（农药学专业论文）cdte量子点与生物大分子相互作用研究.pdf

一姗崂服拶y 1 81 2 4 4 9 脚 学位论文 是如需保密，解密时间 切f 年多月fd 日 是否保密 独创，性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同z - 作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名： 马玺磊 时间：伽7 年易月f 9 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 糊黼蠢马魏 撇名：磁穆仅 签名日期加7 年易月f o 日 签名日期渺岁亍6 月 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 c d t e 量子点与生物大分子相互作用研究 目录 目勇之i 摘要i a b s t r a c t i i 简略词表i v 第一章绪论1 l 光谱法研究生物大分子相互作用的理论基础。2 1 1 紫外可见吸收光谱法2 1 2 荧光光谱法3 1 3 红外光谱法5 2 量子点与蛋白质相互作用的研究进展。6 2 1 量子点对蛋白质结构的影响6 2 2 量子点与蛋白质的静电相互作用8 2 3 蛋白质对量子点表面的修饰和稳定作用8 3 量子点与核酸相互作用的研究进展“9 3 1 小分子与d n a 的相互作用9 3 2 量子点与d n a 的相互作用11 4 量子点在荧光共振能量转移技术中的应用1 3 4 1f r e t 的原理1 4 4 2 能量传递效率e 的测定15 4 3 量子点在f r e t 方法应用中的优势1 5 4 4f r e t 在量子点与生物大分子相互作用中的应用1 6 5 论文设计思想及意义18 第二章不同巯基试剂修饰c d t e 量子点与b s a 相互作用研究1 9 1 前言19 2 材料与主要仪器1 9 2 1 材料一2 0 2 2 主要仪器“2 0 3 实验方法2 0 3 1 量子点的制备、纯化及表征”2 0 3 2 量子点与b s a 相互作用研究2 1 3 3 猝灭常数与猝灭速率常数的测定一2 1 3 4 热力学常数彳，彳g 口和彳妒的计算2 1 4 结果与分析2 2 4 1 不同修饰试剂包覆的c d t e 量子点的合成及表征2 2 4 2 修饰试剂对c d t e 量子点猝灭b s a 荧光的影响”2 3 4 3 修饰试剂对c d t e 量子点与b s a 相互作用猝灭类型的影响“2 4 4 4 修饰试剂对c d t e 量子点与b s a 相互作用力类型的影响“2 6 华中农业大学硕士学位论文 4 5 修饰试剂影响相互作用机理2 6 5 讨论2 8 第三章不同尺寸的c d t e 量子点与小牛胸腺脱氧核糖核酸的相互作用2 9 1 前言2 9 2 材料与主要仪器2 9 2 1 材料2 9 2 2 主要仪器3 0 3 实验方法3 0 3 1 不同尺寸c d t e 量子点的合成及表征3 0 3 2c t d n a 的配置和浓度的测定3 1 3 3 不同粒径c d t e 量子点与c t d n a 相互作用研究”3 2 3 4d n a 与c d t e 量子点相互作用机理研究3 3 4 结果与分析”3 3 4 1c d t e 量子点与d n a 相互作用条件研究3 3 4 2 尺寸对c d t e 量子点与c t d n a 相互作用的影响3 6 4 3c d t e 量子点与d n a 相互作用机理研究3 9 5 讨论4 1 第四章c d t e 量子点r 6 g 共振能量转移体系构建及应用研究4 2 1 前言4 2 2 材料与主要仪器4 3 2 1 材料4 3 2 2 主要仪器4 3 3 实验方法4 3 3 1c d t e 量子点r 6 g 能量转移体系的建立4 3 3 2 能量转移体系测定用于c d t e 量子点与b s a 相互作用研究”4 5 4 结果与分析”4 5 4 1 作为能量供体c d t e 量子点的选择4 5 4 2c d t e 量子点r 6 g 荧光共振能量体系4 7 4 3c d t e 量子点作为荧光探针用于罗丹明6 g 与b s a 的相互作用4 9 4 4b s a 影响转移机理推测5 0 5 讨论51 全文总结5 2 参考文献5 3 致谢6 1 附萄乏6 2 i i c d t e 量子点与生物大分子相互作用研究 摘要 、 量子点作为一种新型荧光纳米材料，已经在生物探针、生物标记、细胞成像、 疾病检测等领域广泛应用；相对于其应用，量子点与生物大分子的相互作用研究还 非常少。本论文利用荧光光谱、紫外可见吸收光谱、红外光谱等光谱的方法研究量 子点与生物大分子间的相互作用，主要内容及结果如下： 1 采用紫外可见吸收、荧光及红外光谱法研究了三种巯基化合物( 巯基乙酸， t g a ；l 半胱氨酸，l c y s ；还原型谷胱甘肽，g s h ) 修饰的c d t e 量子点与牛血清 白蛋白( b s a ) 之间的相互作用。通过s t e r n v o l m e r 方程比较了三种修饰试剂对b s a 荧光猝灭的影响。结果表明，三种c d t e 量子点与b s a 的相互作用都是静态猝灭过 程，猝灭常数k s v ( l - c y s ) k s v ( t g a ) 舔矿( g s h ) ；t g a 和l c y s 修饰的c d t e 量 子点与b s a 的结合力主要为疏水作用力，而g s h 修饰的量子点与b s a 形成了复 合物，其结合力既有氢键作用力又有疏水作用力；并比较了不同c d t e 量子点与b s a 相互作用过程的彳矿、么g 口和彳。以上结果说明量子点与b s a 的作用过程与量子 点表面修饰试剂的类型有关。 2 采用紫外可见吸收光谱、荧光光谱、琼脂糖凝胶电泳等方法研究了不同粒 径的c d t e 量子点与小牛胸腺核糖核酸( c t d n a ) 之间的相互作用。通过等摩尔比 法和f r i s c h - s i m h a e i r i c h 吸附方程计算了不同粒径c d t e 量子点与c t d n a 的平均表 面结合数。结果表明：随着量子点尺寸的增加( 1 8 0 - - 3 3 6n m ) ，c t d n a 在量子点 表面的平均结合数也逐渐增加( 0 5 1 2 0 9 ) 。机理研究也表明c d t e 与c t d n a 之间 以表面结合方式发生相互作用。 3 利用量子点尺寸的可控性，构建了一种有效的c d t e 量子点( 供体) 罗丹 明6 g ( 受体) 荧光共振能量转移( f i 也t ) 体系。发现激发波长在5 1 3n l n 的c d t e 量子点可以与r 6 g 发生有效的共振能量转移，其f o r s t e r 半径为r o = 2 4 4a ，能量 转移效率为5 6 3 ，转移距离( r = 2 3 4a ) 小于f o r s t e r 半径，表明本f r e t 体系可 以准确测量1 6n i n 之间的距离。用所建立的f r e t 体系研究c d t e 与b s a 形成复 合物的相互作用，将c d t e b s a 按照1 ：l 形成复合物，与r 6 g 形成新的能量转移 体系，比较加入b s a 后形成复合物对能量转移体系的影响，发现虽然加入b s a 后 c d t e 的荧光强度显著增加，但是c d t e b s a 复合物r 6 g 体系的能量转移效率减小， 从5 6 3 减小到4 5 8 ，且转移距离从2 3 4a 增加到2 9 3a 。 本论文深入的研究了量子点与生物大分子间的相互作用，包括修饰试剂、量子 点尺寸、能量转移效应等对量子点与生物大分子间相互作用的影响，为量子点在生 物领域的应用提供了重要的参考依据。 关键词：c d t e 量子点；牛血清白蛋白；小牛胸腺d n a ；罗丹明6 g ；荧光猝灭法； f r i s c h = s i m h a - e i r i c h 吸附方程；荧光共振能量转移 华中农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t q u a n t u md o t sa san o v e lf l u o r e s c e n tn a n o - m a t e r i a lh a v eb e e nw i d e l yu s e dm t h e f i e l do fb i o l o g i c a lr e s e a r c hs u c ha st h eb i o l o g i c a lp r o b e s ，b i o m a r k e r s ，c e l li m a g i n g ，a n d d i s e a s ed e t e c t i o ne t c i nc o m p a r i s o no fi t sw i d er a n g eo fa p p l i c a t i o n si nt h eb i o l o g i c a l a r e a , t h ei n t e r a c t i o nr e s e a r c ho ft h eq u a n t u md o t sw i t hb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e si ss t i l l l i m i t i nt h em o l e c u l e sl e v e l i nt h ep r e s e n tt h e s i s ，t h ei n t e r a c t i o n so fc d t eq u a n t u md o t s ( q d s ) w i t hm a c r o m o l e c u l e s ，s u c ha sp r o t e i n ，d n ae t c ，w e r em a i n l ys t u d i e db yu s i n g u v - ss p e c t r o m e t r y , f l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r ya n di n f r a r e ds p e c t r o m e t r ym e t h o d se t c a n df l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e rt e c h n o l o g y t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa n d r e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h ei n t e r a c t i o n so fc d t eq d sw i t hb o v i n es e r u ma l b u m ( b s a ) w e r es t u d i e db y s p e c t r o s c o p ym e t h o d si n c l u d i n gu l t r a v i o l e t - v i s i b l ea b s o r p t i o ns p e c t r o m e t r y ( u v - v i s ) ， f l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r y ( f l ) a n di n f r a r e ds p e c t r o m e t r y ( i r ) t h ec d t eq d sw e r e m o d i f i e db yt h r e ed i f f e r e n tt h i o l - c o m p l e xi n c l u d i n gt h i o g l y c o l i ca c i d ，l - c y s t e i n ea n d g l u t a t h i o n e ，i e t h i o g l y c o l i ca c i dc a p p e dc d t eq u a n t u md o t s ( c d t e1 ) ，l - c y s t e i n e c a p p e dc d t eq u a n t u md o t s ( c d t e l ) a n dg l u t a t h i o n ec a p p e dc d t eq u a n t u md o t s ( c d t e t j ) r e s p e c t i v e l y t h eq u e n c h i n gc o n s t a n tk s va n dc o r r e s p o n d i n gt h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r s ， s u c ha se n t h a l p yc h a n g e0 的，e n t r o p yc h a n g e 翻妈，g i b b sf r e ee n e r g yc h a n g e0 矾 w e r ec a l c u l a t e da c c o r d i n gt os t e r n v o l m e re q u a t i o n s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc d t e t ， c d t e lc d t e ua l lh a v eas t r o n ga b i l i t yo fq u e n c h i n gt h ef l u o r e s c e n c eo fb s a ，a n dt h e i n t e r a c t i o n so ft h r e et y p e so ft h i o l c a p p e dc d t eq u a n t u n ad o t sw i mb s aw e r es t a t i c q u e n c h i n gp r o c e s s t h eq u e n c h i n gc o n s t a n to fk s 矿( t g a ) i ss i m i l a rt ok s y ( g s h ) ，w h i c h i sm u c hl e s st h a nk s 矿( l c y s ) t h eb i n d i n gf o r c e so fc d t e 1 a n dc d t e lw i t ht h eb s a w e r et h em a i nc o n t r i b u t i o n sf r o mh y d r o p h o b i cf o r c ea c c o r d i n gt ot h et h e r m o d y n a m i c p a r a m e t e r s ( a - o ，a s a o ，彳g k o ) ，w h i l et h eb i n d i n gf o r c e s o fc d t e gw i t hb s a c o m p o s e do fb o t hh y d r o g e nb o n d i n gf o r c ea n dh y d r o p h o b i cf o r c ea c c o r d i n gt ot h e t h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r s 凹砍0 ，a s a o ，4 g 眨o ) i tw a s f o u n dt h a td i f f e r e n t f u n c t i o n a lg r o u pa n dm o l e c u l a rv o l u m es i z eo ft h i o ls u r f a c em o d i f i e dr e a g e n tp l a y e d i m p o r t a n tr o l e si nt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nc d t eq d s a n db s a 2 d i f f e r e n ts i z e sc d t eq d sw i t l lc a l ft h y m u sd n a ( c t d n a ) i n t e r a c t i o nw e r e s t u d i e db yu s i n gu v - v i ss p e c t r o m e t r y , f ls p e c t r o m e t r ya n da g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s c t d n aa v e r a g en u m b e r st h a ts u r f a c eb i n d i n gi nc d t eq u a n t u md o t so fd i f f e r e n ts i z e s w e r ec a l c u l a t e dt h r o u g ht h em o l a rr a t i oo fl a wa n dt h ef r i s c h - s i m h a e i r i c ha d s o r p t i o n e q u a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，w i t ht h es i z ei n c r e a s i n go fc d t eq d s ( 1 8 0 - 3 3 6n m ) ， c d t e 量子点与生物大分子相互作用研究 a v e r a g eb i n d i n gn u m b e r so fc t d n ai nt h eq u a n t u md o ts u r f a c eh a dg r a d u a l l yi n c r e a s e d ( o 51 2 o ) t h em e c h a n i s mr e s e a r c ha l s os h o w e dt h a tt h es u r f a c eb i n d i n gw a st h em a i n l y f a c t o ri nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nc t d n aa n dc d t eq d s 3 a ne f f e c t i v ed o n o r ( c d t eq d s ) 一a c c e p t o r ( r h o d a m i n e6 g , r 6 g ) f l u o r e s c e n c e r e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) s y s t e mw a se s t a b l i s h e db ys e l e c t i n gt h ep r o p e r t yo f q d so ft h r o n g hs i z ec o n t r o l l i n g t h ef r e tc a nb ee f f e c t i v eo c c u r r e n c eb e t w e e nr 6 g a n dc d t eq d sw h i c he x c i t a t i o nw a v e l e n g t hw a sa tt h e513n n l ，t h ef o r s t e rr a d i u so f r 0 = 2 4 4a ，e n e r g yt r a n s f e re f f i c i e n c yw a s5 6 3 u s i n gt h ef r e ts y s t e mm e a s u r e dt h e t r a n s f e rd i s t a n c eb e t w e e nt h ed o n o r ( c d t eq d s ) a n dt h ea c c e p t o r ( r 6 g ) ，t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ed i s t a n c e ，( 2 3 4a ) w a ss m a l l e rt h a nt h ef o r s t e rd i s t a n c e ( 2 4 4a ) ，i t m e a n tt h a tt h i sf r e ts y s t e mc a l lm e a s u r et h ed i s t a n c eb e t w e e n1 - 6n n lp r e c i s e l y t h e i n t e r a c t i o no fb s aa n dc d t eq d sw a ss t u d i e db yt h ee s t a b l i s h e df r e ts y s t e m t h e c d t e b s ac o m p l e x e sw e r ep r e p a r e da c c o r d i n gt h em o l a rr a t i o n1 ：1b e t w e e nc d t eq d s a n db s a t h ed i s t a n c eo fc d t eq d sa n dr 6 gw e r ec o m p a r e di nt h ea b s e n c ea n d p r e s e n c eo fb s a t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ef li n t e n s i t yo fc d t eq d si n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l ya f t e ra d d i n gb s a ，b u tt h ee n e r g yt r a n s f e re f f i c i e n c yo fn e wf r e ts y s t e m r e d u c e dt o5 6 3 f r o m4 5 8 w h i c hi sc o n s i s tb yt h ed o n o r ( c d t e - b s ac o m p l e x ) a n d t h ea c c e p t o r ( r 6 g ) ，t h et r a n s f e rd i s t a n c eb e t w e e nt h ed o n o ra n dt h ea c c e p t o ri n c r e a s e d f r o m2 3 4at o2 9 3a a tt h es a m et i m e t h ei n t e r a c t i o n so fc d t eq d sw i t hb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e sw e r es y s t e ms t u d i e d i nt h ep r e s e n tt h e s i s ，i n c l u d i n gt h es u r f a c em o d i f i e r , t h es i z eo fq d sa n dt h ef r e t t e c h n o l o g ya p p l i c a t i o ni ni n t e r a c t i o n t h i sr e s e a r c ha f f o r d e da ni m p o r t a n tr e f e r e n c ef o r t h eq d s w i d e l yu s i n gi nt h eb i o l o g i c a lr e s e a r c hf i e l d k e yw o r d s ：c d t eq u a n t u md o t s ；b o v i n es e r u ma l b u m ；t a f tt h y m u sd n a ； r h o d a m i n e 6 g ； f l u o r e s c e n c e q u e n c h i n g ； f r i s c h - s i m h a - e i r i c h a d s o r p t i o ne q u a t i o n ；f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r 华中农业大学硕士学位论文 c d t e 量子点与生物大分子相互作用研究 第一章绪论 量子点作为纳米荧光材料已被广泛用于生物传感器、生物芯片、生物标记、细 胞成像、疾病检测等生物研究应用领域( j rb r u c h e ze ta 1 ，1 9 9 8 ；c h a na n dn i e 1 9 9 8 ； m i c h a l e te ta 1 ，2 0 0 5 ) 。量子点生物传感器的使用使检测技术的灵敏度和特异性显著 提高，最近汪尔康课题组( y u a ne ta 1 ，2 0 0 9 ) 发明了一种基于谷胱甘肽( g s h ) 包 覆的c d t e 量子点的高灵敏检测葡萄糖的方法；量子点探针在生物芯片领域的应用 也备受关注。常规荧光探针一次只能进行有限的检测，如果使用量子点荧光标记， 就可以将想要研究的蛋白质或基因用一系列不同大小、不同材料、光谱特性不尽相 同的量子点或量子点微球进行标记，可以同时检测所有标记的蛋白质或基因，极大 地提高工作效率( h a r te ta 1 ，2 0 0 1 ) ；量子点凭借其优良的光化性质，在细胞生物学 研究中取得了举世瞩目的成绩( j a i s w a le ta 1 ，2 0 0 3 ) ；量子点水分散性问题的解决， 以及量子点与生物分子偶联技术的发展，为量子点作为生物探针用于活细胞成像研 究实现了突破性进展( k a i j z e le ta 1 ，2 0 0 9 ) ；2 0 0 3 年w | u 等( w ue ta 1 ，2 0 0 3 ) 用 c d s e z n s 量子点连接上i g g 和链霉亲和素后，再结合抗h e r 2 抗体和抗核抗原 ( a n a ) 同时标记了活的和固定的乳腺癌细胞，为乳腺癌疾病的检测诊断做出了突 出贡献；以量子点作为荧光标记，对核酸进行分析检测的技术提高了检测灵敏度， 扩大了检测范围；另外，量子点在d n a 的检测领域也得到了广泛应用。z h a n g 等 ( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 5 ) 使用链霉亲和素修饰的量子点实现了显微镜下对单分子d n a 杂交进行检测分析。该系统通过采用c y s 修饰的量子点探针与生物素修饰的捕捉探 针在目标序列存在的条件下杂交形成复合体，该杂交复合体通过链霉亲和素生物素 特异性反应与量子点结合。当激发量子点时，量子点发射的荧光通过荧光共振能量 转移传递给c y s ，从而使c y s 发光，该技术有望应用于早期癌变的研究。 从d n a 双螺旋结构的发现到分子生物学的建立，生命科学的研究开始进入探 讨生物分子具体结构与功能的分子水平。生物大分子结构与功能的研究是成为生命 科学的核心课题。目前研究表明：小分子与生物大分子( 核酸、蛋白质、多肽等) 间 非共价键的作用，包括静电作用、氢键、范德华力等，虽然其作用很弱( 一般小于 1 0 k j m o l ，比通常的共价键键能小1 - 2 个数量级) ，作用范围为0 3 - - 一0 5n r l l ，但这 些分子间弱相互作用力可在一定条件下起加合与协同作用，形成有一定方向性和选 择性的强作用力，而这种强作用力是分子识别与组装的基础。相对于量子点在生物 研究领域的广泛应用，人们对量子点和生物体系的相互作用的信息了解还比较少， 这也使量子点在生物医学和生物毒理学中的发展遇到了瓶颈( g u oe ta 1 ，2 0 0 7 ；邵 力文，2 0 0 8 ) ，所以对量子点与蛋白质、核酸等生物大分子相互作用的研究开始成 为研究中最受关注的热点。 华中农业大学硕士学位论文 1 光谱法研究生物大分子相互作用的理论基础 科研人员采用了多种实验手段，如光谱法、电化学分析法、核磁共振分析法、 质谱法、色谱法和电泳技术、微量热法、扫描探针显微镜( 原子力显微镜、扫描隧道 显微镜等) 、平衡渗析以及超速离心技术等方法，研究了小分子( 药物、染料、配位 化合物等) 与生物大分子间的非共价相互作用。 量子点作为一种新型的荧光纳米半导体材料，其理化性质与一般药物小分子， 染料等不同，一般的，量子点比表面积大，可与生物分子多点结合。量子点与配位 化合物在一定程度上相似，如量子点与表面修饰试剂间的配位结合等。配位化合物 具有表面电荷，容易与生物分子发生非特异性的静电吸附。而量子点可以通过可调 合成控制量子点表面电荷特性，从而使量子点相对于一般的小分子在此领域有更加 广阔的应用。但是目前研究量子点与生物大分子间的方法还主要沿用以上方法，并 没有就纳米材料与生物大分子间的相互作用而建立特殊的分析方法，下面就分别介 绍了相关方法在研究量子点与生物大分子间相互作用中的理论基础和具体用途。 1 1 紫外可见吸收光谱法 紫外可见吸收光谱( u v v i s ) 是研究量子点与生物大分子相互作用的一种最 方便、最常用的技术。组成生命体蛋白质的基本氨基酸有2 0 种，其中有4 种氨基 酸有紫外信号，前三个为带芳香环之氨基酸，最后一个为带有非键s 原子的氨基酸。 t r y p t o p h a np h e n y l a l a n i n e m e t h i o n i n e 色氨酸 苯丙氨酸甲硫氨酸 图1 - 1 具有紫外吸收的四种氨基酸 f i g 1 - 1f o u ra m i n oa c i d sw i t hu v - v i sa b s o r p t i o n 脱氧核糖核酸( d n a ) 主要是由碱基、五碳糖及磷酸所组成，在碱基中又细分 为五个碱基对，分别为归类在p u r i n e 的a ( a d e n o s i n e ) 、g ( g u a n o s i n e ) 及归类在 p y r i m i d i n e 的t ( t h y m i d i n e ) 、c ( c y t i d i n e ) 、u ( u r i d i n e ) 。 其化学结构如下图所示： c d t e 量子点与生物大分子相互作用研究 h a d e n o s i n e 腺嘌呤 o t h y m i d i n e 胸腺嘧啶 一h i i 一一一 n h ， h g u a n o s i n e 鸟嘌呤 h c y t i d i n e 胞嘧啶 图1 2 双链d n a 常见的四种碱基对 f i g 1 - 2f o u rc o m m o nb a s ep a i r so fd o u b l e - s t r a n d e dd n a 结构中含有大量的共轭双键。因此，可利用量子点与生物大分子结合前后，两者之 一的吸收光谱的变化来判断量子点与蛋白质、核酸等是否存在相互作用，得到作用 方式( 孙德平，2 0 0 8 ) 、热力学参数等信息，还可以进一步研究实验条件对热力学 参数的影响。在蛋白质分子中某些氨基酸残基( 尤其是芳香氨基酸残基) 和许多量子 点中都会有生色团，在紫外光谱中能产生吸收峰，根据峰形和峰位的变化即可判定 量子点是否与蛋白质发生作用( 王君和任百祥，2 0 0 3 ) 。量子点与核酸的相互作用 会引起紫外吸收光谱的红移或蓝移，因而出现增色或减色效应。吸光度降低、光谱 吸收带红移和等吸收点的出现是量子点与d n a 发生嵌插作用的光谱标志( l o n ga n d b a r t o n ，1 9 9 0 ) 。 d n a 会在加热和强碱的作用下变性，即d n a 双链螺旋结构被破坏，碱基对暴 露在水溶液中，因而吸光度a 2 6 0 增大。量子点与d n a 结合后会给这种变性带来影 响，进而可考察量子点与d n a 的作用方式。嵌插作用对d n a 的双螺旋结构起稳定 作用，可导致熔链温度( 乙) 值增大5 8 ，而非嵌插作用的量子点不会使值 增大如此明显( k u m a re ta 1 1 9 9 3 ) 。 除此之外还可以通过紫外等吸收点来判断生物大分子在与外界小分子相互作 用以后的状态( l o n ga n db a r t o n ，1 9 9 0 ) ；等位点指在某个特定波长下，样品的条件 即使不同，在这个波长下，其吸收度或穿透度永远不会变。如果有二个以上的等位 点时，即表示这个化合物的组成有二种状态在转变。 1 2 荧光光谱法 荧光光谱法是研究生物大分子与量子点、离子相互作用的重要手段。 蛋白中的色氨酸残基、酪氨酸残基和苯丙氨酸残基均含有生色基团。通常用2 8 5 a m 激发时，蛋白质中色氨酸残基和酪氨酸残基均有贡献，而3 0 0n m 激发时，只有 华中农业大学硕士学位论文 色氨酸残基有贡献。同时色氨酸残基和苯丙氨酸残基由于其侧链基团不同，有不同 的光谱，其最大波长分别为3 4 8n m ，3 0 3n l n 和2 8 2n n l ，研究蛋白质的荧光猝灭过 程能得到量子点与蛋白质作用的结合常数、作用区域及位置信息( 刘永春和胡之德， 2 0 0 5 ) 。 荧光猝灭法( l a k o w i c za n d 1 9 8 3 ) 可分为动态猝灭和静态猝灭两种方式，可 以引入外源性荧光作为指示探针，也可利用蛋白质、核酸等自身的内源性荧光作为 探针( 刘晔，2 0 0 8 ) 。 在动态猝灭过程中，蛋白质等荧光体与荧光猝灭剂分子间的相互作用可以用动 态猝灭常数描述，s t e r n v o l m e r 方程如下： f 等= 1 + q k s v = 1 + 巧 纠 r 其中， 和，分别为促灭剂( c d t e 量子点) 缺失和存在下荧光体的荧光强度； k s 矿为动态促灭常数( 即s t e r n v o l m e r 促灭常数) ，它描述了它描述了生物 大分子与荧光猝灭剂分子彼此扩散和相互碰撞到达动态平衡时的量效关系； q 】为c d t e 量子点的浓度，a g 为动态荧光猝灭速率常数，它反映了体系 中分子的彼此扩散和相互碰撞对生物大分子荧光寿命衰减速率的影响； 为猝灭剂不存在时荧光分子的平均寿命，一般的，蛋白等荧光体的荧光 平均寿命约为1 0 一s ； 静态荧光猝灭作用是指荧光体分子与荧光猝灭剂分子之间借助分子间力，彼此 结合形成具有一定结构的超分子化合物，而导致荧光体荧光强度减弱现象。用静态 荧光猝灭结合常数k l b ( l i n e w e a v e r b u r k 双倒数函数) 进行描述： ( f o - f ) 一= f o - 1 + 玉乞_ 1 磊- 1 【q 】 其中，k l b ( l m 0 1 ) 描述了在静态猝灭过程中生物大分子与荧光猝灭剂分子的 结合反应达到平衡时的量效关系。 键合常数k 月和键合位点( n ) 通过s c a t c h a r d 方程测定： l g e ( f o f ) f 】_ l g k a + n l g q 】 其中， 叫指键合位点的数量； k 。指q d s b s a 复合物的键合常数； 借助荧光猝灭法可以测得量子点与生物分子的结合常数k a 及结合点数n ，再 依据f o r s t e r 能量转移机制可求出配体受体间的结合距离r 及能量转移效率e ，这 使该法的应用十分广泛( 李来生等，2 0 0 5 ；张红梅等，2 0 0 6 ) ，且常与紫外可见吸 收光谱法以及圆二色谱法一起使用，相互验证。 4 c d t e 量子点与生物大分子相互作用研究 荧光光谱法也被广泛用于外部分子与d n a 相互作用的研究。最早被应用到 d n a 检测的探针分子为溴化乙锭( e b ) ，主要应用于抗癌药物的筛选和小分子与 d n a 作用的研究( z h o ua n dl i ，2 0 0 4 ；刘雪平等，2 0 0 6 ；沈丹等，2 0 0 8 ) 。d n a 三 螺旋结构的发现，扩展了溴化乙锭的应用范围，使其在检测三螺旋d n a 和研究其 与三螺旋d n a 作用等方面发挥了作用( 徐春和何品刚，2 0 0 0 ；孟耀勇，2 0 0 1 ) 。 通过加入荧光猝灭剂和k 4 f e ( c n ) 6 ，考察其对外部分子的荧光的猝灭作用可以判 断外部分子与d n a 之间的作用方式。与纯水介质相比，当外部分子与d n a 为嵌插 作用时，i 。或f e ( c n ) 6 4 。的猝灭作用降低( k u m a ra n da s u n c i o n ，1 9 9 2 ) ；而当外部与 d n a 属于沟槽作用时，猝灭剂的猝灭作用增加( k u m a re ta 1 1 9 9 3 ) 。 外部分子与d n a 相互作用前后荧光偏振的变化是确定外部分子是否与d n a 发 生嵌插作用的又一标准。通常当外部分子嵌插到碱基中时，双螺旋的转动受阻，荧 光偏振会变大，而非嵌插作用不会引起荧光偏振的变化( k u m a ra n da s u n c i o n , 1 9 9 3 ) 。文献( j o oe ta 1 ，2 0 0 8 ) 介绍了荧光偏振方法研究了外部分子与d n a 之间 的相互作用，外