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主要养殖对虾幼体及仔虾酶活力与中肠形态结构的研究 摘要 8 0 年代发展起来的消化酶量化分析技术，无疑对于研究海水淡水虾类饲料 消化率、营养平衡起着重要作用，而且还能勾画出动物饲料组成类型以及对营养 物质的水解能力，随动物生长成熟生理状态的不同消化酶周期性分泌和活力变 化。对虾类消化酶的生理生化分析还将有助于理解十足目动物的营养需求和消化 生理过程。本文首先综述了对虾类的消化酶的研究进展。 本实验研究了中国明对虾幼体和仔虾的胰蛋白酶、糜蛋白酶和淀粉酶，并对 其蛋白质和核酸含量进行了研究。利用人工合成底物t a m e 和s a p f n a 检测了 中国明对虾( f e n n e r o p e n a e u sc h i n e n s i s ) 幼体及仔虾的消化性蛋白酶( 胰蛋自酶 和糜蛋白酶) 和淀粉酶的活性。结果表明，该虾幼体及仔虾具有胰蛋白酶和糜蛋 白酶活力，丝氨酸蛋白酶抑制剂( p m s f ) 对蛋白酶的抑制作用体现为对糜蛋白 酶的抑制，对胰蛋白酶没有抑制作用。中国明对虾个体发育中消化酶的变化趋势 为：( 1 ) 糠虾期蛋白酶的比活力最高，无节幼体期最低，其中总蛋白酶和糜蛋白 酶及胰蛋白酶的比活力分别在m 3 和m l 达峰值；( 2 ) 淀粉酶的比活力在潘状幼 体期( z 。) 最大，m 3 也出现升高趋势，其余各期酶活性均较低；( 3 ) m 2 各种消 化酶的活性都很低。中国明对虾幼体前期水分含量逐渐增加，从z 3 期趋于稳定； 蛋白质含量的波动范围小。无节幼体变态成潘状幼体体重的变化率最大，z 3 m 1 期绝对变化率和相对变化率都很高，糠虾阶段变化率逐渐下降。在个体发育过程 中，从无节幼体变态为涵状幼体时核酸含量发生剧烈变化，n 4 一z 1 期d n a 和r n a 含量显著下降。涵状幼体和糠虾幼体期d n a 含量略有增加，而在z 3 m l 和m 3 一p l t 变态中r n a 含量总是增加。z i 和z 3 期r n a 和d n a 的比值明显下降，其他发 育期趋于稳定。 实验尝试通过中草药强化方法来强化轮虫和卤虫，利用饵料作为载体，最终 提高对虾幼体消化能力和存活力，改善生长。结果表明中国明对虾和凡纳滨对虾 ( l i t o p e n a e u sv a n n a m e i ) 的幼体药i i 的存活率要高于对照组。其中在中国明对虾 实验组，更高于药i 的幼体z 3 期( p 0 0 5 ) ，使用药i 的实验组存活率均较低； 凡纳滨对虾组包膜药i i 的存活率要高于对照组，而日本囊对虾( m a r s u p e n a e u s j a p o n i c u s ) 中草药强化的和对照组无差异。中草药包膜下，中国明对虾和凡纳滨 对虾发育至p l t 干重明显高于对照组。中草药强化的中国明对虾的胰蛋白酶的活 力和对照组无显著差异，仅z 3 期药i 组要显著低于其余组( p 0 。0 5 ) ，m 期配 饵组高于其余组。对于药i i 包膜的日本囊对虾z 2 、z 3 期中草药强化组的胰蛋白 酶均显著高于对照( p 0 0 5 ) ，而在m l 期则显著低于对照。凡纳滨对虾则中草 药处理组和对照组无显著差异。仅m l 期的胰蛋白酶要低于对照。中国明对虾的 主要养殖对虾幼体及仔虾酶活力与中肠7 眵态结构的研究 糜蛋白酶的活性中草药处理组和对照组无明显差异，仅m 一期配饵组显著高于其 它组( p o 0 5 ) 。日本囊对虾m 2 期，中草药包膜组则显著低于对照组( p 2 1 1 d ( 0 o l m g ) 电子天平称重，计算单只幼体重量及水分含量。 2 1 5 蛋白质含量的测定 称取干燥后的样品用改进的简易微量凯氏定氮法( 参照附录) 测定氮元素含量，乘以 6 2 5 折合成蛋白质含量。 2 1 6 核酸含量测定 称取一定量的对虾样品匀浆，参照b u c k l e y 等( 19 8 7 ) 的方法测定d n a 和r n a 含量 计算r n a 与d n a 的比值。 2 1 7 数据的统计分析 实验数据用s p s s l 0 0 软件进行单因素方差分析，p 0 0 5 为差异显著。 1 4 主要养殖对虾幼体及仔虾酶活力与中肠形态结构的研究 2 2 结果 2 2 1 丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用 结果表明，丝氩酸蛋白酶抑制物甲苯璜酰氟( p m s f ) 对蛋白酶的抑制作用体现为对糜 蛋白酶的抑制作用，其对胰蛋白酶无抑制作用。 2 2 2 各发育期消化酶活力的变化 中国明对虾个体发育过程中消化酶有三种变化趋势：( 1 ) 蛋白酶的比活力随发育期的进 行不连续地升高，到糠虾期达到最大值无节幼体捌比活力最低，其中总蛋白酶和糜蛋白酶 的比活力到m 3 达到峰值( 图2 1 图2 - 3 ) 。胰蛋白酶的比活力则是发育到m 。达到最高值( 图 2 - 2 ) ；( 2 ) 淀粉酶的比活力在涵状幼体期( z 1 ) 达到最大，m 3 也出现升高趋势，其余各期 酶括性均较低( 图2 - 4 ) ；( 3 ) 在发育中各种消化酶在m z 酶活性都很低。 h 4 n 6 z t z 2z 3m lm 2 m 3 p l lp l 3 图2 - 1 总蛋白酶比活力 f i g 2 - 1s p e c i f i ca c t i v i t i e so fg e n e r a lp r o t e a s e s n n 6z lz 2z3m lm 2m 3p l l p l 3 图2 - 3 糜蛋白酶比活力 f i g 2 3s p e c i f i ca c t i v i t i e so fc h y m o t r y p s i n 1 蒸 一；： n 4n 6z lz 2z 3m 1 2m 3p l lp l 3 图2 - 2 胰蛋白酶比活力 f i g ，2 - 2s p e c i f i ca c t i v i t i e so f t r y p s i n 2 1 l _ 8 台 蓬 0 3 0 n 4n 6 z i z 2 z 3 m lm 2 m 3p l lp l 3 图2 - 4 淀粉酶比活力 f i g 2 - 4s p e c i f i ca c t i v i t i e so f a m y l a s e 2 5 l 5 0 1 0 o 0 o o p州_puu_和州oqa 目拿r 蝠彗 5 4 3 2 1 0 o o o o o d 0 0 0 o 暑i州p等=ge q 辞r 罂茁 主要养殖对虾幼体及仔虾酶活力与中肠形态结构的研究 2 2 3 各期幼体及仔虾干重、水分和蛋白质含量的变化 中国明对虾幼体前期水分含量逐渐增加 无节幼体变态成滔状幼体体重的变化率最大 虾阶段变化率逐渐下降( 图2 - 7 ) 。 q 9 q 蹬 q 田 q 8 4 q 跎 q 8 q 裙 q 1 7 6 q 7 4 q 讼 q 7 陌丑恐忍磁汜晒f l l 图2 - 5 各发育期水分含量 f i g 2 - 5m o i s t u r ei nl a r v ea n dp o s t t a r v e 1 6 1 4 1 2 蚓 七笔1 0 擗， 戮 2 o 从z 3 期趋于稳定；蛋白质含量的波动范围小。 z 3 - m l 期绝对变化率和相对变化率都很高，糠 q 8 q 7 q 6 q 5 q 4 q 3 q 2 q 1 0 喝殂挖召m娩mf l l 圈2 - 6 各发育期蛋白质含量 f i g 2 - 6c r u d ep r o t e i nc o n t e n t si nl a r v a ea n dp o s f l a r v a e j 1 0 8 0 7 蚓 卜0 0 6 。3 斟， 0 5 基。 0 4 篓； n 3 耍q + 体重绝对变化率 0 2 一+ 体重相对变化率 z lz 2z 3m 1m zm 3p l l 图2 7 中国明对虾不同发育期体重的变化率 f i g 2 - 7d r yw e i g h tg a i ni nl a r v a la n dp o s t l a r v a lf e n n e r o p e n a e u sc h i n e n s i s 2 2 4 各发育期核酸含量的变化 在个体发育过程中。从无节幼体变态为潘状幼体时核酸含量发生剧烈变化：n 。z 一期 1 6 南氆闰醐隔日蹦盟_ 1上坦蟛陬相陌瞄喇阻 一 由阱田田甚崩斟田田出 一 上目出喇出崩出田田盥_ 1由崮斟田田目崮eef且上l_e隅eee田田围且_ |上崮田由阻_ 1由崮粥eef置 主要养殖对虾幼体及仔虾酶活力与中肠形态结构的研究 i l l d n a 和r n a 含量显著下降。涵状幼体和糠虾幼体期d n a 含量略有增加，而在z r m l 南i m 3 ，p l i 变态中r n a 含量总是增加。z l 和z 3 期r n a 和d n a 的比值明显下降其他发育期 趋于稳定。 3 。；i 。l 扎 舀重 l i 善 n z lz 2t ：3m lm 2 犯p l 】p l 3 图2 - 8 各发育期d n a 的含量 f i g 2 - 8d n ac o n t e n t si nl a r v a ea n dp o s t l a r v a c 2 3 讨论 n 4惦7 , 1z 2z 3m l 艟船p l ip l 3 图2 - 9 各发育期r n a 的含量 f i g 2 - 9r n a c o n t e n t si n a r v a ea n dp o s t a r v a e n 4n 6z 1z 2z 3m lm 2m 3p l l p l 3 图2 1 0 各发育期r n a d n a 的比值 f i g 2 - 1 0r n a d n ar a t i o si nl a r v a ea n dp o s t l a r v a c 2 3 1 对虾幼体及仔虾胰蛋白酶和糜蛋白酶的检测和表示方法 由于样品数量少，底物缺乏专性，测定甲壳动物幼体的酶活力十分困难。l o v c t t 和 1 7 5 5 4 5 3 5 2 5 1 5 o 4 3 2 1 o o；2n0v丕 书丑gvno娶vn 主要养殖对虾幼体及仔虾酶活力与中肠形态结构的研究 f e l d e r ( 1 9 9 0 ) 用人工台成的底物证明白对虾( l i t o p e n a e u ss e t i f e r u s ) 幼体的消化酶主要来自消 化腺( 肝胰脏) ，使对虾幼体消化酶分析获得了理论支持。刘玉梅等( 1 9 9 1 ) 和潘鲁青等( 1 9 9 7 ) 研究了中国明对虾幼体和仔虾的总蛋白酶和碱性蛋白酶但是，其底物缺乏专一性，不能具 体阐释胰蛋白酶和糜蛋白酶的作用。于二传坤( 1 9 8 7 ) 用t a m e 和b t e e 底物测定了中国明 对虾幼虾及产完卵的亲虾的胰蛋白酶和糜蛋白酶，发现了较强的胰蛋白酶活性乖i 较弱的糜蛋 白酶活性。随着n ，琥珀酰l _ 丙氮酸l 脯氨酸。l - 苯丙氨酸硝酰基苯胺( s a p f n a ) 在对虾 糜蛋白酶分析中的应用，肯定了对虾中确实存在糜蛋白酶( t s a i 等，1 9 8 6 ；v a nw o r m h o u d t 等， 1 9 9 2 ) 。本实验利用t a m e 乖is a p f n a 分别检测胰蛋白酶和糜蛋白酶发现。中国明对虾幼 体及仔虾除了具有较强的胰蛋白酶活性还显示了一定的糜蛋白酶活力，此尚属首次报道。 本实验得出的丝氨酸蛋白酶抑制物甲苯璜酰氟( p m s f ) 对蛋白酶的抑制作用体现为对 糜蛋白酶的抑制与l e m o s 等( 1 9 9 9 ；2 0 0 2 ) 得出的结果相一致，只有当p m s f 与其他抑制 剂联合使用时才体现为对胰蛋白酶的抑制。 酶活力的表示方法也会影响消化酶的活力分析。目前表示消化酶活力的方法有很多( 湿 重、蛋白质和干重等) 。本实验以每m g 蛋白质来表示酶活力，因为冰冻整体样品可以较好 地保持本实验测定的三种酶活力( l o v e a 和f e l d e r ，1 9 9 0 ；o m o n d i 和s t a r k , 2 0 0 1 ) 。总之， 酶活力的检测和评价在很大程度上要依赖于底物的专一性和酶活力的表示方法。 2 3 2 中国明对虾幼体消化酶的个体发育变化 众多学者研究表明，对虾z 3 m ，阶段胰蛋白酶的活力最高( 图2 - 8 ) ，涵状期淀粉酶活力 最高，这与本实验的结果相符( l o v e u 和f e l d e r ，1 9 9 0 ；l e m o s 等，1 9 9 9 ，2 0 0 2 ) 。对此，大 多解释为幼体食性转换而做出的适应和消化道的组织分化。这种酶活性的变化可能受基因遗 传调控( l o v e t t 雨if e l d e r ，1 9 9 0 ) 。中国明对虾发育至m l 期第一对中肠腺盲囊相对缩小，至 m 3 期完全退化消失，第二对中肠腺盲囊分支逐渐增多。最后发育成对虾消化腺( 肝胰腺) ( 王海林等，1 9 9 7 ) 。本实验得出的结论可能与中国明对虾的消化腺分化形成有关。至于本 实验中所有消化酶的活力在m 2 都很低的原因，目前尚难解释。对虾幼体发育中糜蛋白酶的 活力研究较少( 图2 - 9 ) 但几个实验结果都表明，涵状期的活力较高，这与本实验结果相 符，但本实验的峰值山现在m 3 期。k u m a r 等( 2 0 0 5 ) 发现，隆腺涵( d a p h n i ac a r i n a t a ) 的糜蛋白酶活性较高，几乎为胰蛋白酶的两倍。对虾和枝角类均属于节肢动物门甲壳纲，对 虾的涵状幼体与枝角类有较近的亲缘关系这就不难解释对虾糜蛋白酶在涵状期较高的现 象。 主要养殖对虾幼体及仔虾酶活力与中肠形态结构的研究 图2 - 8 儿种对虾幼体及仔虾胰蛋白酶相对活力 f i g 2 - 8r e l a t i v ea c t i v i t i e so f t r y p s l ni np e n a e i dl a r v a ea n dp o s t l a r v a e 注：l d o p e n a e u ss c h m i f f i 来自l c m o s 等( 2 0 0 2 ) ；f a r f a m e p e n a e u sp a u l e n s i s 来自l e m o s 等( 1 9 9 9 ) ； f e n n e r o p e n a e u si n d i c u s 来自k u m l u 等( 1 9 9 5 ) ；p e n a e u sm o n o d o n 来自k a m a r u d i n ( 1 9 9 2 ) ：m a r s u p e n a e u s j a p o n i e u s 来自k a m a r u d i n ( 1 9 9 2 ) ；f e n n e r o p e n a e u sc h i e n s i $ 来自本实验 1 0 0 8 0 60 d0 2 0 0 n 6z lz2z3mlm 2m3p l l 圈2 - 9 几种对虾幼体及仔虾糜蛋白酶的相对活力 f i g2 - 9r e l a t i v ea c t i v i t i e so f c h y m o t r y p s i np e n a e i dl a r v a e 注：l i t o p e n a e u ss c h m i t t i 来自l e m o s 等( 2 0 0 2 ) ；f a r f a n t e p e n a e u sp a u l e n s i s 来自l e m o s 等( 1 9 9 9 ) f e n n e r o p e n a e u sc h i e n s i s 来自本实验 2 3 3 饵料对个体发育中消化酶活力的影响 甲壳动物个体消化酶的活力主要受生长发育和蜕皮等内源性因子的影响。有关消化酶活 力对食物适应的研究结果常相互矛盾( l em o u l l a c 等。2 0 0 2 ) ，且主要集中在成体和仔虾上。 大多数学者认为，对虾个体发育过程中消化酶活力的变化不受食物影响( l o v e t t 等f e l d e r ， 1 9 9 0 ；l e m o s 等，1 9 9 9 ) 但是，笔者认为，个体发育过程中消化酶的活力同食物密切相关。 育苗生产证明，褶皱臂尾轮虫大小适宜，是z 2 期对虾幼体的良好饵料( e m m e r s o n ，1 9 8 4 ) 。 在轮虫体内还检测出了碱性蛋白酶活性，其特性与胰蛋白酶相类似( h a 鸭等，1 9 8 4 ) 。卤虫无 节幼体给鱼虾带来的外源性酶源作为其体内消化酶的补充已经有了报道( p a n 等，1 9 9 1 ) 。但 众多学者有关对虾幼体消化酶的试验未见有以轮虫作为饵料。本实验从z 2 期开始投喂轮虫。 从z 3 投喂卤虫无节幼体，轮虫一直投喂至m 2 期，胰蛋白酶的活力是否与投喂轮虫有关，仍 1 9 篡警警篇篡篇渤磁绋警置 一一 主要养殖对虾幼体及仔虾酶活力与中肠形态结构的研究 需深入研究。 2 3 4 对虾幼体和仔虾个体发育中水分、核酸含量变化及其与生长和 消化酶活力之间的关系 对虾在个体发育阶段外部形态( 体节、附胺等) 及内部细胞组织等都发生了显著的变化。 在涵状幼体期水分的增加可能是此期附肢增加而引起的体积及表面积增大所致。 l a u b i e r - b o n i c h o n 等( 1 9 7 7 ) 对日本囊对虾幼体及仔虾的核酸和消化酶的研究发现，无节幼 体期d n a 含量很高，涵状期r n a 含量显著增加。对此解释为无节幼体和糠虾期发生细胞 增殖，而潘状期则以细胞过度增生为主这与本实验的结果相一致。利用d n a 含量变化来 表示细胞的增殖，r n a 含量变化来代表干重和蛋白质的变化。用体内d n a 、r n a 含量及 其比值来评价及衡量生物不同发育阶段生长及营养状况的细胞及代谢活性早已为众多学者 所采用( l a u b i e r - b o n i c h o n 等1 9 7 7 ；b u l o w 1 9 8 7 ) 。这种方法的原理是一个物种的每个体 细胞d n a 含量通常是一定的，而r n a 的含量则同蛋白质的合成直接相关，因此d n a 和 r n a 的比值用来测定生物体与生长有关的细胞合成活性。中国明对虾m 。期幼体d n a 和 r n a 的比值较高幼体的增重率及胰蛋白酶活性也最大，说明该期幼体细胞合成活性大， 消化吸收能力强，因此增重率高。而在本实验中，z i 和z 3 期比值明显下降的原因无法解释。 2 0 主要养殖对虾幼体及仔虾酶活力与中肠形态结构的研究 第三章中草药对三种对虾幼体和仔虾消化酶活力、 生长和存活力的影响 病毒，尤其是w s s v ( 对虾白斑综合症病毒w h i t es p o ts y n d r o m ev i r u s ) ，在3 到1 0 天内即可使8 0 的养殖对虾死亡( l i g h t n e r 1 9 9 6 ；l o 等，1 9 9 7 ；m a e d a 等，1 9 9 8 ) 。使用化学药 物，会使对虾生长发育受阻，抗病力减弱，对致病菌产生耐药性，使毒害物质积累、残留， 严重威胁人类健康。为使对虾养殖业持续发展。许多学者从遗传、营养和生态等多方面研究 对策( m o o r e 等，1 9 9 9 ；w o u t e r s 等，2 0 0 1 ) 。现在许多养殖工作者一致认为虾苗质量是关键。 免疫增强剂可以提高鱼、虾的非特异性免疫功能，已在水产养殖中广泛应用( j i a n 等，2 0 0 4 ) 。 我国具有大量调：宵机体免疫力的单方汞l 复方中草药( c h i n e s em e d i c i n e s ) 。它具有营养和药物 等多种生理功效，无毒、无残留、无抗药性、不污染环境平| i 不引发药源性疾病，能确保水产 品安全( 刘红柏，2 0 0 2 ：陈成勋等。2 0 0 2 ) 。 目前多将中草药作饲料添加剂研究其对生长、免疫功能的影响和控制病原生物( 陆彤霞， 2 0 0 3 ；j i a n 等，2 0 0 3 ，2 0 0 4 ) ，有关中草药强化水产饵料后投喂水产动物幼苗的研究还很少。 生物包膜( b i o e n c a p s u l a t i o n ) 是用活饵( 轮虫和卤虫) 作药物传递载体米防治幼体的疾病 ( v e r p r a e t 等，1 9 9 2 ) 。m o h n e y 等( 1 9 9 0 ) 以卤虫无：协幼体羽i 线虫作为抗生素的载体，表明 这种操作可作为对虾幼体的给药方式。k a t h a r i o s 等( 2 0 0 5 ) 利用沙蚕( n e r e i sv i r e n s ) 卵作 水溶性土霉素的载体投喂鳎( s o l e as o l e a ) ，使土霉素在沙蚕卵和鱼体内富集，抑制了鳗弧菌 ( v i b r i oa n g u i l l a r u m ) 。同药浴相比，生物包膜更经济( 用药少) 、高效散失率和药残率低 对环境污染小。本实验的目的是用中草药强化褶皱臂尾轮虫( b r a c h i o n u s p l i c a t i l i s ) 和卤虫 ( a r t e m i as a l i n a ) ( s k l i r i s 等，1 9 9 8 ) 提高对虾幼体消化能力和存活力。 3 。1 材料和方法 3 1 1 实验对虾 实验于2 0 0 4 年4 - 6 月在辽宁省东港市国营种畜厂对虾育苗场进行。中国明对虾 ( f e n n e r o p e n a e u sc h i n e n s i s ) 无节幼体源自捕自山东省威海、w s s v 检测为阴性的健康亲虾 ( 7 5 4 - 1 0 9 ) 。实验水温2 0 0 4 - 0 5 ，盐度3 0 4 - l 。凡纳滨对虾( l i t o p e n a e u sv a n n a m e i ) 和日 本囊对虾( m a r s u p e n a e u s j a p o n i c u s ) 无节幼体分别取自海南省海南市水产研究所和辽宁省瓦 房店市骆驼村海兴养殖公司。实验水温3 0 0 0 5 ，盐度3 0 l 。三种对虾都在自然光照下 培育，实验期间中国明对虾分为四组，投喂四中饵料( 药i 强化、药i i 强化、配饵以及对 照组) ；凡纳滨对虾两组，投喂两种饲料( 药强化和对照组) ；日本囊对虾两组。投喂两种 2 1 主要养殖对虾幼体及仔虾酶活力与中肠形态结构的研究 饲料( 药i i 强化乖i 对照组) ( 表3 1 ) 。饵料密度以投饲3 0 r a i n 后，显微镜检查8 0 个体消化 管充盈为标准，一日三次。幼体放养密度按无节幼体计算( 2 s o i n d l 1 ) ，实验容器；f = j 容水 2 1 0 l 的圆柱形水桶。 3 1 2 中草药的制各及饵料强化 中草药强化液应用两种配方( 药i 配方：黄芪、鱼腥草等：药i i 配方：山楂、甘草等) ， 药物浓度为4 0 x1 0 6 ( 以中草药的干重计，即每l m 3 水体用l g 中药为l 1 0 ，) 。中草药煎 制仿吴光夭彩( 1 9 9 7 ) 的方法，药汁用滤纸过滤后放入含有轮虫和i 卤虫及一定密度浮游植物 的水体中，充气强化2 h 。晟后用筛绢网收获活饵料。 表3 1 三种对虾幼体及仔虾培育期间所用饵料 t a b 3 - 1f o o df o rf e e d i n gl a r v a la n dp o s t - l a r v a lp e n a e i d si nt h ee x p e r i m e n t 3 1 3 粗酶液制备 取样品2 0 5 0 m g ( 湿重) 加入5 m l 预冷双蒸水，在玻璃匀浆器中冰浴匀浆。匀浆液冷冻 离心( 2 ，1 0 0 0 0 9 ) 1 0 m i n ，取上消液做酶活力测定。 主要养殖对虾幼体及仔虾酶活力与中肠形态结构的研究 3 1 4 酶活力测定 3 1 4 1 胰蛋白酶活力的测定 胰蛋白酶活力的测定参照r i c k ( 1 9 7 4 ) 的方法：取酶粗提液0 2 m l ，1 m m o l n q p 甲 苯璜酰精氮酸甲酯( n o - p - t o l u e n e s u l p h o n y l a r g n i n em e t h y le s t e r ，t a m e ，s i g m a ) 底物o 3 m l ，0 0 5mt r i s h c i 缓冲液( 1 0m m o lc a c l 2 ，p h = 8 1 ) 2 5 m l ，2 5 孵浴，在2 4 7 n m 下记录 每m i n 吸光度增大值。用未加样品的测定值作为对照，以2 5 c 下，每m i n 释放lum o l 的硝 基苯胺作为一个酶活力单位。 3 1 4 2 糜蛋白酶活力的测定 糜蛋白酶活力的测定参照g e i g e r 1 9 8 3 ) 的方法：取酶粗提液o 6 m l ，以3 5 m m o l n 琥 珀酰- l 一丙氨酸一l 一脯氨酸l - 苯丙氨酸一硝酰基苯胺( n s u c c i n y l - l - a l a 2 - l p m - l - p h e - p n i t r o a n i l i d e ，s a p f n a ，s i g m a ) 底物o 1 m l ，0 0 5 mt r i s h c i 缓冲液( 1 0m m o lc a c l 2 ，p h = 8 1 ) 1 6m l ，2 5 c 孵浴- 4 0 5 n m 下记录每m i n 吸光度增大值。用来加样品的测定值作为对照，在 2 5 ( 2 下，每r a i n 释放1um o 的硝基苯胺为一个酶活力单位。 3 1 4 3 淀粉酶活力的测定 淀粉酶活力的测定参照b e r n f e l d ( 1 9 5 5 ) 的方法：取酶粗提液o 5 m l ，由0 0 2m 磷酸缓 冲液( p h 9 ) 配制成的l 淀粉底物缓冲溶液o 5 m l ，3 0 下孵育2 0m i n ，加入2 的3 ， 5 - 二硝基水杨酸显色剂1 0 m l 显色，沸水浴5 m i n 流水冷却，加1 0m l 蒸馏水稀释，在5 4 0 n m 处比色测定麦芽糖的生成量。用未加样品的测定值作为对照，以3 0 ( 3 下，每m i n 释放1u m o l 麦芽糖为一个酶活力单位。 以上三种酶活力均以比活力单位表示即每m g 蛋白质所显示的活力。 3 1 4 4 蛋白质浓度的测定 酶液的蛋白质浓度依l o w r y ( 1 9 5 1 ) 的方法测定。以牛血清白蛋白作为标准。 3 1 5 存活率及干重的测定 各发育期中，待8 0 个体变态后取样定量计算存活率。取各期幼体及仔虾若干只，先 用蒸馏水冲洗后，滤纸吸干后用铝箔纸包裹6 0 烘干2 4 h 后，用s a r t o r i u s - b p 2 11 d ( 0 0 1 m g ) 电子天平称重，计算单只幼体重量和水分含量。 主要养殖对虾幼体及仔虾酶活力与中肠形态结构的研究 3 1 6 数据的统计分析 实验数据蜊s p s s i o 0 软1 ，| = 进行单因素方差分析，p h11 瓣姆悼 主要养殖对虾幼体及仔虾酶活力与中肠形态结构的研究 瓣 蜒 性 l20 r 10 0 8 0 6 0 4 0 20 0 n 6z lz 2z3m 1m 2m3pl l 对照 药i i 幽3 - 2 中草药生物包膜的凡纳滨对虾幼体及仔虾存活率 f i g 3 - 2s u r v i v a lo fl a r v a la n dp o s t l a r v a ll i t o p e n a e u sv a n n a m e i , f e e d i n go i ll i v e f e e d sc o n t a i n i n gt r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e n 6 z lz 2 z 3 m 1m 2m 3p l l 对照 瓣药i i 药i i i 配饵 图3 - 3 中草药生物包膜的中国明对虾幼体及仔虾干重 f i g 3 - 3d r yw e i g h to fl a r v a la n dp o s t l a r v a lf e n n e r o p e n a e u sc h i n e n s i s ，f e e d i n go n l i v ef e e d sc o n t a i n i n gt r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e 8 0 r + 对照 + 药i i n 6z 1 z 2 z 3m lm 2m 3p l l 图3 - 4 中草药生物包膜的凡纳滨对虾幼体及仔虾干重 f i g 3 - 4d r yw e i g h to f l a r v a la n dp o s t l a r v a ll i t o p e n a e u sv a n n a m e i f e e d i n go nl i v e f e e d sc o n t a i n i n gt r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e j 麓翳纛溪蠹；i 翼_一蒸篓一罄一楚鲢盘区 一 一 ；上l_o一；毫 加善：鲫加如o如 d日c_!t1一槲土 一 加如如0 言，pu_tiv阃嚣 主要养殖对虾幼体及仔虾酶活力与中肠形态结构的研究 3 2 2 中草药生物包膜对对虾幼体消化酶的影响 中草药生物包膜的中国明对虾胰蛋白酶的活力和对照组无显著差异，仅z ，期药i 组显 著低于其余组( p o 0 5 ) ，m 期配饵组高于其余组( i 鳘 3 - 5 ) 。药i i 包膜的日本囊对虾z 2 、 z 3 期胰蛋白酶活性均显著高于对照( p o 0 5 ) ，而在m i 期则显著低予对照( 圈3 - 6 ) 。中草 药处理组和对照组的凡纳滨对虾无显著差异，仅m l 期的胰蛋白酶低于对照( 图3 - 7 ) 。 中草药处理组，中国明对虾的糜蛋白酶的活性与对照组无明显差异，仅z 3 期药i 显著 高于其它组( p 一pu时uhoq r 姆羞 主要养殖对虾幼体及仔虾酶活力与中肠形态结构的研究 r 燠 丑 o 0 3 5 o 0 3 0 0 2 5 o 0 2 o 0 1 5 o 0 1 o 0 0 5 o如 口对照 囹药i i n 6z 1z 2z 3 m 1m 2 m 3p l l 图3 1 0 中草药生物包膜的凡纳滨对虾幼体及仔虾糜蛋白酶活力 f i g 3 1 0c h y m o t r y p s i na c t i v i t yo fl a r v a la n dp o s t l a r v a ll i t o p e n a e u sv a n n a m e i ，f e e d i n g 0 nl i v ef e e d sc o n t a i n i n gt r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e 3 3 讨论 3 3 1 中草药生物包膜的制备问题 在中草药生物包膜的研究中。大多采用将药物与鱼油混合，生物饵料( 轮虫、卤虫) 摄 食油滴而达到药物导入。利用卤虫作为载体的药物多为j j 旨溶性( g a p a s i n 等。1 9 9 6 ) 。k a t h a r i o s 等( 2 0 0 5 ) 利用沙蚕( n e r e i sv i r e n s ) 卵作水溶性土霉素的载体投喂鳎( s o l e as o l e a ) ，沙蚕 卵和鱼体都富集了较高的土霉素。可见浸泡可使水溶性药物导入生物载体，而达到药效。本 实验中草药生物包膜制各采用药汁浸泡生物饵料的方法，主要是考虑中药的制各一直以水为 介质，中药的有效成分大多为水溶性。但是，目前仍无法检测中草药在生物载体中的富集程 度，因此有关中草药的制备及导入后药物富集浓度的评价还需进一步研究。 3 3 2 中草药生物包膜在对虾幼体及仔虾生长和存活率作用 本实验中药i 配方：黄芪、鱼腥草等：药i i 配方：山楂、甘草等。研究表明，黄芪具有 免疫调节和对抗不利环境等功能( 周显青等，2 0 0 3 ) ；山楂含有机酸及黄酮类化合物，具有 多方面药理作用，如对心血管系统的降压降脂作用、抗癌、助消化等( 方阅等，1 9 9 8 ) 。鱼 腥草挥发油中的主要活性成分有鱼腥草索( 即癸酰乙醛) 、甲基正壬酮等其水溶性成分有芦 丁、绿原酸等，其中癸酰乙醛为主要活性成分具有较强的抗菌、抗病毒作用。实验结果表 明药i 配方对中国明对虾的生长存活好像都有抑制作用，原因无法解释。而药i i 配方在中国 明对虾和凡纳滨对虾的幼体和仔虾确实有促进生长作用。并且据作者观察，在凡纳滨对虾 z 3 向m l 变态过程曾经出现幼体中的畸形现象，但是经药i i 强化的实验组则很少见畸形个体， hp-tpo羽o-h_【o臣 主耍养殖对虾幼体及仔虾酶活力与中肠形态结构的研究 推测可能是由于药剂中某些化学成分将幼体体内的重金属的络合的缘故。c h a i r 等( 1 9 9 6 ) 用卤虫( a r t e m i af r a n c 括c a n a ) 作为甲氧苄氨嘧啶、磺胺甲唑等药物的载体米投喂鱼虾，检 验几种药物在鱼虾体内富集情况，发现在凡纳滨对虾体内药物浓度大约是欧洲鲈 ( d i c e n t r a r c h u sl a b r a x ) 8 - 1 3 倍。可能通过生物包膜作用有效成分在虾体内的富集比鱼类作 用更加明显，将米可能会成为解决对虾的可持续性发展的手段之一。 3 3 3 中草药生物包膜在对虾幼体及仔虾消化酶方面的作用 有关对虾幼体及仔虾发育过程中消化酶活性的变化有学者解释可能受基因遗传调控但 也有学者认为食物可能会诱导这些酶发生变化( l o v e t t 和f e l d e r ，1 9 9 0 ) 。由于中草药的组 成成分十分复杂因此当中可能有些成分对消化酶的促进作用。本实验发现一般z 3 m l 的变态 过程中中草药的包膜处理纽和对照组有显著差异，可能是由于这段期间幼体的酶组成有变 化。这同l e m o s 等( 1 9 9 9 ，2 0 0 2 ) 对南方滨对虾( l i t o p e n a e u ss c h m i t t i ) 和圣保罗美对虾 ( f a r f a n t e p e n a e u sp a u l e n s i s ) 的研究发现在个体发育阶段消化性蛋白酶的高峰多处于z 3 阶 段，并且酶的组成有所变化相一致。 主要养殖对虾幼体及仔虾酶活力与中肠形态结构的研究 第四章凡纳滨对虾( l i t o p e n a e u sv a n n a m e i ) 幼虾中 肠腺组织学和超微结构的研究 中肠腺是甲壳动物重要的消化器官。它合成、分泌消化酶。促进营养物质的吸收，影响 排泄、蜕皮周期、无机物质的贮藏、脂类及糖类代谢：它还可作为某些动物健康状况的重要 指标( v o 昏等，1 9 9 2 ) 。过去曾一度认为，十足目动物的消化液分泌仅限于中肠腺，但近年 来从组织学及超微结构证实中肠存在分泌和吸收细胞( d a l l 等，1 9 8 3 ；刘晓云等，2 0 0 4 ) 。 因此，中肠在对虾消化系统中也起着重要作用。国内外许多学者从组织、细胞及分子水平对 对虾的中肠及中肠腺进行了详细地研究( 陈宽智等，1 9 8 8 ：邹国祥等，1 9 9 3 ；刘晓云和姜明， 1 9 9 7 ；张志峰等，2 0 0 0 ；姜永华等，2 0 0 3 ；刘晓云等，2 0 0 4 ；v o g 等，1 9 8 5 ；a i m o h a n n a 等。1 9 8 7 ； c a c e c i 等，1 9 8 8 ；t o u l l e c 等，1 9 9 2 ；l e h n e r t 和j o h d s o d 。2 0 0 2 ) 。凡纳滨对虾( l i t o p e n a e u s v a n n a m e i ) 生长迅速，出肉率高，耐低盐抗病力强，自1 9 8 8 年引进以来，在我国大面积 推广。但是有关南美白对虾消化生理的研究很少有关幼虾中肠腺组织及超微结构更少见 报道。本文观察了凡纳滨对虾幼虾中肠腺的组织学，用酶联免疫吸附反应( e l i s a ) 法对消 化酶进行原位显示，以期丰富对虾营养及消化生理学基础理论。 4 1 材料和方法 4 1 1 生物样品 凡纳滨对虾仔虾取自辽宁省盘锦市每日集团养殖场的健康个体，体长4 5 5 0i t l m ，实 验室暂养于4 5 l 的圆形塑料桶内，每桶放入5 0 尾。实验用水为砂滤海水( 2 5 1 ) ，初期 投喂卤虫幼体，中期开始投喂水丝蚓( l i m n o d r i l u ss p ) 至体长3 - 4 c m 的幼虾。 4 1 2 石蜡切片制各 将幼虾中肠腺固定于b o u i n s 液中，酒精系列脱水，常规石蜡定向包埋，l e i c a r m 2 1 3 5 切片机切片，厚度为6 - 8um ，h e 染色，o l y m p u s 显微镜观察、拍照。 4 1 3 冷冻切片及组化样品制备 取幼虾中肠腺用t i s s u e t e k 包埋，l e i c a c m l 9 0 0 冷冻切片机切片，厚度为4 - 8um ，酒 精系列脱水，h e 染色，二甲苯透明封片观察。 主要养殖对虾幼体及仔虾酶活力与中肠形态结构的研究 组化样品制备：冰片放置室温3 0 r a i n 后，入4 冷丙酮1 0 r a i n 。用o 1 m 磷酸缓冲液( p b s ) 每隔5 m i n 清洗共三次。3 h 2 0 2 孵育1 0 r a i n ( 消除内源性过氧化物酶活性) ，o i mp b s 每隔 5 m i n 清洗共两次。5 - 1 0 正常山羊血清封闭，室温孵育1 0 m i n ，倾去血清勿洗，滴加一抗 ( 人胰蛋白酶抗兔抗体) 4 c 过夜，次日将玻片放置室温1 h ，吹千加二抗( 辣根氧化酶) ， 孵育3 0 r a i n ，o 1 mp b s 每隔5 r a i n 清洗共三次，吹干，加入d a b ( 3 ，3 - 2 氨基联苯胺) 染色， 显微镜下染色，待置浅黄色时水洗，放入苏术精中复染3 0s e c 左右，观察结果，阳性为浅黄， 阴性为蓝色。阴性对照为不加一抗，其余步骤同上。 4 1 4 扫描电镜样品制备 先用新鲜海水冲净虾体表面。用剪刀剪开头胸甲，将中肠腺暴露，然后用0 i m 磷酸盐 缓冲液( p b s ) 冲净中肠腺表面，再用3 戊二醛( p h = 7 。2 ) 进行原位固定3 0 r a i n ，整个过 程在低温下进行。最后将中肠腺小心剪下置于3 戊二醛中常温固定2 b 。固定后的样品需用 0 i mp b s 清洗3 次，后用l 锇酸双l 司定，叔丁醇逐级脱水置于2 0 冰箱中观察至结晶 后将样品于干燥器中抽真空干燥。干燥后的样品粘在附有双面胶带纸的样品台上。使用 j f c 一1 1 0 0 离子溅射仪。对样品进行金属镀膜，j e m 1 2 0 0 e x 型电子显微镜观察、拍照。 4 1 5 透射电镜样品制备 样品取样和固定同扫描电镜样品，赂有不同的是乙醇逐级脱水，后用醋酸双氧铀进行块 染，4 中过夜，然后继续用乙醇逐级脱水至9 0 丙酮，9 5 丙酮，1 0 0 丙酮四次，e p o n8 1 2 树脂包埋，半薄切片，观察及定位，进行醋酸钳染色。j e m 1 2 0 0 e x 型电子显微镜观察、拍 照。 4 2 结果 4 2 1 扫描电镜观察 观察表明，凡纳滨对虾幼虾中肠腺由有盲端的分支小管组成。这些小管再汇成次级分泌 管，最后次级分泌管汇成初级分泌管( 图4 1 ) 。分支小管具环形凹陷形成的褶皱( 图4 2 ) 。 这些凹陷之间距离约2 0um 左右，此结构为首次报道，分支小管直径7 0um 左右，内壁较 光滑( 图4 3 ) 。 主要养殖对虾幼体及仔虾酶活力与中肠形态结构的研究 4 2 2 组织学观察 显微镜观察发现，中肠腺为复管状腺体，由多级分支的小管组成，结缔组织中富含血窦， 其中胃的后部包裹于其中( 图4 - 4 ，幽4 - 5 ) 。肝小管管壁由单层细胞构成，管腔呈五角或四角 星形。根据细胞形态结构，可将其分为4 种类型：吸收细胞、分泌细胞、纤维细胞和胚细胞 这四种细胞均具有纹状缘( 图4 6 ) 。中肠腺中吸收细胞( r 细胞) 的数量最多，高柱状，核圆形， 基