基因工程载体.ppt

第三章基因工程载体,生物科学与技术学院,基因工程载体的概念,把一个有用的基因（目的基因研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫载体。作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。,复制的起始区：能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制。选择标记基因区：可以筛选重组体。多克隆位点：方便外源基因的插入。,第一节质粒载体,质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。,质粒,染色体,质粒的一般生物学特性：分子大小差异大：1200kb编码基因少：23个中等大小的蛋白质。如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。形状：双链环状DNA；线性双链DNA；超螺旋等。,质粒的空间构型：质粒空间构型与电泳速率：同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同，scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。,共价闭合环状DNA（CovalentclosecircularDNA，cccDNA)，呈超螺旋（SC）（supercoil）开环DNA（opencircular，ocDNA），一条链上有一至数个缺口线形DNA（linear，lDNA）,质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可以分为：1、接合型质粒（能自我转移）：除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如：F质粒（性质粒、或F因子）。甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。不符合基因工程的安全要求。2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin）。符合基因工程的安全要求。,大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠杆菌素免疫蛋白（Immunityprotein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数量的作用。大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1。,质粒的复制类型严紧型质粒（stringentplasmid）：拷贝数少，只有13份拷贝。（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。松弛型质粒（relaxedplasmid）：拷贝数多，有1060份拷贝。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。质粒的不相容性又称质粒的不亲和性，在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存，这一现象称为质粒的不相容性,又称质粒的不亲和性。,质粒的复制过程质粒的复制主要是通过型复制和滚环复制两种方式之一进行的，其中以型复制为主。在型复制中，有单向半保留复制和双向半保留复制。,Ori复制起点,型复制,滚环复制,在革兰氏阳性细菌中大多数质粒是以滚环方式复制。,复制起点(ori)区的功能复制起点是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，在其相关的调控元件中含有由质粒或宿主染色体编码的、参与DNA合成起始调控因子的结合位点。在大多数质粒中，与复制有关的蛋白质基因位于ori序列附近，因此ori位点周围的小范围DNA是质粒复制所必需的。如果质粒DNA的大部分区域被去掉，而只保留质粒的ori序列，而且质粒是环状的，则质粒仍然能进行复制。将ori区克隆到一个不能自主复制的环状双链DNA分子上并引入到原核细胞后，该重组DNA具有自主复制能力。分子克隆中常用的质粒载体就是以这种方法构建的，同时用这种方法可以确定哪部分DNA是ori区并研究ori区的功能。ori区域常决定了质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。,质粒的命名用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez，322为编号。,质粒载体的构建天然质粒的局限性1、分子量大，拷贝数低，第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长9.1kb。但只有一个EcoRI切点充当克隆位点，Tetr作为筛选标志。EColRI酶切位点位于Tetr基因外部，外源基因插入不会引起筛选基因失活，因此无法区别重组体和野生型质粒。2、天然质粒ColE1质粒，长度为6.3kb，唯一的EcoRI酶切位点位于筛选标志基因大肠杆菌素E1（colicinE1）内部。colicinE1能杀死不含ColE1质粒的菌，形成“噬菌斑”。可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicinE1的细胞。质粒载体的发展概况第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。第二阶段：增大载体容量(降低载体长度)，建立多克隆位点区和新的遗传标记基因,如pUC系列载体。第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。,理想质粒载体必须具备的基本条件：1、具有复制起点（ORI）2、具有抗菌素抗性基因：是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。3、若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源DNA片断。且插入后不影响复制功能。4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。,质粒的选择标记及其工作原理：抗菌素抗性绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记.氨苄青霉素抗性（Ampr）:青霉素的衍生物。氨苄青霉素通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的-内酰胺环。卡那霉素抗性（Kanr）:卡那霉素通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读，从而杀死细菌。Kanr编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。四环素抗性（Tetr）:四环素通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。Tetr编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。链霉素抗性（Strr）:链霉素通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译，从而杀死细菌。Strr编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用。氯霉素抗性（Cmlr）:氯霉素通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。Cmlr编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。,人工构建的质粒载体的类型高拷贝数的质粒载体pColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数10003000个。适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。低拷贝数的质粒载体由pSC101派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低，不适合大量扩增DNA用。但当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。如pLG338、pLG339、pHSG415等。失控的质粒载体温度敏感型复制控制质粒，温度低于37度，拷贝数很少；温度增加，大于40度时，拷贝数会很快增加到1000个以上。B.E.Uhlin于1979年构建的载体如pBEU1、pBEU2等。,插入失活型质粒载体载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。如pDF41、pDF42、pBR329。正选择的质粒载体直接选择转化后的细胞。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。如pUR2、pTR262等。目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。表达型质粒载体主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录翻译信号控制之下。克隆质粒载体专用于基因和DNA片段无性繁殖的质粒载体。纯粹的获取基因和DNA片段。,常用的质粒载体,pBR322,1、元件来源复制起点oripMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点Ampr基因pSP2124质粒的Ampr基因Tetr基因pSC101的Tetr基因。2、长度4363bp3、选择标记氨苄青霉素和四环素抗性4、克隆位点24个克隆位点，其中9个会导致Tetr基因失活（如BamHI、Hind、SalI）；3个会导致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。,利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程,BamHI片段(Tcr),pBR322,PstI(Apr)片段,重组分子(ApsTcr),PstI片段,外源DNA,BamHI片段,重组分子I(AprTcs）,分别转化E.coli(ApSTcS),重组分子(ApsTcr),影印到Tc平板上,AprTcr为原载体即为非重组子,影印到Ap平板上,重组分子I(AprTcs）,涂布Ap平板,Apr转化子,涂布Tc平板,Tcr转化子,AprTcS为重组子,ApSTcr为重组子,影印,pBR322的优点,双抗菌素抗性选择标记没有获得载体的寄主细胞在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞在Amp或Tet其中之一中死亡。分子小，克隆能力大载体越小越好。10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。高拷贝数氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy。安全失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。,pBR322的缺点,保留了转移蛋白（mob）的作用位点。能够被pColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移！,pBR322的改良,删除mob识别位点如pAT153，pBR322的改造衍生质粒，除去了mob识别位点，同时增加质粒的拷贝数。改造EcoRI位点如pBR325，使EcoRI也成为插入失活型位点。在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基因cmlr）。cmlr上也带一个EcoRI位点。,cmlr,常用的质粒载体,pUC系列,UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。,1、元件来源复制起点ori-pBR322的oriAmpr基因-pBR322的Ampr基因大肠杆菌-半乳糖基因（lacZ基因）多克隆位点（MCS）区段-位于lacZ基因中的靠近5-端。2、长度约2.7kb,3、克隆位点10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ基因的5端。4、选择标记PUC系列质粒载体的选择标记是Ampicillin抗性和lacZ的a肽互补（蓝白斑）相结合。,乳糖操纵子调节机制,乳糖操纵子(lacoperon)的结构,-半乳糖苷酶,-半乳糖苷酶和Xgal的显色反应,-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸），也叫-肽（lacZ）。,Xgal是一种人工工合成的、无色的乳糖类似物；-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。,lacZ只有在4聚体的状态下才有功能.,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,4聚体,大肠杆菌-半乳糖基因（lacZ基因）-蓝白斑选择原理,1、b-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝；2、a-肽，也叫lacZ，是b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断，lacZ只有在a-肽形成4聚体的状态下才有功能。若受体菌lacZ突变，受体菌本身的b-半乳糖苷酶失效，不能分解Xgal。3、pUC载体上LacZ的5端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ的合成。4、IPTG的诱导作用：IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ的C端部分和载体的lacZ都表达。5、IPTG诱导的结果：MCS无插入时，互补，蓝菌斑；MCS有插入时，不互补，白菌斑。,1、更小的分子量。如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp。2、选择方便。Xgal显色、抗菌素双重直接选择。3、克隆便利。具有多克隆位点4、测序方便。现在最常用的pUC载体是pUC18，它的分子量小，具有多克隆位点和易于选择的分子标记，并且是松弛型复制，在正常情况下，它的拷贝数可达上千个，所以不需要用氯霉素进行扩增。,pUC系列载体的优点,PCR产物克隆载体-T载体,1pMD系列载体：Takara公司开发的一种高效克隆PCR产物(TACloning)的专用载体。它由pUC18载体改建而成。在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3端添加“T”而成。,pUC18载体,EcoRV的酶切位点：,常用的质粒载体,穿梭质粒载体,人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。常用的穿梭质粒载体有：大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体大肠杆菌-动物细胞穿梭载体。,穿梭载体的优点：利用大肠杆菌进行基因克隆、表达；也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达；可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。,f1origin是f1噬菌体基因组DNA的复制区序列，可引导单链DNA复制过程。pUCorigin是大肠杆菌复制区序列，可引导双链DNA复制过程。2uorigin是酵母菌的复制区序列，可引导双链DNA复制过程。,大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体,pcDNA3.1(+)质粒谱图及其用户实验手册讲解,ImportantInformation,MethodsOverview,CloningintopcDNA3.1,MultipleCloningSiteofpcDNA3.1(+),多克隆位点,MultipleCloningSiteofpcDNA3.1(-),pcDNA3.1VectorsMap,pcDNA3.1VectorsMapFeatures,常用的质粒载体,表达载体,原核表达载体：适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。1、普通载体元件复制起始点ORI选择标记多克隆位点MCS2、大肠杆菌操纵子元件阻遏基因I操纵基因O启动基因P核糖体结合位点序列（SD）转录终止信号区,如果在大肠杆菌里表达蛋白，必须把所克隆的目的基因置于大肠杆菌的转录翻译信号控制之下。,1)特点:a.基因的启动子序列和终止子序列；b.一般无检测标记基因；c.克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）；d.重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。2)结构:a.转化单元-宿主细胞转化b.表达单元-外源基因表达3)类型:型：转录起始区（调控序列+启动子）+终止子型：转录起始区+翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）+终止子型：转录起始区+翻译起始区+信号肽链编码区+终止子（常称之为表达分泌型载体）,表达载体（expressionvector）,显然，不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提供。换言之，被表达的外源基因一旦确定，表达载体的类型也就确定了。例子：pET-43和pPIC9K4)用途:a.表达外源基因以产生大量外源基因产物b.用于构建cDNA文库5)注意事项:a.启动子来源b.终止子来源c.启动子的启动效率d.信号肽来源与结构e.调控类型,1.质粒稳定遗传必须的两个条件：（1）每个世代、每个质粒至少要复制一次；（2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分配到两个子细胞中。,六、质粒载体的不稳定性,2.质粒分配方式：有主动分配和随机分配两种假说。（1）主动分配。天然质粒具有一个控制质粒拷贝分配的功能区（Par），能以主动分配的方式确保质粒能正确分配到两个子细胞中。（2）随机分配。人工构建的质粒载体缺失了par区，只能以随机分配方式分到子细胞中。一般情况下也能保证质粒的稳定遗传，但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。,3.质粒分离的不稳定性（segregationinstability）在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。,4.结构的不稳定性（structuralinstability）寄主基因组的IS序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。,IS,dimer,重组,5.影响质粒载体稳定性的主要因素,（1）新陈代谢负荷：a、复制负荷b、转录和翻译负荷使寄主细胞生长减缓：质粒载体使寄主的世代时间延长约15%。减缓的程度与质粒的分子量成正比。丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！（2）质粒载体的拷贝数质粒载体的拷贝数是产生无质粒细胞的重要原因。差度（variance）：每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完全相同，称差度。低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷贝数的菌体多，发生丢失的可能性大。（3）寄主菌的重组体系含有大分子量插入片断的质粒载体普遍能形成质粒二聚体。二聚体灾难（dimercatastrophe）：质粒在寄主的重组酶作用下会发生重组形成二聚体质粒。二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！导致质粒失控。,第二节噬菌体载体,一、噬菌体的一般特性噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌病毒（Bacteriophage）。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。噬菌体的蛋白质外壳内包裹着的DNA，DNA有双链、单链、线性、环状等结构。,二、噬菌体的生活周期1.溶菌周期烈性噬菌体感染细菌后，立即在菌体内复制DNA和合成外壳蛋白质，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。2.溶原周期温和噬菌体感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中,这一过程称为溶源化。整合到细菌染色体上的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。,噬菌斑,三、噬菌体载体,噬菌体是线性双链DNA病毒，具有末端互补的12nt的5-突起末端（5-GGGCGGCGACCT-3），该末端称为cos位点，可被编码的末端酶所识别感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48531bp，含50多个基因。,噬菌体基因大致分为4个区：编码头、尾部蛋白质为结构区，AJ共19个基因组成；重组区为att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission）等组成；调控区由启动子、终止子等基因组成；O-R为裂解区。,结构区,重组区,调控区,裂解区,噬菌体及其组件的应用,噬菌体可以容纳较大的目的基因。例如用置换法可去掉长达20kb的DNA，换入相应长度的目的基因。,CIts857,噬菌体从溶原转为裂解是一种可诱导过程。诱导的因素很多，实验室常用的是热诱导。如分离得到某些噬菌体clts857，在低温时（30）建立溶原，用高温（420C）则出现裂解。这些噬菌体的cl基因是温度敏感突变型的，称为c1ts。clts1857可作为组件插入质粒DNA内。目的基因插在clts857下游，重组体的目的基因在42表达，30不表达。这种方法称为热诱导表达，使用的是温敏开关。,PL和PR,PL和PR是噬菌体上2个主要的启动子，都是启动能力相当强的转录构件。把启动子连同其附属成分，将pBR322的tetr基因进行替换，成为以启动子为组件的质粒。,-DNA载体的构建,噬菌体的缺陷：1、基因组太大（49kb）；2、酶切点太多，它有5个BamH1位点（GGATCC），6个Bg位点（AGATCT），5个EcoR位点（GAATTC）。3、野生型只能接纳一定长度的DNA。噬菌体的改造：1、切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）；2、去掉太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口；3、增加标记基因；4、引入无义突变。载体类型：1、插入型载体：通过特定的酶切位点允许外源DNA片断插入的载体（0-11kb)。2、置换型载体：允许外源DNA片断替换非必需DNA片断的载体(9-23kb)。,-DNA载体的选择标记,1、lacZ基因：IPTG/X-gal2、基因c失活（热敏感）3、Spi筛选：野生型的l噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+），这种生长抑制表型受-DNA上的red和gam两个基因控制。若将外源DNA取代red和gam，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑。,代表性噬菌体载体1、插入型载体-gt10载体2、置换型载体-EMBL3,基因c被一段来自434噬菌体的片段imm434替换了，其中内有一个EcoR位点。,在填充片段两端带有对称的多克隆位点。,四、单链噬菌体载体1M13噬菌体的生物学M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染革兰氏阳性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。M13噬菌体的基因组为单链DNA（+DNA），由6407的碱基组成。基因组90%以上的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因和基因以及基因和基因之间，其间有调节基因表达和DNA合成的元件。M13噬菌体基因组可编码3类蛋白质，包括复制蛋白，形态发生蛋白，结构蛋白。,M13没有包装限制：,2、单链噬菌体的特点：（1）存在两种类型，ssDNA和RFdsDNA；（2）+DNA（ssDNA）；（3）复制型（RF）是双链环状DNA；（4）RFdsDNA和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌，并产生噬菌斑；（5）不存在包装限制；（6）可产生大量的含有外源DNA插入片断的单链分子，便于作探针或测序。,J.Messing证明，IG区存在M13的复制起点，可以插入外源DNA而不影响M13噬菌体的活力。,M13的生活周期,雄性细菌的F性菌毛：仅见于少数革兰阴性菌，比普通菌毛略微稍粗，一个菌体只有14根，通常由质粒编码。带有性菌毛的细菌具有致育能力，称为F+菌或者雄性菌。雄性菌的遗传物质能通过性菌毛传递给F-菌，这个过程称为接合。细菌可以通过这个方式传递耐药性以及毒力。此外，性菌毛还是某些噬菌体感染宿主菌的受体。,3.M13载体的构建单链DNA的酶切和连接是比较困难的，因此M13噬菌体在用作载体时是利用其双链RFDNA。RFDNA很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。1）载体的插入位点在M13噬菌体基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源DNA。基因和基因之间的508bp间隔区是主要的外源片段插入位点。在基因和基因之间的小间隔区也可用来插入外源片段，但是在操作过程中，需要获得感染细胞的菌落进行影印筛选，比利用可见的噬菌斑方法更慢更麻烦。2）M13噬菌体载体组成现在所使用的M13噬菌体载体是Messing及其同事建立的mp系列载体，以基因和基因之间的区域作为外源DNA插入区。mp载体系列都是从同一个重组M13噬菌体（M13mpl）改造而来的。在M13mpl载体中，间隔区内的Hae位点插入了一小段大肠杆菌DNA，引入laz的互补筛选。,3）M13载体系列M13载体系列的命名：M13mpn，n代表系列数字。对M13mp1的改进：加上常用的酶切位点。如B.Gronenborn和J.Messing1978年把LacZ5端的第13个核苷酸G突变成A，产生了一个EcoRI切点，构建成M13mp2。对M13mp2的进一步改进产生了M13mp系列载体。在M13mp2的LacZ的5端加上一段人工合成的多克隆位点（MCS）。如M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19。4）M13mpl8和M13mpl9M13mpl8和M13mpl9这两个载体含有13个不同的酶切位点，可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的DNA片段。M13mpl8和M13mpl9DNA的全序列已经测定完成，这两种载体只是在lacZ区内不对称的多克隆区的方向上有所不同。M13mpl8和M13mpl9轻易不能重新环化。仅当连接混合液中含有带匹配末端的外源双链DNA片段时，方可闭合成环。这一片段在M13mpl8和M13mpl9中将以两个互为相反的方向插入。这样一来，在M13mpl8重组体的子代噬菌体内含有外源DNA的一条链，M13mpl9重组体的子代噬菌体内则含有它的互补链。故用M13mpl8和M13mpl9作为一对载体，就可能用一个引物，从所插入DNA片段的任一端开始，测定互为相反的两条链的DNA序列，并可制备只与外源DNA的任意一条链互补的DNA探针。,M13mp1,M13RF,BsuI不完全消化,各种长度的线性片断,（其中应有只在IG上切开的线性全长M13）,E.colilac基因的HindII片断(lacI、lacP、lacO、lacZ）,JM101宿主,只有在IG区插入lacZ才能存活并在Xgal上出现互补的蓝噬菌斑,4.M13系列载体的优点：（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段。（2）Xgal显色反应，可供直接选择。（3）无包装限制，克隆能力大。（4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链（子代M13噬菌体中包含的是单连+DNA）。5.M13载体的缺点：（1）插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降。（2）实际克隆能力小于1500bp（虽无包装限制，并非无限包装）。,五、COS质粒载体,cosmid是英文cossite-carryingplasmid的缩写,也称粘粒、柯斯载体。本意是带有粘性末端位点的质粒,因此,柯斯质粒是人工建造的的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。1.结构特点：在普通质粒载体中插入一个或两个来自的cos位点片段，双cos载体比单cos载体易于重组，cos结构长200bp，由以下几个亚单位组成：a.cosN末端酶的gpA亚基识别和切割，产生5-12nt突起；b.cosB分别位于cosN的两侧，称之为cosBL（左侧）和cosBR（右侧），为末端酶的结合位点。,优点：1、容量大（可达45kb），用于基因簇的克隆；2、形成的重组DNA分子可进行体外包装，并能感染E.coli细胞（在细胞内不能形成噬菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑）；3、操作简便，可直接转化细胞；4、对重组DNA分子长度具有选择性包装；遗传标记：与质粒载体相同，利用抗生素抗性选择转化子，例子:pJB8和C2XB,六、噬菌粒载体（phagemidvectors）噬菌粒（phagemid）实际上是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，具有ColE1复制起点及抗生素抗性选择标记的质粒，以及丝状体噬菌体的间隔区。此间隔区含噬菌体DNA合成的起始与终止及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用序列。含噬菌粒的细菌被噬菌体感染后，基因蛋白可作用于噬菌粒的间隔区，启动滚环复制产生ssDNA并进行包装。噬菌粒具有以下特征：双链DNA既稳定，又高产，具有常规质粒的特征；免却了将外源DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一既繁琐又费时的步骤；由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链；两种复制形式：既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。因此，既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。噬菌粒的主要优点在于它可以产生大段外源DNA的适量单链拷贝，又不必担心发生缺失突变，而这些外源DNA区段常常由于太大而不能克隆于常规M13载体。但许多噬菌粒都有一个主要缺点，即辅助噬菌体感染后，有时候单链DNA的产量较低且重复性较差。,第三节人工染色体载体,酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC)：YAC人工染色体载体是利用酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。A.W.Murray1983年形成YAC构建理论,D.T.Burke等1987年变为现实。酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为90分钟；含16条染色体，每条的大小为225-1900kb；具真核mRNA的加工活性。,（1）DNA复制起始点（ori）（2）着丝粒（centromere，cen）（3）两个端粒（telomeres，tel）,染色体复制和遗传的三个基本组件：,TEL,TEL,CEN,ORI,（1）着丝粒区（CEN）,AAGTCACGTG,TTGTTTCTGNTTTCCGAAA,酵母染色体着丝粒区的保守序列:,I,II,III,78-86bp,酵母第3、4、6、11号染色体的着丝粒区序列,YAC的组成结构,（2）端粒（TEL）,两个端粒保守序列是(G4T2)n重复序列。如人是TTAGGG重复序列;四膜虫是GGGTTG重复序列。,（3）复制起点（ORI）,约100bp的自主复制序列（ARS）。,（4）克隆位点,克隆位点位于SUP4基因内部。插入外源基因导致SUP4酶失活，酵母菌落呈红色；不失活的菌落是白色。,（5）在酵母中的标记基因,TRP1（色氨酸缺陷）、URA3（尿嘧啶缺陷），分别位于两臂。,（6）在细菌中操作,细菌的复制起点ori和抗生素标记Ampr,（一）YAC人工染色体载体的复制元件（1）两个端粒重复序列（telomericrepeat，TEL）：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。（2）着丝粒（centromere，CEN）：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如pYAC4使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。（3）自主复制序列（autonomouslyreplicationsequences，ARS）一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA进行双向复制所必须的信号。（二）YAC的特点（1）只能在酵母细胞中扩增。（2）克隆容量大，为230kb-1700kb。（3）构建原理是按染色体结构构建。,（三）YAC的组成结构（1）着丝粒区（CEN）：酵母染色体着丝粒区的保守序列由三个区组成。（2）端粒（TEL）：两个端粒序列Tel。酵母端粒保守序列是(G4T2)n重复序列。（人是TTAGGG重复序列;四膜虫是GGGTTG重复序列）（3）自主复制序列（ARS）：约100bp的自主复制序列（ARS）。（真核生物中只有酵母菌有ARS）（4）克隆位点：位于SUP4基因内部。（5）选择标记：YAC载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因trp1、leu2和his3、尿嘧啶合成缺陷型基因ura3等，以及赭石突变抑制基因sup4。与YAC载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因sup4的载体存在于细胞中时，可抑制ade2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源DNA片段插入的重组子。（6）在细菌中操作：细菌的复制起点ori和抗生素标记Ampr。,（三）YAC的组成结构（1）着丝粒区（CEN）：酵母染色体着丝粒区的保守序列由三个区组成。（2）端粒（TEL）：两个端粒序列Tel。酵母端粒保守序列是(G4T2)n重复序列。（人是TTAGGG重复序列;四膜虫是GGGTTG重复序列）（3）自主复制序列（ARS）：约100bp的自主复制序列（ARS）。（真核生物中只有酵母菌有ARS）（4）克隆位点：位于SUP4基因内部。（5）选择标记：YAC载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因trp1、leu2和his3、尿嘧啶合成缺陷型基因ura3等，以及赭石突变抑制基因sup4。与YAC载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因sup4的载体存在于细胞中时，可抑制ade2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源DNA片段插入的重组子。（6）在细菌中操作：细菌的复制起点ori和抗生素标记Ampr。,（四）YAC克隆外源DNA主要是用来构建大片段DNA文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。当用内切酶切割YAC载体成线状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要顺式元件，如自主复制序列、着丝粒和位于两端的端粒。这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配，决定这个微型染色体可以携带酵母染色体大小的DNA片段。对于线形化的微型酵母染色体，当切割抑制基因sup4内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中，达到克隆大片段DNA的目的。装载了外源DNA片段的重组子导致抑制基因sup4插入失活，从而形成红色菌落；而载体自身连接后转入到酵母细胞后形成白色菌落。这些红色的装载了不同外源DNA片段的重组酵母菌菌落的群体就构成了YAC文库。YAC文库装载的DNA片段的大小一般可达200-500kb，有的可达1Mb以上，甚至达到2Mb。,（五）YAC转化过程,（1）宿主酵母菌：trp-和ura-。如AB1380。（2）选择方式：只有同时得到YAC的两个臂（色氨酸，尿嘧啶），才能在基本培养基（不加TRP和URA）上生长。,酿酒酵母各种人工染色体载体的特征,a.每次细胞分裂仍有约1%的载体DNA从染色体上脱落下来b.在选择培养基中15-20代后，10-30%的转化子丢失载体DNAc.非孟德尔式分离，主要是4+：0-d.无丝分裂时有3-14%转化体丢失质粒，有丝分裂时有3%转化体质粒不发生分离在选择培养基上丢失质粒的转化体低于1%,第四节动物病毒载体,质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40（SimianVirus40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或作基因治疗等。,一、反转录病毒载体,属于正链RNA病毒，显著的特点是具有2倍体基因组。两个相同的RNA分子在5端附近经氢键连接形成70SRNA，这种结构可能在逆转录过程中起调节作用。,反转录病毒的基因组结构,类似于真核细胞mRNA。LTR是长末端重复序列。在病毒基因组整合中至关重要。整合时，整合酶在U5-U3连接处切开双链DNA，随机插入到宿主基因组里。LTR本身还具有启动子和polyA加尾信号的功能。U5、U3：5段或3端独特序列。y+：组装时必需的非编码序列。env：外壳蛋白。pol：反转录酶和整合酶。gag：核心蛋白。,（三）反转录病毒载体构建（1）删除pol、env和gag基因。（2）插入标记基因（如neor）（3）外源基因和启动子插入到y+下游。（四）反转录病毒载体的包装（1）包装细胞系的构建反转录病毒DNA转化细胞的效率很低，必须包装成病毒颗粒转染细胞。用两个缺失了y+的反转录病毒染色体转化细胞，以制造病毒外壳蛋白。（2）载体RNA的包装用载体DNA转化包装细胞系。转入的载体DNA上带有y+，转录成的载体RNA就会被包装细胞中原有的病毒外壳蛋白识别包装成重组病毒颗粒。（五）反转录病毒载体的优点（1）将DNA插入宿主基因组的随机位点上。（2）侵染范围广、感染率高。（3）整合的原病毒在宿主基因中比较稳定，拷贝数目较低。（4）包装的外源DNA可达10kb。（5）反转录病毒感染哺乳动物细胞，对宿主细胞没有毒性。（反转录病毒一般只感染处在分裂状态的细胞）,DNA病毒载体腺病毒载体,（一）腺病毒的基因组：是线状双链DNA病毒，基因组中有14个基因。共同特点是都带有倒置的末端重复（ITR），在病毒的复制过程中起非常重要的作用。（二）腺病毒的优点：（1）比较安全，无致病、致癌、致畸作用。（2）宿主范围广：不仅能感染有分裂能力的细胞，也能感染不能分裂的细胞。（3）可以在呼吸道和肠道中繁殖，可以通过口服或喷雾的方式感染。（4）载体中的插入片断可达7.5kb（有包装容量限制）。（5）腺病毒容易制备、纯化。（6）基因组结构和功能了解得清楚。,（三）腺病毒载体目前最常用的基因治疗载体之一。腺病毒载体的构建:用同源重组的方法插入外源基因。（1）删除腺病毒DNA一些非必需区。如E1或E3区，增加插入能力。（2）构建质粒载体。含有E1或E3区两侧的同源序列，并在同源序列之间插入外源基因和选择标记基因。（3）把质粒切成线性（4）共同转染细胞。在细胞中发生同源重组，把外源DNA加到病毒基因组中，并包装成重组病毒颗粒。（四）重组腺病毒DNA在细胞中的生存（1）以游离的附加体形式存在于细胞中。不能整合到细胞基因组中。基因表达时间短。（2）E1是腺病毒繁殖的必需区。缺失E1的重组腺病毒必须在已经被腺病毒（辅助病毒）感染的细胞中繁殖。（3）E3区对腺病毒的繁殖不是必需的。缺失E3的重组腺病毒不需要辅助病毒。,宿主系统,E.coliDH5a菌株在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的-半乳糖苷酶氨基端实现-互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。基因型：F-，80dlacZM15，(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，-，thi-1，gyrA96，relA1E.coliBL21(DE3)菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。该菌适合表达非毒性蛋白。基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB），gal，dcm（DE3）E.coliJM109菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZM15进行-互补，从而显示-半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi1，hsdR17，supE44，relA1，（lacproAB）/FtraD36，proAB+，lacIq，lacZM15E.coliTOP10菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。基因型：F-，mcrA(mrr-hsdRMS-mcrBC)，80，lacZM15，lac74，recA1，ara139(ara-leu)7697，galU，galK，rps，(Strr)endA1，nupG,基因工程中常用的工程菌,1、基因重组相关的基因型recA(Recombination)表达ATP依赖型DNA重组酶，具有对DNA放射性损伤的修复功能。Del-recA说明此菌株的表现型是重组缺陷的。recB(Recombination)表达ATP依赖型DNase和核酸外切酶V的一个亚基，对recA的DNA重组酶起辅助和促进作用。DNase催化双链DNA的解旋和解链，核酸外切酶V催化单链DNA的裂解，在DNA的重组和损伤修复中发挥重要作用。recC(Recombination)表达核酸外切酶V、ATP依赖型的核酸内切酶、解旋酶和ATP酶，它们和recA,recB所表达的酶相互协调作用，在DNA的重组及放射性损伤的修复中发挥作用。,大肠杆菌基因型及遗传符号说明（1）,2、甲基化相关的基因型dam(DNAadeninemethylase)表达DNA腺嘌呤甲基化酶，它能催化特异序列GATC中A的甲基化，保证DNA免受限制性核酸内切酶MboI的切断，同时在DNA复制时也起一定的辅助作用。dcm(DNAcytosinemethylase)表达DNA胞嘧啶甲基化酶，它能特异性识别DNA双链上的CCWGG序列，并使第二个C甲基化，即CmCWGG,避免DNA受到相关限制酶的切断。hsdM表达DNA甲基化酶，该酶是I型限制酶复合体(具有对DNA切断和修补的双重功能)的一部分，它能使DNA双链上的AA(双腺嘌呤)甲基化，保护宿主DNA不被分解。,大肠杆菌基因型及遗传符号说明（2）,3、核酸内切酶相关的基因型hsdR表达I型限制酶EcoK(K12株)或EcoB(B株)，在大肠杆菌细胞中起到一种”抗体“的作用，对外来的各种DNA有严格的限制。hsdS表达的特异性蛋白是I型限制酶EcoK或EcoB复合体中的一部分，它专门负责hsdR酶和hsdM酶对DNA序列的特异识别。endA(Endonuclease)表达非特异性核酸内切酶，它能使所有DNA双链解开，在DNA的复制和重组中起重要作用。,大肠杆菌基因型及遗传符号说明（3）,大肠杆菌宿主的限制和修饰系统（hsdR、hsdM和hsdS）,hsdS,hsdR,hsdM,(1)hsdR(HostspecificitivedefectiveRestriction)限制性内切酶(EcoKIK12株或EcoBIB株)识别特定位点(EcoKI识别5.AAC(N)6GTGC序列，EcoBI识别5.TGA(N)8TGCT序列)并随机切断DNA。(2)hsdM(HostspecificitivedefectiveMethylation)DNA甲基化酶识别特定位点并甲基化(3)hsdS辅助hsdR和hsdMD,4、停止密码子相关的基因型supE(SuppressorE)表达的阻遏蛋白与停止密码子UAG结合，使蛋白质合成停止。supE基因变异时，不能表达正常的阻遏蛋白，遇到停止密码子UAG,蛋白质合成仍能继续，并使UAG作为一个密码子编码谷氨酰胺（Glutamine）。supF表达的阻遏蛋白与停止密码子UAG结合，使蛋白质合成停止。supF基因变异时，不能表达正常的阻遏蛋白，遇到停止密码子