（农药学专业论文）天然海鱼共附生细菌抗tmv菌株的分离、筛选及鉴定.pdf

d i s s e r t a t i o nf o rm a s t e rd e g r e eo ff u j i a na g r i c u l t u r ea n df o r e s t r yu n i v e r s i t y s t u d i e so ni s o l a t i o n ，s c r e e n i n g ，i d e n t i f i c a t i o no f s y m b i o t i ca n de p i p h y t eb a c t e r i aw i t ha n t i t m v f r o mm a r i n ef i s h d i s c i p l i n e ：a g r i c u l t u r a ls c i e n c e f i r s t l e v e ld i s c i p l i n e ：p l a n tp r o t e c t i o n s e c o n d - l e v e l d i s c i p l i n e ：p e s t i c i d es c i e n c e r e s e a r c hf i e l d ：b i o l o g i c a lp e s t i c i d ea n db i o n i cp e s t i c i d e i o s t g r a d u a t e ：w e n b i nz h a n g s u p e r v i s o r ：p r o f m i n g - a no u y a n g s u b m i t t e dd a t e ：a p r , 2 0 10 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：磁交宾 日期： 2 , o l 口多，7 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 口 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：戮文驻日期：幻，阢多t7 7 指导教师亲笔签名：萨乞幻m日期咖夕引7 福建农林大学2 0 1 0 届硕士学位论文天然海鱼共附生细菌抗t m v 菌株的分离、筛选及鉴定 目录 摘要i a b s t r a c t l i 1 。前言1 日 看l 1 1 烟草花叶病毒的研究状况l 1 2 烟草花叶病毒的防治1 1 2 1 植物源活性物质防治t m v 1 1 2 2 微牛物源活性物质防治t m v 2 1 2 3 化学合成活性物质防治t m v 4 1 3 海洋细菌次级代谢产物研究5 1 3 1 海洋细菌次级代谢产物的抑菌作用5 1 3 2 海洋细菌次级代谢产物的杀虫作用k 6 1 3 3 海洋细菌次级代谢产物的抗肿瘤作用6 1 4 海洋细菌的分子鉴定方法7 1 4 1 核酸杂交技术8 1 4 216 sr r n a 序列分析8 1 4 3r f l p 9 1 4 4 r a p d 9 1 4 5 低分子量r n a 分布图。9 1 5 本研究的目的和意义。1 0 2 材料与方法1 2 2 1 实验材料12 2 1 1 抗t m v 供试寄主、供试毒源1 2 2 1 2 实验仪器与试剂1 2 2 2 海洋细菌的分离与筛选13 2 2 1 样品的采集l3 2 2 2 海洋鱼类共附生细菌的分离1 3 2 3 菌株的发酵与次级代谢产物粗提物的制备一1 4 2 3 1菌株发酵液的制备1 4 2 3 2 菌株次级代谢产物粗提物的制备1 4 2 4 海洋鱼类共附牛细菌活性菌株筛选一1 4 2 4 1抗t m v 增殖活性测定1 4 2 4 2 抗t m v 侵染活性测定l5 2 5 活性海洋细菌的形态鉴定和分子鉴定1 5 2 5 1 活性海洋细菌的复红染色鉴定1 5 2 5 2 细菌1 6 sr d n a 序列测定及菌株间的聚类分析1 5 3 结果与分析。2 0 3 1 海洋鱼类共附生细菌的分离：2 0 3 1 1 海洋鱼类共附生细菌的分离2 0 3 1 2 培养基的选择2 2 福建农林大学2 0 1 0 届硕士学位论文天然海鱼共附生细菌抗t m v 菌株的分离、筛选及鉴定 3 1 3t m v 浓度标准曲线。2 2 3 1 4 抗t m v 增值活性的测定2 3 3 1 5 抗t m v 侵染活性的测定3 0 3 2 抗t m v 活性菌株的分类鉴定3 6 3 2 1 复红染色鉴定3 6 3 2 2 活性菌株1 6 sr d n a 序列鉴定3 8 4 讨论4 7 4 1 天然海鱼共附生细菌的分离4 7 4 2 抗t m v 活性菌株的筛选4 7 4 3 活性菌株的分子鉴定4 8 5 结论4 9 参考文献5 0 附录l缩略词及英汉对照5 6 附录2 常用试剂及溶液的配制5 7 附录3p m d l 8 t 克隆载体图谱及克隆位点5 9 至定谢6 0 福建农林大学2 0 1 0 届硕士学位论文天然海鱼共附生细菌抗t m v 菌株的分离、筛选及鉴定 。摘要 从福建平潭潮间带周边海域采集7 种海鱼共1 0 份，选择了6 种分离培养 基，共获得海洋鱼类共附生细菌1 1 9 株，将其中的9 1 株海洋细菌液体发酵后， 通过叶碟法进行海洋细菌发酵液抑制烟草花叶病毒( t o b a c c om o s a i cv i r u s ， t m v ) 增殖活性的筛选。结果表明，有3 6 株海洋细菌的发酵液对t m v 增殖 的抑制率超过6 0 。将这3 6 株海洋细菌发酵液制成粗提物，在lm g m l 的供 试浓度下，有8 株海洋细菌抑制t m v 增殖的抑制率超过6 0 ，又分别测定这 8 株海洋细菌粗提物在0 5m g m l 和0 2 5m g m l 抑制t m v 增殖的抑制率，其 中有3 株海洋细菌在0 5m g m l 时抑制率超过5 0 ，特别是菌株0 1 6 7 b 和菌株 0110 b 在0 5m g m l 时抑制率分别达到6 6 。81 和5 8 8 7 ，在o 2 5m g m l 时抑 制率分别达到4 8 1 8 和3 9 1 9 。 将上述3 6 株活性菌株粗提物在lm g m l 的供试浓度下，抑制率大于5 0 的1 4 株菌株液体发酵，发酵液用无菌蒸馏水稀释l o 倍后，利用半叶法测定其 抑制t m v 侵染的活性，每株菌重复5 次j 结果表明，这1 4 株海洋细菌的发酵 液平均抑制率都在9 8 以上，大多数抑制率都是1 0 0 。 对5 株活性菌株进行了形态鉴定，并对其1 6 sr d n a 序列进行了菌株间聚 类分析。结果表明，菌株0 11 0 b 的1 6 sr d n a 序列与b a c i l l u s p u m i l u s ( e u 8 8 0 5 2 9 ) 的1 6 sr d n a 序列同源性高达1 0 0 ，可鉴定为b a c i l l u s p u m i l u s ，菌株0 11 1 b 的 1 6 sr d n a 序列与s e r r a t i a m a r c e s c e n s ( a b 0 6 1 6 8 5 ) 的1 6 sr d n a 序列同源性高达 1 0 0 ，可鉴定为s e r r a t i am a r c e s c e n s ，菌株0 1 3 4 b 的1 6 sr d n a 序列与b a c i l l u s s u b t i l i s ( e u 2 2 1 3 4 5 ) 的1 6 sr d n a 序列同源性高达1 0 0 ，可鉴定为b a c i l l u s s u b t i l i s ，菌株0 1 6 5 b 的1 6 sr d n a 序列与b r e v i b a c t e r i u ml i n e n s ( e u 6 6 0 3 7 2 ) 的 1 6 sr d n a 序列同源性高达1 0 0 ，可鉴定为b r e v i b a c t e r i u ml i n e n s ，菌株0 1 6 7 b 的1 6 sr d n a 序列与a r t h r o b a c t e r s p ( e u 2 3 1 6 0 6 ) 的1 6 sr d n a 序列同源性高达 1 0 0 ，可鉴定为a r t h r o b a c t e rs p 。 关键词：海洋鱼类，海洋细菌，烟草花叶病毒，菌种鉴定，抑制率，发酵 福建农林大学2 0 1 0 届硕士学位论文天然海鱼共附生细菌抗t m v 菌株的分离、筛选及鉴定 a b s t r a c t 10s a m p l e so fs e v e nm a r i n ef i s hw e r ec o l l e c t e df r o mp i n g t a ns e aa r e ai nf u j i a n p r o v i e n c e 6d i f f e r e n tm e d i aw e r eu s e da si s o l a t i o nm e d i a at o t a lo f119s y m b i o t i c a n de p i p h y t yb a c t e r i ao f m a r i n ef i s hw e r ei s o l a t e d t h ef e r m e n t a t i o nb r o t ho f t h e9 1 m a r i n eb a c t e r i aw e r eu s e dt od e t e r m i n et h e i ri n h i b i t o r ya c t i v i t i e sa n t i t m v r e p l i c a t i o nb yl e a f - d i s km e t h o d s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tat o t a lo f3 6m a r i n e b a c t e r i aw e r ea b l et oi n h i b i tt h er e p l i c a t i o no ft m vw i t ht h ei n h i b i t i o nr a t eo v e r 6 0 t h ec r u d ee x t r a c t so ft h ef e r m e n t a t i o nb r o t hw e r ea c q u i r e da n du s e df o r f u r t h e rs c r e e n i n gt e s tf o rt h e3 6m a r i n eb a c t e r i a t h e8m a r i n eb a c t e r i a sc r u d e e x t r a c t sa tac o n c e n t r a t i o no f1m g m li n h i b i t e dt h et m v r e p l i c a t i o nw i t ht h e i n h i b i t i o nr a t eo v e r6 0 t h ei n h i b i t i o nr a t eo ft h e8m a r i n eb a c t e r i a sc r u d e e x t r a c t sa tt h ec o n c e n t r a t i o no f0 5 m g m la n do 2 5m g m lw e r et e s t e d ， r e s p e c t i v e l y t h ei n h i b i t i o nr a t eo ft h e3m a r i n eb a c t e r i a sc r u d ee x t r a c t si nt h e8 m a r i n eb a c t e r i aw e r eo v e r5 0 a tt h ec o n c e n t r a t i o no f0 5m g m l ，e s p e c i a l l yt h e c r u d ee x t r a c t so ft h et w ob a t e r i a ：016 7 ba n d0110 b ，s h o w e dh i g hi n h i b i t i o nr a t e i t w a s6 6 81 a n d5 8 8 7 a tt h ec o n c e n t r a t i o no f0 5m g m l ，4 8 18 a n d3 9 19 a t t h ec o n c e n t r a t i o no fo 2 5m g m l ，r e s p e c t i v e l y a st ot h e3 6a c t i v es t r a i n sd e s c r i b e da b o v ew h o s ec r u d ee x t r a c t sw e r eu s e dt o t e s tt h e i ri n h i b i t i o nr a t ea n t i - t m v r e p l i c a t i o na tt h ec o n c e n t r a t i o no f1m g m l ，t h e 14o fw h i c hs h o w e dt h ei n h i b i t i o nr a t eh i g h e rt h a n5 0 t h e14s t r a i n sw e r e c u l t r u r e dw i t hl i q u i dm e d i u ms u b s e q u e n t l y , t h ef e r m e n t a t i o nb r o t hw e r ed i l u t e dt o 10 一f o l d ，a n dt h e nt h ed i l u t i o nw e r eu s e dt oe x a m i n et h e i ri n h i b i t o r ya c t i v i t i e s a n t i - t m vi n f e c t i o nb yh a l f - l e a v em e t h o d e a c hs t r a i n si n h i b i t i o nr a t ew a st e s t e d5 t i m e s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h em e a ni n h i b i t i o nr a t eo fa l lt h e14s t r a i n sw a s h i g h e rt h a n9 8 ，m o s to ft h e14s t a i n s ，i n h i b i t i o nr a t ea n t i t m vi n f e c t i o nw e r e 1 0 0 f i v ea c t i v es t r a i n sw e r ei d e n t i f i e db ym o r p h o l o g yc h a r a c t e r i z a t i o n t h ec l u s t e r a n a l y s i sb e t w e e ni d e n t i f i e db a c t e r i aa n do t h e rb a c t e r i af r o mg e n b a n kw e r ed e d u c e d f r o ms e q u e n c e so fl6 sr d n a t h er e s u l t ss h o w e dt h a t0l io bw a si d e n t i f i e da s b a c i l l u sp u m i l u s ，011ibw a si d e n t i f i e da ss e r r a t i a m a r c e s c e n s ，0 13 4 bw a s i i 福建农林大学2 0 1 0 届硕士学位论文天然海鱼共附生细菌抗t m v 菌株的分离、筛选及鉴定 i d e n t i f i e d 硒b a c i l l u ss u b t i l i s ，016 5 bw a si d e n t i f i e d 嬲b r e v i b a c t e r i u ml i n e n s ， 016 7 bw a si d e n t i f i e da sa r t h r o b a c t e rs p k e yw o r d s ：m a r i n ef i s h ，m a r i n eb a c t e r i a , t m v , s t r a i ni d e n t i f i c a t i o n ，i n h i b i t i o nr a t e ， f e r m e n t a t i o n i i i 福建农林大学2 0 1 0 届硕士学位论文天然海鱼共附生细菌抗t m v 菌株的分离、筛选及鉴定 l 前言 1 1 烟草花叶病毒的研究状况 烟草花叶病毒( t m v ) 是烟草花叶病毒属的代表成员，其寄主范围很广泛，可 危害十字花科、茄科、豆科、葫芦科等3 3 个科的2 0 0 余种作物【1 1 。它是一种系 统侵染性病害，在田间发生后危害严重，据统计，全球每年仅烟草花叶病毒一项 危害就造成l 亿多美元的损失【2 1 。由于烟草种植面积的扩大，农作物布局的改变 以及蔬菜等经济作物的发展，增加了病毒毒源和传播介体的数量，增加了病毒的 侵染和危害，使其危害性呈逐年上升的趋势，给烟叶产量和质量造成巨大的损失， 成为烟草生产的主要限制因子。因此，寻找防治t m v 的方法迫在眉捷【3 】。 对烟草花叶病毒的防治可以追溯到2 0 世纪初，1 9 1 4 年a l l a r d 发现t m v 侵染 商陆( p h y t o l a c c a ) 后，不能用它的汁液摩擦接种到烟叶上【4 1 。d u g g e r1 9 2 5 年发现 商陆中有一种抗病毒物质，该物质虽无一般的杀菌作用，但若用其来处理t m v ， 就能使其失去对非商陆寄主的侵染力，由此引起了对病毒浸染活性抑制的一系列 研究，并把植物病毒病控制引向了药剂调控的轨道。 目前，对烟草花叶病毒的防治研究主要集中在合成化合物、植物源及微生物 源抗病毒剂的筛选与利用上。现用抗植物病毒剂的防治效果和安全性还不理想， 远远不能满足农业的需求，及需开发新型抗病毒制剂，而高效、高活性的生物源 抗病毒剂是实现产业化生物防治的关键。对我国来说，微生物来源的生物化学农 药是生物农药发展的丰题【5 。 1 2 烟草花叶病毒的防治 1 2 1 植物源活性物质防治t m v 姚宇澄嘲等从朴子草地上部分醇浸粗提物中分离到得菲并吲哚里西定生物 碱，对烟草花叶病毒有高抑制活性。陈宁等【9 】从灰树花子实体中分离到了一种具 有抑制烟草花叶病毒侵染活性的热稳定蛋白g f a p 。经鉴定，该蛋白含有两个分 子质量分别为3 4k d 和4 0k d 的亚基，沈建国等【1 0 】对我国7 8 科1 6 2 种药用植物 提取物进行了抗t m v 侵染和增殖作用测定，发现大多数药用植物提取物具有一 定抗t m v 侵染活性，仅少数药用植物提取物有较好的抗t m v 增殖作用。在1 0 m g m l 水平下，1 9 种植物提取物可有效抑制t m v 侵染，9 种植物提取物有明显 福建农林大学2 0 1 0 届硕士学位论文天然海鱼共附生细菌抗t l v i v 菌株的分离、筛选及鉴定 抑制t m v 增殖作用。王海鹏等【ll 】研究了以齿苋( p o r t u l a c ao l e r a c e a 三) 、板兰根 ( i s a t i sl n d i g o t i af o r t ) 、甘草( g l y c y r r h i z au r a l e r s i sf i s c h ) 等3 种植物粗提物为主 要成分的植物源农药v f b 的抗病毒活性，结果表明v f b 对烟草花叶病毒( t m v ) 具有明显的体外钝化作用。翟梅枝等【1 2 】的研究发现，核桃青皮和叶乙醇提取物对 烟草花叶病毒具有明显的抑制作用，且抑制率最高可达8 8 9 7 。蔡建华等【1 3 】从豆 科植物豆薯( p a c h y r r h i z u se r o s u s , l e g u m i n o s a e ) 的种子中分离纯化了一种具有抗 t m v 的蛋白质，分子量约为1 5k d 。陈启建等【1 4 】从金鸡菊根中分离获得抗病毒活 性物质1 苯基1 ，3 ，5 三庚炔，该化合物对t m v 表现出较好的体外抑制侵染和 增值活性，且经荧光定量p c r 测定结果表明，该化合物对t m v 外壳蛋白基因的 表达有明显的抑制作用。 1 2 2 微生物源活性物质防治t m v 1 2 2 1 细菌源活性物质防治t m v 早在1 9 2 6 年m u l v a n i a 就发现被细菌污染的植物病毒榨出液很快丧失侵染 力。后来发现软腐细菌( p e c t o b a c t e r i u mc a r o t o v o r a ) 、玉米枯萎杆菌( p a n t o e a s t e w a r t i o 、枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、产气杆菌“e r o b a c t e ra e r o g e n s ) 的代谢 产物经无水乙醇或丙酮抽提后，具有抑制和钝化t m v 的能力1 5 1 张成省等【1 叼发 现枯草芽孢杆菌t p b 5 5 菌悬液对t m v 具有较好的钝化、预防和治疗效果，不论 在烟株接种t m v 前或后，用t p b 5 5 菌液处理烟株的叶片与只接种病毒烟株相比， 叶片内过氧化物酶( p o d ) 、多酚氧化酶( p p o ) 、苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 活性均 显著提高，以接毒前t p b 5 5 菌液处理的烟株活性水平最高。从本试验结果来看， t p b 5 5 具较强的抗t m v 活性，可通过直接接触钝化作用及诱导烟草抗病性来抑 制t m v 侵染。申莉莉等【1 7 】从烟田耕层土壤分离获得对t m v 有拮抗作用的菌株 b y 3 3 和b y 8 8 。其无菌发酵液对t m v 的体外钝化作用分别为8 1 8 1 和8 3 2 9 ， 涂抹菌液2 4h 后接种，仍有7 3 0 1 和6 6 9 8 的防效，硫酸铵沉淀获得的活性粗 蛋白对t m v 体外钝化作用分别为8 5 3 5 和8 7 4 7 ，进一步研究表明，抗病毒 活性物质为蛋白类物质，电镜下观察到活性蛋白能打破t m v 粒体的规则排列， 与t m v 粒子不可逆的结合，从而降低侵染力，有抑制t m v 在烟株体内复制的 作用。吴惠惠等【1 8 】获得了对t m v 有很强抑制活性的j u 抗细菌菌株c z ，其发酵 液的抑制率可达到9 6 7 3 ，并初步确定活性物质为蛋白类物质。 2 福建农林大学2 0 1 0 届硕士学位论文天然海鱼共附生细菌抗 r m v 菌株的分离、筛选及鉴定 1 2 2 2真菌源活性物质防治t m v 2 0 世纪6 0 年代就有报道说食用菌的浸提物或深层发酵液有抗植物病毒活 性，孙慧掣1 9 】曾报道过几种食用菌蛋白对烟草花叶病毒的抑制效果，认为食用 菌中的蛋白质具有抑制烟草花叶病毒侵染的作用。马学萍【2 0 】等发现7 种食用菌包 括蘑菇( a g a r i c n sc a m e s t r i s f r ) 、香菇 l e n t i n ue d o d e s ( b e r l q s i n g 、平菇 ( p l u r i b u s ) 、茶树菇 a g r o c y b ea e g e r i t a ( b e r k ) s i n g 、鸡腿菇( c o p r i n u sc o m a t t t s ) 、 真姬菇( h y p s i z y g u sm a r m o tr e u s ) 及金针菇( f l a m m u l i n av e l u t i p e s ) 乙醇提取物水溶 液都具有钝化及抑制t m v 侵染的作用，该研究证明了香菇的预防效果最好，达 到8 2 0 。吴丽萍等【2 l 】从新鲜食用菌毛头鬼伞( c o p r i n u sc o m a t u s ) 子实体中分离 纯化出一碱性蛋白y 3 ，经活性检测结果显示：当其浓度为l2 5 t g m l 时，对t m v 在心叶烟枯斑寄主上的侵染抑制率达8 3 o 。付鸣佳等【2 2 】从金针菇中获得具有抗 烟草花叶病毒活性的蛋白z b ，经s d s p a g e 确定该蛋白相对分子质量为3 0k d 。 k o b a y a s h i 2 3 1 从香菇子实体中获得一个约1 9 9 个氨基酸残基组成的蛋白香菇菌素 ( f r u i t i n gb o d yp r o t e i n ，f b p ) ，可强烈抑制无细胞系统生物的蛋白质合成，其对 t m v 的抑制浓渡为6 3i _ t g m l ，还可用于防治番茄病毒病。沈硕等阱】发现两株海 洋真菌0 31 2 f 1 和1 0 0 8 f l 发酵液的提取物能够抑制烟草花叶病毒的活性。经分子 鉴定结果显示，该两株真菌分别与( p e n i c i l l i u mo x a l i c u m ) 和( n e o s a r t o r y a f i s c h e r i ) 的同源性极高。 1 2 2 3 放线菌源活性物质防治t m v 宁南霉素( n i n g n a n m y c i n ) 是从诺尔斯链霉菌西昌变种( s t r e p t o m y c e s n o u r s e i - v a r x i c h a n g e n s i s ) 发酵液中分离出的一种农用抗生素，它是一种胞嘧啶核 苷肽，对多种植物病毒病有特效，具有广谱、高效、低毒和低残留的特点【2 5 1 。大 量的研究表明宁南霉素对t m v 具有很好的预防与治疗作用，且使用浓度以 1 5 0 2 0 0l a l m l 为宜【2 6 1 。嘧肽霉素是新报道的由土壤中分离筛选出的不吸水链霉 ，菌辽宁变种( s t r e p t o m y c e sa c h y g r o s c p i c u sv a t 1 i a o n i n g g e n s i s ) 产生的其有效成分是 胞嘧啶核苷肽类化合物该物质的抗病毒机理是通过抑制病毒核酸的复制和外壳 蛋白的合成来达到预防病毒病的目的，所以该药剂既能体外钝化病毒又能在植物 体内抑制病毒的增殖【2 7 彩】，放线菌产生的放线菌素d 能够与病毒模板d n a 中的 鸟嘌呤基团结合而阻止病毒r n a 的转录。福米诺卡氏菌( n o c a r d i a f o r m i c a ) 产生 福建农林大学2 0 1 0 届硕士学位论文天然海鱼共附生细菌抗t m v 菌株的分离、筛选及鉴定 的福米诺卡霉素( n o f o r m y c i n ) 可抑制t m v 的增殖。淡灰链霉菌( s 1 a v e n d u l a e ) 产 生的全霉素( h o l o m y c i n ) 对t m v 具有防治作用。陈力力【3 0 】等从神农架国家自然保 护区土样中分离筛选到l 株抗烟草花叶病毒的放线菌h n s 2 2 。该菌株为链霉菌 属中的草绿色链霉菌( s t r e p t o m y c e sh e r b a r i c o l o r ) 。将h n s 2 2 菌株培养滤液与 烟草花叶病毒混合后接种在枯斑寄主曼陀罗和系统侵染寄主普通烟k 上，对两 寄主的枯斑抑制率分别为9 2 6 2 和6 1 8 8 ：接种病毒前、后施用h n s 2 2 菌株 培养滤液对两寄主的枯斑抑制率分别为8 3 7 8 、6 7 2 6 和5 4 0 6 、4 2 3 7 。y e o l 3 l 】 等发现放线菌b 2 5 产生的抗病毒物质a s a 能被植物内吸并在植物体内转移，对 t m v 有抑制作用。 1 2 3 化学合成活性物质防治t m v 目前通过化学合成具有抗植物病毒活性的化合物，从结构上来分包括以下几 类，即杂环类、核苷酸、生物碱、取代苯、醛类及其缩合物、有机磷、氨基酸衍 生物等。在化学合成抗植物病毒剂方面，比较成功的是德国莱比希大学的 g s c h u s t e r 等人在1 9 7 1 1 9 8 0 年通过1 0 年时间研究筛选化学合成抗植物病毒活性 物质，发现了三嗪类化合物较好，以此为基础最终合成出d h t 和d a d h t 两种抗 植物病毒剂，能被植物很好地吸收，对病毒表现良好抑制活性，并能促进植物的代 谢和组织分裂，且对人畜无毒。陈洪掣3 2 】在碱性条件下由2 ( 4 羟苯基) 5 一取代苯 并咪唑与氯乙酸作用得到5 个新化合物取代苯并咪唑基苯氧乙酸。使其在4 二甲 氨基吡啶催化下与溴代乙酰糖酯化合成了3 个新化合物含氟、硝基苯并咪唑苯氧 乙酸糖酯。试验结果表明，含氟、硝基苯并咪唑苯氧乙酸糖酯较取代苯并咪唑基 苯氧乙酸具有更高的抗t m v 的活性。马军安等【3 3 】合成的拟除虫菊酸一4 二甲( 乙) 氨基苯甲醛肟酯有抗t m v 的活性。陈卓【3 4 】等合成的毒氟磷可以防治t m v 。 实际生产中已有多种化学源抗植物病毒农药在应用，但几乎没有一种化学药 剂能有效治愈感染植株，且随着植物抗药性的增加和人们对生态环境的重视化学 源农药的发展受到限制。近几年抗植物病毒的研究重点是寻找对环境损害小且抗 病毒活性高的生物农药，与传统的化学农药相比生物农药具有对人畜和非靶标生 物安全、环境兼容性好、不易产生抗性、易于保护生物多样性、来源广等优点， 故生物源农药为较理想的方案【3 5 。7 1 。且随着相关学科的进展，如分子生物学、病 毒学、植物生理学、化学、生物化学、物理学和数学与计算机等学科的进步和相 4 福建农林大学2 0 1 0 届硕士学位论文天然海鱼共附生细菌抗t m v 菌株的分离、筛选及鉴定 关技术的应用，各种先进的现代检测分析技术和手段被应用到该领域研究，如生 物质谱、生物核磁技术的应用和各种探针技术，这些现代分析测试技术的进步将 推动抗植物病毒剂向实用化方向发展，使其在植物病毒危害控制中发挥重要作用 【3 8 】 0 1 3 海洋细菌次级代谢产物研究 目前，关于海洋细菌次级代谢产物在农业方面研究主要集中在抗植物病原真 菌和杀虫作用，而在除草作用和抗植物病毒方面报道很少，主要研究根际细菌和 活体病原细菌在除草方面的应用，根际细菌主要包括假单孢菌属( p s e u d o m o n a s ) 、 肠杆菌属( e n t e r o b a c t e r ) 、黄杆菌属( f l a v o b a c t e r i u m ) 、柠檬酸细菌属( c i t r o b a c e r ) 、 无色杆菌属( a c h r o m o b a c t e r ) 、产碱杆菌属( a l c a l l i g e n e s ) 、黄单孢杆菌属 ( x a n t h o m o n a s ) 等【3 9 1 。而活体病原细菌就是可以直接穿透寄主表皮，进入寄主组织， 使寄主发病死亡 4 0 l 。抗植物病毒方面主要是对陆地细菌的次级代谢产物的研究， 本研究应用海洋细菌的次级代谢产物来防治t m v 具有创新意识，特别是以海洋 鱼类为载体来筛选细菌。海洋细菌的次级代谢产物在抗肿瘤方面研究比较多。 1 3 1 海洋细菌次级代谢产物的抑菌作用 j u n g h e ew o o 等【4 1 】发现细菌a p 7 7 ( s t r e p t o m y c e ss p ) 产生的胞外蛋白， 能够抑制引起紫菜赤腐病的病原真菌( p y t h i u mp o r p h y r a e ) ，田黎等【4 2 】从海洋生 境中分离得到1 株芽孢杆菌b 一9 9 8 7 菌株，其胞外分泌的次级代谢产物对植物病 原真菌有显著的抑制作用，其中对茄交链孢菌、大丽轮枝菌、黄枝孢菌、立枯丝 核菌的抑制作用主要是造成病原真菌孢子或菌丝末端膨大成球状，继而胞壁崩 解，原生质外泄，对尖孢镰刀菌和莴苣霜霉菌的抑制作用，则表现为孢子萌发率 降低和芽管长度明显变短，经分析其代谢产物活性物质为酚类化合物。张海龙等 【4 3 】等从海洋细菌b a c i l l u s s p 菌株发酵液中分离出8 个成分，分别鉴定为吡咯并哌 嗪2 ，5 二酮( i ) 、3 异丁基吡咯并哌嗪2 ，5 二酮( i i ) 、3 甲基哌嗪- 2 ，5 - 二酮 ( i i i ) 、胸腺嘧啶( i v ) 、尿嘧啶( v ) 、曲酸( v i ) 、丁四醇( v i i ) 、苯丙氨酸( v i i i ) ， 经研究发现，其中的化合物i ，i i ，i i i 对稻瘟霉分生孢子或菌丝体有一定抑制作用。 郭少华等h 4 从极地海洋环境中筛选获得一株海洋细菌b s w l0 0 0 5 ，研究发现其胞 外代谢物质对植物病原真菌有显著的抑制作用。杨好等【4 5 】从中国东海微生物样 品中分离得到4 2 1 株细菌，其中有5 4 株细菌具有抗稻瘟霉活性，活性最好的 5 福建农林大学2 0 1 0 届硕士学位论文天然海鱼共附生细菌抗t m v 菌株的分离、筛选及鉴定 株为海洋枯草芽孢杆菌。聂亚锋等m 】从连云港海域的海水和海泥中分离得到一株 细菌p y - s w - 1 ，经田间试验结果表明，菌株p y - s w - 1 及其胞外物质对水稻纹枯病 的防治效果好，喷施后7d 的防效分别为6 3 2 和5 3 9 。暴增海等f 4 7 】从连云港 附近海域采集的样品中分离到一株海洋细菌l 9 对l o 种植物病原真菌都有明显的 抑制作用，其中对小麦赤腐霉病菌( f u s a r i u mg r a m i n e a r u m ) 的抑制作用最为明 显。长期使用化学农药造成大量的病原微生物都有不同程度的抗药性，所以生物 防治显得越来越重要，生物农药的开发更是迫在眉睫，而海洋是生命之源，也是 地球上物质资源最丰富的领域，从海洋微生物的次生代谢产物中寻找和开发有别 于陆栖微生物的生物活性物质，对开发生物农药具有巨大潜力。 1 3 2 海洋细菌次级代谢产物的杀虫作用 刘济宁【4 8 】对从南海分离得到的一株能产生杀虫活性物质的海洋细菌 j a a s 0 1 ，对其进行发酵条件优化，发酵液对棉铃虫初孵幼虫的杀虫活性为 6 7 3 3 ，对初发菌株j a a s 0 1 细菌进行细胞诱变，经棉铃虫活体筛选获得突变株 j a a s 0 1 d ，该突变株发酵液杀虫活性达7 7 7 8 。经传代试验表明，该突变株遗 传性能较稳定。陈志芳等【4 9 】从海藻海头红中分离得到的一株海洋杀虫细菌 1 0 0 2 0 6 ，通过对其液体发酵条件进行优化，采用发酵液饲喂棉铃虫初孵幼虫，结 果4 8h 后棉铃虫的死亡率达到6 6 6 7 。因此海洋微生物是一个重要的活性物质 来源。开发海洋微生物农业杀虫剂具有重要的现实意义。 1 3 3 细菌次级代谢产物的抗肿瘤作用 海洋细菌是海洋微生物抗肿瘤活性物质的一个重要来源。主要集中在假单 胞属( p e s u d o m o n a s ) 、弧菌属( v i b r i o ) 、微球菌属( m i c r o c o c c u s ) 、芽孢杆菌属 ( b u c i l l u s ) 、肠杆菌属( e n t e r u b a c t e r i u m ) 和别单胞菌属( a l t e r o m o n a s ) p 。方金 瑞等【5 1 】从日本海下3 千多米深底泥分离得到一株海洋细菌( a l t e r o m o n a s h a l o p l a n k t i s ) ，产生的离子载体类产物b i s u c a b e r i n ，在很小剂量1 0p g m l 下，与巨 噬细胞、纤维肉瘤1 0 2 3 等肿瘤细胞一起培养时，对肿瘤细胞作用非常明显。美 国马里兰大学发现，海绵中存在复杂的微生物群落，海绵中的抗癌物质是由其中 共生或共栖的细菌所产生，从这些细菌中可以分离出抗白血病、鼻咽癌的活性成 分【5 2 1 。a c e b a l 等从海洋被囊动物中分离出两株农杆菌( a g r o b a c t e r i u m ) ，并从它 们的代谢物中分离出抗肿瘤活性物质s e s b a n i m i d e 5 3 1 。l u e s c h 等【5 4 】研究了从海洋 6 福建农林大学2 0 1 0 届硕士学位论文天然海鱼共附生细菌抗t m v 菌株的分离、筛选及鉴定 蓝细菌中得到的l y n g b a b e l l i nc ，l y n g b y a p e p t i n sb 和c 以及名为p a l a u i m i d e 的 n 酰基比咯酮的生物活性，发现它们对k b 、l o v o 的细胞系均有细胞毒活性。 w i l l i a m s 掣5 5 1 2 0 0 3 年从采自帕劳群岛海域的一株藻青菌( l y n g b y as p ) 分离得到 的细胞毒性物质u l o n g a p e p t i n ，研究显示该物质对k b 细胞的i c s o 为0 6 3m m o l l 。 m a s a h i r om a t s u d a 等【5 6 】对从海洋细菌( p s e u d o m o n a ss p ) 中分离得到的磷酸盐多 糖b 1 进行分析，发现b 1 对多种各不同的人类肿瘤细胞株都具有抑制作用，其 诱导u 9 3 7 发生细胞凋亡的i c 5 0 为6 3 2l a g m l 。梁静娟等【5 7 】对筛选自广西北部湾 红树林海洋淤泥中的海洋细菌( b a c i l l u s p u m i l u sp l m 4 ) 产生的多糖具有抗肿瘤 活性。2 0 0 6 年，t l u k