（茶学专业论文）茶氨酸生物合成研究.pdf

摘要 茶氨酸是茶叶中特有的氨基酸，具有很高的医用价值和商业价值，但由于从茶叶中 提取高纯度的茶氨酸，成本高昂。因此，开展茶氨酸的生物合成研究具有重要的理论意义 和实践价值。本研究的主要目的是筛选得到可合成茶氨酸的徽生物菌株，并对该菌株的培 养、生物合成茶氨酸的条件以及茶氨酸合成关键酶类的基因克隆和表达等进行研究，以期 为今后利用微生物发酵和基因工程的方法工业化生产茶氨酸提供理论依据。主要研究结果 如下： 1 从6 种含有谷氨酰胺酶的微生物中筛选得蓟一株可以台成茶氨酸的微生物菌株一硝基还 原假单胞菌( p s e u d o m o n a sn i t r o r e d u c e n s ) 。 2 培养研究表明，该硝基还原假单胞菌在丰富盐离子培养基中7 小时以后进入对数生长期， 1 8 小时以后进入稳定期。其最佳培养条件是：培养基p h 7 0 、培养温度3 0 c 、l 葡萄 耱为c 源、o 6 谷氨酸钠为n 源、自然通气量、装渡量3 0 - - 4 0 。该菌株在传代1 0 次 时基本保持稳定，传代4 0 次时出现不稳定性质。 3 摇瓶实验结果表明，硝基还原假单胞菌生物合成茶氨酸的最佳条件为：底物浓度o 3 m 谷 氨酰胺1 1 5 m 乙胺、p h 9 5 、湿细胞量7 0 m g m l ，培养温度3 0 ，培养时间2 4 小时。此 时，茶氨酸的最大生成量为2 4 1 0 9 , l l 。底物浓度0 7 m 谷氨酰胺，1 4 m 乙胺、p h 9 5 、湿 细胞量7 0 m g n d ，培养温度3 0 c ，培养时间2 4 小时。此时，茶氨酸的最大生成量为 4 1 3 8 9 l 。发酵小试结果表明，该条件下发酵1 0 小时，茶氨酸生成量达到最大值为 2 2 5 2 9 l ：6 0 小时发酵终点时，发酵液中茶氨酸平均含量为1 5 0 1 9 l 。 4 ，试图克隆硝基还原假单胞菌中谷氨酰胺酶的基因。由基因测序可知，克隆得到的基因序 列与已g e n b a n k 报道的假单胞菌的谷氨酰胺酶基因序列回源性很低，其原因有特于进一 步研究。 5 本实验成功克隆、表达了e c o l i 中的谷胺酰氨转肽酶基因：所得基因工程菌在底物浓度 0 3 m 谷氨酰胺1 5 m 乙胺、p h 9 5 、湿细胞量7 0 m g m l ，培养温度3 0 c ，培养2 4 小时， 茶氨酸的最大生成量为9 0 0 9 l 。 关键诃：茶氨酸，硝基还原假单胞菌，生物合成，谷氨酰胺酶基因克隆， 谷氮酰胺转肽酶基因克隆和表远 a b s t r a c t t h e a n i n ei sa s p e c i a la m i n o a c i di nt e a p l a n t s ，p o s s e s s i n gh i g hm e d i c a l b e n e f i t sa n de c o n o m i c v a l u e s i ti sv e r yd i f f i c u l ta n dm o r e e x p e n s i v e t oe x t r a c ta h i g hp u r i t yt h e a n i n ed i r e c t l yf r o m t e a l e a v e s s ot h eb i o s y n t h e s i so f t h e a n i n ei sg e t t i n gm o r ea n dm o r ea t t e n t i o n i nt h i ss t u d y ，as o r to f m i c r o b e - p s e u d o m o n a sn i t r o r e d u c e n at h a tc a n a b u n d a n t l ys y n t h e s i z et h e a n i n ew a s f o u n d t h e c u l t u r ec o n d i t i o no f p s e u d o m o n a s n i t r o r e d u c e n s ，t h eb i o s y n t h e s i so f t h e a n i n eb yp s e u d o m o n a s n i t r o r e d u c e n sc e l l s ，t h eg e n ec l o n eo f g l u t a m i n e s ea n d g l t a m y l t r a n s p e p t i d a s ew e r e s t u d i e d t h e m a i nr e s u i t sw e p ga sf l o l l o w s ： 1 a m o n gs i x m i c r o b e s t h a t c o n t a i n 西咖i l i n a s e ，p s e u d o m o n a s n i t r o r e d u c e n s w a s a o n l y m i c r o b ew h i c hc a na b u n d a n t l ys y n t h e s i st b e a n i n eu n d e r a p p r o p r i a t ec u l t u r ec o n d i t i o n 2 t h e o p t i m u m c o n d i t i o nf u rp s e u d o m o n a sn i t r o r e d u c e n sc u l t u r ew a sm e d i u mw i t hp h 7 0 ， 3 0 c ，1 g l u c o s ef o rcs u b s t a n c e ，0 铂g l u t a m a t ef o r ns u b s t a n c e ，a n dn a t u r eo x y g e n q u a n t i t y 3 t h e o p t i m u m c o n d i t i o no f s y n t h e s i st h e a n i n eb yp s e u d o m o n a sn i t r o r e d u c e n sc e l l sw a s s u b s t a n c es o l u t i o nc o n t a i n i n g0 3 mg l u t a m i n ea n d1 s me t h y l a m i n ew i m p h 9 5 w e tc e l l s c o n t e n t7 0 m g m l ，c u l t u r et e m p e r a t u r e3 0 ca n dc u l t u r ef o r2 4 h o u r s t h em a x i m u mt h e a n i n e y i e l d w a s2 4 1 0 # l a n d t h e o p t i m u mc o n d i t i o n o f s y n t h e s i s t h e a n i n e b y p s e u d o m o n a s n i t r o r e d u c e n sc e l l sw a ss u b s t a n c es o l u t i o nc o n t a i n i n g0 7 mg l u t a m i n ea n d1 4 me t h y l a m i n e w i t hp h 9 5 ，w e tc e l l sc o n t e n t7 0 m g m l ，c u l t u r et e m p e r a t u r e3 0 ca n dc u l t u r ef o r 2 4 h o u r s t h em a x i m u mt h e a n i n e y i e l dw a s4 1 3 8 9 n 一af u r t h e rf e r m e n t a t i o n t r i a ls h o w e dt h a t u n d e rt h es a m ec u l t u r ec o n d i t i o n , t h em a x i m u mt h e a n i n ey i e l dw a s2 2 5 2 9 l t h ef i n a l a v e r a g ec o n c e n t r a t i o no f t h e a n i n ei nf e r m e n t e dl i q u i dw a s1 5 o l g la f t e r6 0h o u r s 4 t h ec l o n eo f g l u t a m i n a s eg e n eo b t a i n e df r o mp s e u d o m o n a sn i t r o r e d u c e n sw a sn o ts u c c e s si n t h i ss t u d ya n dn e e daf u r t h e rr e s e a r c h 5 a g l t a m y l n a n s p e p t i d a s eg e n eo b t a i n e df r o m e c o i lw a sc l o n e da n d e x p r e s s e ds u c c e s s f u l l y c o m p a r i n g i t sn u c l e o t i d es e q u e n c ew i t ho t h e rg l t a m y l t r a n s p e p t i d a s eg e n e sf r o mm i c r o b e r e p o r t e di nl i t e r a t u r ei ng e n e b a n k , c o n s i d e r a b l eh o m o l o g y ( m o r e t h a n9 9 9 ) w a so b s e r v e d i t c a np r o d u c e t h e a n i n e w i t ha y i e l d o f 9 0 0 # l k e yw o r d s ：t h e a n i n e ，p s e u d o m o n a sn i l r o r e d u c e n s ，b i o s y n t h e s i s ，g l u t a m i n a s eg e n ec l o n e g l t a m y l l r a n s p e p t i d a s eg e n e c l o n ea n d e x p r e s s i o n 论文评阅人： 杨亚军研究员 屠幼英副教授 答辩委员会主席： 江用文副研究员 答辩委员会成员： 杨崇仁研究员 杨贤强教授 何普明教授 成浩研究员 答辩时间： 茶学 茶学 中国农业科学院茶叶所 浙江大学 茶学中国农业科学院茶叶所 植物化学 茶学 茶学 茶学 2 0 0 5 年6 月2 4 日 答辩地点： 中国农业科学院茶叶研究所 中国科学院昆明植物所 浙江大学 浙江大学 中国农业科学院茶叶所 本研究属浙江省重点科技计划 “茶氨酸提取制备产业化技术研究” ( 编号0 2 1 1 0 1 1 5 6 ) 英文缩写 a m p a t p b p e b g a g g t g l u g l n i p t g l b o d p c r p s e ，n i t r o t r d u c e n s 缩略词 a b b r e v i m i o n s 英文全称 a m p i e i l l i n a d e n o s i n e 5 - t r i p h o s p h a t e b a s e p a i r e t l i d i u mb r o m i d e g l u t a r n i n a s e g l u t a m y l t r a n s p e p t i d a s e g l u t a m a t e g l u t a m i n e i s o p r o p y lt h i o g a l a e t o s i d e l u r i a - b e f t t a n i o p t i c a l d e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p s e u d o m o n a sn i t r o t r d u c e n s 中文名称 氨卞青霉素 腺苷三磷酸 碱基对 溴化乙锭 谷氨酰胺酶 谷氨酰胺转肽酶 谷氨酸盐 谷氨酰胺 异丙基硫代半乳糖苷 一种培养基 光密度 聚合酶链反应 硝基还原假单胞 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名时间：c ；b 咕年乡月巧日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院 有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传 播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名 劢孬 锄 时间：占k 哆年g 月j f 日 时间：棚j _ 年f 月自 中国农业科学l 亮硕士论文绪论 1 1 研究目的和意义 第一章绪论 茶氨酸是茶叶中特有的氨基酸，具有很高的医用价值和商业价值，但由于从茶叶中提取 高纯度的茶氨酸，成本还非常昂贵因此，有关它的生物合成研究越来越受到重视。目前采用 茶树愈伤组织、悬浮细胞培养等方法虽然能生成天然l 型茶氨酸，但由于运行成本过高，产品 制率低，暂时还无法产业化。微生物发酵法是目前工业化生产茶氨酸最成功的方法，日本太阳 化学株式会社拥有该方法，而国内目前有关这方面的研究还未见有报道。 本研究试图从微生物的大本营中筛选出可合成茶氨酸的微生物菌株。并对筛选得到的微 生物菌株的培养、茶氨酸生物合成条件以及茶氨酸合成关键酶类的基因克隆和表达等进行研 究，以期为今后利用微生物发酵和基因工程的方法工业化生产茶氨酸提供理论依据 1 2 国内外研究现状 1 2 1 茶氨酸的特性 茶氨酸f r l a e a n i n e ) 是茶叶中含有的一种特殊的非蛋白氨基酸，属于次生代谢产物，在一般植 物中比较罕见，被认为是茶叶的特征氨基酸。它与茶叶的滋味及香气形成关系密切是构成绿茶 品质的极重要的成分之一，甚至被作为鉴别真假茶叶的重要化学指标。茶氨酸是1 9 5 0 年e t 本学 者酒户弥二郎首次从绿茶中分离得到的，它的化学名为n 乙基吖l 谷氨酰胺( n e t h y l y l - g l u t a m i n e ) ，属于酰胺类化合物，有的文献中常称作y 一谷氨酸乙胺( y - g l u a m i ce t h y l a m i n e ) 或t 谷酰基乙酰胺( y - g l u t a m y l e t h y l m i d e ) ，分子式为：h o o c c h - c h 2 c h 2 - c o - n h - c h 2 c h 3 ，分 子量为1 7 4 2 。 c 弋籍 o c c c c 4 图1 茶氨酸分子结构 f i g 1 m o l e c u l es t r u c t u r eo f t h e a n i n e ( 5 - n - e t h y lg l u a t m i n e ) 自然界存在的茶氨酸均为l 型，纯品为白色针状晶体，熔点2 1 7 - - 2 1 8 c ( 分解) ，比旋光 度阻】d 卜7 7 - 8 5 ( 乌居秀一1 9 5 2 ) 。茶氨酸极易溶于水，而不溶于无水乙醇和乙醚，具有很强的 茚三酮反应，可用醋酸汞和碳酸钠沉淀( 但不为中性硝酸汞沉淀) ，易于碱式碳酸铜生成浅紫色 柱状铜盐，用2 5 硫酸或6 n 盐酸水解，生成l - 谷氨酸和乙胺，由此推测茶氨酸是由乙胺和谷 中国农业科学院硕士论文 绪论 氪酰胺为前导物质合成的，这推测现已完全得到证实茶氨酸水溶液呈微酸性( p h 5 晰o ) ， 具有焦耱香和类似味精的鲜爽昧，味阀值为o 0 6 。茶氨酸是茶叶中游离氨基酸的主体部分f 赵 和涛1 9 9 0 ) 并大量的存在于茶树的芽叶、嫩茎及幼根中。它的含量约占茶叶千重的l 一3 ，占 总氨基酸的5 0 以上，它与绿茶品质呈正相关。在茶汤中，茶氨酸的浸出率可达8 0 ，与茶叶 滋味等的相关系数达o 7 8 7 - 0 8 7 6 ，在高档绿茶( 成茶) 中含量最多，一般绿茶次之，红茶较少( 破 坏) 。自日本学者首次分离出茶氨酸以来。已出现多种分析测定方法碱式碳酸铜沉淀法、强酸 性阳离子交换树脂层析法、茚三酮显色法、纸层折、薄层层析、气相色谱、氨基酸自动分析仪、 高效液相及胶束电动气毛细管色谱法等。氨酸的测定方法。随着高效液相色谱技术的迅猛发展， 分析速度、灵敏度和自动化程度的不断提高，该技术越来越广泛地应用于氨基酸分析领域。李 布青等0 9 8 9 渐究了用氨基酸分析仪测定茶氨酸，发现增加柱温可以改善t h e 与a s p 、t h r 的分 离，在l p h _ 一l 中增加乙醇量可以改善t h e 与t h r 的分离。采用2 5 n 水和5 乙醇的i p h l 及 i p h2 、i p h - - r g 为洗脱缓冲液，流量0 7 m l m i n ，柱温7 0 ( 2 可达到茶氨酸的最佳分离效果。 郭升华在1 9 9 6 年研究了h p l c 测定茶叶中茶氨酸的方法，以异硫氰酸苯酯作衍生剂，醋酸钠缓 冲液与乙腈梯度洗脱，方法具有快速，精确，灵敏等特点。周光明等( 2 0 0 2 ) 研究了用高效液相色 谱分离、抑制化学发光测定茶叶氨酸的分析方法。利用茶氨酸抑制c 0 2 + 催化鲁米诺( l u m i n 0 1 ) 与过氧化氢化学发光反应的性质测定茶氨酸的含量。在茶氨酸质量浓度为0 2 叽5 0 9 l 时， 茶氨酸抑制化学发光产生负峰的相对峰面积与其质量浓度之间的线性回归良好。朱d , 兰( 2 0 0 3 ) 建立了未衍生化h p l c 测定茶叶中茶氨酸含量的方法。采用c ”色谱柱，o 0 5 0 ：v ) 三氟乙酸 水溶液为流动相，检测波长2 0 3 r i m 。当茶氨酸质量浓度在0 0 2 l g l 时，其浓度与峰面积呈 良好的线性关系，最低检出限为1 7 5 n g ，回收率为9 7 2o a 。除高效液相谱法之外，1 9 8 8 年池谷 贤次自5 等用近红外分光光度法对煎茶和抹茶中的茶氨酸进行了定量测定。1 9 9 0 年夏静等研究了 用生理体液法测定茶中的茶氨酸，该法能分开荼氨酸与谷氨酰胺但试剂价格昂贵。检测过程 手续较繁琐。随着近年来分析技术和分析手段的不断提高，毛细管电泳技术和液质联用技术也应 用到了茶氨酸检测领域。k i e h n e a 等( 1 9 9 6 ) 报道了采用热喷雾液质联用仪分析茶叶中多酚类物 质的方法，通过测定其准分子离子峰同时测定了茶叶中的儿茶素、黄酮醇糖甙、黄酮糖甙及咖 啡因、可可碱和茶氨酸。a u c a m pj p 等( 2 0 0 0 ) i j ：究了用毛细管电泳仪同时进行儿茶素、茶氨酸、 咖啡因及没食子酸、抗坏血酸分析的方法。 1 2 2 茶氨酸的生理功能、应用前景 茶氨酸自发现以来，一直是被作为茶叶的主要品质成分广为研究。直至上个世纪九十年代， 茶氨酸具有的一些特殊生理功能不断地被发现，从而成为茶叶功能性成分合成和提取、应用的 又一大热点。茶氨酸的主要生理功能有： ( 1 ) 缓解神经紧张、焦虑作用。t e r a s h i m a t 等( 1 9 9 9 ) 的动物实验表明，口服茶氢酸后通过肠 道吸收后，能迅速进入血液，再通过血液循环输送到各个组织器官。1 小时后。血清、肺、脑中 浓度明显增加，之后血清和肺中浓度逐渐下降，但脑中浓度持续增加，至5 小时达最高；2 4 小 时后，血清、肺、脑等组织均末检出说明茶氨酸主要受体是脑。由于茶氨酸能通过胺中的特 殊调节机构( 非特定物质不能通过) 屏障进入脑部，从而能调节脑神经机能，具有许多独特的生理 功能。y o k a g o s h ih 等( 1 9 9 8 ) 研究发现，茶氨酸在进入脑后使线粒体内神经传达物质多巴胺显著 2 中目农业科学院磺士论文 绪论 增加。多巴胺是肾上腺素及去肾上腺素的前驱体，是对传达脑神经细胞兴奋起重要作用物质。 ( 2 ) 抑制咖啡因引起的兴奋。k o b a y a s h ik ( 1 9 9 8 ) 等研究表明茶叶有提神兴奋作用，但饮茶后， 却不会产生饮用等量咖啡因的兴奋作用。茶氨酸能消除小鼠因摄入咖啡因所引起的自发运动， 说明茶氨酸为咖啡因的话抗物，具有明显安神、减少紧张和松弛神经等作用。当茶氨酸用量达l ， 7 4 0 m g k g 时可显著抑制咖啡因所引起神经系统* 奋；咖啡因可缩短由环己巴比妥导致的睡眠 时间，而茶氨酸可抑制咖啡因这种作用。 ( 3 ) 增强脑中的n 波的强度，使人产生轻松感，提高学习能力和记忆力。k o b a y a s h ik 等( 1 9 9 8 ) 研究表明在不同精神状态下，脑部会产生不同电流频率的脑波。脑波按其频率( h z ) 不同，可分 为四种，熟睡时为0 5 - 3 h z 的5 波时、打吨时为4 7 h z 的0 波、松弛时为8 1 3 h z 的波兴奋 时为1 4 h z 以上的1 3 波。曾对5 0 名1 8 2 0 岁女学生进行精神焦虑状态检查f m a n i f e s ta r l x i e t y s c a l e ，m a s ；该方法共分五级，i 级为高度焦虑状态，v 级为低度焦虑状态) 。选i 级和v 级各 四名进行试验，给予5 0 m g l o o m l 或2 0 0 m g j 1 0 0 m l 茶氨酸，服用后用脑波仪测定前3 0 r a i n 和后 3 0 m i n ，结果为在v 级中低浓度时影响不大，高浓度时后3 0 m i n 的n 波明显大约前3 0 m i n ；但在 i 级中，无论是服用低浓度还是高浓度的茶氨酸，均使脑部波的强度都明显大于对照( 0 r a g ) , 约为1 2 倍。测试后，询问服用2 0 0m g 茶氨酸受试者，服用时均无嗅、无味异常感觉。高焦虑 组中服用茶氨酸后有手、足，指尖暖和感觉，说明末端血管得到扩张；同时，茶氯酸有轻松、 愉快、心情舒畅、放松感觉( 杨志博等2 0 0 0 ) 。另有据m a s o na ( 2 0 0 1 ) 报道，茶氨酸作为镇静的 有效成分，可提高大脑功能，促进大脑对学习和记忆功能。 ( 4 ) 降血压作用。h y o k o g o s h i 等( 1 9 9 5 ) 研究报道，茶氨酸对原发性高血压大鼠( s h r ) 有降压 作用。对每组5 只体重在3 0 0 - 4 0 0 9 s h r 口授茶氨酸0 m g 、5 0 0 m g 、1 , 0 0 0 m g 、1 , 5 0 0 m g 、2 ，0 0 0 m g k g 体重( 配入0 9 n a c i ，口授7 m l k g ) ，口授前和口授6 0 r a i n 后测定s l i p , 血压和心搏率得出，随着 授予量增加，各项血压均随之下降，尤其当授予量达1 ，5 0 0 m g - - 2 ，0 0 0 m g k g 时，可下降血压 3 0 - 4 0 m m h g ，且这样降压作用对血压正常的大鼠( 1 5 0 0 士7 4 m m h g ) 作用不明显。另外两组s h r 分别饲以茶氨酸和化学结构与茶氨酸十分相近的谷氨酰胺进行试验，两者的饲与量均为 2 0 0 0 m g k g ，原始平均收缩压为2 3 3 6 + 5 7 m m h g ，结果显示出，茶氨酸能降低收缩压、平均血 压和舒张压约4 0m m h g ，而谷氨酰胺却无效。 ( 5 ) 预防血管性老年痴呆症。y o k a g o s h i 等( 1 9 9 6 ) 研究知道随着年龄的增长，脑栓塞等脑障 碍的发病率也呈上升趋势。由此引起的短暂脑缺血常导致缺血敏感区发生延迟性神经细胞死亡， 最终引发老年痴呆症。在沙土鼠的实验中，投给1 0 u l 浓度为5 0 - - 5 0 0 u m o l l 茶氨酸后并使其 处于3 r a i n 脑缺血状态，发现脑中完好的神经细胞数目比对照群多，并且保护效果随茶氨酸用量 的增加而提高，茶氨酸1 2 5 u m o l l 时神经细胞的存活率为6 0 ，5 0 0u m o f l 时神经细胞的存活 率为9 0 。这说明茶氨酸能抑制短暂脑缺血引起的神经细胞死亡。兴奋型神经传达物质谷氨酸 过多也会引起神经细胞死亡，这通常是老年痴呆的病因。茶氨酸与谷氨酸结籀相近，能竞争细 胞中谷氨酸结合部位，从而抑制神经细胞死亡。用鼠的大脑皮层细胞做试验中4 0 0 u m o l l 浓度 的茶氨酸可抑制5 0u m o l ，l 谷氨酸引起的神经细胞死亡。这些结果使茶氨酸有可能用于对脑栓 塞、脑出血、脑中风、脑缺血以及老年痴呆等疾病的防治。 ( 6 ) 增强肿瘤药物的效果。s a d z u k 等( 1 9 9 6 ) 研究表明茶氦酸本身虽无抗肿瘤活性，却能提高 多种抗肿瘤药物的疗效。茶氨酸与抗肿瘤药物一起使用时，不但提高药物活性。而且还提高其 3 中国农业科学院硕士论文 绪论 抑制肿瘤转移活性，并且茶氨酸不增加药物在正常组织中的浓度。其原理均为防治药物从肿瘤 细胞中流出，从而提高了药物在肿瘤细胞中的浓度( s u g i y a m a te ta l1 9 9 9 ：z h a n gge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 对于药物从肿瘤细胞内往外流，研究认为谷氨酸盐进入细胞后生成谷胱苷肽，谷胱苷肽会与药 物结合而被泵出细胞外。而茶氨酸能减少细胞对谷氨酸的吸收，使细胞中谷虢苷肽的生成量减 少，从而抑制了药物流出。这些研究将使肿瘤治疗有了新的发展，利用茶氨酸来减少毒性强的 抗肿瘤药物的剂量，减少其副作用，使肿瘤治疗变得更有效并且安全。 ( 7 ) 抑制肝癌细胞浸润。在癌细胞的生长过程中，原生部的癌细胞会通过对周围组织的浸润 进行局部扩散，转移到身体其他部位。抑制癌细胞的浸润是延长患者生命的一个有效手段。用 大鼠肠道的中皮细胞培养基中，观察肝癌细胞浸润状况的实验中，添加2 5 u m o l l 茶氨酸时，癌 细胞的浸润开始受到抑制，此抑制作用在2 5 - - 4 0 0 u m o l l 浓度之间随着茶氨酸浓度的增加而增 强。并且在空腹一夜的大鼠胃中投入茶氨酸后，其血清也有抑制癌细胞浸润的作用，在1 小时 采制血清检测结果表明抑制作用蛙强。此时浸润的癌细胞数减少了约3 0 ，此后抑制作用逐渐 降低。这与茶氨酸被吸收到体内后在血液中的浓度变化相关，血液中茶氨酸浓度高，其阻碍癌 细胞浸润的能力也就强fs u g i y a m a t e ta 1 1 9 9 8 ；k a k u d a te ta l2 0 0 0 ) 。 ( 8 ) 减肥作用。用混有o 0 2 8 茶氮酸的饲料喂养小鼠1 6 周后，其体重比对照群有明显减少， 腹腔脂肪减少到对照群的5 8 ，同时血压中脂肪级胆固醇减少了2 8 因此，茶叶的减肥作用 是指茶叶中包括茶氨酸在内的多种成分共同作用的结果。研究发现茶氨酸尤其对减少体内胆固 醇有效。 f 9 ) 改善经期综合症。经期综合症( 简称p m s ) 是女性在月经前3 到1 0 日中出现的精神 及身体上的不舒适的症状。y o k o g o s h i h 等( 2 0 0 1 ) 考察了茶氨酸对p m s 的改善作用，让2 4 名女 性每日服用茶氨酸2 0 0m g ，两个月后p m s 症状有明显改善。具体有头痛、疆痛、胸部胀痛、 无力、易疲劳、精神无法集中、烦躁等症状得到改善【i 】。其机理还需进一步调查，可能与茶氨 酸的镇静作用有关。 ( 1 0 ) 提高免疫力，防御病毒。2 0 0 3 年5 月美国国家科学院进度报告发表了哈佛大学研 究人员k a m a t h a ( 2 0 0 3 ) 就茶氨酸在人体肝脏分解为乙胺和谷氨酸后，前者调动了“伽玛德耳塔t 型细胞”这种人体血液免疫细胞作出抵御外界侵害的反应，成为抵御放大细菌、病毒因子的第一 道防线，继而t 型细胞促进干扰素的分泌量激增5 倍，对细菌的歼灭反应提高1 0 倍，可是喝咖 啡者的免疫细胞的干扰素分泌量没有变化。这种调节机体免疫系统的功能使茶中的“l _ 茶氨酸” 可制成药物以提高体内的抗传染能力0 3 u k o w s h ij 1 9 9 9 ) 。 美国的科学家研究发现茶氨酸可以让人体对疾病的抵抗力提高五倍。这种物质具有调动免 疫细胞活力的功能，从而使肌体可以更好地抵抗细菌、病毒、真菌等，可以预计未来有一天会 把这种物质转化成治疗药物。尤其在s a r s 期间，国内外专家都提出，饮用绿茶有助于增起人 体免疫力，预防传染病。美国的最新研究，这些可能均与茶氨酸的作用有关，哈佛医学院布考 斯基博士通过对志愿者进行测试，证明茶氨酸可以通过调节免疫细胞来增强人体的免疫系统， 抵抗致病微生物如病毒、细菌、真菌的入侵( 林智2 0 0 3 ) 。 早在1 9 8 5 年，美国食品和药物管理局( f d a ) 就认可了茶氨酸，并确认人工合成茶氨酸是 一种公认安全的物质( g r a s ) ，在使用过程中不作限制用量的规定。其安全性实验表明，茶氨 酸的大鼠急性毒性在5 9 k g 以上：连续服用2 8 天( 每天2 9 k g ) 茶氨酸的亚急性实验中，大鼠 4 中国农业科学院硕士论文 绪论 来见任何毒性反应；在致突变实验中也没有发现茶氨酸的任何诱变作用；细菌恢复突变实验也 证明未导致基因变异。因此，可以说茶氨酸是一种十分安全的，无毒的茶叶天然产物，可广泛 应用于食品和医药行业。茶氨酸可广泛应用于下列行业( 杜荣茂2 0 0 2 ) ：( 1 ) 可作为饮料，食品的 品质改良剂、风味的添加剂，改善茶叶中咖啡碱和茶多酚的苦涩味，添加到咖啡，巧克力，布 丁，果冻，口香蓿，啤酒等食品中( 2 ) 功能食品的添加剂来缓解神经紧张，提高记忆力和益智 等；( 3 ) 降血压和抗肿瘤的辅助药物；( 螗症治疗的辅助药物( 5 ) 可研制增强人体免疫力，抵抗致 病微生物的新药；( 6 溅肥的有效成分，添加到食品、保健品中。净化饮用水、及除臭剂的 有效成分，目前日本以拥有这两项专利。 1 , 2 , 3 茶氨酸在茶树体内的分布、合成、代谢途径 1 2 3 1 茶氨酸的分布 发芽前的种子中主要的氨基酸和酰胺是茶氨酸；发芽后，茶树子叶仍以茶氨酸和精氨酸为 主。但是，根中的茶氨酸占氮基酸总量的8 0 左右，精氨酸占1 0 左右。当茶树幼根和茎叶开 始生长时，他们所含的茶氨酸是由子叶运输而来的( 宛晓春。1 9 7 9 ；沈同和王镜岩，1 9 8 1 ) 。不久， 幼苗即将开始分化，于是根部开始吸收无机氮合成氯基酸。茶氨酸分布在茶树各个组织的含量 差异较大，以第叶、子叶含量，明显较其他组织高。此外，茶氨酸在各个组织中的相对含量 还受茶树的生育阶段、营养状况的影响。茶树新梢开始萌发以后，主根和成叶中贮藏的氮开始 趋于减少，而茎、枝、新梢中贮存的含氮量递增。随着新梢的生长发育，氮素不断的往新梢运 输，根部吸收的氮则大量的运送给叶部。杨贤强( 1 9 8 2 ) 研究表明茶树因施肥种类不同，对其氨基 酸、酰胺等的分配和积累亦有明显差异，旌用铵态氮肥初期，茶树体内谷胺酰氨的浓度急剧上 升，茶树根部茶氨酸、精氨酸和谷氨酰胺的浓度叶星直线上升，但不久除茶氨酸的浓度仍继续 提高外，其他氨基酸都有所下降。这时，地上以精氨酸为主，根部主要是茶氮酸硝态氮肥的 用量与根部氨基酸类化合物的浓度不呈现上述关系。茶氨酸的积累和分布与其转移速度和利用 速度有关( 杨贤强，1 9 8 1 ；陈昕，1 9 9 9 ) 。茶树氨基酸中以谷氮酸利用晟快，而茶氨酸贮存期长， 因为茶氨酸由根部转移到叶部的速度和叶部利用速度都比谷氨酸慢，新梢中的茶氨酸从萌发开 始就具有较高的含量，随着新梢的生长一直保持较高的水平。 1 2 3 2 茶氨酸的体内合成、代谢途径 佐佐冈启等( 1 9 6 3 ) 用同位素c “标记的谷氨酸和乙胺的方法饲喂茶籽幼苗。发现谷氨酸和乙 胺是茶氨酸合成的直接前导物，并且随着减少乙胺的饲喂量，合成的茶氨酸就有所减少。加入 酸将带有标记的茶氨酸水解又生成带有c “标记的谷氨酸或乙胺。小西茂毅等进一步探明茶氨 酸合成是在茶树的根部，茶树根系利用谷氮酸为碳源乙胺为作为氮源( 乙胺由叶片中存在的 丙氨酸通过丙氨酸脱羧酶作用在叶片生成，也可通过三羧酸循环产生的丙酮酸重新合成，在运 送至根部) ，通过茶氨酸合成酶将谷氨酸和乙胺相结合，合成茶氨酸( 汤焱，2 0 0 2 ) 。丙氨酸广泛 存在于各种动植物体内，但却只有茶树才具有大量合成茶氨酸的能力。这是因为茶树体内具有l 一谷氨酸：乙胺连接酶( l g l u t a m a t e ：e t h y l a m i n el i g a s e ) ，该酶又称茶氨酸合成酶，催化如下反应： 谷氨酸+ 乙胺+ a t p l ：益氩酸i 己题羲接瓯茶氨酸+ a d p + p i 中国农业科学院硕士论文 绪论 k s a s a o k a 等( 1 9 6 5 ) 从萌发的茶籽中分离出茶氨酸合成酶，并且研究了茶氨酸合成酶的一些 理化性质。并证实对谷氨酸、乙胺和a t 具有较高的特异亲和力，且仅为茶树所特有，但该酶 在体外极易失活。为了进一步明确这个专一条件，k s a s a o k a 等用氨代替乙胺时，并用c ”标记 的l 谷氮酸。分别生成谷氨酰胺和茶氨酸；当氢和乙胺同时存在培养时，再次生成各自的醌胺 类化台物。正如单独反应时生产物一样。这说明茶氨酸的合成是独立于谷氨酰胺合成的。这些 结果显示在茶苗中存在一个合成酶，它对乙胺具有高亲和力，并且不同于谷氨酸合成或谷氨酰 胺酶。茶氨酸合成酶和谷氨酰胺合成酶它们在不同缓冲液中酶的稳定性也是明显不同的，这也 说明了它们是两种不同的酶( t s u g e he ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 表1 茶氮酸合成酶话性与答氮酸台成酶稳定性 t a b l e l s t a b i l i t yo f t h e t h e a n i n es y n t h e s i z i n ge n z y m ea n dg l u t a m i n es y n t h e t a s e 缓冲液处理茶氮酸合成酶活性谷氨酸合成酶活性 未处理酶液 1 0 01 0 0 磷酸钾 1 0 57 6 t n s h c l2 69 2 昧畦一h c l 2 61 0 6 磷酸钠 5 0 1 缸h c i k c l6 3 t r i s - h c l 磷酸钾 9 0 以上的研究显示，茶苗中合成茶氨酸的酶可能是一种命名为l 一谷氨酸：乙胺连接酶，它 是一种合成酶，并对乙胺就有高亲和力，而对氨、l 一半胱氨酸有低亲和力，并且合成茶氨酸的 酶需要钾离子和磷酸来维持酶的活性，而谷氨酰胺合成酶却不需要这样的条件。 茶氨酸属于植物次级代谢的产物，根据陈宗懋等( 1 9 9 8 ) 报道，茶树生成的茶氨酸由根部迅速 转移到芽梢部并在那里积累。如果茶树光合作用旺盛。茶氮酸的分解代谢就会加速，其碳素积 极参加与多酚类或其它相关物质的代谢。因此，茶树体内大量积累有机碳化合物时。茶氨酸的 含量就相应降低；反之降低碳索同化作用就直接提高茶氨酸的含量。对于茶氨酸的代谢中的因 素控制，m a t s u u r a t 等( 1 9 9 2 ) 研究认为，在2 0 - - 2 8 c 的温度范围内，茶氨酸的积累与温度成正相 关，并提出其最适温度为2 5 c 。另外，根据k i l a d z e td 等( 1 9 4 9 ) 和杨贤强( 1 9 8 9 ) 研究认为，使用 氮肥可以促进茶氨酸的合成量。 6 中国农业科学院硕士论文 绪论 c o j先 。 l 一一_ - 一l 一 时帮 ， l 要：- f ： i 乙囊+ 普羹一豢t 图2 茶氨酸在茶树体内代谢途径 f i g 2 t h e a n i n em e t a b o l i s m i nv i v i dt e ap l a n t 1 , 2 3 3 茶树体内合成茶氨酸的前体物质 t t a e h i k i ，h s u z u k i 和s w a k i s a k a 等( 1 9 6 4 ) 研究报道得知合成茶氨酸的前体物质有谷氨 酸、谷胺酰氨等。茶氨酸与谷氨酸、谷胺酰氨在分子结构上十分相似如图所示： 0o h 。w 。h n h 2 g l ue g l u t a m i n s a e u r e 图3 各氨酸分子结构式 oo 掣w n h 2 g l nqg l u t a m i n 图4 谷胺酰氨分子结构式 f i 9 3 m o l e c n l es t r u c t u r eo f g l u t u m i ca c i df i 9 4 m o l e c u l es t r u c t u r eo fg l u t a m i n e 谷氮酸和谷胺酰氨在含氪微生物的新陈代谢中具有非常重要的作用：( 1 ) 微生物和植物通过 它们自身的有机组织内谷氨酸合成酶或谷酰氨合成酶体系，反应生成谷氨酸和谷酰氨；( 2 ) 微生 物的大部分的一氨基来自谷氨酸；( 3 ) 谷酰氨侧链上的氮，在广泛的生物合成的第一步起着重 要生理媒介作用。h a n n l a nsc 等( 1 9 7 9 ) 研究了一些细菌发酵过程中的氨、谷氨酸、谷氨酰胺， 发现酶的活性是和微生物生长的环境及新陈代谢相关的：一个相似的观点来自于除氮细菌，在 自然界氮循环中氮扮演着一个重要的作用，但是人们对含氮的有机体的了解相对_ 丁+ 含氧生物的 研究是很少的。t t k h 越等( 1 9 9 6 ) 研究硝基还原假单胞菌( p s e u d o m o n a sn i t r o r e d u c e n s ) 中的谷胺 酰氨酶。谷氢酰胺酶分解谷氨酸盐为谷氨酸和氨这个反应在自然界是根常见的。并且人们已经 从生理和药理方面对动、植物和细菌的谷酰氨酶类进行了大量的研究。而来自于硝摹还原假单 胞菌0 u d o m o n a sn i t r o r e d u c e n s ) 中的谷氨酰胺酶，让人感趣的是它的反应活性，因为只有很少的 7 中国农业科学院硕士论文绪论 谷胺酰氨酶可以转移谷酰氨上的酰基到一个受体上，正如谷酰基酰基转移酶( g l u t a m i n e g l l n a r n y m f e m e e c 2 3 2 i ) 或者t 珞酰氨转移酶( t g l u t a m y l t r a n s f e r a s e e c 2 3 2 2 ) ，谷胺酰氨转 肚酶( g l t a m y l 唧p t i d a s e e c 2 3 2 2 ) 同时它还具有水解反应。谷氨酰胺酶( e c 3 5 1 2 ) 定义 为水解谷氨酰胺为谷氨酸和氨，但是许多谷氨酰胺酶催化来自于像谷胺酰氨或者谷胱苷肽等供 体到t 一谷酰基受体的转移反应。另一方面谷氨酰胺转移酶水解供体。但是在谷氨酰胺酶和谷 氨酰胺水解酶之间并没有严格的区分界限。因此，在大多数的情况下将谷氨酰胺酶和谷酰胺转 移酶分为四类：只有水解活性；对于一些受体水解活性优先于转移活性：转移优先于水 解( 水解活性被大量抑制在适合的受体) ：只有转移活性。谷氨酰胺和谷氨酸代谢途径如下 ( s t a d t m ah e ta 1 1 9 7 9 ) ： 图5d l - 谷氮馥和谷氨酰胺代谢途径 f i g a a - g l u t s m i n ea n dg l u t a m a t em e t a b o l i s m 通过对硝基还原假单胞菌( p e u d o m o n a sn i t r o r e d u c e n s ) 的谷氨酰胺酶对不同底物的水解和 转移反应的结果显示，如以对l 谷氨酰胺的水解和转移反应为1 0 0 作为标准。则：对如下底物 为l 谷氮酰胺、d 一谷氨酰胺、t 一谷酰基硝基苯胺、r 谷酰胺甲胺、茶氮酸、谷胱苷肽、天冬 酰胺酸的水解反应的活性分别为1 0 0 、1 0 7 、8 5 、7 8 、7 4 、8 2 、0 ；转移活性分别为1 0 0 、9 5 、1 0 8 、 6 2 、8 3 、8 3 、一： 1 2 3 4 茶氨酸合成的相关酶类 a 谷氨酰胺酶 谷氨酰胺酶( g l u t a m i n a s e ，g a ，e c 3 5 1 2 ) 类在在含氮动、植物以及微生物中是广泛存在的，并 且它们多数以复合酶形式存在于细胞中，常见的主要有谷氨酰胺天门冬氨酸酶。它催化水解谷 氨酰胺为谷氨