（高分子化学与物理专业论文）羽毛角蛋白为原料制备自组装齐聚物.pdf

塑邈毗童摘要 羽毛角蛋白为原料制各自组装齐聚物 摘要 大规模的家禽养殖产生了大量废物，其中羽毛产量位居榜首，由于其难以被 降解，而造成了很大的环境污染；羽毛主要由角蛋白构成，占到9 0 以上。角 蛋白，胶原蛋白和丝蛋白都是纤维状蛋白质的一种，它们广泛地分布于脊椎和 无脊椎动物体内，这类蛋白质外形呈纤维状或细棒状。分子是有规则的线性结构， 这与多肽链的有规则的二级结构有关，这种多肽链是重要的蛋白资源。 众所周知，角蛋白大量的存在于自然界中，是头发、羊毛、羽毛、指甲和动 物鳞角的主要组成部分，它们在结构和氨基酸的组成上根据动物的不同，而有所 差别。角蛋白因其氨基酸组成的不同以及特殊的胱氨酸单元的存在而与其他的纤 维状的蛋白质区别开来，如丝蛋白、纤维蛋白、胶原蛋白和肌纤维蛋白。角蛋白 是一种抗性很强的硬性蛋白，它的分子结构通过二硫桥键、氢键和其他交键作用 后非常稳定。 在通常条件下，角蛋白是不溶与水的。然而，当水的温度和压强超过3 7 4 0 c 和2 2 1 0 m p a 而进入p t 相图中所显示的超临界区域时，水将会变成很多物质的 良溶剂。即使，在高于通常意义上的沸点而低于超临界点的条件下，水的存在属 于种过热的状态。在这种状态下，水分子之间的氢键会极大的减弱从而大大增 加了分子的活动性。在这样的基础上，让角蛋白溶于水成为了可能。 在这篇论文中，我们探讨了角蛋白溶于水的可行性，发现在高温下，角蛋白 可溶解在水中，并且发生了水解形成氨基酸的齐聚物，即多肽。在适合的条件下， 水解而成的齐聚物能够自发地形成等级式的结构( 似树枝状结构) 。用光学显微 镜可以跟踪到随着时间的推移，这种结构的成核和自组装的过程。树枝状物质的 生长倾向于发生异相成核，首先形成具有双折射性质的约为1 0 微米长的针状结 构，当拥有足够的时间时，这些小的针状物质聚集起来从而形成具有上百微米长 度的针状结构。通过带有显微镜的x 射线衍射的检测，证明了这种针状结构物 叟塑幽塞 烂 质确实拥有晶体结构，并且这种结构类似于原来的蛋白质的结构但在a b 平面上 却更为有序。在红外光谱的研究中，可以看到结晶区域峰，并且这个区域会在 1 5 0 0 c 以上消失，这与晶体的d s c 结果一致。 传统的处理羽毛的方法为运用强酸和高温使其发生水解，造成环境污染。本 文所提的方法提供了一种温和的处理方法，并且可以获得氨基酸的齐聚物，从而 为进一步合成新颖的聚合物提供了生物来源。另外水解产物还可以作为涂料提高 材料的生物相容性和作为分子印记支持细胞生长等等。 最后，本文还对其他的角蛋白，如头发和羊毛进行了初步的研究。发现它们 水解后的产物也可以形成类似的树枝状结构，得到类似的氨基酸齐聚物。 关键词：羽毛：角蛋白；多肽；结晶；树枝状晶体 中图分类号：0 6 3 6 避一童 出地丛 s e l f - a s s e m b l y o f o l i g o p e p t i d e sf r o m e c o f r i e n d l yw a t e r s o l u t i o no fk e r a t i n a b s t r a e t f e a t h e r sa r ea l li m p o r t a n tw a s t ep r o d u c to ft h ep o u l t r yi n d u s t r y , c a u s i n ga n e n v i r o n m e n t a l l yd i f f i c u l td i s p o s a lp r o b l e m f e a t h e r sc o n s i s tf o r9 0 o ft h es t r u c t u r a l p r o t e i n ，k e r a t i n k e r a t i n s ，c o l l a g e na n ds i l ka r es e l f o r g a n i z e dp r o t e i n s t h e ya r e a b u n d a n t l y , a v a i l a b l ea n da r ep o t e n t i a l l yac h e a pf e e d s t o c ko fa m i n o a c i db u i l d i n g b l o c k s a sk n o w n ，k e r a t i ni sa b u n d a n t l yp r e s e n ti nn a t u r ea n di st h em a j o rc o m p o n e n to f h a i r , w o o l ，f e a t h e r , n a i la n dh o r n s ，t h ea m i n oa c i dc o n t e n ta n ds e q u e n c eo fw h i c hm a y v a r ys l i g h t l yd e p e n d i n gu p o nt h ea n i m a ls t r u c t u r ei nw h i c hi to c c u r s f i b r e f o r m i n g k e r a t i n sa r ed i s t i n g u i s h e df r o mo t h e rs t r u c t u r a lp r o t e i n ss u c ha ss i l k ，f i b r i n ，c o l l a g e n a n dm u s c l ep r o t e i n sb yt h e i ra m i n oa c i dc o m p o s i t i o na n di np a r t i c u l a rb yt h en u m b e r o fc y s t i n eu n i t si nt h ek e r a t i nm o l e c u l e t h eh a r d n e s sa n di n s o l u b i l i t yo fk e r a t i n si s a t t r i b u t e dt ot h ei n t e r m o l e c u l a rc r o s s l i n k i n go f t h ep e p t i d ec h a i n sb yt h ec y s t i n eu n i t s t h r o u g ht h es - sb o n d n o r m a l l yu n d e ra m b i e n tc o n d i t i o n sk e r a t i ni si n s o l u b l ei nw a t e r h o w e v e r ，i nt h e p tp h a s ed i a g r a mo fw a t e rt h es u p e r c r i t i c a lr e g i o ne x i s t sa b o v e3 7 4 屯2 2 1 0m p a ， w h e r ew a t e rb e c o m e sag o o ds o l v e n tf o rm a n ym a t e r i a l s e v e na b o v et h ea m b i e n t b o i l i n gp o i n ta n db e l o wt h es u p e r c r i t i c a lp o i n t ，w a t e ri si nt h es u p e r h e a t e ds t a t ew h e r e t h eh y d r o g e nb o n i n gb e t w e e nw a t e rm o l e c u l e sw e a k e n sc o n s i d e r a b l y ，t h u st h ew a t e r m o l e c u l e sa r e h i g h l ym o b i l e e x p l o i t i n g t h es u p e r h e a t e dn a t u r eo fw a t e rt h e d i s s o l u t i o no f k e r a t i n ( f r o mf e a t h e r s ) i sp o s s i b l e t h i st h e s i se x p l o r e st h ed i s s o l u t i o no ft h ef e e ds t o c ki nw a t e ru n d e rs p e c i f i c p r e s s u r e - t e m p e r a t u r ec o n d i t i o n sw h e r eh y d r o l y s i so c c u r st oy i e l do l i g o 。p e p t i d e sa s i i i 蹙塑唑塞 出血煎 o b s e r v e df r o ma m i n o a c i d s e q u e n c i n g u n d e r a p p r o p r i a t e c o n d i t i o n st h e o l i g o - p e p t i d e s s e l fa s s e m b l e l e a d i n gt o h i e r a r c h a la r c h i t e c t u r e t h en u c l e a t i o n f o l l o w e db ys u b s e q u e n ts e l f - a s s e m b l i n gp r o c e s si sf o l l o w e di nt i m ew i t ho p t i c a l m i c r o s c o p y t h eo b s e r v a t i o n sa r e t h a t b i r e f r i n g e n t n e e d l e s t e n dt on u c l e a t e h e t e r o g e n e o u s l y w h e ng i v e ns u f f i c i e n tt i m et h e s en e e d l e s ，i n i t i a l l yt e n so fm i c r o n si n l e n g t h ，a c ta sf u r t h e rn u c l e id e v e l o p i n gas t r u c t u r eo fs e v e r a lh u n d r e d so fm i c r o n s m i c r o f o c u sx r a yd i f f r a c t i o ns t u d i e ss u p p o r t e d b yi n - s i t um i c r o s c o p yr e v e a lt h a t t h e s en e e d l e sh a v eac r y s t a ls t r u c t u r es i m i l a rt ot h en a t i v ep r o t e i n ，t h o u g hb e t t e r o r g a n i z e d a l o n gt h ea b - p l a n e s p e c t r o s c o p i cs t u d i e s o nt h e s es t r u c t u r e sr e v e n c r y s t a l l i n eb a n d sw h i c hd i s a p p e a ra b o v e15 0 。cw h i c hc o i n c i d e sw i t ha l le n d o t h e r m i c p e a ki nd s c s e r i e so fs u c hc h a r a c t e r i z a t i o ns t u d i e sc o n f i r mt h a tt h es e l g a s s e m b l e d b i r e f r i n g e n te n t i t i e sa r ei n d e e do l i g o p e p t i d e s i nt h i st h e s i s ，t h ep r o p o s e de e o - f r i e n d l yr o u t ec a np r o v i d ea r le f f e c t i v er o u t ef o r r e c y c l i n go fw a s t ep r o d u c t s t h i st e c h n i q u ec a nb eu s e dt om a k ei m p o r t a n tb u i l d i n g b l o c k sf o rf u r t h e rs y n t h e s i so fa r a n g eo f n o v e lp o l y m e r sf r o mb i o l o g i c a ls o u r c e sa n d o p e nan e wp o s s i b i l i t yo f s p r a y i n go rc o a t i n go f a m i n oa c i d sf o rc e l lg r o w t h f u r t h e r m o r e ，t h ei n v e s t i g a t i o n so fo t h e rk e r a t i n sa r ea l s oc a r r i e do u t ，t i k eh u m a n h a i r sa n dw o o l s t h ep o s s i b i l i t yo ft h ef o r m a t i o no ft h es e l fa s s e m b l eo l i g o p e p t i d e si s e x p l o r e d k e y w o r d s ：f e a t h e r ；k e r a t i n s ；o l i g o m e r s ；c r y s t a l s ，d e n d r i t e c h i n e s el i b r a r yc l a s s i f i c a t i o n ：0 6 3 6 i v 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名：埏隰掣 论文使用授权声明 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：醯导师签名： 壁蘧必童绪论 第一章绪论 1 1 引言 据估计，全世界对家禽的需求量在接下来的几年里将增长3 到4 ，主要 由于经济打大力发展和人口的增长【1 。全世界家禽的产量在1 9 6 1 年时为7 5 0 力| 吨，而到了1 9 9 8 年，这一数量达到了5 8 0 0 百万吨，其中8 5 为烤鸡，8 为火 鸡，4 为鸭子以及3 为鹅。 大规模的家禽养殖产生了大量废物，其中羽毛的产量位居榜首，这对环境造 成了一一定的压力。羽毛占家禽总重量的7 ，意味着在1 9 9 7 到1 9 9 8 年，在全世 界有4 0 0 万吨的羽毛成为了废品。对于这些羽毛我们应尽量避免用燃烧和掩埋 的方法来处理它们。羽毛捌有很多应用价值，例如可以用在衣服，床上用品，装 饰品和体育用品上等 2 ，近年来，羽毛被用来作为生物纤维的原料，这些纤维 被加工成纸张或者类似的产品，还有无纺布，过滤器和复合材料等等 3 。 羽毛中角蛋白的含量高达9 0 以上，给畜牧业饲料提供了一种重要的蛋白 资源。但是完整的羽毛的消化率非常低，所以在成为饲料之前要先进行水解。将 收集得到的羽毛用水清洗，同时给予一定的压力和搅拌让其水解，然后烘干制成 羽毛粉加入饲料中使用。胱氨酸，苏氨酸，精氨酸在羽毛粉中的含量较高，而营 养性氨基酸如赖氨酸、蛋氨酸、组氨酸、色氨酸的含量则不足。在动物饲料中， 这些营养性氨基酸要被额外的加入，实际上羽毛粉只占动物饲料的o 5 - 1 5 目前，人们对于无环境污染的材料的发展和生产产生了越来越浓厚的兴趣 【4 ，主要集中在蛋白质膜的研究上。这些膜拥有很好的气体选择性，可以用于 混合肥料的包装，农用薄膜或者可食用的薄膜和涂料等 5 1 1 。在这一领域中， 羽毛角蛋白的应用不多，虽然有一些专利问世，但是现在还没有真正被应用于工 业中 1 2 1 9 】，此外这些产品中羽毛角蛋白的结构和组织还没有确切的研究。所以 对角蛋白结构的了解有利于开发角蛋白的应用价值。 羽毛角蛋白的分子量大约为l o k d a ，其中心部位由p 折叠的微晶构成，两端 为随机排列地分子链所连接 2 0 。在羽毛角蛋白中，两条彼此缠绕的螺旋状原纤 墅鳖咄童绪迨 维链构成微纤维( 直径约为3 0a ) ，原纤维链由微晶组成，上有不规则的肌链排 列在它的侧面，两条原纤维肌链呈反平行排列。这些链由二硫桥键( 胱氨酸二聚 而成) 将内外连接并且形成非晶区将微晶纤维包围在中心。二硫桥键地存在和分 子结构使角蛋白难以被溶解，并且不易被大多数的蛋白水解酶降解。 1 2 羽毛角蛋白的结构和性质 角质层存在于许多脊椎动物的外骨骼结构中，譬如毛发、羽毛鳞片和指 甲等，他们都是由细胞经过精细地分化或者说由专门地细胞角质化而来，这些细 胞被叫做角化细胞。在这个分化地过程中，活细胞逐渐转变成非活性地，坚硬的， 难溶的纤维状的物体，成为具有特殊性能的外表保护层。这个保护层主要由具有 一定结构的角蛋白构成。与其他纤维状蛋白质( 胶原蛋白，弹性蛋白，和肌原纤 维蛋白质) 相比，角蛋白中存在大量的半胱氨酸，它们发生二聚后形成二硫桥键， 以胱氨酸的形式存在于角蛋白中。角化细胞的活动会导致角蛋白的分化，传统上 称分化后的角蛋白一种为软性角蛋白，另一种为硬蛋白 2 1 。通常组织结构中的 角质层和皮肤的硬结组织成为软性角蛋白，这种角蛋白含有较为少量的二硫桥 键，表皮以及表皮的衍生物，如羽毛，头发，指甲和角蹄等属于硬蛋白，相对应 的它们含有较多的胱氨酸。根据多肽链的占支配地位的二级结构的不同( o 螺旋， b 折叠) ，角蛋白分为a 角蛋白和1 3 角蛋白，它们有各自不同的x 射线衍射图样， 这也是区分它们的主要依据 2 2 2 4 。软性角蛋白和哺乳动物的硬蛋白是c 【角蛋 白，而鸟类和爬行动物的硬蛋白则为b 角蛋白。在绝大多数的含有角蛋白的组织 中，纤维体被至于一个不规则的肌链中。这种组织是一个复合物，纤维体构成了 具有较高弹性模量的部分，另一部分由具有较低弹性模量的肌链构成。在机械压 力下肌链成为缓冲带分散压力从而阻止裂痕的进一步扩散。很多因素，包括纤维 的取向，天然性能和与肌链的比例，以及结晶度等对角蛋白的机械性能都有很大 的影响。因此，鸟类和爬行动物的角蛋白有各自不同的模量，哺乳动物类的角蛋 白因为含有较少的二硫桥键而能形成较多的结晶了的纤维，反之含有较多硫桥键 的蛋白质则具有较多的无定形的结构 2 5 。 壁塑必塞缝论 研究结构蛋白，无论是对经济价值，对在增长中的药用价值以及对组织工程 都有重要的意义 2 6 。1 9 3 1 年m a r w i c k 2 7 1 矛l j 用x 射线衍射发现羽毛难溶于溶剂 中主要是由于含有大量的二硫桥键，并且当这些键减少的时候，它会溶于某些溶 剂中 2 8 】，在这之后对于羽毛角蛋白的结构和分子的研究有很大的发展。市场 的需求使家禽业发展的很快，但是同时还要符合可持续发展 2 9 并1 1 可再生资源 3 0 】 的要求，这些都促使我们研究羽毛的应用价值，涌现出很多相关的专利【3 1 - 3 5 。 由于角蛋白具有一定的机械性能，所以许多注意力都集中在如何提高它的机械强 度以达到应用的要求，例如膜和涂层。对角蛋白结构的深入了解有助于对其应用 价值的研究。 1 2 1 羽毛角蛋白的结构和组成 在这里，羽毛角蛋白的成分组成和结构以及二硫桥键的化学性质将被详细 的介绍。有很多重要的关于羽毛发展的综述 2 5 ，3 6 3 8 ，包括羽毛角蛋白的分子 机理，基因表述等等 3 7 ，3 9 4 3 】。 鸟类的羽毛拥有温度调节功能和飞行功能，这使它与其他脊椎动物的角质 层区别开来。羽毛主要分为6 种，它们是：箭翎，廓羽，半羽，绒羽，毛羽和刚 毛 4 4 。图1 为一根典型的廓羽的示意图 4 5 1 。 r r a r a c h i s b c a 一。也m u 8 b b a r b s f i g u r e1 a n a t o m yo f ac o n t o u rf e a t h e r ( a f t e rs c h r o e d e re ta t 4 5 ) 壁整咣塞绪论 从图中可以清楚看到几种不同形态的部分，从r 到a 的部分为主茎，用来支 撑连接羽支，而这些羽支用来支持鸟的小羽枝。鸟的小羽枝如小钩子一样互相勾 在一起，从而支撑起羽毛的基本轮廓，如图2 所示( f i g u r e2 ) 。主茎中被填满了一 种髓质物，这种髓质物同时也存在于羽支中。图中c 到a 的部分被称为羽根， 其位于鸟的表皮下使羽毛固定在主体上。 f i g u r e2 s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o g r a p ho fac o n t o u rf e a t h e ro f t h e c h i c k e ns h o w i n g b a r b u l e sa n dh o o k l e t sa sap a r to f t h ef e a t h e rb a r b sf 1 0 0 0 x ) 利用x 射线衍射，a s t b u r y 和m a r w i c k 证明了鸟类和爬行动物身上的硬角 蛋白多肽链的构象为基本的收缩的p 折叠 2 3 。用电子显微镜观察褪色后的羽毛 主茎上超薄的部分，可以清晰看到在羽毛中，角蛋白以非常有序的微纤维( 直径 大约为3 0a ) 的形式存在，同时被浓密的不规则的肌链所包围口i g u r e3 ) 【4 6 。与 旺角蛋白相比，b 角蛋白的微纤维的直径要小很多( a 角蛋白的直径约为8 0 a ) ， 并且比c 【角蛋白的微纤维排列更为有序。从1 9 3 1 年第一次得到p 链的x 射线衍 射图样 2 7 ，到1 9 7 1 年由f r a s e r 等得到p 链由彼此缠绕的原纤维构成的结构 4 7 】， 曾经有很多关于羽毛b 链微相结构的讨论 2 3 ，2 7 ，4 8 - 5 6 ，f r a s e r 等给这些研究给 出了一个非常详尽总结 2 5 。 堡邀必室绪论 c r o s s s e c t i o n m i c r o f i b r i l s p r o t o f i b r i l f e a t h e rk e r a t i n s f i g u r e3 s c a n i n ge l e c t r o nm i c r o g r a p ho f ac r o s s - s e c t i o no f t h ef e a t h e rc a l a m u sa n da m o l e c u l a rm o d e lf o rt h em i c r o f i b r i lo ff e a t h e rk e r a t i n sm a d eu do ft w ot w i s t e d p r o t o f i b r i l s t h e s ep r o t o f i b r i l sa r ef o r m e db ys m a l l3 - s h e e tc r y s t a l l i t e s t h eb s h e e ti s p r o b a b l yf o r m e db yt h ec e n t r a lp o r t i o no faf e a t h e rk e r a t i nm o l e c u l e ：t h en a n dc t e r m i n a lo ft h em o l e c u l ef o r l nt h ea m o r p h o u sm a t r i x ，s t a b i l i z e db yc y s t i n e ，i nw h i c h t h ef i b r i lsa r ee m b e d d e d s i xc y s t e i n er e s i d u e sa r ep r e s e n ti nt h en - t e r m i n a lr e g i o n w h i l eo n l yo n ei sp r e s e n ti nt h ec t e r m i n a l ( a f t e rf r a s e r 5 7 1 ) 在图3 中给出的b 链的微相结构是目前普遍认同的一种模型结构，x 射线 衍射和电子显微镜都给出了这种结构的有利证据 6 7 1 。红外光谱也证明在角蛋白 的分子链中有将近三分之一的链是反平行排列的b 折叠链，这也构成了蛋白质的 晶状中心。微纤维由b 折叠的微晶构成，这些微晶的长和宽大约分别为2 3a 和 2 0a 。这些微晶头对头，尾对尾扭曲缠绕成螺旋结构，每4 个折叠构成一个螺旋， 螺旋构成了原纤维，原纤维的周期为9 5a 5 5 ，5 7 。两条原纤维又反时针彼此缠 绕螺旋而成微纤维。比较占优但又不完全确定的说法是，这种反平行的b 折叠结 构是否与角蛋白的多重链折叠相关。横向的两个b 侧链的相互作用力和轴向成环 的反平行的b 链的相互作用决定了微纤维的稳定性。多重链折叠的选择性使得每 一个b 折叠都含有至少两个分子或更多分子的部分或者全部。不规则的肌链部分 由羽毛角蛋白的单体构成，占了其角蛋白的三分之二，并将微纤维包围起来。 用过甲酸氧化 5 9 6 1 1 或通过变性剂减少二硫桥键和硫的羧甲基化 6 0 6 3 i j - 以制备可溶性的羽毛角蛋白的衍生物。羽毛角蛋白是一种较小分子量的蛋白质， 墅熊魁室 绪论 拥有比较统一的大小，分子量约为1 0 ，4 0 0 9 t o o l 【5 9 6 1 。羽毛角蛋白的氨基酸组 成成分有些与众不同，它含有较多的甘氨酸，丝氨酸，脯氨酸和脂肪族类的氨基 酸，组氨酸，赖氨酸和蛋氨酸的含量却几乎为零，如表1 所示。同时确定的还有 色氨酸的含量 6 0 1 。虽然有许多研究证明不同鸟类的羽毛在形态上有所区另1 1 1 4 5 ， 6 0 ，但是它们角蛋白的氨基酸组成成分却差别不大 6 2 。用电泳和色谱分析法可 以分馏鸟类胚胎时和成年时角蛋白中不同形态的部分 5 8 ，6 0 ，6 1 ，6 3 6 7 1 。成年鸡 羽毛角蛋白不同形态的部分与其他的角蛋白有很多相似的地方 6 3 1 。通过这些研 究可以得出在鸡的成长和羽毛成分的分化过程中，从鸡的主要基因组里所选择的 基因以某种特殊的方式被表达出来。 t a b l e1 a m i n oa c i da n a l y s i so f c h i c k e nf e a t h e rk e r a t i n sb e f o r ea n da f t e re x t r a c t i o n w i t hu r e a ( 8 m ) a n d2 - m e r c a p t o e t h o l ( o 4 m ) ( r e s i d u e sn 1 0 0 ) 1 5 8 1 a m i n o 。a c i dw s h o l ef e a t h e rw h o i ee x t r a c t 佃1 0 0 )( n 1 0 0 ) c y s t i n e 4 2 c v s t e i n e 28 3 a r g i n l n e 4 7 4 8 s e r i n e1 5 71 4 6 a s p a r t i ca c i d 6 35 o g l u t a m i ca c i d 8 67 7 t h r e o n i t i e5 34 5 g l y c i n e 1 1 51 1 ，9 a l a n i n e 5 65 3 p r o c i n e 1 1 7 1 1 8 m e t h e i o n i n e0 3仃a c e v a l i n e7 79 1 p h e n y l a l a n i n e 3 63 5 i s o l e u c i n e4 34 9 l e u c i n e7 47 o h i s t i n e 0 3p a c e l y s i n e 1 2 0 ，4 t y r o s i n e 1 61 2 1 ) r e s u l t sa r en o tc o r r e c t e df o rh y d r o l y s i st i m e 2 d e t e r m i n e da ss - ( c a r b o x y m e t h y l ) c y s t e i n e 堡塑必塞绪论 通过蛋白质序列的测定，已经被确定的有5 种不同鸟类的羽毛角蛋白的氨基 酸序y | j 6 8 7 1 。一个角蛋白分子可以由9 5 ( 鸭和鸽子的羽支) ，9 6 ( 鸡的羽支) ， 9 8 ( 海鸥的羽根) 或1 0 2 ( 鸸鹋的主茎和羽根) 个氨基酸组成，它们呈现出很高 程度的同系现象。通过对比鸡，鸭，鸽子的羽根，发现有8 2 个位置上的氢基酸 是相同的( 8 5 ) ，它们中的大多数已经被局部化固定在角蛋白链的主要部分 7 1 。 这就说明保存主要部分的氨基酸序列的完好的重要性，这样可以保证结构和功能 的差不多一致性。所有的半胱氨酸片断都存在以n 原子为终端的区域( 6 ) 里，以 c 原子为端点的区域里的变化最多( 1 6 种氨基酸中有9 个可以和它相连，占总 数的5 2 ) 。通常是一个半胱氨酸构成了c 原子终端。半胱氨酸位置的保持对羽 毛结构的稳定性有重要意义。这些事实也说明了序列的多样性是有严格的选择性 的，为了保持角蛋白的基本结构不变，需要知道精确的氨基酸序列。 从鸡的羽毛中，有5 组不同的基因序列被确定，如图4 所示，一组是成年鸡 的羽支的氨基酸序列直接从蛋白质序列测定而来 7 0 】，通过对胚羽基因组的克隆 体l c f k l 的基因编译预测得到其他4 组基因序列。这四组基因都是对功能基因 的编译，在胚羽组织中都能发现这四组基因的表达。衍生蛋白的基因序列与成年 鸡的羽毛角蛋白的序列非常相似，主要的区别在于成年鸡的羽毛角蛋白的在c 原子终端那没有精氨酸的片断。可以再次看到蛋白质序列中c 原子终端区域的 可变性是最高的。构成反平行b 折叠结构的氨基酸序列发生一些变化是完全可以 接受的( 图4 ，片断2 4 到6 6 ) 。更进一步的研究显示鸟类的b 角蛋白至少有2 1 到 2 4 种基因序列的表述，它们非常的相近组成了一个同系的大家族，并且这些基 因组在小鸡羽毛组织的发育过程中都可能被找3 0 6 3 1 。一个或几个氨基酸位置的 不同就是一组新的氨基酸序列，在鸡的羽毛中有2 0 到3 0 组这样不同的氨基酸序 列f 6 3 ，6 4 ，这与前面所描述的完全一致。 墅塑咝塞绪论 a d u | ts e rc y sp h e a s p l e u c y sa r gp r o c y s g l y p r ot h rp r ol e u a l aa s n g e n e a g e n e b g e n e c g e n e d t y r t y r s e r a l a 2 0丫3 0 a d u l ts e rc y sa s ng l up r oc y s la r gg l nc y sg l na s p s e ra r g lv a l g e r i e a g e n e b g e n e c g e n e da l a 4 0 a d u l tl l eg l np r os e rp r 0v a lv a lv 久lt h rl e up r o g l yp r 0i l el e us e r s e r g e r i e a g e l e b g e n e c g e r i e d 5 06 0 a d u l ts e r p h e p r o g l n a s n t h r a l a v a l g l ys e r s e r t h rs e r a l a a l a v a l g e n e a g e n e b g e n e ca l a g e n e dl l g u 丫7 08 0 a d u l tg n 7s e ri l el e us e rg l ng l ug 【，y 、强lp r oi l es e rs e rg l yg 【p h e g e n e ag l u g e n e bc y s g e n e cg l u g e n e dg l u 9 0 a d u l tg i j y i l es e r g l y l e u g l ys e r a r g p h es e r g l y a r g t y r p r o p r o c y s g e n e a s e ra g rc y sl e ut y r g e n e ba g r c y s l e u g e n e ca g r c y s l e u g e n e da g r c y s l e u f i g u r e4 c o m p a r i s o no f t h ed i r e c t l ys e q u e n c e da d u l tc h i c k e nf e a t h e rk e r a t i nw i t ht h e p r e d i c t e da m i n oa c i ds e q u e n c e so ff e a t h e rk e r a t i ne n c o d e db yg e n e sa t odl c f k l a m i n oa c i ds e q u e n c e st h a td i f f e rf r o mt h ea d u l tf e a t h e r k e r a t i na r es h o w ni nb o l d t h e d o r e dl i n er e p r e s e n t sa l la p p a r e n td e l e t i o no ri n s e r t i o nd i f f e r e n c eb e t w e e na d u l ta n d e m b r y o n i cp r o t e i n s t h es e g m e n tb e t w e e na r r o w sc o u l df r o mar e g u l a r1 3 - s h e e t ( a f t e r p r e s l a n de ta l 4 2 ) 8 壁塑磷窒绪迨 1 2 2 二硫桥键的化学性质 角蛋白作为天然存的物质不溶于大部分通用溶剂，并且能够抵制水解酶的水 解作用。这些性质都要归功于一定量的二硫桥键( 半胱氨酸二聚而成) 的存在， 它们使蛋白质的结构中有了一种类似于刚性的构造。想要使蛋白质溶解就必须破 坏这些二硫桥键，为了阻止破坏后的半胱氨酸重新建立二硫桥键，要使它在化学 组成上有一定变化。减少和破坏二硫桥键的方法有氧化法，磺化法或者使用硫醇 改变半胱氨酸的端基。 1 2 2 1 二硫桥键的立体构象【7 2 】 在二硫化物中，s s 键的旋转会受限于硫原子上不成对p 电子的静电排斥 作用，这种排斥力在c s s c 二面角的角度为0 。或1 8 0 。时达到最大值，在9 0 。时 达到最小值，旋转的势垒经计算约为8 到6 7k j m o l 。在左旋胱氨酸中发现了约 为8 0 0 的二面角，在一些蛋白质中，如溶解酵素和羧肽酶a ，c s s c 二面角的角 度为1 0 0 。，而在糜蛋白酶中这一角度从8 7 。到1 2 6 。都可能存在。s s 键的长度 在2 0 2 到2 0 5a 之间。烷烃里的二硫键的离解能约为2 9 3 k j m o t ，当c s - s c 二 面角为9 0 。时，二硫键的强度达到最大值 7 3 。 1 2 2 2 二硫桥键的氧化 胱氨酸的的硫桥键可以用有机过氧酸氧化破坏，如过甲酸( ( 2 1 ) 7 4 ，7 5 】。 r - n - 艮盱5 崤o 加。0 h + 强。一2 躐嚣描飞一嘲u ( 2 1 ) 氧化的机理比较复杂，经过很多不稳定的氧化中间态。一般地，一摩尔地 二硫键氧化后形式上会得到两摩尔的磺酸。过甲酸也可以氧化色氨酸和蛋氨酸。 用过氧酸处理后的羽毛角蛋白，如过甲酸 5 9 ，6 0 】，由于磺酸基团的电负性可以 在一个很宽的p h 的范围内溶解。 壁鞑咝塞绪论 1 2 2 3二硫桥键的亚硫酸酸化 亚硫酸也可以被用来破坏蛋白质的二硫桥键。亚硫酸盐与胱氨酸的二硫键 相互作用生成半胱氨酸的磺酸盐和胱氨酸( 2 2 ) 【7 6 ，7 7 。 r一一一s082-_-p姻一so；+rss s 一 王毫一一 一s 0 8 一 + l o l ( 2 2 ) 反应在碱性条件下( p h 约为9 ) 效果最理想。氧化剂，如铜离子或者连四 硫酸盐，可以使半胱氨酸重新缩合建立二硫桥键，所以务必要使所有的半胱氨酸 转变成硫代磺酸盐的衍生物( 2 2 ) 7 8 。亚硫酸氢根的反应速度要比亚硫酸根要缓 慢的多。p h 低于9 0 时，反应的机理比较复杂，而高于9 0 时却比较简单，是可 逆的双分子机理 7 9 。硫代磺酸盐基团在p h 为中性时可以稳定存在，但是会发 生酸解游离于溶液中。 1 2 2 4利用硫醇还原二硫桥键 到目前为止，应用最广泛的是使用硫醇还原二硫桥键从而达到破坏的目的 ( 2 3 ) 7 2 。 一 f 2 r s + ! 一e j o8 8 一i ：目曦一 il 当2 卜c 融百+ r - s - s - r ( 2 3 ) 反应包括两个连续的亲核取代反应，或者称硫醇与二硫键之间的还原反应， 形成一个混合的二硫化物的中n 态( s c h e m e1 ) 。反应速度与硫醇阴离子的浓度成 正比，因此也就强烈的依赖与溶液的p h 值，一般来说反应后带有半胱氨酸的硫 醇的p k a 会比原来的半胱氨酸要低( 从9 0 9 5 到8 5 9 0 ) 。总的平衡常数k 1 等 于k 2 k 3 的乘积。平衡常数一般不会改变，所以经常在使用时使硫醇或硫醇盐大 墅塑啦窒缝途 大的过量。s c h e m e1 给出的是在碱性p h 条件下半胱氨酸和硫醇之间的反应。胱 氨酸( i i ) 与硫醇阴离子( i ) 发生亲核取代反应生成半胱氨酸的阴离子( ) 和混合 的二硫化物的中间物( i l i ) ，这一中间物再次与硫醇阴离子发生取代，形成相应的 二硫化物( v ) 。最常用的硫醇试剂是2 一巯基乙醇( 2 4 ) ( d t t0 或者c l e l a n d 试剂) 或者它的异构体二硫赤藓醇 8 0 1 。由于能发生环化反应形成稳定的六原环，反应 平衡倾向于向右移动，据报道这一反应的平衡常数可以达到1 3x1 0 4 。 r s ( 1 ) 、 一e h f 8 - ：幕c 睁嗲| 一睡锰i i 一) 8 一r + 一斧一|( 1 i ) l ( i i v ) l r s ( d 、 一c 眭，i 一8 一r ，! | 一c 毛一争+ r g s r ( 1 i )l ) 聊 翠h 珏 h o c j - i h f ：o h e 印珏 s c h e m e l r e d u c t i o no f c y s t i n e ( i i ) w i t ha t h i o l ( i ) + r - s - s - r - = ：一鼢一 研 ( 2 4 ) 还原二硫桥键所需过量的硫醇的具体数量要根据硫醇一二硫化物对的氧化 壁避喇塞绪论 还原电势和蛋白质二硫化物的反应力而定。一些硫醇一二硫化物对的氧化还原电 势( e o ，p h7 0 ) 已经有所报道，半胱氨酸的约为一0 2 2v ，d t t 的为一o 2 3v 。因为