（海洋化学专业论文）我国近海浮游植物色素的荧光光谱特征分析.pdf

我国近海浮游植物色素的荧光光谱特征分析 摘要 浮游植物种类和数襞的监测足海洋科学研究中一项例行的基础性工作，随着 全球，特别是我国近海赤潮频发，迫切需要能够直接、快速进行浮游植物种类和 数量分析的方法。三维荧光光谱能给出整个激发、发射波长范围的全部荧光信息， 通过对不同藻类色素的三维荧光光谱特征提取，应用化学计量学方法可以直接进 行多组分混合物的定性、定量分析。 本文选取中国东海黄海赤潮多发区的1 8 种分属于五个门类的常见浮游植物 ( 甲藻6 种：东海原甲藻p r o r o c e n t r u md o n g h a i e n s e ，微型原甲藻p r o r o c e n t r u m m i n i m u m ，塔玛亚历山大藻a l e x a n d r i u mt a m a r e n s e ，链状亚历山大藻a l e x a n d r i u m c a t e n e l l a ，微小亚历山大藻a l e x a n d r i u mm i n i t u m ，红色裸甲藻g y m n o d i n i u m s a n g u i n e m ；硅藻9 种：中肋骨条藻s k e l e t o n e m ac o s t a t u m ，旋链角毛藻c h a e t o c e r o s c u r v i s e t u s ，小角毛藻c h a e t o c e r o sm i n u t i s s i m u s ，扁面角毛藻c h a e t o c e r o s c o m p r e s s u s ，扭链角毛藻c h a e t o c e r o st o r t i s s i m u s ，柔弱角毛藻c h a e t o c e r o s d e b i l i s ，柔弱根管藻r h i z o s o l e n i ad e l i c a t u l a ，海链藻属t h a l a s s i o s i r as p ，圆海链 藻t h a l a s s i o s i r ar o t u l a ，布氏双尾藻d i t y l u mb r i g h t w e l l i ；绿藻1 种：蛋白核小球 藻c h l o r e l l a p y r e n o i d o s a ；金藻1 种：等鞭金藻l s o c h r y s i s g a b a n a ) 。萃取上述藻 类的色素，进行荧光特征提取，以期在纲或更细层次识别典型浮游植物。本文主 要研究成果如下： l 对不同藻类色素提取液，固定荧光发射波长6 8 0 n m ，测量激发荧光光谱。 由于藻类所含有色素的荧光激发波长范围不同，不同属的荧光激发光谱属脚差异 大，可以辨别到属；同一属内部藻种的荧光激发光谱特征具有一定的差异，不能 辨别某些相似程度很高的藻种，如塔玛亚历山大和链状亚历山大。 2 分别对1 8 种藻的3 个平行样品的三维荧光光谱进行统计分析，采取降维 的方法，对三维光谱进行奇异值分解，取前5 个主成分重构后分解得到的得分矩 阵第一列u 1 与载荷知阵的第一列v 1 分别埘应发射光谱和激发光谱的作为典楚 特征谱，具有区分部分藻种的能力。实验所选取的1 8 种藻，大部分可以根据发 射和激发特征谱峰形和位嚣的不日j 加以区分，而a e 和a t ，c o 和p r ，c h 和肼 对对之日】特征差异小，不能区分开来。 3 设计氮磷锌锰的正交试验，研究东海原甲藻和塔马亚历山大藻在不同化学 因子综合作用下色素的荧光特征，测试荧光特征谱的稳定性。发现同一种藻在不 同化学因子控制下的特征谱相似，可以作为辨别特征。 4 在氮磷锌锰的正交试验中，四个因子的三个水平对东海原甲藻比生长率 影响顺序大小为：p 0 4 知 n 0 3 m n 2 + z n 2 + ；稳定生物鼍与比生长率的关系并不 致，影响稳定生物垦顺序为p 0 4 h n 0 3 m n 2 + z n 2 + ；影响单位细胞叶绿素a 含鼍大小顺序为p 0 4 3 。 m n 2 + z n ” n 0 3 。；锌限制条件下，藻液中出现异常胶联 现象，说明低锌对藻类生理机制和光合作用产生限制。 5 在对塔玛哑历山大藻的正交试验中，四个因子的三个水平对塔玛眨历山 大藻比生长率的影响顺序大小为：n 0 3 z n 2 + m n 2 + p 0 4 孓；影响稳定生物跫顺序 为n 0 3 。 p 0 4 m n 2 + z n 2 + ；对单位细胞叶绿素a 含量大小顺序为 n 0 3 - z n 2 + m n 2 + p 0 4 3 _ 。 综上所述，本论文用主成分分析方法对藻类色素的三维荧光光谱的特征提取 进行了研究，经过重构的二维特征谱，具有一定的种属分辨能力。 关键词：浮游植物；藻；三维荧光光谱；特征光谱；色素 s t u d i e so nf l u o r e s c e n c es p e c t r ac h a r a c t e r i s t i c so fp h y t o p l a n k t o n p i g m e n t s a b s t r a c t m o n i t o r i n gp h y t o p l a n k t o nc l a s s e sa n dt h e i ra b i d a n c e i sf tr o u t i n et a s ki n m a r i n ee c o l o g yr e s e a r c h w i t lt h ef r e q u e n to c c u r r e n c e so fr e dt i d e ，t h e r ei sa l lu r g e n t n e e df o rr a p i da n a l y s i sm e t h o d st h a tc a l lp r o v i d eq u a t i t a t i v ei n f o r m a t i o n s t h r e e d i m e n s i o n a lf l u o r e s c e n c es p e c t r u m , a l s ot e r m e da se x c i t a t i o n e m i s s i o nm a t r i x ( e e m ) s p e c t r u m , g i v e st o t a lf i n g e r p r i n t si n f o r m a t i o n si nt h ew h o l er a n g eo fw a v e l e n g h t h s b yu s i n gc h e m o m a t r i c so ne x t r a c t i n gt h e i rp i g m e n t ss p e c 砌f e a t u r e s ，e e ms p e c t r u m i so f t e nu s e df o rm u l t i c o m p o n e n t sa n a l y s i s t h i sp a p e ra i m st os t u d yt h ec h a r a c t e r i s t i c so fe e ms p e c t r ao fe i g h t e e n p h y t o p l a n k t o ns p e c i e s , t h e ya l ep r o r o c e n t r u md o n g h a i e n s e ，p r o r o c e n t r u m m i n i m u m ， a l e x a n d r i u mt a m a r e m e ，a l e x a n d r i u mc a t e n e l l a ，a l e x a n d r i u m m i n i t u m ， g y m n o d i n i u ms a n g u i n e m ，s k e l e t o n e m a c o s t a t u m ，c h a e t o c e r o sc u r v i s e t u s ， c h a e t o c e r o sm i n u t i s s i m u s ，c h a e t o c e r o sc o m p r e s s u s ，c h a e t o c e r o st o r t i s s i m u s ， c h a e t o c e r o sd e b i l i s ，r h i z o s o l e n i ad e l i c a t u l a ，t h a l a s s i o s i r as p ，t h a l a s s i o s i r a r o t u l a ，d i t y l u mb r i g h t w e l l i ；c h l o r e l l ap y r e n o i d o s a 1 s o c h r y s i sg a l b a n a e x t r a c t e d t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ac h a r a c t e r i s t i c so fp h y t o p l a n k t o np i g m e n t sm e n t i o n e da b o v e ， i no r d e rt oi d e n t i f yt y p i c a lp h y t o p l a n k a o ni nc l a s so rf u r t h e rd e t a i ll e v e l s t h em a i n r e s e a c h m e n ti sa sf o l l o w s ： 1 t h em e t h o do f f l u o r e s c e n c ee x c i t a t i o ns p e c t r ar e m a i n st h em o s ts p e c i f i ct ot h e v a r i a b i l i t yo f p i g m e n tc o m p o s i t i o n t oc h a r a c t e r i s ep h y t o p l a n k t o n f l u o r e s c e n c e e x c i t a t i o ns p e c t r ao f c u l t u r es a m p l e sw e r em e a s u r e da tt h es p c c t r a lr a n g e ( e x c i t a t i o n 4 0 0t o6 6 0n m ，e m i s s i o n6 8 0n m ) i ti so b v i o u st h a ti ti sq u i t ed i f f i c u l tt od i s t i n g u i s h t h es p e c i e s c l a s si d e n t i f i c a t i o ns u c ha sa l e x a n d r i u mt a m a r e n s ea n da l e x a n d r i u m c a t e n e l l a b u tw ec a nd i s t i n g u i s hd i f f e r e n tg e n u s ； 2 s p e c t r a lf e a t u r ee x t r a c t i o nm e t h o d sw e r es t u d i e d t h ee e m s w e r ep r o c e s s e db y s i n g u l a rv a l u ed e c o m p o s i f i o n ( s v d ) t h e 缶g tp r i n c i p a lc o m p o n e n t o f t h eo b t a i n i n g e x c i t a t i o ns p e c t r u mh a sd i s t i n g u i s h i n ga b i l i t y a n di tw a s t a k e r t 鹅t h ec h a r a c t e r i s t i c s p e c t r u m m o s to f t h ec h o s e ns p e c i e s c a nb ed i s t i n g u i s h e db yt h ec h a r a c t e r i s t i c s p e c t r u m 3u n d e rt h ed i f f e r e n tn u t r i e n tl e v e l ，t h e r ei sl i t t l ed i f f e r e n c eb e t w e e n t h ec h a r a c t e r i s t i c s p e c t r ao f p r o r o c e n t r u md o n g h a i e n sa n d a l e x a n d r i u ml a m a r e n s e ，a c c o r d i n gt ot h e s i m i l a r i t yo f s p e c t r a ，t h i sw a y i se f f i c i e n t i ns u m m a r y , t h i sp a p e rs t u d i e dt h ee e ms p e c t r u mo f p h y t o p l a n k t o np i g m e n t s ， u s i n gt h eo b t a i n e dc h a r a c t e r i s t i cs p e c t r a , s o m eo f t h ea l g ac a n h ed i s t i n g u i s h e df r o m e a c ho t h e ri nl a b o r a t o r yc u l t u r e s 。 k e yw o r d s ：p h y t o p l a n k t o n ；a l g a e ；3 - df l u o r e s c e n c es p e c t r a ；c h a r a c t e r i s t i cs p e c t r u m ； p i g m e n t 独创声明 本人声明所里交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 掘我所知，除了文中特别加以杯注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含未获得或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同怎对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的晚明 并表示谢意。 学位论文作者签名：芽甚n 幽签字只期：哪侔6 月只 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权僳留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学 位论文的争部或郜分内容编入有关数掘库进行捡索。可以采用影印、缩印或扣描等复制乒 段傈仔、予编学f 市论文。( 保密的学位论文在解密后适用奉授权书) 摊论文作苦憝名：轴函 够# f 1 期：一钎r 月fh 学位论文作者毕业后去向： 工作单位：山东师范大学 通讯地址：济南市文化东路8 8 号 铷酶躬镌鹇 签字闩期：旷多年月r 同 电话： 邮编：2 5 0 0 0 2 我国近每浮游植物色亲的荧光光谱特征分析 1 文献综述 1 1 概述 我国是一个海洋大国，也足一个遭受赤潮严重危害的国家。随着海岸带经济 的迅猛发展和对海洋开发与利用强度的增加，赤潮爆发的频宰和强嚏都育可能进 步增加，对海洋生态系统和公众健康产生的危害也可能会更加剧烈。赤潮的形 成具有复杂的生物学、化学和物理学背景，虽然不同赤潮的形成机理育一定的共 性，但不同海区的赤潮成因由于赤潮原因种的不同和海洋环境之间的差异又有其 独特性。 我国的赤潮研究开始于7 0 年代末，在此后的1 0 余年间中科院、国家基金委、 海洋局、国家环保局、农业部等相继启动了一些研究项目，如“渤海湾营养类型 和赤潮问题研究”、“南海赤潮的发生与变化规律的研究”等。进入9 0 年代后， 赤潮问题开始在中国引起更广泛的重视，国家基金委相继启动了两项重大基金， “中国东南沿海赤潮发生机理的研究”和“中国沿海典型养殖区有害赤潮发生动 力学及防治机理研究”，对我国近海赤潮生物的分类、藻种培养、赤潮生物生态 生理特征、赤潮与富营养化之间的关系、赤潮藻毒素的生态毒理学以及赤潮的防 治对策开始进行比较系统的研究，取得了一批重要成果。通过一系列的监测研究， 使我们对赤潮从陌生到逐步了解。 浮游植物足海洋中主要的初级生产者，作为浮游动物的基础饵料乃是海洋食 物网结构的基础环节，在海洋生态系统的物质循环与能量转换过程中起着重要作 用( j e f f r e y 等，1 9 9 7 ) 。海洋生态环境的改变直接导致浮游植物群落结构的变化。 赤潮是海洋中的微凛、原生动物或细菌在一定环境条件下爆发性增殖或聚集，引 起水体变色或对海洋中其他生物产生危害的一种生态异常现象。赤潮爆发时，因 赤潮生物种类和数量的不同，海水可呈现红、黄、绿等不同颜色。赤潮危害极大， 有毒赤潮生物分泌的毒素可以直接导致海洋生物大量死亡，或者通过食物链传递 造成人类食物中毒。无毒赤潮生物则因其产生的粘性分泌物阻塞鱼、贝的呼吸系 统，或者由于赤潮生物大面积衰亡时消耗了水体中大量的氧气，而造成大面积的 鱼、贝窄息死亡。研究表明，赤潮不仅给水体生态环境造成危害，也给渔业资源 中国虑洋大学硕士研究中学位论文 和生产造成重大经济损失，而且还给旅游业和人类带来了危害，已成为全球性的 海洋灾害之一，是国际上广泛关注的国际性研究课题( g o e b e l ，1 9 9 4 ) 。 海洋中的浮游植物色素是藻类进行光合作用时吸收、转化和传递光能的主要 物质。叶绿素a 是浮游植物的主要光合色素。其他辅助色素( 如：叶绿素b 和c ， 类胡萝h 素和藻胆蛋白) 不仅通过给有机体提供的光学收集窗口，在光合作用中 起着重要作用，而且在高生长辐射中阻止细胞破坏，提供光学保护作用。水环境 中还存在其他重要的叶绿素降解产物( 如：叶绿素盐、脱镁叶绿素酸、脱镁叶绿 素，和同醇酯) 。 叶绿素是以一种色素蛋白复合体的形式存在于类囊体中，占植物鲜重的 0 0 5 至o 2 0 ，占干重的o 5 左右，有较多类似体，如在高等绿色植物内， 含有比例为3 ：l 的叶绿素a 和叶绿素b ，褐藻、硅藻类含有叶绿素a 、c l 、c 2 ， 红藻含叶绿素d 等。其分子由四个吡咯环构成的卟啉环，一个镁原子，环戊酮和 叶醇等构成，不溶于水，溶于有机溶剂，主要吸收红光与蓝光。一般分为叶绿素 a 、叶绿素b 和叶绿素c 。叶绿素a 和叶绿素b 在结构上稍有差异，前暂在侧键上 为- - - - c h 3 ，而后者为c h 0 ，其分子式分别为c 5 5 h 7 2 0 s n 4 m g 与c 5 5 h t 0 0 6 n 4 m g 。 图1 1c h l o r o p h y l la c 5 5 1 1 7 2 n 4 0 5 m g 图1 2g e n e r i cc a r o t e n o i d c 4 0 h 5 6 类胡萝h 素是属于萜烯基团炎的不饱和化合物，分子中心都是多烯键的聚肄 戊二烯长链，以此为摹础，通过末端的环化、氧的加入或键的旋转及异构化等方 式产生出很多衍生物。它在自然界生物体内广泛存在，现已发现了约6 0 0 种类胡 萝h 素，仅有3 8 5 0 种是作为维生素a 前体，类胡萝卜素存许多生物学作用。 2 我固】丘海浮游植物色素的荧光光谐特征分析 叶绿素存酸性条件下降解成脱镁叶绿素。 在光合作用中：类胡萝h 素直接受光激发，形成第一受激单线态( i c a r ) ， 随后激发能转移给叶绿素，启动光合过程。 c a r + h v 啼l c a r i c a r + c h i a r + l c l l l 此过程可有效地扩展光合生物可利用光的波长范围，因其吸收光的波长不同 于叶绿素( 赵文恩等，1 9 9 8 ) 。 叶绿素的光合作用功能使其成为衡量海洋浮游植物生物量和初级生产力水 平的最直接有效的指标。因此，叶绿素不仅是海洋生态调查中必不可少的调查项 目，还是测藿最频繁的生化参数之一。 1 2 浮游植物色素研究方法的发展历程和现状 色素的检测是基于叶绿素、类胡箩b 素和胆蛋白等色素分子的吸收和荧光性 质，不管在初状态下浮游植物细胞中的色素一蛋白质复合物，还是提取的溶液中 部保持不变。色素可以用分光光度计，荧光仪和显微镜进行检测，这些方法均适 用于实验室、岸边和晦洋环境。他们也可以用卫星传感器进行检测。将这些方法 与高选择性的分离技术相结合，就成为有力的海洋勘测工具。 1 2 1 分光光度法 最先使用分光光度法对浮游植物的提取物中测量三种叶绿素a 、b 、c 的足 r i c h a r d s 和t h o m p s o n ( 1 9 5 2 ) 。由于吸光系数太高，这个方法测得叶绿素a 的含 量过高，其中还含有叶绿素的降解产物。因为没有适用的消光系数，叶绿素c 算 是其中的“稀有色素”。h u m p h r e y ( 1 9 7 8 ) 和w a r t e n b e r g ( 1 9 7 8 ) 假设不存在降 解产物，重新设计了这个方法。 由于此法操作方便、准确度高、可同时测定多种色素、便于处理大量样品等 优点，至今分光光度法还被广泛应用。h u m p h r e y 在东南印度洋( h u m p h r e y ，1 9 6 6 ) 的研究中使用了叶绿素c 的消光系数( j e f f r e y ，1 9 6 3 ) 。得到的叶绿素c 的值( 1 a g l 。) 过高( j e f f r e y s ( 1 9 7 2 ) 修订了晶体叶绿素c l 和c 2 的消光系数) 。 科学家们不断计算出更精确的消光系数对三色光度法进行改进( p a r s o n s 和 中国惠洋大学硕士研究生学位论文 s t r i c k l 和( 1 9 6 3 ) ，u n e s c o ( 1 9 6 6 ) ，和j e f f r e y 和h u m p h r e y ( 1 9 7 5 ) ) 这些方 程对叶绿素a 都很精确，但是只有j e f f r e y 和h u m p h r e y ( 1 9 7 5 ) 的方程可以同时 精确计算叶绿素b 和c 。所有这些方程都是针对纯的叶绿素混合物而言的，均假 设具有相似吸收的降解产物不存在。这个前提导致了各种不同的误差( l o r e n z e n 和j e f f r e y ，1 9 8 0 ) 。 v e r n o n ( 1 9 6 0 ) 的酸化法成功的摆脱了脱镁色素的干扰，对叶绿素a 进行分 析。该方法是对浮游植物分光光度法和荧光法( l o r e n z e n ，1 9 6 7 ：y e n t s c h 和 m e n z e l ，1 9 6 3 ；h o l m - - h a n s e n 等1 9 6 5 ) 的改进。该方法将一系列的降解产物归 为脱镁色素，假设体系中仅存在叶绿素a 和脱镁色素，这使这个方法应用较少。 1 。2 2 荧光法 1 2 2 1 萃取荧光法 荧光法比分光光度法敏感5 0 多倍，可以用来分析较少的海水样品。各种各 样的原因使荧光分析法得到了广泛的应用( y e n t s c h 和m e n z e l ，1 9 6 3 ； h o l n v - - h a n s e n 等1 9 6 5 ) 。y e n t s c h ( 1 9 6 3 ) 等人发现，当叶绿紊b 存在的时候， 这个荧光酸化泫就不能用了。叶绿素b 广泛分布于贫营养晦区( j e f f r e y ，1 9 7 6 a ： g i e s k e s 和k r a a y ，1 9 8 6 a ，b ；v e m e t 和l o r e n z e n ，1 9 8 7 ) ，为此，w e l s c h m e y e r ( 1 9 9 4 ) 对这个方法进行了修正。 1 2 2 2 活性荧光法 活性荧光法是海洋学家可以测得浮游植物原始荧光值( l o r e n z e n ，1 9 6 6 ) 。 特纳荧光计可以测得浮游植物细胞的活体荧光，得到持续的荧光值。该技术成功 地运用于表层水的浮游值物量分布测晕和大洋垂直分布测量中i r i o s e n s ( f r u n g e l 等，1 9 7 6 ：h e r m a n 等，1 9 7 7 ) ，a q u a t r a c k a ( f a s h a m 等，1 9 8 3 ) 和s e a t e c hl n c ( g u o 和d u n s t a n ，1 9 9 5 ) 。 然而，d r d j m a c k e y 未公开实验指出，低浓度下，混合藻种表现出尖锐多 变的荧光信号。他认为这些假象是v a r i o s e n s 荧光计( m a r k1 1 1 ) 灵敏度低造成的， 别的荧光计如s e a t e c h 活体荧光仪，就表现出较好的线性相关，更敏感，在低浓 4 我国近海浮游植物色素的荧光光潜特征分析 度下的噪音很低( d rd j m a c k e y ，未出版) 。 除了仪器因索，活性荧光值还受很多因素影响，它仅作半定量捌量之用。影 响因素有：细胞的不均匀性( 形状和大小) 、浮游植物量、营养盐变化、光照时 间、衰败细胞和活性叶绿素的存在、位置、温度、测量时间，及叶绿素降解产物 的荧光变化( j e f f r e y 等，1 9 9 0 ) 。不过，活性荧光是浮游植物分布的最佳指示剂， 特别是用于确定叶绿素的最大值( 见v e n r i c k 等，1 9 7 3 ) ，进而用更精确的方法对 该位置进一步研究。 1 2 2 3 荧光光谱信号 科学家试图利用活性荧光的激发和发射特征作为指纹来识别藻的种类。这项 技术主要依靠辅助色素( 见图1 1 ，y e n t s c h 等，1 9 7 9 ；y e n t s c h 和p h i n n e y ，1 9 8 5 ) 或总荧光光谱矩阵( 图1 1 ，o l d h a m 等，1 9 8 5 ) 。y e n t s c h 和p h i n n e y ( 1 9 8 5 ) 报 道了四种基本浮游植物可以用它们的激发一发射光谱鉴别了：硅藻( 叶绿索a ， c 和捕光类胡萝h 素) ，绿藻( 叶绿素a 和b ) ，隐藻和红藻( 叶绿素a 和藻红蛋 白) 和藻青菌( 叶绿索a 和藻青蛋白) 。 p o r y v k i n a 等( 1 9 9 4 ) 将这项研究成果扩大到8 个微藻种类，并将它们的激 发一发射信号用二维矩阵图表示( 图1 1 0 l d h a m 等，1 9 8 5 ) 。但是，s o oh o o 等 ( 1 9 8 6 ) 和h i l t o n 等人( 1 9 8 9 ) 对藻的进一步研究表明，光适应性可以戏剧性 的改变色素含量和荧光响应，后者跟藻的色素分类学差异同时存在。因此，在解 释荧光信号的垂直剖面的时候，我们必须同时考虑光适应效果，特别是光的变化 大的时候。现有的迹象表明，活性荧光矩阵光谱不太可能鉴别混杂的浮游碴物中 藻的种类，除非象细胞计数那样逐个清点细胞数目( c h i s h o l m 等，1 9 8 8 ；o l s o n 等，1 9 8 8 ，1 9 8 9 ) 。显然，荧光指纹技术需要纵深化的研究，特别是在天然浮游 植物群落中的应用。 中国晦洋大学碗十研究牛学位论文 图1 3 激发一发射信号的二维矩阵图 1 2 2 4 活性荧光作为浮游植物光合效率的测量手段 k o l b e r 和f a l k o w s k i ( 1 9 9 3 ) 改进了现场荧光技术。它通过作为“象和探 针”的荧光技术，对天然浮游植物群落的p s i i 最大光合效率进行了估算。船载 实验室和现场仪器郁得到了改良( f a l k o w s k i 和k o l b e r ， 1 9 9 5 ) 。 根据即时光谱辐射知识，aq o m a x ，6 p s i i 和光化学猝灭，光合电子传输速 率的绝对疽可以得到。f a l k o w s k i 和k o l b e r ( 1 9 9 5 ) 甩活性荧光计持续测量活 性荧光参数，使得卫星的全球观测跟局部范围的季节性浮游植物碳固定联系起 来。叶绿索荧光通过这个模式，与海洋动力学关联起来。 1 2 3 色谱技术 s t r m n 等利用传统的柱色谱技术分离藻类叶绿素( s t r a i n ，1 9 5 8 ) ，使得六十 年代中期浮游植物色素微定量技术的发展。简单的分光光度法和荧光方法不能在 野外提供精确测量，这就要求寻找更精确的微爱分离技术。 色谱技术之所以能迅速地在海洋学中得到广泛运用，这跟它的特性分不开： 6 ill罡 我国近霹浮礴植物色索的荧光光谱怿征分析 首先，它使用起来快速简洁，可以在数量上分离主要成份，简单的物理吸附，可 以从一般的海水样品中检测出少量色素( 4 0 0 n m ) ，为叶绿索及其它辅助色素的荧光峰。 三维芡光图谱光谱能够给出整个激发、发射波长范围内的全部荧光光谱信 息。但是，以往的方法大多只是利用了荧光峰的数目、位置、强度等少量的信息， 丢失了大量的信息( p e r s s o na n dw e d b o r g ，2 0 0 1 ：s t e d m o ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 。本节采用 化学计量学方法分别对1 8 种藻的三维荧光光谱进行主成分分析，提取三维光谱 数据的本征特征。 2 。2 2 2 三维荧光光谱特征提取方法一主成分分析 主成分分析足以一种最优化的方法浓缩及综合e e m s 数据中的信息，使数据 简化，降低数据维数，寻找疗个由原始变量线性组成的新变量( 主成分) ，以期揭 示数据内部的结构特征( 倪永年，2 0 0 4 ) 。主成分分析可以通过奇异值分解( s i n g u l a r v a l u ed e c o m p o s i t i o n ，s v d ) 和非线性迭代偏最小二乘法( n o n l i n e a rr e r m i v ep a r t i a l l e a s ts q u a r e s ，n i p a l s ) 的算法来实现( 梁逸增，2 0 0 3 ；倪永年，2 0 0 4 ) 。奇异值分 解是一种常用的方法，是将一个二维矩阵分解成三个二维矩阵的乘积。 一 矿 现有数据测量矩阵“一，n 表示测最目标数目，p 表示测晕通道数。将奇异 y 值分解用于数据矩阵“m 一的分解，可得 x = u k v t 式中，u 为疗，阶列正交矩阵；矿为p 。7 阶列正交矩阵，上标7 表示矩阵 的转置；而a 为，阶对角阵；r 为矩阵x 的秩( r a n k ) ，7 s p o 8 u m ) 。 赤潮爆发区无机磷的浓度大约在o 1 0 8 1 x m ，硝氮大约在1 9 2 5 3 u m 。而海 洋微藻常用的舰培养液中无机磷和硝氮的最适浓度分别为5 p m 和4 0 u m 。因此， 选择无机磷的低中高三个水平浓度为别为1 1 t m 、5 1 a m 、1 0 0 m ，硝氮的浓度为 2 5 m 、5 0 “m 、1 0 0 p m 。 微量元素往往是诱发和促进赤潮发生的因素。比较莺要的微最金属育f e 、 m n 、c u 、m g 、m o 、c o ，其主要机理足作为辅助因子参与生物生化反应以促进 生物增殖。l e b r a n d ( 1 9 9 4 ) 指出低浓度的f e 、m n ，z n 会限制藻类增殖，且 存在浅海和深海藻种的差异。f e 是藻类细胞色素和许多酶的组成成分，络合铁 在富营养的海水水体中，是触发赤潮的因子之一，并与氮产生协同作用( f en c o l i m i t a t i o n ) ( p r i n c e 等，1 9 9 4 ) 。弓此类似，锌可能限制海洋初级生产力，并因此 影响全球的碳循环( m o r e lf m m ，1 9 9 4 ) 。该假设认为，由f 锌是光合作用中碳 酸酐酶的组分，锌的缺乏可能会限制藻类光合作用，并且锌限制弓无机碳青协同 中国海洋大学硕上研究牛学静论文 作用( z ncg o 1 i m i t a t i o n ) 。 锌离子除了作为碳酸酐酶的组分外，还足酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的组分， 因而锌在浮游植物的营养源碳和磷的代谢中起着重要作用。由此，使得对有 关锌浓度及其存在状态对藻类的影响越来越受到研究者的重视。已有不少关于锌 限制对微藻生长、光合作用和生化组成影响的报道( m o r e lf m m ，1 9 9 4 ；胡晗华 等，2 0 0 3 ) 。然而，有关锌浓度对赤潮藻类的影响少见报道。 锰在藻类的光合反应中起着重要的作用，可能足叶绿素形成过程中某些酶的 活化剂，在叶绿素形成过程中起间接作用( 潘瑞炽等，1 9 9 5 ) 。由于在水体中锌、 锰等重金属的含量很低，往往成为藻类生长的限制因子，一旦这些因子由外界插 入水体，很可能引起藻类的爆发性生长而造成危害。因此，加强重金属对藻类生 理生态特性影响的研究和重金属在特定水体中分布的研究，对预报和预防赤潮有 重要的意义( 秦晓明等，1 9 9 7 ) 。 未受污染的海水中总z n 2 + 浓度为o 1 0 2 n m o l l d 左右，并多以络合态存在， 藻细胞仅能利用游离的锌离子。沿海水域总锌浓度通常为o 5 4 5 n m o l l ，而河 口的总浓度则高达4 - 5 0 0 n m o l l 1 ，当锌离子浓度在1 - 1 0 n m 范围时，锌离子对藻 细胞表现出毒害作用，限制藻类生长( b u i t e n h u i s ，2 0 0 0 ) 。因此，我们选择游离 z n 2 + 的水平为高锌1 0 0 n m 、中锌1 0 n m 、低锌l n m 。锰在天然海水中的含量为 o 2 m 舡，大洋水中的含量为o 0 3 - 2 1 p p b ，外海锰的浓度很低，大约为2 1 0 4 m o 儿 ( b e n d e r 等，1 9 7 7 ) 。选择锰离子的浓度为o 1 l a m 、l m 、l o p m 。 3 1 2 正交实验设计 正交实验设计足多因素分析的有力工具。通过正交实验不仅可以搞清每个 因素对实验结果的影响情况，还可以分清因素的主次以及他们之间交互作用的关 系。 正交实验设计按正交表安排实验，既能使实验点分布均匀、分散，又能减 少实验次数，能够清楚的阐明实验条件与实验指标间的关系。 在前面的实验因子与水平选择中，已经选定了硝氮、无机磷、锌、锰四个 因子，每个因子各对应高中低三个水平。四因子三水平实验选择l 9 ( 3 4 ) 正交表， 我周近序浮游植物色索的荧光光谱特征分析 由于正交衷各列已被因子和交互作用占满，没有留下空白列，使用重复实验的方 法，进行误差项的估计。重复实验三次。 表3 1 和表3 2 分别为实验因子及水平和l 9 ( 3 4 ) 正交实验表格。 表3 1 实验因子及其水平 1 曲3 1f a c t o r sa n dl e v e l so f t e s t 水平 n o ；， x mp 0 4 3 l a m z n 2 + r i m m n 2 + “m l e v e l 12 5llo i 25 051 01 3l o o1 01 0 01 0 表3 2 k ( 3 4 ) 正交实验设计 t a b3 2l o ( 3 4 ) s c h e m ef o ro r t h o g o n a ld e s i g n e dt e s t 实验号 图塑 n o n 0 3 。p 0 4 孓 n 0 3 m n 2 + 3 2 实验部分 3 2 1 仪器和材料 3 2 1 1 仪器 ( 1 ) l r h - 2 5 0 g 光照培养箱( 广东省医疗器械厂) ； 中陶海洋夫学硕l 研究乍学f 1 7 论文 ( 2 ) f 4 5 0 0 荧光分光光度计( h i t a c h i ，j a p a n ) ： ( 3 ) h a n s a t e c hq u a n t i t h e r ml i g h tm e t e r ； ( 4 ) j y 9 2 2 d 超声波细胞破碎机； ( 5 ) t u 1 9 0 1 t u 1 9 0 0 紫外可见分光光度计( 北京普析通用仪器公司) ； ( 6 ) 倒置显微镜( n i k o nt e 2 0 0 0 - u ，j a p a n ) ； ( 7 ) l d f l z x - 4 0 s i 型立式自控电热压力蒸汽火菌器； ( 8 ) 电烘箱； ( 9 ) 电炉： ( 1 0 ) 锥形瓶； ( 1 1 ) 移液枪； ( 1 2 ) 电炉； ( 1 3 ) 真空泵； ( 1 4 ) s e d g e w i c k - r a f t e rc o u n t i n gc e l l 细胞计数框( 1 m 1 ) 。 3 2 1 2 材料与试剂 ( 1 ) 0 4 5 p mw h a t m a ng f f 玻璃纤维滤膜； ( 2 ) 0 7 $ t mw h a t m a ng f c 玻璃纤维滤膜； ( 3 ) 丙酮，分析纯； ( 4 ) 叶绿素标准( s i g m a 公司) ； ( 5 ) f 2 培养液( n a n 0 3 、n a h 2 p 0 4 - h 2 0 、n a 2 s i o r 9 h 2 0 、n a 2 e d t a 、 f e c l 3 6 h 2 0 、z n s 0 4 7 h 2 0 、c o c l 2 6 h 2 0 、m n c l 2 - 4 h 2 0 、n a m 0 0 4 2 h 2 0 、 t h i a m m h c i 、b i 2 ) ； ( 6 ) 鲁哥氏液( 1 u g o lr e a g e n t ) 。 3 2 2 培养条件 近岸海水中锌、锰等离子条件要高于实验设定，氮磷浓度也难以控制，会对 实验造成很大误差。而人工海水培养的藻生命力弱，生理形态容易产生异常，因 此，取用采自南海的大洋海水( 1 1 6 。0 3 e ，1 8 。0 6 n ) ，盐度为3 6 ，使用前测 我国近每浮游植物色素的荧光光f ! 特征分析 得的氮磷锌锰的浓度很低，低于一次蒸馏水的浓度，未达到检测限。大洋海水用 0 4 5 i _ t mw h a t m a ng f c 玻璃纤维滤膜过滤，再用电炉煮至沸腾，冷却后用二次蒸 馏水调前盐度到3 2 ，恒温到培养箱温度后接种。 接种前的东海原甲藻，经大洋海水驯化培养，稀释眈培养液中的高离子浓 度，避免干扰实验。培养液按不含氮磷锌锰的舵配方，硝氮、无机磷、锌、锰 按实验设计的加入。 东海原甲藻的接种密度约为2 0 0 0 c e l f m i 。用1 0 0 0 m l 锥形瓶在培养箱中培养。 培养箱温度为2 0 - a ：l 。c ，光源为白色冷光源，光照强度8 0 r e t o o lp h o t o n s m - z s - 1 ，光 暗比为1 2 h ：1 2 h 。 在正交实验同时，分别用近岸海水和大洋海水接种相同数鼍的藻作为空白对 照，标号分别为1 0 、1 1 。 3 2 3 细胞计数 每天取少最藻液用鲁哥试剂固定，然后用s e d g e w i c k - r a t t e r 细胞计数框( 1 m 1 ) 在倒置显微镜下进行细胞计数，通过对数生长期藻细胞数的变化用公式： u = ( l n x t l n x o ) t 计算比生长速率，) ( o 表示初始细胞密度，x t 表示t 天后细胞密度。 图3 1 为s e d g e w i c k - r a n e r 细胞计数框，总体积为l m l ，5 0 2 0 共1 0 0 0 个小 中困毒洋大学硕士= 研究乍学俺论文 3 2 4 藻类色素测定 根据细胞计数分析，在对数生长期内，用直径2 5m m 的g f f 玻璃纤维滤膜 在真空( 1 8 0 2 0 0 m m h g ) 下过滤相同体积的藻液。将滤膜贮存在氮气罐里，提高 对色素的提取效率。为了进一步提高色素提取效果，将滤膜放入丙酮溶剂中o o c 浸泡2 4 小时后，再用超声破碎仪迸一步破坏藻细胞。 色素提取液使用h i t a c h if 4 5 0 0 荧光分光光度计，i c m 石英比色皿，测龟样 品的三维光谱： 激发波长3 0 0 6 5 0 h m ，激发狭缝5 u m ，激发步长5 u m ： 发射波长3 0 0 8 0 0 n m ，发射狭缝5 r i m ，发射步长5 n m ： 扫描速度1 2 0 0 0 n m s 。扫描间隔、数据间隔5 n m 。