（药物化学专业论文）功能化的多壁碳纳米管与碳酸酐酶相互作用的研究.pdf

产 原创性声明 i 删煳y 1 7 9 2 2 6 z 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：墨! ! 嗑 日 关于学位论文使用授权的声明 本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件 和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 嵫撇：超导师虢i 啦日期喇吖叼 a 、 ，i 山东大学硕1 - ：学位论文 目录 摘要l a b s t r a c t 3 符号说明5 第一章前言6 1 1 引言6 1 2 碳纳米管简介8 1 3 碳酸酐酶简介9 1 4 碳纳米管与蛋白质相互作用的研究进展1 0 1 5 研究蛋白质结构的方法1 2 1 5 1 荧光光谱法1 2 1 5 2 圆二色谱1 4 1 5 3 紫外可见光谱法1 5 1 5 4x 射线单晶衍射分析1 5 1 5 5 红外光谱法1 6 1 5 6 拉曼光谱法1 7 1 5 7 核磁共振法1 8 1 6 纳米材料的功能化修饰1 9 1 6 1 纳米材料表面功能化对生物分子的作用1 9 1 6 2 组合化学1 9 1 7 展望2 0 第二章功能化多壁碳纳米管与碳酸酐酶相互作用的研究2 2 2 1 引言2 2 2 2 实验器材和仪器2 3 2 2 1 实验材料和试剂2 3 2 2 2 实验仪器2 3 2 3 实验方法2 3 2 3 1 功能化多壁碳纳米管组合化学库的合成2 3 l 山东大学硕t 学位论文 2 3 2 碳纳米管水溶液浓度的确定 2 3 3 功能化碳纳米管对碳酸酐酶活性的影响研究 2 3 4 稳态荧光光谱分析 2 3 5 碳纳米管对酶的吸附 2 3 6 圆二色谱分析 2 3 7 酶促反应动力学分析 2 3 8 功能化基团对碳酸酐酶活性的影响 2 4 结果与讨论 2 4 1 功能化多壁碳纳米管组合化学库的设计及表征 2 4 2 碳纳米管水溶液浓度的确定 2 4 3 功能化碳纳米管对碳酸酐酶活性的影响研究 2 4 4 稳态荧光光谱分析 2 4 5 碳纳米管对酶的吸附 2 4 6 圆二色谱分析 2 4 7 酶促反应动力学分析 2 4 8 功能化基团对碳酸酐酶活性的影响 第三章结论 附图与附表 参考文献 致 射 硕士期间发表论文 山东人学硕i j 学位论文 c o n t e n t s a b s t r a c ti nc h i n e s e 1 a b s t r a c t 3 s y m b o le x p l a n a t i o n 5 c h a p t e rib a c k g r o u n d 6 1 1i n t r o d u c t i o n 6 1 2c a r b o nn a n o t u b e 8 1 3c a r b o n i ca n h y d r a s e 9 1 4d e v e l o p m e n to fi n t e r a c t i o nr e s e a r c hb e t w e e nc a r b o nn a n o t u b e sa n d p r o t e i n s 。1 0 1 5m e t h o d so fp r o t e i ns t r u c t u r e sd e t e r m i n a t i o n 12 1 5 1f l u o r e c e n c es p e c t r o s c o p y 12 1 5 2c i r c u l a rd i c h r o i s ms p e c t r o s c o p y 1 4 1 5 3u v - v i ss p e c t r o s c o p y 15 1 5 4x r a ya n a l y s i s 15 1 5 5i n f r a r e ds p e c t r o s c o p y 16 1 5 6r a m a ns p e c t r o s c o p y 1 7 1 5 7n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c es p e c t r o s c o p y 18 1 6s u r f a c ef u n c t i o n a l i z e dn a n o p a r t i c l e s 19 1 6 1e f f e c t so nb i o m o l e c u l a r 19 1 6 2s i g n i f i c a n c eo fc o m b i n a t o r i a lc h e m i s t r y 19 1 7p r o s p e c t 2 0 c h a p t e ri is t u d yo ni n t e r a c t i o nb e t w e e n f - m w n ta n dc a r b o n i ca n h y d r a s e 2 2 2 1i n t r o d u c t i o n 2 2 2 2m a t e r i a l sa n di n s t r u m e n t 2 3 2 2 1m a t e r i a l sa n dr e a g e n t s 2 3 2 2 2i n s t r u m e n t s 2 3 2 3m e t h o d s 2 3 2 3 1s y n t h e s i so f f - m w n t sl i b r a r y 2 3 i ! i 山东大学硕士学位论文 2 3 2d e t e r m i n a t i o no f t h ec o n c e n t r a t i o no f f - m w n t s 2 3 3i n h i b i t i o no f c a r b o n i ca n h y d r a s ea c t i v i t y 2 3 4s t e a d y - s t a t ef l u o r e c e n c es p e c t r o s c o p y 2 3 5a m o u n t sd e t e r m i n a t i o no f c a r b o n i ca n h y d r a s eb o u n d 2 3 6c i r c u l a rd i c h r o i s ms p e c t r o s c o p y 2 3 7e n z y m ek i n e t i c sa n a l y s i s 2 3 8e f f e c t so f f u n c t i o n a lg r o u p s 2 4r e s u l t sa n dd i s c u s s i o n 2 4 1d e s i g na n dc h a r a c t e r i z a t i o no ff - m w n tl i b r a r y 2 4 2d e t e r m i n a t i o no ft h ec o n c e n t r a t i o no ff - m w n t s 2 4 3i n h i b i t i o no fc a r b o n i ca n h y d r a s e 2 4 4s t e a d y - s t a t ef l u o r e c e n c es p e c t r o s c o p y 2 4 5a m o u n to fc a r b o n i ca n h y d r a s eb o u n dt of - m 1 、i t 3 4 2 4 6c i r c u l a rd i c h r o i s ms p e c t r o s c o p y 3 4 2 4 7e n z y m ek i n e t i c sa n a l y s i s 3 6 2 4 8e f f e c to f f u n c t i o n a lg r o u p s 3 9 c h a p t e ri i ic o n c l u s i o n s 4 1 a t t a c h e df i g u r ea n dt a b l e 4 2 r e f e r e n c e s 4 5 a c k n o w l e d g e m e n t 5 4 p u b l i c a t i o n s j 5 5 i v 山东人学硕 ：学位论文 摘要 纳米材料是指三维空间尺度至少有一维处于纳米量级( 卜lo o n m ) 的材料，纳米材料因表现出特异的光、电、磁、热、力学、机械等性 能而引起了人们的广泛关注，纳米技术成为当前世界科学研究的热点 领域之一。现在纳米材料越来越多地用于人类的生活中，如纳米电子 器件，医学和健康等方面。碳纳米管，是继富勒烯之后出现的又一种 新型碳纳米材料。当碳纳米管和生物体接触时，在界面上首先发生的 是材料表面对蛋白质分子的吸附作用，这种吸附作用决定了后续的细 胞响应以及整个系统对材料的反应。碳酸酐酶是一种重要的金属酶， 广泛存在于人体肾脏、脑视网膜等组织器官中，能可逆性的催化二氧 化碳的水合反应，产生在人体多种生理活动中发挥重要作用的质子和 碳酸氢根离子，因而与人类关系密切。碳酸酐酶缺失、表达异常或活 性发生改变都会引发机体的病变，例如青光眼、骨质疏松症、癫痫、 肿瘤等疾病的形成。所以研究碳纳米管与碳酸酐酶之间的相互作用， 对其更好的应用于药物载体及新的治疗技术的发现等领域有很重要 的意义。 本文首先利用组合化学方法合成了不同表面化学修饰的多壁碳 纳米管，利用紫外分光光度法、稳态荧光等分析技术研究了功能化多 壁碳纳米管与碳酸酐酶的相互作用。通过酶活性分析和稳态荧光光谱 初步筛选了功能化多壁碳纳米管对碳酸酐酶活性和自身荧光的影响。 根据筛选结果对碳纳米管与碳酸酐酶的相互作用进行了深入的研究， 测定碳纳米管对碳酸酐酶的吸附量，利用圆二色谱的分析碳纳米管吸 附碳酸酐酶后对其二级结构的影响，通过酶促反应动力学法研究碳纳 米管对碳酸酐酶的抑制机理。 分析实验结果得到以下结论：通过碳纳米管对碳酸酐酶活性抑制 实验进行生物筛选，表面不同化学修饰的碳纳米管对碳酸酐酶活性的 影响不同。根据荧光婢灭实验，我们发现不同功能化多壁碳纳米管库 由于表面基团的不同，对碳酸酐酶的荧光产生不同的影响，但由于碳 酸酐酶本身结构的特点，其荧光婢灭程度大致相同；根据筛选结果， 山东大学硕l 二学位论文 选出了8 种对碳酸酐酶活性抑制比较大的碳纳米管，发现其吸附碳酸 酐酶的量也大致等同，而c d 光谱也显示这些碳纳米管对碳酸酐酶的 二级结构没有造成显著的改变：动力学实验表明8 f 、l5 撑、l6 群碳纳 米管对碳酸酐酶的抑制属于竞争性抑制。但在对照试验中，这些碳纳 米管表面连有的功能化小分子化合物基团却不能抑制碳酸酐酶的活 性。因此，只有碳纳米管与一些小分子化合物形成的功能化碳纳米管 才能有效地靶向碳酸酐酶的活性位点，进而影响其活性。即本文通过 组合化学的方法对多壁碳纳米管进行了表面多样化的化学修饰，发现 了具有很好的靶向性、能够特异性结合碳酸酐酶活性位点的功能化多 壁碳纳米管，他们将在纳米医学和生物学上具有极大的应用潜力。 关键词：功能化多壁碳纳米管；碳酸酐酶；组合化学；生物筛选；碳 纳米管一酶相互作用 f i 山东大学硕 二学位论文 a b s t r a c t n a n o m a t e r i a l sr e f e rt om a t e r i a l sw i t hs t r u c t u r eu n i t sa tt h e n a n o s c a l e ( 1 1o o n m ) i na tl e a s to n ed i m e n s i o n t h e i rs p e c i f i ca n du s e f u l p r o p e r t i e s ，s u c h a s s p e c i f i co p t i c a l ，e l e c t r i c a l ，m a g n e t i c ，t h e r m a l ， m e c h a n i c a l ，m a k et h e i rw i d ea p p l i c a t i o n st om a n yf i e l d s ，e s p e c i a l l yi n n a n o e l e c t r o n i c s ，m e d i c i n eh e a l t ha n ds oo n w h e nt h ec a r b o nn a n o t u b e s e n t e rb i o l o g i c a ls y s t e m s ，t h en a n o m a t e r i a l sw i l la d s o r bt h ep r o t e i n sa n d e n z y m e si m m e d i a t e l y ，w h i c h d e t e r m i n e st h ec e l l r e s p o n s e a n dt h e r e s p o n s eo ft h ew h o l es y s t e m c a r b o n i ca n h y d r a s ei s av e r yi m p o r t a n t m e t a le n z y m e ，w h i c hi sw i d e l yp r e s e n ti nh u m a nk i d n e y ，b r a i nr e t i n a a n do t h e rt i s s u e sa n do r g a n s i tc a nc a t a l y z et h er e v e r s i b l eh y d r a t i o no f c a r b o nd i o x i d et op r o d u c ep h y s i o l o g i c a li o na n dp r o t o nw h ic hp la ya n i m p o r t a n t r o l ei n p h y s i c a l a c t i v i t i e s t h e d e f i c i e n c y ，a b n o r m a l e x p r e s s i o no ra c t i v i t yl o s tw i l ll e a d t o p a t h o l o g i c a lc h a n g e s ，s u c ha s g l a u c o m a ，o s t e o p o r o s i s ，e p i l e p s y ，c a n c e ra n do t h e rd i s e a s e s s oi t i s i m p o r t a n tt oi n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nc a r b o nn a n o t u b e sa n d c a r b o n i ca n h y d r a s ef o rt h e i ra p p l i c a t i o n si n d r u gc a r r i e r a n dn e w t h e r a p e u t i ct e c h n i q u e s ，e t c v a r i o u ss u r f a c ec h e m i c a lm o d i f i e dm u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s h a v e b e e ns y n t h e s i z e db yc o m b i n a t o r i a lc h e m i s t r y t h ei n t e r a c t i o n s b e t w e e nf - m w n t sa n dc a r b o n i ca n h y d r a s eh a v eb e e ns t u d i e db yu s i n g t h em e t h o do fu vs p e c t r o p h o t o m e t r y ，s t e a d y s t a t ef l u o r e s c e n c e ，c d ， e t e t h ee f f e c t so f8 0k i n d so ff o m w n t so nc a r b o n i ca n h y d r a s e a c t i v i t y a n df l u o r e s c e n c ea r es t u d i e d f r o mt h es c r e e n i n gr e s u l t s ，w ef o u n dt h e c h a n g e so fc a r b o n i ca n h y d r a s e s e c o n ds t r u c t u r ea f t e ri n t e r a c t i n gw i t h f - m w n t su s i n gc d ，t h ea d s o r p t i o no fc a r b o n i ca n h y d r a s eo nf - m w n t s a n dt h ei n h i b i t i o nm e c h a n i s m f o l l o w i n gr e s u l t sa r eo b t a i n e df r o mt h ei n h i b i t i o na s s a yr e s u l t s a f t e r b e i n g i n t e r a c t e dw i t hf - m w n t s ，t h ea c t i v i t i e so fc a r b o n i c 3 山东大学硕r ：学位论文 a n h y d r a s e a r ei n h i b i t e d t h ea c t i v i t i e so fc a r b o n i c a n h y d r a s e a r e d e c r e a s e dt od i f f e r e n t d e g r e e sb y v a r i o u sf - m w n t s t h e8 0 f - m w n t s f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n ga r ei nt h es a m el e v e lb e c a u s eo ft h e c h a r a c t e r i s t i c so fc as t r u c t u r e t h ec dr e s u l t so ft h ec a r b o n i c a n h y d r a s ea f t e ri n t e r a c t i n gw i t ht h e8f - m w n t sw h i c hw e r es e l e c t e db y t h ei n h i b i t i o n a s s a ys h o w e dt h a tt h ef - m w n t sh a v e n oe f f e c to n c a r b o n i ca n h y d r a s es e c o n ds t r u c t u r e f r o mt h ek i n e t i ca s s a y ，w ek n o w t h a t8 撑，15 撑，16 撑f - m w n t sc a ns p e c i f i c a l l yb i n dt ot h ec a t a l y t i cs i t eo f c a r b o n i ca n h y d r a s ea n di n h i b i ti t s e n z y m a t i ca c t i v i t yc o m p e t i t i v e l y s t r u c t u r e - a c t i v i t yr e l a t i o n s h i pa n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ec o m p o s i t e so f t h ef u n c t i o n a lg r o u pa n dc a r b o nn a n o t u b e sw e r ep r o b a b l yc r u c i a lf o r t a r g e t i n gt h ec a t a l y t i cs i t eo fc a r b o n i ca n h y d r a s e t h i si sas t r o n g s u p p o r t f o rt h e c o n c e p t t h a ts u r f a c ec h e m i c a lm o d i f i c a t i o n b y g e n e r a t em o l e c u l a rr e c o g n i t i o ni n o n s m u l t i w a l l e dc a r b o n n a n o t u b e s ； c h e m i s t r y ；b i o l o g i c a ls c r e e n i n g ； j j 一 厂 山东大学硕。 ：学位论文 符号说明 n p s w n t m w n t f m w n t c a 4 n p a p b s c d h p l c b c a r p m h m i n 纳米颗粒 单壁碳纳米管 多壁碳纳米管 表面功能化多壁碳纳米管 碳酸酐酶 4 硝基苯基乙酸酯 磷酸盐缓冲液 圆二色谱 高效液相色谱 b c a 法测定蛋白浓度 每分钟转速 小时 分钟 5 1 1 引言 纳米材料广义 者由该尺度范围的 总称。纳米( n m ) 到原子大小( 约0 纳米粉末( 纳米颗 块体和纳米相分离 所迥异的表面效应 纳米材料具有异于普通材料的光、电、磁、热、力学、机械等性能。 这些特性使得纳米材料在材料学、电学、光学、计量学及信息通讯等 方面有着广泛的应用。近期研究发现纳米技术在生物、医学上也有着 巨大的应用前景，包括生物传感器、分子成像、疾病诊断、药物靶向 释放等。f 1 o 】 新产品的创新对社会的发展、经济振兴、国力增强有着重要的影 响，纳米材料是当今新材料研究领域中最富有活力、对未来经济和社 会发展有着重要影响的研究对象。近年来，纳米材料已取得了引人注 目的成就，例如，存储密度达到每平方厘米时4 0 0 g 的磁性纳米棒阵 高效纳米阵列激光器、价 热电转化元件、用作轨道 世，充分显示了它在国民 潜力。 术也对人类社会、环境存 应用到工业制造、生物医 们所处的环境，人们在 此纳米材料是否会对人 乃至政府部门的高度 征意味着它们可能具有 山东大学硕j ：学位论文 类似于石棉纤维的毒性，所以对其毒理的了解是纳米管被广泛应用的 前提。目前已有报道发现当细胞暴露于碳纳米管后，可以导致抗氧化 物的枯竭以及细胞活力的丧失，也可能发生超微结构和形态学的变 化。【11 】对于同一种物质，纳米颗粒较常规尺寸颗粒的毒性更强， 这种毒性可能与纳米粒子的比表面积和表面的化学活性有关，也可能 是由于纳米颗粒更容易洞穿细胞的缘故。研究纳米材料的生物效应、 毒性等，能减小许多对健康、安全和环境方面的不利影响，降低应用 风险，能够保证纳米材料科学与技术的顺利发展。早在2 0 0 3 年的美 国化学学会年会上，就已经有研究小组发表纳米材料具有特殊毒性的 报告。2 0 0 4 年12 月，欧共体在布鲁塞尔公布了e u r o p e a ns t r a t e g yf o r n a n o t e c h n o l o g y ( 欧洲纳米战略) 和o p e nc o n s u l t a t i o n o nt h e e u r o p e a ns t r a t e g y f o rn a n o t e c h n o l o g y ， 把研究纳米生物环境健康效 应问题的重要性，列为欧洲纳米发展战略的首要问题之一。同时，美 国、日本等发达国家迅速组织和开展了有关纳米材料生物毒理作用的 研究。 纳米材料所具有的生物活性，也就是说纳米粒子与一系列生物分 子( 蛋白质、核酸、酶等) 相互作用的过程。蛋白质作为一类极为重 要的生物大分子，其在细胞和生物体的生命活动过程中，起着十分重 要的作用。若因遗传缺陷造成某个蛋白质或酶缺损，或其他原因造成 蛋白质和酶的活性减弱，均可导致机体代谢紊乱，甚至发生疾病。在 传统的治疗手段中，有机小分子和多肽类化合物常用来治疗由于这些 蛋白质的结构和功能变化引起的疾病。但有机小分子和多肽类化合物 由于膜透性比较差，而且没有选择性，所以往往事倍功半。纳米材料 具有与普通材料不同的性质。首先，纳米材料的膜透性很好，能够很 容易的进入细胞。【1 8 l 其次，纳米材料有巨大的比表面积，可以吸附 足够多的蛋白质和酶。【1 9 ，2 0 1 近年来由于对制备纳米材料的研究突飞 猛进，相继开发出具有不同大小、形状、表面性质的纳米材料，可以 用来研究其与蛋白质的相互作用及其机理。1 2 1 - 2 3 】 纳米材料进入生物体后，进入不同的组织和细胞，进而与多种蛋 白质发生相互作用，纳米材料巨大的比表面积、表面电荷以及功能化 7 山东大学硕二i ：学位论文 修饰的活性基团使得其特异性或非特异性的吸附或结合体内多 白质。在有些情况下，蛋白质的这种吸附是有害的，会造成蛋白 变形、酶催化活性的减弱，甚至会使物质代谢紊乱，从而导致疾 生。另一方面，有些情况这种吸附则是有利的，比如各种生物传 的应用。到目前为止，尽管有关纳米材料对细胞和动物的毒性及 白质、d n a 等生物大分子的相互作用的文献报道已经很多，但 如何改善纳米材料的靶向性的研究比较少，这些研究空白将会大 约纳米材料的应用前景。因此研究纳米材料与体内主要蛋白质的 作用，对研究纳米材料的生物效应以及开发纳米材料的潜在应用 是至关重要的。 1 2 碳纳米管简介 碳纳米管( c a r b o nn a n o t u b e s 。c n t ) ，又名巴基管，是在l9 91 年 由日本科学家饭岛首次发现的，它是继富勒烯之后出现的又一种新型 碳纳米材料。透射电镜和扫描电镜对其研究结果表明碳纳米管从结构 上可以视为由石墨片卷曲而成的中空管状结构，其管壁是一种类似于 石墨片的碳六边形网状结构，直径在几个纳米到几十纳米之间，长度 却可达几十甚至上百微米，长径比很大。碳纳米管根据管壁上碳原子 层数的不同可分为单壁碳纳米管( s i n g l e w a l l e dn a n o t u b e s ，s w n t s ) 和多壁碳纳米管( m u l t i w a l l e dn a n o t u b e s ，m w n t s ) 。单壁碳纳米管是 由一层碳管子构成的纳米管，多壁碳纳米管则是由几个到几十个单壁 同轴卷曲而成，管间距为0 3 4 n m 。 2 4 】 与传统的碳质材料相比，碳纳米管具有一些独特的物理化学性 质，如特殊的导电性能、力学性能及物理化学性质等，【2 5 1 因此自碳 纳米管出现以来即引起广泛的关注并应用于许多的科学领域。比如依 据其一维管状结构和极大的长径比可用作高效的传质单元；由于其有 较强的场发射性能，可以用作场效应晶体管材料；利用其巨大的比表 面积，可应用于储氢、储能以及吸附剂等领域。碳纳米管具有生物亲 和性，可以和人体的组织器官形成友好的界面，生物大分子如蛋白质、 8 山东大学硕十学位论文 酶、核酸等可以吸附或结合到碳纳米管的表面或空穴中，随着各种修 饰功能化纳米材料的制作成功，碳纳米管作为一种高级生物传感器材 料已进入应用领域，在抗原识别、酶催化反应和d n a 杂交等领域有 潜在的应用前景； 2 6 - 2 8 】在生物医学上，碳纳米管可以作为人工肌肉 的电动机械制动器，用生物活性分子对碳纳米管进行功能化后，其可 以作为神经生长的基质；【29 】碳纳米管还可以作为多功能生物传感 器、药物载体和选择性杀伤癌细胞的近红外媒介。【3 0 】 1 3 碳酸酐酶简介 碳酸酐酶( c a r b o n i ca n h y d r a s e s ，c a s ) 是一类分布广泛的含锌金 属酶，它能可逆性地催化c 0 2 的水合反应，产生参与人体多种生理功 能的h c 0 3 - 及h + 。【3 1 ，3 2 】根据碳酸酐酶氨基序列的不同，人们主要将 其分为0 【、1 3 、丫、6 和五种不同类型的酶。其中0 t c a s 存在于脊椎 动物、细菌、藻类及绿色植物的胞浆中；3 - c a s 存在于高等植物及藻 类叶绿体中，对植物光合作用过程中c 0 2 的获取及c 0 2 浓度的维持 有着必不可少的作用；丫一c a s 则主要存在于太古细菌及一些细菌中： 6 c a s 主要存在于海洋硅藻中；c a s 是近年来才确定的类型，主要 存在于蓝细菌及一些化能自养性细菌中。多年来人们对碳酸酐酶的研 究主要集中在与人类关系密切的a c a s 和1 3 - c a s 上。a c a s 在氨基酸 序列上存在2 0 6 0 同源性，哺乳动物的几乎所有组织中都含有参与 机体多种生命活动的c a s 。目前研究表明，q c a s 至少存在l4 种 不同的同工酶：c ai i i i ，c a v i i 及c a 为胞浆酶；c a i v ，c a i x ，c a x d 为 膜链接酶；c av 为线粒体酶；c a v i 则存在于唾液中；另外还有已知的 非催化形式的碳酸酐酶相关蛋白。人体中也含有多种碳酸酐酶的同工 酶，它们广泛分布于多种组织器官中，其中催化c 0 2 水合效率最高， 研究最为透彻的是碳酸酐酶i i 。【3 3 】 c ai i 是l9 4 0 年被发现的第一个含锌金属酶，它广泛存在于人体 肾脏、脑、胰腺、胃粘膜、骨骼肌、视网膜及晶状体等组织器官中， 能高效催化c 0 2 的水合反应，产生在人体多种生理活动中发挥重要作 9 山东大学硕- i ：学位论文 用的质子和h c 0 3 。，故而与人类关系密切，若该酶缺失、 活性发生改变都会引起机体的病变。纠正该酶异常表达或 过高活性也会对c al i 引发的疾病起到积极的治疗作用， 眼的c ai i 抑制剂多佐胺等。 3 4 - 3 7 1 有研究发现，不同尺 纳米材料会对碳酸酐酶的蛋白结构和功能会产生影响，曲 会造成更多的蛋白结构变形，进而酶活性丧失越多，曲率 纳米材料对碳酸酐酶的结构和功能影响较小。【3 8 】由于碳 型较多，并且在人体中所在的部位很广泛，这样就造成了 酸酐酶的抑制剂选择性较差，s t i t i 等人将碳酸酐酶的抑制 纳米材料上，对不同亚型的碳酸酐酶作用，发现这种连有 纳米颗粒可以选择性的抑制与肿瘤有关的碳酸酐酶。【3 1 4 碳纳米管与蛋白质相互作用的研究进展 碳纳米管具有巨大的比表面积以及良好的膜透性，使得许多有机 分子( 包括生物分子) 或无机分子可以以共价或非共价的方式结合在 碳纳米管的表面，实现了碳纳米管的功能化，从而使其生物学应用得 到了广泛的关注。对碳纳米管表面进行功能化修饰可以使其性质发生 改变，包括使碳纳米管在介质中的分散程度和溶解性得到提高、阻止 蛋白分子的特异性吸附、提高生物亲和性、降低毒性、能够识别和结 合特定的生物分子等等。这些均有利于其在生物医学方面中的应用。 有研究发现多壁碳纳米管可以通过非特异性吸附的方式吸附许多蛋 白，当多壁碳纳米管的低端被氧化打开，小的蛋白质分子就可以进入 管道中，用这种方式可以使固定在多壁碳纳米管上的酶保持正常的生 物活性。【2 7 ，4 0 1l i n h a r d t 等将肝磷脂结合到碳纳米管上，可以增加碳 纳米管的生物相容性，使其更好的与血液相兼容。【4 l 】b o u s s a a d 等人 通过监测单壁碳纳米管的导电性变化发现细胞色素c 可以以非特异 性吸附的方式固定在半导体单壁碳纳米管上。f 4 2 】s h i m 等以表面活性 剂t r i t o n 和聚乙二醇对单壁碳纳米管进行表面修饰，可以有效阻止抗 生物素蛋白链霉素在单壁碳纳米管上的非特异性吸附；在此基础上， 1 0 山东大学硕十学位论文 以目标蛋白的配体对碳纳米管进行进一步的修饰，则可以实现碳纳米 管对目标蛋白的特异性结合。【43 】d a i 实验室的研究报道在t e m 网栅 中直接将化学气相沉淀法产生的单壁碳纳米管在铁蛋白水溶液中孵 育，并没有发现蛋白吸附现象。【4 4 】 在各种条件下，对蛋白吸附机理的了解是得到最优化条件的首要 因素。【2 8 】碳纳米管与蛋白质间相互作用的反应机制主要有以下几 种：疏水作用、j i j l 作用和静电作用。从反应机制上说，蛋白质在碳 纳米管上的非特异性吸附比普遍认为的疏水作用要复杂。【4 5 】例如 s h i m 等人发现链亲合素很容易吸附到单壁碳纳米管上，但是纤维蛋 白原却不易吸附，这与疏水作用原理相背离，因为相对于链亲合素来 说，纤维蛋白原与疏水界面有很强的亲和性。【4 3 】蛋白与介质界面的 非特异性吸附还包括静电作用、氢键作用等机制。1 4 6 】但是，a z a m i a n 等人发现蛋白在碳纳米管上的吸附与蛋白的等电点无关，无论带正电 荷的蛋白还是带负电性的蛋白都在碳纳米管上有很强的吸附，因此与 静电作用机制不相符合。【47 】至于有些研究所观测到的蛋白吸附，很 可能是与碳纳米管的氨基亲和作用有关，至少是部分相关，因为蛋白 质通常含有足够多的表面氨基。d h r i t i 等人的研究证明在p h 值低于 溶菌酶的等电点时，除了j l - j l 作用和疏水作用外，溶菌酶还通过质子 化的氨基成分与单壁碳纳米管的缺陷位点相互作用。在p h 值高于蛋 白等电点时，它们之间的相互作用表现为氨基在碳纳米管上的吸附。 【4 8 】c a r o l i n a 等研究发现血清和血浆蛋白在碳纳米管上的结合具有高 度的选择性，除血清补体蛋白、纤维蛋白原和阿朴脂蛋白外，其它的 蛋白几乎不会结合到碳纳米管上。【4 9 】m e n g 等人发现表面无纺化的单 壁碳纳米管能够选择性的吸附纤维原蛋白，而对白蛋白的吸附能力很 弱。吸附在碳纳米管上的纤维蛋白发生了构象的变化，而且其介导血 小板识别、粘附、活化和聚集的功能受到严重的影响。【5 0 j 缩氨酸和碳纳米管的相互作用可以作为蛋白质和碳纳米管相互 作用的一个模型，其结构有一定的参考意义。w a n g 等人开发了一种 抗菌素显示技术用来确定不同肽序列与碳纳米管非共价反应的亲和 力是否具有选择性。他们发现组氨酸单元( h ) ，特别是色氨酸单元 l l 疏水基团由于蛋白三维结构的变化而暴露于溶剂中，从而使蛋白质发 生变性。【5 4 1 同时研究证明蛋白质的组成单元氨基酸与单壁碳纳米管 的作用也同样具有构象选择性，【5 5 1 在相互作用时，氨基酸分子调节 自身构象，使芳香环易于和单壁碳纳米管相结合。f 5 6 ，5 7 1 1 5 研究蛋白质结构的方法 1 5 1 荧光光谱法 荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、用量少、方法简便以及能 够提供较多的物理参数等特点，这些参数从各个角度反映了蛋白质分 1 2 一 广 山东丈学硕十学位论文 子的成键和结构情况。当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去 活化过程的一种形式是以l0 一10 。6 秒左右的短时间内发射一个光子 返回基态，这一过程成为荧光发射。 在蛋白质分子中发射荧光的氨基酸残基有色氨酸、酪氨酸和苯丙 氨酸，个别蛋白质分子含有黄素腺嘌呤二核昔酸( f a d ) 也能发射荧 光。三种氨基酸由于侧链生色基团的不同而有不同的荧光激发和发射 光谱。其中色氨酸的荧光强度最大，酪氨酸次之，苯丙氨酸最小。因 为蛋白质的荧光通常在2 8 0 n m 或更长的波长被激发，苯丙氨酸在绝 大多数实验条件下不被激发，所以很少能观察到其荧光发射，这样蛋 白质的内部荧光主要来自色氨酸与酪氨酸两种残基。色氨酸残基对微 环境的变化很敏感，并且大多数蛋白都含有几个不同的色氨酸残基， 因而常作为内源性荧光探针来研究溶液状态下蛋白质的构象。除测定 蛋白质分子的自身荧光，即“内源性荧光”外，还可以利用荧光探针， 即“外源性荧光”。荧光探针有两种：稀土离子荧光探针如铕( i i i ) ， 铽( 1 1 1 ) ，有机荧光探针如卜苯胺基萘一5 一磺酸( 1 ，8 - a n s ) 、卜n ，n 一 二甲氨基萘- 5 - 氯磺酸( 1 ，5 一d n s c l0 ) 和2 一对甲胺萘一6 一磺酸( 2 ， 6 一t n s ) 等。 在已研究的许多蛋白质中，球蛋白是荧光研究比较多的一种蛋 白，根据其荧光性质不同，又可分为a 类球蛋白和b 类球蛋白。【5 8 】a 类球蛋白能发射酪氨酸残基的特征荧光光谱，且酪氨酸荧光光谱的位 置不受蛋白质构象变化的影响。b 类蛋白，由于