（药剂学专业论文）去甲斑蝥素固体脂质纳米粒的研究.pdf

虫衷丈学磺士谂文 符号说明 n c l mn o r c 锄m a r i d i n去甲斑蝥素素 s l ns o l i dl i p i d 撇o p a 确e l e 医露s 筹厦纳米粒 s as 埯a f i e 撕d硬鬻酸 p b sp h o h a _ t eb u 疏r e ds a l i m磷酸盐缓冲液 s d + s t a l l d a r dd e v i a 南n标准差 r s dr c l 瓶v es t a n d a r dd e 、，i a t i o 相对标准偏差 胬e 戮嚣e 潮东蠢s c 撼斌ge 蠢。渤l 癜y差示羟箍垂熬分撰 n a m s o in o r c 匝吐挺晾蛀n 蹴n去甲斑蝥素溶液 e g e g gp h o p h a t i d y l c h o i i 卵磷脂 a ra c c 哪u 1a _ t er e l e a s e 体外累计释放百分辜 c cc o 辩l a 畦德c o e 藤c i 憾提关系数 癸芰，c 臻痨p e 函黜c el i q 糠de h r o m a t o 擎裔效滚籀色谱 a u ca r e a 岫d e rc u e 药时曲线下面积 a v da p p 盯e n tv o l u m eo f d i s t r i b u t i o n表观分布容积 t b ct o 纽lb o d vc l e a r a 融c e桃体总清除率 劐敲羊m 龆珏遮v v of e s i d e 糙el h 强e平穆洚誓辩霆 e r ce 1 i l n i n a 矗o nr a t ec 0 删消除速度常数 b h lb i o l o g i c a ll l a l f - l i f e 生物半衰期 6 原刨性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，怒本人在导师的指导下，独立 进行研究所取褥的成果。除文中已经注明弓 用的内容终，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出 重要贡献戆个人嚣集薅，均已在文中淡明确方式标嗳。本声嗳的法律责 任由本人承担。 论文作者签名： 密边蓬日期： 圭型! 生j 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解出东大学有关保留、使用学位论文的规定，嗣意学校 保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅；本人授权由东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文 和汇编本学位论文。 ( 镶密谂文在鼹密露应遵守就魏定) 论文 箸者签名：逭出耋导筛签名：亏茎璺壅 匿 山东大学硕士论文 中文摘要 固体脂质纳米粒( s o 衄l i p i d 咖o p a r t i c l 路，s l n ) 是以固态的天然或合成脂类 为载体制成的固体胶粒给药体系，可用于局部给药、口服给药以及静脉注射给 药等多种给药途径，具有靶向性良好、药物泄漏慢、物理稳定性高、毒性低等 优点，是一种极有发展前景的新型给药系统。本文以广谱抗癌药物去甲斑蝥素 为模型药物，对注射用去甲斑蝥素固体脂质纳米粒进行了研究。本文首先建立 去甲斑蝥素含量测定办法，并通过高速离心法分离去甲斑蝥素固体脂质纳米 粒，测定包封率。以包封率为指标，采用薄膜超声分教法制备固体脂质纳米 粒，通过均匀设计以药物硬脂酸的重量比、大豆卵磷脂用量、泊洛沙姆1 8 8 浓 度、水相注入油膜速度、超声频率和油膜与分散相( 水相) 的体积比为考察因 素，优化并确定最佳处方工艺，包封率为5 5 4 士1 2 。理化性质研究表明所制备 的固体脂质纳米粒粒度分布均匀，平均粒径为( 1 8 9 士6 0 0 ) n m ；z e t a 电位为( 2 3 1 5 士0 1 7 ) m v ；p h 在5 4 6 o 之间；载药量为l o 1 2 。初步稳定性研究表明， 4 放置3 个月稳定性良好，粒径和包封率未见显著变化；考察在释放介质 ( p h 6 8 磷酸盐缓冲液) 中体外释药过程，药物释放符合双室模型。把去甲斑蝥素 固体脂质纳米粒冻干粉末通过d 础行物相分析，表明所制得的s l n 完全不同 于其物理混合物，形成了一种新的物相，证明了s l n 确己形成。本研究建立了 液相色谱测定血清及组织中去甲斑蝥素含量的方法，测定了静脉给药后小鼠各 组织中去甲斑蝥素浓度，比较了去甲斑蝥素溶液和去甲斑蝥素固体脂质纳米粒 在小鼠体内的药物动力学过程。结果显示，2 种制剂均符合双室模型，药时曲 线下面积a u c 分别是1 0 1 2 1 3 、1 6 1 0 2 4 ( n 咖1 ) h ，表观分布容积v d 分别是l o 1 2 和2 8 2 l k g 、机体总清除率c 1 分别是o 4 1 6 和0 1 4 7 w 蝇、体内平均滞留时间 m r t 分别是5 3 和1 0 1 h 、消除半衰期分别是4 2 和9 6 h 。肝组织的相对摄取率 r e = 1 5 9 ；肝组织的靶向效率t c = 1 4 5 ；肝组织的峰浓度比c 。= 1 3 6 。从相对摄取 率、靶向效率、峰浓度比等靶向评价指标均表明去甲斑蝥素一s l n 比甲斑蝥素 s o l 具备较好的肝靶向性。 出家大学硕士论文 s t u d i e so nn o r c a n t 珏a r 珏，l n l o a d e ns o l i dl 腭l d n a n o p a r t i c l e s s p e c i a 肛船：p h a r m a c e u t i c s p 姻缘强d 翻l e ：瓤a 珏珏a i y a 载 s u p e r v i s o r ：z h a ig u a n g x i ，l il i n g b i n g a b s t r a c r s o l i di 硒dn 必o p a m c l e s ( s l n ) w e l i d l l o i d a ls y s t e m s 砸t l ln a 衄嫩o r 蜀搓e l 兹c 基奔d 罄歉挂gc a 西e n 糯y 豫n o 蘸a l 砖p 蒯嫩g 莲糯gd e 薮娜 s y s t 删，w h i c hc a 山db el l s e df o rt o p i c a l ，o r a l 釉dp a r c m e r a la d n l i i l i s 仃a t i o n ， a d v 觚t a g e so f i d e a lt a r g c t i n ge 饿c t s ，l o wd n l gl e a k a g c ，g o o dp h y s i c a ls 诅b i l 埘a n d l a w 呶i 幽蓼曩把。秘e 蕊v o 西氇e 畦糙s 至sw 豁t o 娥v e 鲥g 瑟en 缓e a 珏氇蕊蠡l l o 建d s o l i d1 i p i dn a l l o p a n i c l e s ( n c t d - s l n ) f o r 血r a 、r e n o u sa d m i n i 洲i o n f i r s t l y ，n l e m e t h o do fl l l 缸甚c e m 矧h g a t i o nw a su s e dt os e p a r a t es i j 噜锄d 抒e ed n l g ，m e nt h e c o 豫激鼍a 觳de 鼬嘎聪e 瓣e 玺c i 鞠e y 硝s 王n 帑黼蠢嗽强i 蕊谤 臻毛e 豫m e 睡谢o f m e m b r a n e - u l 仃鹄。王l i cd e c e n n m i z a t i o na tl o wt e m p e f a t u r ew a s 翎m l o y e dt op 粥p a r e n c t d - s l n ，谢t hs t e a r i ca c i d 弱娃p i dc a r r i e r s u c hi n v e s t i 鲥o nh a dn or e p 帐i n c 甑熊eo 鲥m a | 奶蹴馥正。珏w a so 融d 酚嘲i f o 瞄s 主辨琳醯斌，巅攮疆瑶 助t r a p m e n te f ! f i c i e n c yo fn c t d s l n 酃t l = i ec r i t 献o n ，趾d 吐l ed r u g - t o - h p i dr a t i o ， w e i g h to fe g gp h o p h a t i d y l c h o l 妣，c o n c e 姗铺o no fp o l n i cf 6 8 ，r a t eo f 蝎e c 蛀n g ，氆扭a s o n 主e 纛毽e n e y 秘do i 挠张毒嚣v o l u 黼e 碰。够i l 擞镡勰蠡e 艳f s 司瞻 h i g h e s t 咖m e n te m c i e n c yo f5 5 4 士1 2 w a sa c q u i r e d n en c t d s l nw 弱 p 咒p a 聪d 如r 也e 矗f s t 斑n e ，埘也o u ta l l yo t h e rd o m e s t i co rf b r e i g nr e p o 纯t h e p 每s i c h 鼬i c 痰p f o 嬲尊t i e s 妇姒g a 矗o ns h o w e d 逸a 主斑en c d s 王n 辨辫d w 鹬r e g l l l a r 锄dw e i lm s 晡b u t c d 谢t ham e 锄d i a m e t c ro f ( 1 8 9 士6 o o ) n m ，z e t a p o t e 磷a lo f ( - 2 3 1 5 士o 1 7 ) m v ，p 王= l 舶m5 4t o6 o ，a n dd r u 轳1 0 8 d e dc a p a c i t yo f l o 1 2 强ep f e l 确i 黼f ys 轾出i l 澍e x p e 醯n t s 础i c a t e d 娃缎娃搪n c t d * s 毛n s 啷p e 燃i o nc o l l l dk e e ps t a b l ea t4 f o ra tl e a s tm r e em o m i l s ，觚dt l l e 陀w e r en o 4 山东大学硕士论文 r e m a 出a b l ec h 觚g 骼o nt h ep 硎c l es i 雳a n d 既i t r a p m te 蚯c i e n c y i na d d i 石。玛也e i n v i 的d n l g l e a o fn c t d s l nw 勰i i e s t i g 砷e d i nd i 】i 酿斌m e 血珊 ( e g ，p h o s p l l a ：t eb l l 丘砘p h 6 8 ) ，孤dt h em s l l l ta l lt a l l y 、撕t hb i o e ) 【p o n 酬a ie ( 1 l l a d o n 1 1 l ef o 珊a t i o no fn c n ) - s l n 哪v a l i d a l c db yd t a d i 舳c t i o n ，w b i c hi n d i c 锄e d m a ti tw 越a b s o l u t e l yd i 丘打e n t 丘d mm es i m p l em i x t i l o fi t sc o m p o n c n 乜t h e m c l 【h o do fl 口l cw a se s t a b l i s h e dt 0 d d 【e 曲n i n cn o r c 锄毗h a r i d i ni nm i c es a n l m 锄d t i s s l l c s 诵t hs t c a d yr e c o v e r y ，h i g hs e n 枷v i t y ，c m t e m 豁a n dg o o dr e p r o d l | c i b i l i 饥 w 1 1 i c hw 勰s l l i t a b l ef o r t h e 缸a l y s i so fb b s 卸叩l e s i nb 如h e s a 舭ri v a d m 缸s 廿a 垃o fn o f c a n t h a r i d i nl i n i o na n dn c t d s l nt om i c e ，t h ed r l l g c o n c 副1 t 蒯o n si n 剐毒r 眦a n dd i f f e 冒e m6 s s u e sw e 糟d d 【锄i n e db yh p l c ，缸d 也e p h a l m a c o h n e d cp r o 乒e s si nt h el n i c ef o rt v p 1 q ，a 训0 n sw e 陀b r o u g h t 岫 c o m p a r i s o n ，w h i c hs h o w e dt h e yw e b o t l lf i 舵dt ot w o c o m p a r 恤l 蛆tm o d e l a u c o 2 4w e 1 0 1 2 1 3a n d1 6 1 0 2 4 ( n 咖1 ) h ；v dw e ml o 1 2 锄d2 8 2 眦g ；c l 恍o 4 1 6 a n d0 1 4 7 l h 瓜g ； l r t 、 r e r e5 3a n d l o 1 h ；e l j m i n a t j v eh a l b l i f ew e r e4 2a n d9 6 h ， r e s p e c 廿v e l y t h e r e l 砒i v eu p t a k er a t e 啦) 、船s1 5 9a 1 1 dt h et a r g e t i l l ge 伍c i c y ( t c ) 、a s1 4 5a n dt h ec o i l s i d e r a 主i o n ( c 0w a s1 3 6 1 1 1 el e v e l so fn o r c a n t h a r i d i ni nl i v e r 、w r em u c hl l i 曲e rw h e na d m i l l i s 拄砒e d 弱s l n ，l o w e ri i ll ( i 血e y 锄dh e a r t ，b u tn o c h a n g e i n n h n a n d l u n g k e yw o r d s ：n o r c a n t b a d d i n ；s o l i dl i p i d n o p a m c l e s ；u n i f o 衄d e s i 弘；m 锄b r a 雎- 1 1 l 仃a s o n i cd e c e n 们l i z a t i o n ；h p l c ；p h 锄a c o 虹n e t i c s ， 山东大学硕士论文 日u舌 一、固体脂质纳米粒给药系统发展概况 b i 玎e n b a c h 等f 1 1 在1 9 7 6 年首次提出纳米粒的概念和制备方法，c o u v r e u 等【2 】于 1 9 7 9 年首次制备了体内可生物降解的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米粒，为纳米粒在 医药领域的应用带来了希望。理想的纳米粒应具备以下性质l m l ：( 1 ) 具有较高的 载药量；( 2 ) 具有较高的包封率；( 3 ) 具有适宜的制备方法；( 4 ) 载体材料可生物降解、 毒性较低或没有；( 5 ) 具有适当的粒径和粒子形态；( 6 ) 具有较长的体内循环时间。 目前使用的聚合物纳米粒载体材料为合成的生物降解高分子材料，如聚氰基丙 烯酸烷基酯类、聚甲基丙烯酸甲酯以及聚乳酸等，它们在体内降解缓慢，长期 使用会导致其单体和降解产物的聚集，产生蓄积。聚合物纳米粒经过三十多年 研究，目前除了n y c 伽e d 公司生产的诊断试剂a b d o s c 锄外，尚无产品上市，归 其原因主要是由于聚合物长期蓄积会产生细胞毒性以及没有合适的大规模生产 方法。上世纪9 0 年代初，研究人员将纳米粒研究重点逐渐转向了生物相容性 好、安全无毒、易于体内降解的天然固体脂质材料，常用的固体脂质材料为不 饱和脂肪酸及其酯类、饱和脂肪酸及其酯类。固体脂质纳米粒给药系统更是目 前亚微粒给药系统的发展热点。 综合国内外文献报道，固体脂质纳米粒( s o l i dl i p i d n 锄p 础i c l e ，s l n ) 的制 备方法主要有以下几种：( 1 ) 薄膜超声分散法【6 4 】：将类脂和药物等溶于适宜 的有机溶剂中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，形成一层脂质薄膜，加入含有乳 化剂的水溶液，用带有探头的超声仪进行超声分散，即可得小而均匀的s l n 。 ( 2 ) 乳化蒸发低温固化法1 8 】：将药物与脂质溶于有机溶剂中构成油相，再把 表面活性剂溶于水中制成水相，加热至同温，在机械搅拌下将油相倾入水相 中，继续搅拌将有机溶剂蒸发，所得混合物快速分散于另外的低温水相中，搅 拌即得。( 3 ) 乳化溶剂挥发法【9 】：本法先把药物或药物与类脂的混合物溶于 有机溶剂( 如氯仿、丙酮等) ，制得油相，再把它加入到含有乳化剂的水相中 形成0 ，w 型纳米乳，挥发溶剂，通过脂质在水介质中的沉淀形成s l n 。( 4 ) 高 压乳匀法【1 0 l ：将脂质、磷脂和表面活性剂与药物在脂质熔点以上的温度熔融、 混匀，将熔融物制成初乳，再用高压乳匀机循环乳化冷却后制得。本法首先制 由东丈擎硬士论文 得的鼹纳米乳或亚微乳，冷却固化得s l n 。( 5 ) 微乳法【1 i j ：本法一般先把脂质 与药物加热熔融，然后加入乳化剂、助乳化剂，制得熔融体。接潜取适量泊洛 沙姆潞予热水中。把水溶波嬲入熔融脂质中，制成温热的0 脚型微巍。最后在 嚣拌祭佟下，鞋定滗倒擦徽嚣分鼗予冷水审，霹褥s 菇。( 6 ) 离夔甥襄证超 声法；通常恕药耱、脂瘦、磷脂、有褫溶嬲等混合，热热成璐融俸，然君取 适潋凝丽活性剂，制备阐濑水相，接着把烙融体注入水相，用踹辫切法进行乳 化。嫩厝将所得体系超黟处理得s l n 。( 7 ) 髂融超声法【1 3 1 4 1 ：般把药物、 鹈震、磷精等燕热至骚媛熔点湿度辇乏土形藏楚融俸，终薏漓糯。褥壤适量巍凭 裁等耱覆溶子霸溢燕窳，律为承稳。在税藏攒搀下，楚求稿等演麓混合形残扔 乳，用带有探头的超声仪谶行超声分散即可。( 8 ) 薄膜接触器法i l5 j ：薄膜接 触器法摄一种制备s l n 的新方法。原理：先将脂质加热至其熔点以上，在外界 压力终惩下，脂质透过不麓强径懿模琵形成微小的滚滚。承摆在游艇舱中循 ；l ：，将器霞滚囊蔌窭我黪臻，室漫下冷帮繇褥s 菱瓣。e 酝瀚粼等最先毯立了薄 膜接触器法。这种方法其宵装置简单，s l n 的粒径可调，载药爨大，可大擐模 生产镣优点。 舅翦s t i n 的稳定性磺窕童要育丽方萄：、可以灭菌，制餐丁s l n 蜃，还 建对箕遴行灭蓥处理。灭菌处理鲢方法主要霄热歪灭蓉，￥辗嚣灭菌秘过滤除蓥 三释。：、哥戳予澡，爨予s n 分教系实壤土怒一个包含驳京、g 旨震俸、药耪 晶体婶萁他胶体微粒在内的多相体系，存放的过程中可能发生粒襁增长或药物 降解，可以冷冻干燥或喷嚣干燥将其制备成固体制剂，以获得长期的物理化学 稳定髓。 缭会蘑蠹癸文熬擐邋，s 聪绘药系统逶蕊予瑟骚、静敦注瓣、禺帮等多静 给药影式，有其特殊的优越性【协。7 】。s l n 管为药物载体的应用裳鼹商以下几方 面： ( 1 ) 作为注射给药系统的载体f 1 8 】；( 2 ) 作为口服给药系统的裁体【19 】； ( 3 终为鼹部给药系统的鼗体口o l ： ( 4 ) 作为经皮绘药系统的载体【2 l l ； ( 5 ) 终先靶囱给药系凌鲮载体辫 ：涵) 箨黄囊莹骢潜在薪墅蒜辩；( 7 ) 终舞墓嚣 转染的藏体 等。 从文献资料来看，s l n 的体外释药特性比较明显。由于s l n 的降解速度对 药物的释放和毒性起关键作用，医此，研究s l n 的降解机制和影响降解速度的 山东大学硕士论文 因素，可更好地控制药物在体内的释放和靶向性。通过选择具有不同熔点的脂 类，在一定程度上控制s l n 中药物的释放，从而达到缓释、控释及靶向特定组 织、细胞的目的。赋形剂( 表面活性剂、助乳化剂等) 的性质对s u q 降解速度 和体内释药非常重要。m l l l l e r 等肼1 通过测定s l n 溶液的浊度和游离的脂肪酸， 研究了采用不同脂质载体和表面活性剂( 包括助乳化剂) 制备的s l n 在胰脂酶， 复合脂酶中的降解情况，结果发现s l n 的降解速度取决于所用脂质载体和表面 活性剂的性质，这对设计特定释药曲线的s l n 具有重要意义。因此，本研究把 去甲斑蝥素制成固体脂质纳米粒可以提高生物利用度，降低毒副作用。 二、去甲斑蝥素制成固体脂质纳米粒的意义 去甲斑蝥素( n o r c 锄_ c i l a r i d i n ，n c t d ) ，商品名：艾力尤，别名依尔康。为 全人工合成的一种抗癌活性成分，与中药抗癌活性成分斑蝥素( c a n ，c a ) 相比，缺 少l ，2 位的两个甲基，立体结构相同。n c t d 克服了c a 刺激泌尿系统的副作 用，在体外试验及临床治疗中显示较好的抗癌效果。n c t d 的分子量：1 6 8 1 4 ， 分子式：c 。h 。o 。常温下为无色结晶性粉末，无臭，稍有刺激性，微溶于水 及乙醇，易溶于热水及丙酮。 i 去甲斑螯素是斑螫素的去甲基衍生物，是我国首先合成的具有较强抗肿瘤 活性和独特的升高白细胞作用的新型抗肿瘤药物，适用于治疗肝癌、食管癌、 贲门癌、肝炎和银屑病，主要用于原发性肝癌的治疗【2 5 之6 】。去甲斑蝥素口服后 吸收较快，在肝、肾、胃、肠及癌组织中均有较高的药物浓度，但口服剂量过 大时会出现恶心、呕吐等症状，对消化道刺激性较大【2 7 也8 】。静脉给药后1 5 m i i l ， 在肝脏、肿瘤组织中达高峰浓度，6 h 浓度显著下降，2 4 h 内大部分从肾脏排泄， 体内蓄积甚少。 固体脂质纳米粒给药系统可控制药物在体内的释放( 缓释) 和提高组织靶 向性。将去甲斑蝥素制成固体脂质纳米粒( n o r c a n _ t l 】a r i d i ns o l i d1 i p i d n a i l o 口枷c l e s ，n c t d s l n ) ，目的在于延长去甲斑蝥素在体内的作用时间，提 高对肝组织的靶向性，以减少对正常组织的副作用，提高疗效。 目前，去甲斑蝥素的微囊【2 9 l 、微剐3 0 1 、壳聚糖纳米粒【3 ”、脂质体圈等新剂 型已有研究报道，但是采用硬脂酸、大豆卵磷脂等生物相溶性好、可降解的材 料制备的去甲斑蝥素固体脂质纳米粒，国内还未见有关报道，具有更广阔的开 9 出糸大学硕士论文 发应用前景。 1 0 山东大学硕士论文 第一部分去甲斑蝥素固体脂质纳米粒的制备 根据文献报道【3 3 】去甲斑蝥素的分析检测方法有紫外分光光度法、衍生化 法、酸碱滴定法和放射示踪法。去甲斑蝥素的水溶性较强，且在酸性、碱性和 中性介质中的表观溶解度均较大。根据文献报道，去甲斑蝥素溶液静脉给药后 1 5 m i n ，在肝脏、肿瘤组织中达高峰浓度，6 h 浓度显著下降，2 4 h 内大部分从肾 脏排泄，体内蓄积甚少。在小鼠体内组织分布快，半衰期短，血药浓度低，达 不到紫外分光光度法的最低检测限( o 2 m 咖1 1 ) 。相比之下，高效液相色谱 法，检测效果较好，方法较简便、灵敏。 固体脂质纳米粒是当前药剂学研究的新型亚微粒即司给药系统，由于其生 物相容性好、理化性质稳定、可控制药物释放以及具有良好的靶向性等优点， 已经成为国内外药剂学研究的热点领域。为提高去甲斑蝥素的肝靶向性，延长 在体内的作用时间，增强疗效，本研究用生物内源性物质硬脂酸为载体材料， 试制了固体脂质纳米粒( s o l i dl i p i d n a n o p a n i c l e s ，s l n ) ，期望改变去甲斑蝥素 体内分布，提高肝脏局部药物浓度，达到提高治疗靶向病灶( 肝部疾病) 目 的。 1 1 仪器与试药 1 1 1 主要仪器w 孔琊6 0 0 型高效液相色谱仪，包括紫外检测器( w 如r s 2 4 8 7 和 n l 锄h y p e r s i lc 1 8 色谱柱) ；j e m 1 2 0 0 e x 透射电镜( 日本电子) ：3 k 3 0 型 高速冷冻离心机( 德国s i g m a 公司) ；9 6 一a 快速混匀器( 姜堰市新康医疗器械 有限公司) ；t g 3 2 8 a 分析天平( 上海精密科学仪器有限公司) ；旋转蒸发仪 ( 德国c m s t 公司) ；超声发生仪( a u t 0s c m n c e ) ；移液枪( g i l s o n ) 。 1 1 2 试剂及药品去甲斑蝥素原药( 山东大学康诺制药有限公司，含量 9 8 5 ，批号0 5 0 7 2 8 ) ；去甲斑蝥素对照品( 中国药品生物制品检定所，纯度 9 9 9 ) ；泊洛沙姆f 6 8 ( s i g n l a 公司) ；注射用大豆卵磷脂( 北京双旋微生物培 养基制品厂) ；硬脂酸( 上海东海制药厂) ；砀t o nx 1 0 0 d b 京化学试剂公司进 口分装) ：乙腈( f i s h e r 公司，色谱纯) ；磷酸( 上海试剂一厂，分析纯) ；无 水乙醇( 分析纯) 。 1 2 固体脂质纳米粒中去甲斑蝥素的h p l c 含量测定法【3 7 。8 】 圭表大学硕女论文 1 2 1 姆液配制 糟襁称取干燥至恒黧的去甲斑蝥素对照晶适量，加无水乙醇超声溶解，制 成1 o 煳咖l 的母液。精密置取母液，用流幼相( 乙腈：p h 3 o 的磷酸水溶液 = | 0 ：9 0 ) 嚣藏系曩蠡壤滚，进襻测定，戮去攀褒鏊素浓度( c ) 凳壤坐凑，峰 面积( a ) 为级坐标，进行线性西好。 1 2 2 离效液相色谱条件：o d s 色谱柱；流动棚为乙腈p m 磷酸水溶液( 1 0 ： 9 0 ) ；流速为o 8 m 呐n i n ；捡测波长为2 2 0 姗；进样量为l o t l l ；a u f s 为2 0 0 0 在本寅疆条停下，去甲嚣凝索与憝方中其键成分蜂褥妥良好分蒜，傈鍪辩瓣鸯 4 - 18 j 4 m 遮。 1 2 3 线性范围：精密称鞭5 0 m g 的去甲斑蝥素予5 0 n l l 量瓶中，用光水乙醇溶解并 定容，从中依次取出o 2 ，o 4 ，o 8 ，1 6 ，3 2 ，6 4 m l 鬣1 0 l n l 量瓶中，以色谱级试剂配制 的流动榻定容。分别从上述滚滚中取出l m l 嚣l o m l 鸯瓶中，加入2 蹦l o 强翻，l 痰溶渡_ 鬻7 越色谱级流动穗，瘸滚麓稳定客至裹线，搿翻爱量浓度为 2 ，4 ，8 ，1 6 ，3 2 ，6 4 n 咖l 的溶液，进样测定，以去甲斑蝥素浓度( c ) 为横坐标，峰 面积( 一) 为纵坐标进行线性回归，得曲线方程为c = o 0 0 2 4 6 a + 0 ，3 1 7 2 ， r = o 9 9 6 7 ，在药物质量浓度2 6 4 n 咖l 内线性关系良好。 强b l l 知s 毛l l t 硪kd 哟燃泌耋至潍o f n c 固照粼鼬匹e 嗽趣妇l i q 撼d 洳g c ( 蕊 3 o )( n = 5 ) 1 2 山东大学硕士论文 3 0 0 0 0 2 f ；0 0 0 2 a 0 0 0 1 5 0 0 0 1 0 0 0 0 5 0 0 0 o y = 如6 5 x 一1 2 8 1 萨= l 0加 4 06 08 0 f i 9 1 1 去甲斑蝥素的h p l c 标准曲线 1 2 4 方法精密度测定：分别将质量浓度为4 ，1 6 ，6 4 n 咖l 的标准溶液加入1 m l 的空白纳米粒( 事先用2 m l1 0 的t r i t o nx 1 0 0 溶解) 中，计算方法回收率， 得高、中、低3 种质量浓度的回收率见1 曲l - 2 。同质量浓度每天测定5 次，连 续测定5 天，得高、中、低3 种质量浓度的日内r s d 分别为4 2 ，3 1 ， 5 7 ，日间r s d 分别为3 5 ，5 1 ，7 9 ，说明方法较稳定、灵敏、可靠。 1 a b l 2t h er e s i l l tp r e c i s i o no f n c ) 诵曲一d a ya n db e t w e e n - d a y ( n = 9 ) 1 2 5 方法回收率精密吸取空白硬脂酸固体脂质纳米粒1 5 份置容量瓶中，加入 2 0n l ll o “t o n x 1 0 0 水溶液，超声使溶解，然后加入去甲斑螯素标准溶液适 量，振摇，加入流动相，定容于1 0 m l 量瓶，分别配成4 o ，1 6 o ，“on 咖l 浓度 的高、中、低三水平的溶液，每个浓度5 份，按上述色谱条件测定，计算回收 率，结果见表1 3 由东丈学硕士论文 1 a b l 3 伯er e c o v 唧o f n c l d 谢也b l a l l l cs l n 由上表可见，该方法离、中、低三浓度的回收率在l o o 1 0 2 之间，r s d 在 o 知o 8 之阕，空自露俸艨震缡米粒对照液对舞骢懿含量测定没鸯影响。 1 2 6 禽蟹溅定方法稽密吸联l 癌样晶混惹浚，热入2m l1 0 翔l o 赫x 1 承溶 液，撮摇，再加入7 i n l 流动相于1 0 叫量瓶，混匀后抽滤( 滤膜为o 4 5 砌) ，照 上述饿谱条件检测，得峰酾积a 1 ，带入标准曲线方程，得样品浓魔c l ( 样品体积 为v 1 ) 。 l 。2 。7 黩赫率溺定薅密塞散去甲斑謦素s 王烈滋悉滚l 承曩手离心警审，曩s i 辫a 离心机，采用2 0 0 0 0 【n ，离心6 0m 诅，取上满液，然后抽滤( 滤膜为 o 4 5 u m ) ，滤液照上述色谱条件下检测，得峰丽积a 2 ，带入标准曲线方程，得 上清液样品浓度c 2 ( 样品体积为v 2 ) 。 山东大学硕士论文 1 1 2 8 包封率的计算把所有检测样品的浓度数据( c l 和c 2 ) 和体积( v l 和v 2 ) 带入计算公式：包封率= ( 混悬液总药量游离药物量) 混悬液总药量，1 0 0 一 ( c i + v l - c 2 v 2 ) ，c l + v 1 1 0 0 。 f i g l - 2 去甲斑蝥素的 口l c 标准图谱 f i 9 1 - 3 空白固体脂质纳米粒的 玎，l c 图谱 由末夭学矮士论文 f i 9 1 珥空囱网体脂质纳米粒加轰甲斑蝥素的肿l c 对照图谱 f i 9 1 5 去甲斑蝥素固体脂质纳米粒的砌，l c 图谱 1 3 去擎囊蝥素霆俸瓣袋绥寒粒戆裁冬【3 务辫l 本研究采用薄膜- 越声分散法：将处方璧的类脂和药物等溶弓：适宜的有机溶 剂中，减压旋转蒸发除嵌有机溶剂，形成屡脂质薄膜，加入禽有乳化剂的水 溶液，用带有探头的超声仪进行超声分散，即可得小而均匀的s l n 。 l 。3 1 潮冬方法 水楣：将处方中计簿嚣的泊洛沙姆f 6 8 稍蒸馏承敖在烧杯中混合，超声谴完 全溶解，随后在容量瓶中定容，即得到不同浓度泊洛沙姆f 6 8 的分散相。 油膜：将处方中适爨去甲斑蝥素药物、磺脂酸和大豆卵磷脂鬣于烧杯中， 用甏承乙醇溶解，超声、灞匀后退速转入骞爨瓶，定容；混匀麓羯滤纸过滤， 山东大学硕士论文 把滤液置于旋转蒸发仪，以6 0 6 2 旋转蒸发1 5 2 0 m i n 制得油膜( 5 1 5 m 1 ) 在 超声仪上，根据实验设计选择不同频率的超声条件，把水相缓缓注入油膜，得 去甲斑蝥素固体脂质纳米粒混悬液。通过均匀设计实验，以包封率为指标优化 制各工艺。 1 3 2 处方筛选及优化 根据预实验的单因素实验结果及相关文献报道【5 5 删，确定影响n c t d s l n 包封率的主要因素有6 个，分别为药物硬脂酸的重量比( 一) 、大豆卵磷脂用量 ( b ) 、泊洛沙姆浓度( c ) 、水相注入油膜速度( d ) 、超声频率( e ) 和油t 膜与分散相( 水相) 的体积比( f ) 。各因素采用无约束配方设计，按u 1 8 ( 1 8 1 1 ) 表均匀设计以上述方法制备n c t d s l n 混悬液，以包封率为评价指标， 实验结果见表l 一6 。 f i gl - 6 均匀设计方案及实验结果 山东大学硕士论文 1 8o 5 0 0 01 8 8 21 3 1 23 1 7 66o 1 1 7 61 5 6 2 应用华军软件- 均匀设计程序进行数据处理，采用二项逐步回归计算得回归 方程，并对方程进行方差分析。结果表明，复相关系数为0 9 9 6 6 ，回归方程有 显著性差异。根据包封率取最大值的原则，由回归方程计算得优化工艺为，药 物一硬脂酸比o 3 5 1 2 、大豆卵磷脂用量1 2 5 1 0 m g l o o m l 、泊洛沙姆浓度 7 8 2 m g m l 、水相注入油膜速度3 2 4 6m i m i n 、超声频率6 和油膜与分散相( 水 相) 的体积比o 1 2 8 6 旋转蒸发温度6 0 较好。结果表明，处方中大豆卵磷脂 的含量越高，药物的包封率越大，这是因为大豆卵磷脂可增加膜强度而利于药 物的包裹。 1 3 3 工艺稳定性的考察 按优化处方工艺制备3 批去甲斑蝥素固体脂质纳米粒，测定去甲斑蝥素纳 米粒的包封率，测得包封率分别为5 4 3 、5 5 2 、5 6 6 ，平均包封率为 ( 5 5 钍1 2 ) 。优化条件下所制备的去甲斑蝥素固体脂质纳米粒包封率在理论 预测范围之内，优化处方重现性好，包封率稳定。 1 3 4 讨论 载药固体脂质纳米粒比较适合于脂溶性药物的制备，但水溶性药物可通过 酯化等方法制成脂溶性强的前体药物后再制成固体脂质纳米粒。由于去甲斑蝥 素固体脂质纳米粒的使用设备简单，条件易于控制，目前国内实验室研究制备 固体脂质纳米粒较常用硬脂酸泊洛沙姆载体系统，因其生物相容性好、理化性 质稳定而倍受关注，成为药剂学研究热点之一【6 1 棚1 。其中硬脂酸是一种机体内 源性生理活性物质，且易于形成油膜，泊洛沙姆和大豆卵磷脂是可用于静脉注 射的无毒表面活性剂，文献报道洎洛沙姆和大豆卵磷脂共用所制得的固体脂质 纳米粒往往具有较小的粒径和较高的贮藏稳定性，因此本文选择用泊洛沙姆 f 6 8 作为乳化剂。液态油膜与水相混合后在表面活性剂泊洛沙姆f 6 8 和超声波 作用下形成固体脂质纳米粒混悬液。 本实验前期先后筛选了乳化蒸发低温固化法、乳化溶剂挥发法、微乳法 和薄膜一超声分散法，均可以得到均匀的n c t d s l n ，但考虑到实际的实验条件 和设施，最后确定了薄膜超声分散法。 在薄膜超声分散法的具体制备过程中，一定控制好水相的温度( 1 0 1 5 ) ，尤其在连续制备固体脂质纳米粒时，要加入冰块降温。 l r 山东大学硕士论文 第二部分固体脂质纳米粒理化性质及初步稳定性研究 为研究所制得去甲斑蝥素固体脂质纳米粒的理化性质，对其粒子微观形 态、粒径大小及分布、表面电动电位、p h 、载药量、初步稳定性等方面进行了 测定，并对其体外释药规律进行探索。另外，还利用差示热分析法( d t a ) 对去 甲斑蝥素固体脂质纳米粒进行了物相分析研究 2 1 实验材料 2 1 1 试剂及药品去甲斑蝥素原药( 山东大学康诺制药有限公司，含量 9 8 5 ，批号0 5 0 7 2 8 ) ；去甲斑蝥素对照品( 中国药品生物制品检定所，纯度 9 9 9 ) ；泊洛沙姆f 6 8 ( s i 鲷1 a 公司) ；注射用大豆卵磷脂( 北京双旋微生物培 养基制品厂) ；硬脂酸( 上海东海制药厂) ；t r i t o nx - l o o ( 北京化学试剂公司进 口分装) ：无水乙醇( 分析纯) 。 2 1 2 主要仪器w a _ 【e r s 6 0 0 型高效液相色谱仪，包括检测器( w 西t 盯s 2 4 8 7 和 t h e r m oh y p e r s i lc 1 8 色谱柱) ；j e m 1 2 0 0 e x 型透射电镜( 日本电子) ；c d r - 4 p 型差动热分析仪( 上海精密科学仪器有限公司) 。激光散射仪( 日本电子公 司) ，) 9 6 一a 快速混匀器( 姜堰市新康医疗器械有限公司) ，t g 3 2 8 a 型分析天 平( 上海天平仪器公司) ，旋转蒸发仪( 德国c l l r i s t 公司) ，超声发生仪( a u t o s c i e n c e ) ，移液枪( g i l s o n ) ，p h 计( 上海雷磁) ，电泳仪。 2 2 方法与结果 2 2 1 去甲斑蝥素s l n 的形态观察、粒径大小及分布 取去甲斑蝥素s l n 混悬液适量加水稀释，滴加在覆盖碳膜的铜网上，用 2 磷钨酸钠溶液染色，在透射电镜下观察( 见下图) 。实验结果表明，纳米粒 呈类球形，粒径范围为1 0 肛5 0 0 衄，见图2 ，2 - 2 。 由窳大学硕士论文 f 1 9 z - lm 1 c r o p h o t o g r 印ho t _ n c t d - s l nl l n d e r 仃a i l s i i l i s s i o ne | e c 呐ni n i c r o s c o p e ( 4 6 0 ，o o o ) $ b 鲥硼# 雄) - _ * - - -。 ll 5o 5 0 潮嘲 d i - m e t e f ( n 巾) f i 9 2 - 2s 妇d i s t r i b 嘶o no f n c t d s l n 2 2 2 去擎斑螯素s 瓣夔表瑟电动滚谴溅定 将去甲斑螯素s l n 用适量蒸馏水稀释后，直接加入外加直流电场的电泳 池，测定其电动电位数值。 测定3 援n c 功s l 蕊瓣电魂魄霞鼗蓬，络祭冕表2 1 。 山东大学硕士论文 t a b 2 11 kz e t ap o t e n _ 叫o f n c t d - s l n 2 2 3 去甲斑蝥素s l n 的p h 值测定 以最优处方制备3 批n c t d - s l n 混悬液，用p h 计分别测定其p h 值，结 果见下表 1 曲2 2 p h o f n c t d s u 4d i s p e r s i o n s 2 2 4 去甲斑蝥素s l n 载药量的测定 以最优处方制备3 批n c s l n 混悬液，按下式计算载药量： 载药量= ( 包封率+ w n c r d ) ，w n c t n s l n 。1 0 0 其中w n c t d 为处方中药物质 量；w n c t ds l n 为冷冻干燥后所得冻干品的质量；包封率= ( 混悬液总药量一游离 药物量) 混悬液总药量+ 1 0 0 多红( c 1 + v l - c 2 + v 2 ) c i + v i + 1 0 0 ；c l 、v l 、c 2 、 v 2 的数据见第一部分制备中的检测结果】，结果如下表。 t a b 2 3d m g l o a d e dc a p a c 埘o f n c t d - s l n 2 2 5 去甲斑蝥素s l n 的d t a 分析 分别取硬脂酸、泊洛沙姆、大豆卵磷脂、去甲斑蝥素等原料为样品和去甲 斑蝥素，s l n 冻干粉末样品及硬脂酸、泊洛沙姆、大豆卵磷脂、去甲斑蝥素等四 者的处方量比例物理混合物为样品。采用c d r 4 p 差动热分析仪，以氧化铝为 参比，升温速率1 0 m i n ，进样量均为1 0 m g 左右，分别进行d t a 扫描，实验 结果表明去甲斑蝥素s l n 中形成了新的物相。 山农大学硕士论文 髭1 0 02 0 0o 辩鲒- 3 去串凝螫素原料药的双a 图谱 3 2t 2 a 略翱附翎啦 f i 醇4 硬腊酸的口i = a 图谱 山东大学硕士论文 a 2 够：徽黪嗣簿壤女磐 f i 9 2 5 大豆卵磷脂的d t a 图谱 f i 蛇一6 泊洛沙姆f 6 8 的d 1 a 图谱 出东大学硕士论文 f 韬- 7 物壤混会物鲍d 强国谱 f i 醇8n c 硼d _ s l n 冻千粉样品图谱 麸l 三乏上图谱黻器窭，n c 秘心王n 在3 7 5 左右形成了锐峰，鞠显不闰予 物理混合物、n c h 原药及各种辅料的图谱，说明形成了新物相。 2 2 6 去甲斑蝥素s t ，n 的体外药物释放研究岬l 2 2 6 。l 去甲斑鍪素程p b s ( 6 s ) 巾豹标准馥线 准确称量去甲斑繁素标品，制备母液( 1 m 幽毗) ，然后用p b s ( 6 8 ) 配制 成2 o ，4 o ，8 。0 ，1 6 o ，3 2 。o ，6 4 o n 咖l 的梯发标准溶液，按上述h p l c 方法 测定蜂颡积a ，霞熬标准馥线，e 锄0 0 3 0 5 a + o 。4 1 5 2 ，瑚9 9 9 3 ，莠送行了梧关 方法学验证。 山东大学硕士论文 t a b 2 4r c s l l l to fm ed 如珊j n a 6 o fn c l