h ei o nt r a n s p o ni no r d e rt om a k e c l e a rt h em e c h a n i s m so fs a l tt 0 1 e r a n c ea n dc o r r e s p o n d i n gr e g u l a t i o n r e s e a r c h e si na n i m a l s r e v e a lt h a tn k c ci sak e yk i n do fi o nt r a n s p o n o rt h a ti st i g h t l yr e l a t e dt ot h es a l ts e c r e t i o n f u n c t i o no fs a l t9 1 a n d s ，c o m p a l l i e dw i t hc l 一c h a r u l e la i l do m e rm e m l ) c r si nt h es 锄eg e n e f a m i l ys u c ha sk c c ，n c c ，n k c cp l a y sas i g n 诳c a i l tr o l ei ns a l ts e c r e t i n go fa n i m a l ss a l t 出a 玎d s i np l a n t s ，s a l ts c c r e t i o ni sav i t a ls t r a t e g yo f h a l o p h y t e st or c s i s ts a l ts t r e s s ，b u ts t u d i e s c o n c e r n i n gm es a l ts e c r e t i o no fp l 卸to nt b em 0 1 e c u l a rl e v e la r ef 打f 而me n o u g hn o w a sa c o n s e q u e n c e ，i no r d e rt oe l u c i d a t et h em e c h a n i s m so fs a l ts e c r e t i o ni p l a n t sa n dd e m o n s t r a t e m ef u n c t i o no fg e n e sm a ti ss i m i l a rt o 锄i m a l s ，i ti sp r a c t i c a l l yw o m l w h i l et oa 1 1 a l y z et h e f i l n c t j o no f n k c ci np l a n t s ，e s p o c j a l l yi nh a l o p h y t e s t h e三f 删d 以m 州j 胁p 盯占pk u n t z ei sap e r e n n i a lp l a 玎t ss e c r c t i n gs a l to ff a m i l y p m 聊6 昭f 盯d c 印pa n dg e n u s 三拥伽f “卅i th a st h ep e c u l i a rs e c r e t i n gs a l ts t r u c t u r c s a l tg l a i l d ， m a yw i l la b s o r bs a l ti o n s 丘o mi nv i h dt oi nv i v o ，a v o i d i n gs a i i n i t yh u r tt h e r e by t h e 咖o n i “脚s 胁e 5 口k u n t z ec 锄u s es o l o n c h a kd e s a l i n a t i o n ，i m p m v es o i ls t r u c t u r e ，s ot t l e ”p i o n e e rp l a n tf o rt r 觚s f b 肌a t i o no fs a l i n ea n da l k a l i n el a l l d ”i sp m j s e d t h e 助卵o h i “删 s 加p 盯蹦- k u n t z ei sf r e s hc u tn o w c r sc u l t i v a t e ds p e c i e s ，a 1 1 da l s oi st h ei d e a lm a t e r i a lt od o i n g d r yn o w e li ti sp o p u l a rn a m e d ”s t a r sn o w e r ”，a n di sc o m m e r c i a l l yc u l t i v a t d ei nal o to fa r e a o f w o r l d t h e f 肼o h m 肌s f ”p 打占pk m n t z eh a s1 a i 卫ea m o u n to fs t e r i l eb r a i l c h ，a tt h es a i l l et i m e ， i th a st h ef c a t u r e so ft h es a r n et y p eo f h y b r i di n f e n i l i t y a n do fl e s ss t r o n gs e e d ，t h e r e f o r e ， p r o f e s s i o n a lp m d u c t i o ni sl i m i t e d w ec a l lc o n s i d e ru s i n gt h et r a n s g e n i ct e c t l l l 0 1 0 9 yt o i m p r o v et h ev a r i e t yo f 三f m o 竹f “m5 加p n s ek u n t z e 3 山东师范大学硕十学位论文 s t u d yb yt h ef k tt h 砒t h ep r o c e s sa 1 1 dm e c h a i l i s mo fm eg l a n ds e c r e t i n gs a l t ，w h a tf o m o fs a l t9 1 a n ds t i u c t u r ea n dt h e i rk e yf a c t o rs e c r c t i n gs a l tp r o c e s sa n dm l e sa l r e a d yh a v et h e f i r s t s t e pk n o w s ，b u tt h er e a s o nw h y 三f 埘d 九f “ms 抽p h s pk u n t z ec a na d a p tt ol l i 曲一s a l t e n v i r o n m e n ti su l l l m o w n t bs 0 1 v et h ep m b l e m ，t h eg e n ek n o c k s o u to rt h er n a it e c h n o l o g y i saf o r c e f u li m p l e m e n tu n d o u b t e d l y a tt h ef i r s tw em u s tr e q u i r eb u i l d i n gt h eh i g h e f - f e c t i n h 嘶t a n c es y s t e mo f t h e 咖z d 撕“卅s f 玎e ，醛pk u n t z e t h i ss t u d yi so nt h eb a s i so fr e g c n e r a t i n gs y s t e mo fl 加d n f “ms 伽删s pk u i l t z ea l r e a d y b u i l t h 1 吐血。驴刮蜘捌s h l 咄w es h 】母l l l e 佗自瞰】i so fa g 【d ) a 嘶响曲mt 啪e f a c i e n s m e d i a t e d g e n e t i ct r a n s f b 册a t i o n w ef i n dt h a t ： 1 ) 三f m 。砧m m 占f ”8 船8k u n t z el e a fi ss e l l s i t i v et ok a n 锄y c i n ，5 0m lk a n 蛐y c i ni st h em o s t p r o p e rc o n c e l l t r a t i o nt ot h el 甜门d 玎f 埘s f ”e 船pk u n t z ej e a f 2 ) b a c t e r j o s t a te f 佟c ti sd i f 兜r c n tb e t w e e nc e f 硒a ) 【o n es o d 讪m ( r o c 印h i n ) a 1 1 dt i m e n t i n 4 0 0m ls p i to ft i l i l e n t i nh a v et h eb a c t e r i o s t a te f r e c t ，a n dt l l ee f r e c tc a n1 a s tm r c eo rf o u r w e e k s t h a tn o to n l yc a nd e c r e a s eb y 锄o u n to f w 0 1 k ，b u ta l s oi m p r o v ec o n v e r s i o nr a t e 3 ) w h e ni n o c u l a t e dw i t he h a l 0 5b a c t e r i a ls t r a i n ，t h e 工f 用d ”m m5 加册碰：k u n t z ec o n v e r s i o n r a t ei s o v e n o p e dt oi n o c u l a t i n gw i t hl b a 4 4 0 4a i l dg v 3 l0 1b a c t 嘶a ls t r a i n ，i tc a n 锄o u n t st o1 5 4 ) t h eo d 6 0 0o f b a c t 谢u ml i q u i db e i n go 7 一1 oi ss u i t a b l e ，c o n v e r s i o nr a t em a ya m o u n t t o 1 5 5 ) t h r e eo rf o i l rd a y so fc o - c u l t i v a t i o nh a v en oo b v i o u se f r e c t ，b u tf o u rd a y si sb e t t c o n v e r s i o nr a t em a ya m o u n tt o15 i nt h i ss t u d y ，s j l e n tc 枷e ro ft l l e m “g e n eh a v eb e e ns u c c e s s m l l yb u i l t ，t h e t h r a n s g e n i cp i a n t sh a v eb e e no b t a i n e d ，a n dh a v ed o n et h em o l e c u l ei d c n t i f i e s t h em o l e c u l a r i d e n t l f l c a t l 咖o f t l l e s em r a n s g c n i cp l a n t sa r ea sb e l o w ： 1 ) p c rr e s u l ts h o w e dt l l a ta 1 1k a n 锄y c i n r e s i s t a l l tp l a n t sh a ds t r o n gp o s m v es i g f l a l s ，a n dn o s i g l l a lw a ss h o w l li nw i l dt y p ep l a i l t s 2 ) t h es o u t h e r nh y b r i dr e s u l tf m h c rc o n f i n n e dt h a te x o g e n o u sg e n eh a v ea l r e a d yc o n f o m l i t yt o t h e g e n o m eo f t h e 三f m d 以f m 埘s 扬e 以s pk u n t z e 3 ) r e a lt i m ep c rr e s u l t ss h o w e dl h a tt h ej v 蜀c cr n ad e c r e a s e dmd i 触n tt r a n s 南n n e d p l a n t st od i f l e r e n td e g r e e k e yw o r d s ：i m d n i “m5 抽p h j p4 d 6 d c 把r f “用g e n e t i ct r a n s f o m a t i o n 黝r n a i c a t e g o r y ：q 7 8 4 山东师范大学硕十学位论文 第一部分文献综述 盐胁迫是影响植物生氏、发育和农作物产量的主要环境胁迫因子之一。全世界约有 2 0 的土地盐渍化，还有近一半的灌溉上地受次生盐渍化的影响。我国也有3 亿多亩 土地盐渍化，约占可耕地面积的2 5 。随着我国人口的剧增及工农业的快速发展，小城 镇建设步伐加快，可耕地噬积急剧下降，而不合理的农业措施又造成了大量耕地次生盐 渍化l 。盐渍化对可耕地的破坏一直严重影响着远古文明和现代文明【4 】，盐渍化已成为 最重要的影响社会经济发展的环境因素之一【5 】。 盐分对植物的伤害主要包括两方面：其一，土壤中较高的溶质浓度导致的水分亏缺； 其二，植物吸收水分的同时i 吸收了过多的赫离子所带来的离子毒害，特别是n a + 毒害。 高浓度n a + 可置换质膜和细胞内膜系统所结合的c a 2 + ，膜所结合的离子中n a + c a 2 + 比 增加，膜的通透性增大，同时，植物体内活性氧代谢系统的平衡受到影响，活性氧含量 增加，而活性氧清除剂( s o d 等) 活性及含量降低，膜脂过氧化或膜脂脱脂作用被启动， 而导致膜的完整性被破坏，差别透性丧失，电解质及某些小分子有机物大量渗漏，细胞 物质交换平衡破坏，进而导致一系列生理生化代谢紊乱，使植物受至n 伤害f 6 j 。植物降低 n a + 的毒害的主要策略有离子外排和区域化，这两方面都与植物跨膜离子转运蛋白有着 密切的关系。 盐胁迫主要体现在渗透胁迫和离子不平衡造成的离子毒害和营养匮乏等方面，使得 植物生长受到抑制，光合下降、能耗增加、衰老加速，甚至死亡1 6 】。f 常情况下，带电 的无机离子必须通过质膜 二专一的转运蛋白才能进出细胞。胞质对钾、钠离子的选择性 调节主要依赖于质膜和液泡膜的阳离子转运系统，这些系统是由膜上的转运蛋白组成 的，每种转运蛋白负责运输某一种或某一类离子，具有严格的种类与数量控制。研究植 物的离子运输对理解植物耐盐的机理及调节至关重要。 1 植物对盐胁迫的适应 1 1 植物的耐盐机理 盐生植物根据耐盐机理的不同可以分为稀盐盐生植物( s a l t d e l u t i o nh a l o p h y t e s ) 、 泌盐盐生植物( s a l t s e c r e t i o nh a l 叩h y t e s ) 和拒盐盐生植物( s a n e x c l u s i o nh a l o p h y t e s ) m j 。稀 盐盐生植物主要的耐盐方式为茎或叶的肉质化，还包括渗透调节和离子区域化；许多农 作物主要通过拒盐方式来抵抗盐害，所谓拒盐就是不让外界盐分进入植物体，或进入植 物体后将它们集中在根部，不让盐分进入植物代谓j 活跃的地上部分【9 】。泌盐盐生植物体 山东师范人学硕士学位论文 中具有特殊的泌盐结构一盐腺或盐囊泡，可将植物体内过多的赫分排出体外，所以能很 好的适应就渍环境，在多种盐渍环境中皆能生存，如盐湖、盐漠、盐渍草甸、盐沼等【l0 1 。 泌盐盐生植物的耐盐机理主要是通过盐腺泌盐、渗透调节和离子区域化。 1 1 1 泌盐 泌盐可以理解为植物在整体水平上对离子区隔化的一种手段，通过泌船可将过量离 子外排。通过外排系统由根部细胞向土壤排n a + 或由地上部分的盐腺或盐囊泡向外排出 盐分( n a + ) ，盐分的外排是泌敲植物抗熊的主要途径之一【1 1 】。在盐生植物中，有一些植 物的叶片和茎部表皮细胞发育分化成盐腺( s a l tg l a l l d ) ，通过这些盐腺，将根系吸收到 植物体内的盐分排到体外，从而保持植物体内较低水平的盐分，使植物体免遭盐害。例 如柽柳( 而朋口胞曲i n e n s 括) 在吸收了盐分后，并不把盐分积存在体内，而是通过密布在茎 叶表面的盐腺将盐分排出体外，靠风吹雨打把盐分冲刷掉。红树( r f z 卿d m 印f 删缸胁) 更是能惊人地排泌几乎1 0 0 的盐分【1 2 】。有实验证明，进入根系的盐分，有一部分可通 过脉内再循环从根系再分泌到根外。在非盐生植物中，因为缺少盐腺，不能通过盐腺泌 盐排除进入体内的过多的盐分。 1 1 2 稀盐 有些盐生植物可通过肉质化( s u c c u l e m ) 来适应盐渍环境，即植物的茎叶部分产生 大量的薄壁细胞，可以吸收和贮存大量的水分，植物体通过肉质化在细胞水平上将细胞 内的离子区隔化，将进入细胞中的盐分大量区隔化使之进入液泡，同时伴随着快速的生 长从而使盐分被薄壁组织中的水分稀释到不会产生毒害的水平，避免可能发生的毒害作 用，使植物得以正常生长发育。常见的这类盐生植物包括碱蓬属( s u a e d a ) 、海莲子属 ( s a l i c o m i a ) 和猪毛菜属( s a l s a l a ) 的植物。非盐生植物生长在盐渍环境中，其营养器 官一般不会发生肉质化，它们主要是通过快速生长来稀释进入植物体内的盐分。植物生 长在盐渍环境中时，其根系不断吸收赫离子，使植物体内盐离予数量不断增多，与此同 时，植物也不断进行营养生长、大量增加有机物质、快速增加细胞数量和植物体的体积。 并且，有机物质、细胞数量和植物体积增力的速度远远超过盐离子的摄入速度，结果， 植物体内盐离子的浓度有时不但不会增加，反而有一定程度的降低，从而使植物免受盐 离予的伤害作用。如大麦和绿豆，在盐渍条件下苗期生长快的品种一般都比生长慢的品 种的盐耐受能力强。 液泡是植物成熟细胞中最大的细胞器，液泡的体积约占细胞体积的9 0 以上，通过 液泡膜与细胞质分开，能储存离子和代谢物质，许多盐生植物将吸收的盐分离子储存在 6 山尔师范大学硕士学倪论文 液泡内，避免了对细胞质内生理生化过程的影响或伤害。液泡大大提高了细胞质表面积 与体积之比，这有利于细胞与环境间的物质交换，对细胞化学能的利用、信号传导、膨 压调节和耐盐性等都有重要作用。如苜蓿悬浮培养细胞液泡中n a + 、c r 分别占原生质 n a 十、c l + 总量的7 3 8 9 1 2 和7 4 一8 9 4 。 盐分被储藏在液泡内是维持细胞质内离子稳态的最有效机理之一。在“高盐”中培养 的大麦根( 培养液有k + 供应) ，细胞质内k + 浓度约为9 0r m 0 1 l 液泡内约为8 0m m o 儿； 而在“低赫”中培养的大麦根 培养液仅含c a s 0 4 ) ，液泡中的k + 浓度仅为1 0 2 0 m m 0 1 l ， 而细胞质k + 浓度接近高盐大麦根细胞质中的浓度。此例显示从“高盐”环境到“低盐环 境，大麦液泡中k 十浓度减少到原来的l 4 l 8 ，而细胞质内k 十浓度几乎没有变化。这 说明，当环境中生理代谢所需离子减少到不足以保证生理需求时，液泡中该离子便被转 运至细胞质内以保证生化反应所需的最优化的离子内环境，所以液泡还具有调节细胞质 内离子浓度，维持其相对稳态以保证离子最优化水平的功能。与细胞质相比，液泡内离 子种类和浓度有很大的区别，细胞质对离子的选择和浓度范围有严格的要求，液泡可以 补充细胞质所需的某些离子。为了维持细胞的膨压，液泡内参加代谢的离子浓度降低时， 可以由其他离子如n a + 、c 矿和有机溶质来替代作为渗透剂，可见液泡没有严格的选择 性。 除了通过泌盐在整体水平将盐离子区隔化到植物体外或在细胞水平将离子区隔化 到液泡，植物还可以通过在组织和器官水平上的区隔化应对盐胁迫，即表现为k + 、n a + 在植物体不同部位分布的不均衡性。l r 十、n a + 被吸收后，始终以离子的状态存在并可 参加再循环，还具有转移到其他更需要它们的组织和器官的趋势。如当植物体内k + 缺乏 时，老叶中k + 会向幼叶中转移。 1 1 3 拒盐 拒盐( s a l t “c l u s i o n ) ，即不让外界盐分进入植物体内，从而避免盐分的胁迫作用。 主要依靠质膜对盐的不透性，或利用其它方式阻止盐分向地上部分转移来适应盐渍化环 境。有的植物根部吸收细胞具有特殊的细胞质膜组成，对离子有一定选择性，即对盐离 子的透性小；有的植物根系允许土壤中的盐分进入根部，但进入根部后大部分贮存在根 部，不再向地上部分运输，使地上部分盐分浓度仍保持较低水平。耐盐芦苇就属于此类 植物。 玉米地上组织的拒龠机理：( 1 ) n a + 在玉米根表皮和皮层细胞质膜上主动向外运输， 从而降低了细胞液的n a + 浓度，减少了n a 十向木质部的共质体运输。( 2 ) 在玉米较老的根 山东师范人学硕十学位论文 区，木质部薄壁细胞可以从木质部汁液吸收n a + ，从而减少到达地上部分的n a + 【2 0 】。 还有一类植物的拒盐方式是通过特殊结构实现的。土壤溶液中的各种离子、水分一 般以外质体运输方式穿过根皮层细胞的质壁间隙，而在内皮层中由于存在着凯氏带 ( c a s p 撕a n ) ( 凯氏带上的细胞不发生质壁分离) ，使得溶液中的各种离子、水分由此通 往木质部时都必须经由共质体运输，因此凯氏带形成了植物阻隔盐分的第一道屏障；进 入木质部的盐分随蒸腾的水分一起向地上部分运输，大多积累在成熟的老叶片中，盐分 不均衡的流动相对保护了光合作用活跃和生长旺盛的细胞。研究发现，在植物组织中富 含液泡的组织( 如成熟叶片) 往往积累大量离子，而液泡少的组织( 如幼叶) 往往含渗 透调节剂多，这种分配实际上是由于植物形态发生过程中，胞问连结和转运蛋白的相互 作用造成的，即分生组织和维管组织不直接相连，因此盐分流入较少【2 l l 。 分子水乎上，通过对模式植物拟南芥s o s 通路的研究以及在真盐生植物碱蓬中的研 究，使人们对植物的稀盐作用有了较多的了解，但对植物的泌赫、拒盐的分予机理了解 较少。而植物的泌盐又是许多盐生植物的重要的耐盐策略，重要的农作物水稻也有类似 的现象，因此，无论是就基础研究还是就耐盐农作物的培育而言，植物的泌盐研究都十 分重要。 1 2 盐腺的结构 泌盐盐生植物的口 片和茎部表皮细胞发育分化成盐腺( s a l l 譬1 a 1 1 d ) ，通过这些盐腺， 将从根系吸收到植物体内的盐分排到体外，从而保持植物体内较低水平的盐分，使植物 体免遭盐害。盐腺主要有两类，一类叫盐囊泡( s a l t b l a d d e r ) ，另一类叫盐腺( s a l t9 1 a i l d ) ， 盐腺又有双细胞盐鹰和多细胞盐腺之分 1 0 】。盐腺细胞中有大量出膜包围的小液泡，有大 量的线粒体为离子运输提供能量。盐腺泌盐是一个被动和主动协同作用的过程。 多细胞盐腺存在于双子叶植物的许多科中，不同科的泌盐盐生植物盐腺细胞数目和 排列方式又有各自的特点，如：报春花科海乳革盐腺包括一个收集细胞、一个柄细胞和 4 - 8 个分泌细胞，含中央大液泡的收集细胞在基部，与之相连的是大而扁的柄细胞，再 外部是4 8 个分泌细胞。柽柳科无叶柽柳盐腺由排列成4 对的8 个细胞组成，基部2 个液泡 化的收集细胞，其外6 个细胞质浓稠的分泌细胞。马鞭草科海榄雌盐腺出数个收集细胞 ( 2 - 4 个) ，一个盘状柄细胞和8 个( 或1 2 个) 细胞质浓的分泌细胞组成。补血草盐腺由4 个收集细胞、4 个毗连细胞、8 个杯状细胞和4 个分泌细胞。紫会牛科蜡烛果盐腺由一具 单独的基细胞和2 0 一4 0 年分泌细胞组成。另外，属于多细胞盐腺的泌盐盐生植物还有爵 床科的老鼠勒属、瓣鳞花科的瓣鳞花属、海桑科的海桑属、旋花科的番薯属、玄参科的 山东师范大学硕十学位论文 火焰草属，以及红树科的红树属、角果木属、木榄属等植物”。 单子叶植物禾本科植物的盐腺结构简单，为双细胞盐腺，大米草具有典型的禾本科 植物盐腺，由一个较大的基细胞和一个小圆顶状帽细胞组成。帽细胞位于基细胞颈状突 起的上部，两者均具有浓稠的细胞质、大的细胞核、多数线粒体、一些小的液泡、游离 核糖体、肉质网、高尔基体和质体1 0 】。基细胞具有遍柿整个细胞的壁突起和隔膜系统将 细胞质分离，帽细胞的显著特征是核仁明显，染色质遍及整个核质并沿核膜分布，基细 胞肩部和底部与表皮细胞和叶肉细胞之问没有角质层隔开，而基细胞与附近的叶肉细胞 和帽细胞邻接的壁上有明显的胞阳j 连丝。帽细胞上部的角质层明显厚于周围部分，圆顶 的角质帽有一些小孔。禾本科植物的盐腺分为3 类：a 、盐腺下陷于表皮细胞层，分泌 功能强，如大米草、獐毛等植物的盐腺；b 、盐腺突起于表皮细胞层，腺体无分泌功能 或分泌功能很弱，如隐花草属和黍属植物的盐腺；c 、盐腺在表皮细胞层半下陷，腺体 具有较弱的分泌功能，如雀稗属植物的盐腺【l 。 盐囊泡是一类特殊的盐腺，其特殊表现在它分泌的盐分不是排出体外，而是积存在 一个泡状细胞内，盐囊泡存在于藜科的一些属中，如滨藜属的所有种类、藜属的多数种 类以及猪毛菜属的部分种类”】。一般情况下，盐囊泡由一个柄( 1 4 个柄细胞) 和一个 膨大的泡状细胞组成，柄细胞和结构与盐腺的各种细胞相似，细胞质浓稠，有较多的线 粒体、内质网和许多小液泡，与盐腺不同的是盐囊泡柄细胞含有叶绿体。柄细胞通过大 量胞间连丝与泡状细胞和相邻的叶肉细胞相连，成熟的泡状细胞有一个很大的中央液 泡，边缘细胞质中含有线粒体、小液泡高尔基体和叶绿体。盐囊泡有一层很厚的多层次 的角质层与表皮细胞连接【l ”。 1 3 泌盐机理 关于盐腺的泌盐机制，由于离子进入盐腺是逆着电化学梯度进行的和是一种非电解 质的运输，只知道它是一个主动的生理过程，其所需能量均由代谢产生提供，所以对低 氟低温特别敏感，更细致的了解目前尚不清楚，仍停留在假 兑阶段。 ( 1 ) 分泌作用的渗透机制假说 这个假说由a r i z 等( 1 9 5 5 ) 【”疑出。盐离子主动的积存到盐腺细胞中，从而增大盐腺 细胞的渗透势，即导致流体静压力的产生，当盐腺压力达到最高水平以后，则通过周期 性的微小滴，向盐腺分泌细胞外部排出以解除这种压力，认为盐腺的分泌作用。俨然是 一个物理过程。 ( 2 ) 盐腺分泌作用是胞饮相反作用的假说 9 山尔师范人学硕士学位论文 这个假说由z i e g l e r 和l u t t g e ( 1 9 6 7 ) 【1 哪以及s h i m o n y 和f a h n ( 1 9 6 8 ) 【2 4 】提出。他们认 为盐腺的分泌作用是通过以前积存在一些小细胞质囊泡中的盐液，向细胞外表面排出的 过程，是一个相反的胞饮现象。 ( 3 ) 盐腺的分泌作用类似动物液流运输系统假况 这个假说由l e v e n g 和t h o m s o n ( 1 9 7 2 【1 5 b 提出，他们发现大米草属植物盐腺显著不 同于双子叶植物，盐腺的基部细胞中的唯一物质是具有围绕胞外通道的各种分割的膜， 这种结构就参与分泌作用，另外通过这种特殊结构与动物细胞组织系统比较研究，发现 大米草属植物盐腺的分泌机制几乎与动物液流运输系统相同。他们提出在盐腺基部细胞 中有一个主动的将离子分泌到分隔膜的胞外通道的作用，这个过程是通过幂q 用线粒体提 供的能量来完成的。如果假设有一个偶联的溶水的运输系统，则水分将被动地沿着渗透 梯度通过基细胞进入胞外通道。 近年来，泌盐机理研究进展缓慢，对上述假说既无证实的也无反驳的报道。s t o r c y 等 ( 1 9 8 3 ) 利用x m y 微量分析法对滨藜叶片的不同部位的细胞及细胞的不同部位的n a + 、k + 、c l 。等离子进行定位分析，认为叶细胞的细胞质倾向于选择k + 而排斥n a + 。n a + 、 c l 。离子经过一系列偶联的离子区域化，最终进入盐囊泡的大液泡中( 图1 ) 。 泌盐盐生植物在受到盐胁迫时，不但可以将盐分排出细胞之外，还可以通过液泡膜 上的n a + m + 逆向转运蛋白将盐分集中到液泡中，这种盐分在细胞中的区域化分布既防止 了细胞质中的盐离子浓度过高产生毒害，又可以起到渗透调节的作用【1 “。 目前一般认为补血草盐腺泌盐的过程如下： 叶肉细胞盐离子主筹装一收集细胞主纂一分泌细胞王豸淼一分泌到 细胞外 0 山尔师范大学硕士学位论文 图1 滨黎q f r 驴妇枷咿口) 在6 0 0r r m o l ，l n a c l 条件下盐囊泡泌盐图解 f i g 1s c h e m a t i cd i a g r a mo fs a hs e c r e t i 彻b ys a l tb l a d d e r o f 爿护驴h 印。岵胁dg r o w no n6 0 0n 硼o l p l n a c l b s ：维管鞘细胞，v s ：导管，p ：栅栏细胞，h ：表皮下细胞 e ：表皮细胞，b ：泡状细胞，g ：保甲细胞， 箭头表c 0 2 平u h 2 0 的运动方向 b s ：b u n d l es h e a t l lc e l l ，v s ：v 踮c u l a rs y s t e m ，p ：p a l i s a d ec e u ，h ： h y p o d e m 吼lc e l l ，e ：e p i d e r r n a ic e l i ，b ：b l a d d e rc e l l ，g ：g u a r dc e l l a r i d w ss h o wc 0 2a n dh 2 0m o v e m e n t s 1 4 泌盐盐生植物补血草 泌盐盐生植物种4 i 仅有许多种经济植物，而且许多泌盐植物还是极其重要的资源植 物：第一，由于世界性的淡水缺乏和耕地次生盐渍化的不断加重，海水灌溉农业成为今 后的研究方向，可用海水灌溉的植物，目前看来，最有前途的是箍生植物资源，其中包 括泌盐盐生植物。第二，通过研究泌盐盐生植物对盐渍生境的生态适应机制，可以发掘 提高农作物抗盐能力的途径。第三，泌盐盐生植物还是重要的抗盐种质资源库，某些泌 盐盐生植物与农作物亲缘关系较近，如禾本科的某些种类以及豆科的野大豆等，这些都 是很有利用价值的种质资源，可以利用遗传学手段与近缘农作物杂交，以提高农作物抗 山东师范火学硕士学位论文 盐能力。第四，泌盐盐生植物还提供生物抗盐基因库。通过在研究泌盐植物对盐渍生境 的适应机制基础上，进一步利用分子生物学手段，确定泌盐盐生植物的特殊抗盐基因，然 后，将这些基因分离，克隆，并转移到非抗盐农作物中，以培育出抗盐的转基因作物新品 种，使其能正常生长在盐渍土地上，充分将盐碱地利用起来，这在我国可发挥极大经济 效益，因为我国约有3 3 1 0 6h m 2 盐荒地，6 6 10 6h m 2 次生盐渍化土地。能对这些土地 很好利用，对我国的农业发展的意义是不可估量的( 惦】。 中华补血草( l 咖d h m 州s 加p 月s pk u m z e ) 为白花丹科( p 觑m 6 昭朋口c e d p ) 补血草属 口渤伽j “脚) 多年生泌盐草本植物【1 9 】。它具有特殊的泌盐结构一盐腺，可将吸收到体内的盐 离子排到体外，从而避免盐分胁迫的伤害。中华补血草可以使盐土脱盐，改善土壤结构， 被誉为盐碱地改造的”先锋植物”。 通过对补血草盐腺泌盐过程和泌盐机理的研究，盐腺的形态构造及其泌盐过程和规 律已有初步了解2 2 0 3 1 ，但是中华补血草之所以具有较高抗盐能力的关键因子是什么? 至 今还不太清楚。要研究该问题，基因敲除或r n a i 技术无疑是强有力的工具，这就需要 建立中华补血草的遗传转化体系，但农杆菌介导的中华补血草的遗传转化还未见报道。 中华补血草是一种鲜切花栽培种，又是理想的天然干花材料，俗称“星辰花”、勿忘 我”，在世界许多地区商业栽培。但中华补血草具有大量的不孕枝，同时又具有同型杂 交不孕的特性，种了结实少，限制了专业化生产的发展，可以考虑利用转基因技术来改 良补血草品种。 2 根癌农杆菌t i 质粒介导的基因转化 根癌农杆菌口譬m 掘“仃f “腕z “m 翰c 托w 嘲t i 质粒介导基因转化系统是目前研究最多、 理论机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。第一批能表达外源