实验三 大豆中转基因成分定性PCR检测.doc

大豆中转基因成分定性PCR检测一、 实验目的(1)学习从各种材料动物、植物组织、微生物中提取和纯化DNA的原理和操作技术。(2)学习水平式琼脂糖凝胶电泳及紫外检测确定DNA的纯度、含量与分子大小。(3)学习PCR的基本原理和操作方法。(4)掌握高速冷冻离心机、微量移液枪、水平电泳仪、PCR仪等仪器设备的使用。二、 实验原理由于现有的商品化转基因产品中绝大多数含35S启动子和NOS终止子。故转基因食品的检测一般基于聚合酶链式反应(PCR)方法对35S启动子和NOS终止子进行筛选。聚合酶链反应(PCR)是近年来常用的一种快速、灵敏的检测转基因产品的方法,但要求待分析的基因组DNA样品尽可能纯化。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。三、 PCR引物设计检测对象Detect target引物名称Primer name引物序列Primer sequence扩增产物长度Production length基因库中序列号Genebank database accession numberCaMV35S 启动子35S-15-TCA TCC CTT ACG TCA GTG GAG-3165 bpI0807635S-25-CCA TCA TTG CGA TAA AGG AAA-3NOS 终止子NOS-15-GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG-3180 bpI08076NOS-25-TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA-3农杆菌CP4-EPSPSCP4-15-GCA AAT CCT CTG GCC TTT CC-3146 bpI43998CP4-25-CTT GCC CGT ATT GAT GAC GTC-3凝集素基因Lectin-15-CTT CGC CGC TTC CTT CAA C-3436 bpK00821Lectin-25-GAG TCC CGT GGC AGC AGA G-3表1引物序列及扩增产物长度四、 转基因大豆抗草甘膦转基因大豆品种京引D-1 、京引D-2 、京引D-3 、京引D-4获市面上购买的转基因大豆，万能粉碎机粉碎。五、 DNA的提取1、称取约0.1g磨碎的大豆放入灭过菌的研体中加入液氮捣碎迅速转入2ml离心管中；2、加入600l CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)缓冲液震荡均匀，65水浴保温30min；3、 加入500l 酚：三氯甲烷：异戊醇(25:24:1)，振荡均匀，12000r/min离心15min；4、吸取上清液，放入另一新管中加入500ul的异丙醇，12000r/min离心10min。5、弃去上清液，加入70%乙醇溶液洗涤，12000r/min离心1min。6、弃去上清液，干燥，用50l TE缓冲溶液溶解沉淀。7、加入5l RNA酶溶液，37水浴保温30min。8、加入400l的CTAB缓冲溶液，振荡均匀。9、加入250l的三氯甲烷：异戊醇(1:1)，振荡均匀，12000r/min离心15min。10、吸取上清液，放入另一个新管中，加入200l的异丙醇，12000r/min离心10min。11、弃去上清液，干燥，用50l TE缓冲液溶解沉淀。12、1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的大小和完整性。六、 PCR扩增反应体系试剂加样体积(l)ddH2O1710X PCR Buffer(with MgCl2)2.5dNTP(10mM)2正向引物(10M)1反向引物(10M)1样品DNA(10-50ng)1Taq酶(IU/ul)0.5总体积25注：如何10X PCR Buffer没有包含镁离子，另外加2l MgCl2(25mM)溶液七、 PCR反应程序95 预变性5 min 后, 进行40 个循环;每个循环, 退火30 s , 72 延伸1 min , 循环结束后72 延伸5 min , 然后4 保存。PCR反应程序95 预变性5 min94 变性45s35个循环56 退火45s72 延伸1 min72 延伸5 min4 保存八、 电泳的步骤1.琼脂糖凝胶液的制备2.凝胶板的制备3.加样4.电泳5.染色6.观察DNA提取的琼脂糖凝胶电泳图分析采用1.2的琼脂糖凝胶电泳进行分析；电泳缓冲液采用1TAE或0.5TBE；电泳条件为：100V，30min。电泳结束后，用凝胶成像系统对结果进行分析或用核酸紫外观测仪进行观测拍照与结果分