（植物学专业论文）麻疯树（jatropha+curcas）种子抗真菌蛋白及相关基因的分离、表达研究.pdf

四川1 人学博f 论文 麻疯树( d a t r o p h ac u r c s s ) 种子抗真菌 蛋白及相关基因的分离、表达研究 植物学专业 研究生魏琴指导教师陈赦教授 摘要 麻疯树( j a t r o p h a c t u r c a 3 ) 为大戟科麻疯树属植物，其种仁含有丰富的蛋白质。 分离、纯化抗真菌蛋白并检测其对提高植物抵抗病原真菌的潜力具重要意义。 本实验从四川攀西地区的麻疯树种仁中纯化了一种b l ，3 葡聚糖酶，分子量约 为6 5 5 硒，三亚基组成，菲共价键结合，等电点为8 3 。酶最适作用温度为4 0 一5 0 ，最适p h 为7 。在4 c 一5 5 内以及p h6 _ 8 范围内最稳定。该酶具 特定的紫外光谱、荧光光谱和氨基酸组成。w e s t e r n 杂交显示麻疯树b 一1 ，3 葡 聚耱酶仅存在于种子中而在根、茎、叶中未见分布。 麻疯树1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶能不同程度地抑制水稻稻瘟病菌、玉米纹枯病菌、 小麦赤霉病菌、玉米弯孢杆菌菌丝的生长、孢子的萌发与形成，其中对水稻稻 瘟病菌的抑制作用最强而长效。光镜下经处理的水稻稻瘟病菌菌丝多数呈葫芦 形，小麦赤霉病菌菌丝细胞内有黄色圆球状物分布。电镜观察处理菌丝的细胞 壁均变薄。推测麻疯树b l ，3 葡聚糖酶的抗真菌活性与其对菌丝细胞壁的分解 作用有关，也可能与代谢的改变有关。麻疯树b - 1 ，3 葡聚糖酶对小白鼠毒性低， l d s o 为2 2 2 6 0 5 2g k g ( 9 5 的可信限) 。在聚乙二酵介导下有特异凝集鸭血的 作用。 麻疯树毒蛋白( c u r c i n ) 能强烈抑制水稻稻瘟病菌、松赤枯病菌、玉米纹枯 病菌、油菜菌核病菌和胶胞炭疽杆菌菌丝生长 嘴子的产生。光镜下观察处理 x v _ q 川大学博j 论文 菌丝畸形。s d s p a g e 显示，试验菌丝的蛋白质条带减少。推测c u r c i n 对菌丝生 长和孢子萌发的抑制作用与c u r c i n 阻碍蛋白质合成有关。w e s t e r n 杂交检测到 c u r c i n 仅存在于种子中而在根、茎、叶中未见分布。 首次从麻疯树基因组中分离到与编码麻疯树毒蛋白( c u r c i n ) 的e d n a 序列 一致的开放阅读框( o r f ) ，证明了无内含子的存在。通过农杆菌介导将c u r c i n 基因导入烟草，经p c r 和r t p c r 检测到c u r c i n 基因已整合到烟草d n a 中， 并在转录水平得到表达，转基因烟草对力枯丝核菌( 足s o l a n i ) 有一定的抗性。 首次从麻疯树叶中克隆了在水分、温度胁迫及真菌侵染条件下诱导表达蛋 白j f i p 的e d n a 序列。j f i p 前体蛋白o r f 由9 2 7 个核菅酸组成，编码3 0 9 个氨 基酸，带有4 2 个氨基酸组成的信号肽，推测的分子量为3 4 9k d ，等电点为6 5 6 ； 成熟蛋白0 r f 由8 0 1 个核苷酸组成，编码2 6 7 个氨基酸，分子量为3 0 1k d ，等 电点5 2 5 。j f i p 具特定的疏水区结构及特定的酶修饰位点，二级结构以d 螺旋 为主，其三级结构包括6 个n 螺旋和6 个1 3 转角。j f i p 与r i p s 的保守结构域 有较高的同源性。w e s t e r n 杂交结果显示，麻疯树毒蛋白( c u r c i n ) 的抗血清在 4 c 和5 0 1 2 温度胁迫及松赤枯病菌、玉米弯胞病菌、小麦赤霉病菌侵染后的叶中 识别了一条3 2k d 左右的蛋白条弗，而在根、茎中无。在1 0 一4 0 聚乙二醇 ( p e g 一6 0 0 0 ) 胁迫后的叶中识别了一条3 2k d 和一条6 5k d 的蛋白条带。其中 3 2k d 的杂交阳性带的分子量与j f i p 的预测分子量接近。我们推测该蛋白与j f i p 有相关性。干旱、商低温胁迫及病原真菌侵染下麻疯树蛋白质分子标记的存在， 为逆境蛋白的研究奠定了实验基础。 将编码j f i p 韵成熟蛋白和前体蛋白的o r f 分男q 定向克隆到p q e 3 0 、p q e 3 1 质粒后，转化大肠杆菌m 1 5 菌株。经i p t g 诱导，编码成熟蛋白的p q e 3 0 m 表 达出了n 端融合了6 x h i s 的融合蛋白，过量表达的蛋白主要以不溶性蛋白形式 存在，其表达量占菌体总蛋白的2 5 。s d s p a g e 分析表明，表达产物的分子 量约为3 1 9k d 。经w e s t e r n 印迹分析，证实表达的蛋白可与r g s - h i s 抗体和c u r c i n 抗兔血清发生专一性抗原抗体反应。包涵体经变性后又复性处理，用h i st r a p t m h p 柱分离纯化，纯度可达电泳纯。体外抗真菌潘陛试验表明，复性处理后的j f i p 融合蛋白使玉米弯孢菌和玉米纹枯菌的菌丝生长受到一定程度的抑制。而带信 号肽的前体蛋白未能表达。该实验结果为信号肽功能研究及j f i p 基因功能研究 提供实验基础。 四川人# 博l 论z 关键词：麻疯树；d 1 ，3 葡聚糖酶；麻疯树毒蛋白；分离纯化；原核表达 真菌侵染诱导蛋白；转基因烟草；抗真菌活性；基因克隆 x i i i 蚪川人学 尊f ：论文 i s o l a t i o na n d e x p r e s s i o n o f a n t i f u n g a l p r o t e i n sa n dt h er e l a t e d g e n e si nt h e s e e d so f j a t r o p h a c l l r e a s m a j o rb o t a n y p h d c a n d i d a t eq i nw e i s u p e r v i s o rp r o f f a n gc h e n a b s t r a c t j a t r o p h ac i d r c a $ i s am e m b e ro ft h ef a m i l ye u p h o r b i a c e a e n es e e d sr e p r e s e n t a na b u n d a n ts o u r c eo f p r o t e i n s p u r i f i c a t i o nt oa a t i f u n g a lp r o t e i n si si m p o r t a n tf o r i m p r o v i n gr e s i s t a n c e o fp l a n t s a g a i n s tp a t h o g e n i cf u n g i i no u rs t u d y a1 3 一l ， 3 - g l u c a n a s ew a si s o l a t e da n dp u r i f i e df r o mj ：c r r c a ss e e d s ，w h i c hw e r ec o l l e c t e d f r o mp a n x ia r e a , s i c h u a np r o v i n c e i te x h i b i t e dam o l e c u l a rw e i g h t 似r r ) o f6 5 5k d c o n s i s t i n go f t h r e es u b u n i t sw i t hn o n - c o v a l e n tb o n dc o n j u g a t e t h ei s o e l e c t r i cp o i n t ( p d o f g 5 4 w a 3 6 e t e r m i n e d 日艟o p t i m a l t e m p e r a t u r e a n d p h o f 也e 8 一l ，3 一g l u c a n a s e a c t i v i t yw e r e4 0 0 - 5 0 ca n d7 r e s p e c t i v e l y t h ee n z y m ew a ss t a b l ea tp h 6 8a n d t e m p e r a t u r eb e t w e e n4 c 5 5 t h es p e c i f i c u l t r a v i o l e t s p e c t r u m f l u o r e s c e n c e s p e c t r u ma n da m i n oa c i dc o m p o s i t i o n 、v e r ed e t e r m i n e d a n t i s e r u m t ob 1 ， 3 - g l u c a n a s er e c o g n i z e dt h r e eb a n d so f 2 0k d ，2 2k da n d2 3k do nw e s t e r nb l o to f p r o t e i n se x t r a c t e df r o ms e e d s n ob a n dw a ss h o w e do nw e s t e r n b l o to f r o o t s ，s t e m s a n dl e a v e s w es u g g e s tt h a tt h eb 一1 ，3 - g l u c a n a s ei se x p r e s s e d s p e c i f i c a l l yi ns e e d s t h e 8 - 1 ，3 - g l u e a n a s ee x h i b i t e d d i f f e r e n t a n t l f u n g a la c t i v i t y t o w a r dh y p h a l g r o w t h s p o r ef o r m a t i o na n dg e r m i n a t i o no fp y r i c u l a r i ao l y z c z ec a v ，r h i z o c t o n i a s o l a n ik u h a ，c u r v u l ? t r i al u n a t a ( w a l k ) b o e da n dg i b b e r e l l ez e a e ( s c h w ) p e t c h ，o f x i v 四川大学博l 论立 w h i c ht h ei n h i b i t o r ye f f e c to np y r i c u l a r i ao r y z a ec a r w a st h es t r o n g e s ta n d c o u l db e m a i n t a i n e df o ral o n gt i m e t h ec a l a b a s h s h a p eh y p h a eo fpo r y z a ec a v a n dt h e y e l l o wb a l l si nh y p h a lc e l l s o fgz e a e ( s c h w ) p e t c h w e r eo b s e r v e du n d e rl i g h t m i c r o s c o p e u n d e rt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e t h ec o m m o ne f f e c t o ft h eb - 1 , 3 - g l u c a n a s eo nh y p h a lg r o w t hi n h i b i t i o nc o u l db ed e t e c t e di nt h ep r e s e n c eo f c e l l w a l l t h ec e l lw a l l so fh y p h a et r e a t e db y p - 1 , 3 一g l u c a n a s eb e c a m et h i na n dw e a k w es u g g e s tt h a tt h ea n t i f u n g a l a c t i v i t y o f8 - 1 , 3 一g l u c a n a s e m i g h t b er e l a t e dt o h y d r o l y z i n gf u n g a l c e l lw a l l sa n d c h a n g i n gf u n g a l m e t a b o l i c p a t h w a y 1 3 - 1 ，3 - g l u c a n a s ew a ss l i g h t l yt o x i ct om i c e ，l d s 02 2e c x g ( 9 5 c o n f i d m m el i m i t s ) i t c o u l d a g g l u t i n a t ed u c k r e dc e l lu n d e r p o l y e t h y l e n eg l y c o l ( p e g ) i n d u c t i o n c o n d i t i o n c u r c i nc o u l d o b v i o u s l y i n h i b i t h y p h a lg r o w t h a n d s p o r e f o r m a t i o no f 加i c u l a r i ao r y z a ec a v ，p e s t a l o t i af u n e r e a l ，r h i z o c t o n i as o l a n ik u h a ，s c l e r o t i n i a s c l e r o t i o r u m ( l i b ) d eb a r y ，a n dc o l l e c t o t r i c h u m g l o e o s p o r i o i d e s ( p e r z ，) s a c c m o d i f i e dh y p h a et r e a t e d1 她也c u r c i nw e r eo b s e r v e du n d e rl i g h tr n i c r o s e o p e s o m e p r o t e i nb a n d so ft r e a t e dh y p h a ed i s a p p e a r e do ns d s - p a g e w es u g g e s tt h a tt h e i n h i b i t o r ye f f e c to f c u m i no n p a t h o g e n i cf u n g im i g h tb er e l a t e dt op r o t e i nd i s a p p e a r o f t r e a t e df u n g i a n t i s e r u mt oc u m i n r e c o g n i z e do n eb a n do f 2 8 5k d o nw e s t e r nb l o t o f p r o t e i n se x t r a c t e df r o ms e e d s n ob a n dw a ss h o w e do nw e s t e r nb l o to fr o o t s ， s t e m sa n dl e a v e s w es u g g e s tt h a tc u r c i ns h o u l db ee x p r e s s e d s p e c i f i c a l l y i ns e e d s a no p e nr e a d i n gf r a l x l e ( o r de n c o d i n gm a t u r ep r o t e i no f c u r c i n ，w h i c hw a s a m o s t l yc o r r e s p o n d e dt o i t se d n as e q u e n c e ，w a sf i r s tc l o n e df r o mt o t a ld n ao f j a t r o p h ac u r c a 3 i tw a si n d i c a t e dt h a tn oi n t r o n se x i s t e d t h eo r fw a st r a n s f e r r e d i n t ot o b a c c o ( n i c o t i a n at a b a c u ml ) v i aa g r o b a c t e r i u mm e d i a t i o n t h ec u r c i no r f w a si d e n t i f i e dt ob e i n t e g r a t e d i n t ot o b a c c o g e n o m e ，a n d t ob e e x p r e s s e d a t t r a n s c r i p t i o nl e v e lb yp c ra n dr t - p c r t h et r a n s g e n i ct o b a c c op l a n t se x h i b i t e dt h e a n t i f u n g a la c t i v i t ye n h a n c et o w a r d r h i z o e t o n i as o l a n i t h ee d n a s e q u e n c ee n c o d i n gj f i pw a sf i r s tc l o n e df r o m ，c t d r c o sl e a v e s w h i c hw e r es t r e s s e d b yp e g ，t e m p e r a t u r ea n df u n g ii n f e c t i o n i t so r f , w h i c h c o n t a i n sas i g n a lp e p t i d eo f4 2a m i n oa c i dr e s i d u e s ，h a d9 2 7b pt h a te n c o d e da p r e c u r s o rp r o t e i no f 3 0 9a m i n oa c i dr e s i d u e sw i t hc a l c u l a t e dm ro f3 4 9k da n dt h e x v 州i t 学肆f 论文 p r e d i c t e dp l o f6 5 6 t h eo r ft h a te n c o d e dt h em a t u r ep r o t e i nw i t h2 6 7a m i n oa c i d r e s i d u e sh a d8 0 1 b p t h e c a l c u l a t e dm rw a s3 0 1k da n dt h ep r e d i c t e dp lw a s5 2 5 t h e r ea r es p e c i f i ch y d r o p m h yp l o ta n dc h e m i c a lm o d i f i c a t i o np o i n ti nt h ed e d u c e d a m i n oa c i ds e q u e n c e t h e p r e d i c t e ds e c o n d a r y s t r u c t u r eo f j f i pw a s m a i n l y c t ，h e l i x j f i pi n c l u d e ss i xd h e l i x e sa n ds i xb f o t d i n g si n3 d s t r u c t u r e t h e r ei s h i g h s i m i l a r i t yw i t ht h ec o n s e r v e dd o m a i no fr i p s a n t i s e r u mt oc u r c i nr e c o g n i z e do n e b a n do f 3 2k do nw e s t e r nb l o to f l e a v e st r e a t e db yt e m p e r a t u r es t r e s s e sa t4 c a n d5 0 a n d b yf u n g a li n f e c t i o no f 只f u n e r e a lcl u n a t a ( w f l k ) b o c d g ，：e d e ( s c h w ) p e t c h n ob a n dw a ss h o w e do i lw e s t e r nb l o to f r o o t s 。s t e m sa n dl e a v e sb y t h e s a m e s t r e s s e sa n di n f e c t i o n s t w ob a n d so f 3 2k da n d6 5k dw e r er e c o g n i z e do nw e s t e r n b l o to ft h el e a v e st r e a t e db y1 0 一4 0 p e g a n dn ob a n dw a ss h o w e do nw e s t e r n b l o to f r o o t s ，s t e m sa n dl e a v e s t h e3 2k dw a s n e a r l y t h em ro f j f i ew e s u g g e s t t h a t t h ep r o t e i no f3 2k ds h o u l db er e l a t e dt oj f i p t h ep r e s e n c eo f p r o t e i nm o l e c u l a r m a r k e ru n d e rd r o u g h t , t e m p e r a t u r ea n df u n g a li n f e c t i o nm a yp r o v i d ee x p e r i m e n t f o t m d a d o nt os t u d yt h es t r e s s e dp r o t e i n s t h eo f f e n c o d i n g i p m a t u r ep r o t e i nw a si n s e r t e di n t oa p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n v e c t o rq i a e x p r e s ss y s t e mp q e - 3 0 t h e g e n ew a so v e r e x p r e s s e di ne c o bm 1 5 t h e r e c o m b i n a n t g a v e r i s et oa31 9k dm a t u r e p r o t e i ni nr e s p o n s et ot h ei p t g i n d u c t i o n t h e a n t i b o d ya g a i n s tr g s h i sr e c o g n i z e ds p e c i f i cb a n do f3 1 9k do nw e s t e r nb l o t ， a n dt h ea n t i s e r u ma g a i n s tc u r c i na l s or e c o g n i z e dt h es a m eb a n d t h ef u s i o np r o t e i n s w e r ef o u n dl a r g e l yi na ni n s o l u b l ei n c l u s i o nb o d i e sa n di t sc o n t e n tw a sa b o u t2 5 a m o n gt o t a lc e l lp r o t e i nb yg e n eg e n i u sb i oi m a g i n gs y s t e m a f t e rt h ei n c l u s i o n b o d i e sw e r od e n a t u r e da n d r e n a t o r e d ，t h ep u r i f i e df u s i o np r o t e i n sw a so b t a i n e db yh i s t r a p t m h p c h r o m a t o g r p h y c o l u m n t h er e n a t u r e df u s i o n p r o t e i n s e x h i b i t e d a n t i f u n g a la c t i v i t ya g a i n s tr h i z o c t o n i as o l a n ik u h aa n dc u r v u i a r i al u n a t a ( w a l k ) b o e d k e y w o r d s j a t r o p h ac u r c o s ；b - i ，3 一g l u c a n a s e ；c u r c i n ；p u r i f i c a t i o n ；p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n ；j f i p ；t r a n s g e n i ct o b a c c o ；a n t i f u n g a la c t i v i t y x v l 四川大学博e 学臣论文 麻疯树b - i ， 一部分 _ 上上l z - 卜 口j ) _ 3 葡聚糖酶纯化、性质 及抗茵活性研究 第 到川大学博 学位论文 第一章麻疯树p 一1 ，3 葡聚糖酶的提取纯化、 性质及其分布特异性检测 摘要用盐离子浓度、p h 值和州h 4 ) 2 s 0 4 饱和度三园子优化麻疯树种子中b 一1 3 葡聚糖酶的提取条件。结果表明，b l ，3 葡聚糖酶在p h7 0 的条件下 用含im o l ln a c ! 的5m m o i l 磷酸缓冲液提取和用6 0 8 0 饱和度的( n h 4 ) 2 s 吼 沉淀后得率大约为1 7 ( g 蛋白质1 0 0 9 种子) ，高于所试其它条件。b 1 ，3 葡聚糠酶在粗酶依次通过荀聚糖凝胶s 印h m e xg 7 5 ，离子交换剂s p s e p h a r o s ef f 及h i p r e p s e p h a c r a y s i o o h r 预装柱柱屡析后得到纯化。经常规聚 丙烯酰胺凝胶电泳，十二烷基磺酸钠线形梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳，w e s t e r n 杂 交及凝胶过滤检测后表明，该酶分子量为6 5 5k d ，三亚基组成，非共价键结合。 经等电聚焦测得等电点为8 3 。经酶学性质和稳定性测定，其最适作用温度为4 0 一5 0 c ，最适p h 为7 ；在4 c 一5 5 。c 内以及p h6 _ 8 范围内最稳定。理化分析 表明，该酶具特征性的紫外吸收光谱、荧光光谱和氨基酸组成。用该蛋白免疫 家兔获得了特异性强的兔抗血清。通过w e s t e r n 杂交的方法检测到b 一1 ，3 葡 聚糖酶仅存在于种子中而在根、茎、叶中未见分布。 关键词麻疯树：1 3 1 ，3 葡聚糖酶；分离纯化： 性质；特异性分布 引言 8 一i ，3 葡聚糖酶，又称为昆布多糖( l a m i n a r a n ) 酶或胼胝质酶。它的作 用底物为以b 1 ，3 一糖苷键连接起来的多聚糖，以随机作用方式将多聚糖分解成 为糊精或寡聚糖川。b l ，3 葡聚糖酶可由多种生物园子和非生物因子诱导产 生，是植物抗真菌病的重要抗性物质之一，也在植物正常的阶段发育中发挥重要 作用【2 j 。其蛋自家族一直都倍受关注，对葡聚糖酶的研究已经涉及到了分类、 生理、分子生物学、抗病基因工程及雄性不育基因工程的实际应用等方面。 2 婴型：苎；兰竖主兰垡迨塞 一 根据蓝海燕，c l a u d ep ，蔡新忠，杜良成等【1 , 4 - 6 的描述，0 一i ，3 葡聚糖酶 是植物中由p r 基因编码的一类病程相关蛋白( p a t h o g e n e s i s - r e l a t e dp r o t e i n s ， p r s ) ，属于p r 2 。它具有离体水解b l ，3 一葡聚糖的作用。各种类型的b l ，3 葡 聚糖酶已从多种植物中分离出来。如葡萄、桃树、烟草、香蕉、马铃薯、大麦、 水稻、大豆、亚麻、玉米、高粱、豌豆、早熟禾、菜豆、西红柿、拟南芥、鹰 嘴豆、三叶胶树等。根据其特点可将其分为四种不同类型。i 类葡聚糖酶为碱 性，主要存在在于液泡中，体外具较强抑菌活性。该类蛋自在小于5 0 “g m l 的 水平上抗大量的真菌包括人类和植物病原菌，如r h i z o c t o n i as o l a n lc a l b i c a n s ， a n d a s p e r g i l l u s m i g a t u s 。其抗真菌活性己通过离体的酶和细胞整体实验及转基 因植物的高效表达而得到证实。主要分布在叶的表皮细胞层中，受病原菌、乙烯、 水杨酸、伤口、u v 等因素诱导。i l 类葡聚糖酶具有较低等电点，被称为酸性葡 聚糖酶。主要分布在细胞间隙，在体外无抑菌活性，与i 类酶有5 5 同源性，但i i 类酶与i 类酶在血清学上具有相似性。能被病原菌诱导。i i i 类葡聚糖酶分别从 烟草和黄瓜中分离得到，为酸性酶，分布在胞外。与i 类碱性酶比较，氨基酸序列 同源性从5 0 7 0 ，与i i 类葡聚裙酶相比，只有5 4 5 9 的同源性，可以被 病原菌诱导。类葡聚糖酶为酸性胞外酶，与i i 、i i i 类酶相似性较小，它不能被 瘸原物诱导。 许多植物中都含有种以上的葡聚糖酶，如从烟草中至今已分离出i 、i i 、 i i i 类的4 种葡聚糖酶。不同类型的葡聚糖酶在同一种植物中的丰富程度亦不同。 在菜豆中，含量最高的为碱性葡聚糖酶，其次为两种酸性萄聚糖酶。 麻疯树种子中含丰富的蛋白质资源。到目前为止，已从麻疯树种子中分离 出抗癌活性蛋白，酯酶和脂肪酸酶等，并相继作了性质测定1 7 f 甄9 删“，然而麻 疯树一l ，3 葡聚糖酶钓分离纯化及相关研究未见报道。为了探讨麻疯树防卫 反应的物质基础，特别是抗植物病原真菌的物质基础，以便该物质在进一步的 植物抗性研究中发挥作用，我们对麻疯树种子进行了b 一1 ，3 葡聚糖酶的筛选、 纯化和性质测定。为了了解纯化到的b l ，3 葡聚糖酶在麻疯树不同器官中的 分布情况，我们以纯化的b l ，3 葡聚糖酶为抗原免疫兔子，以制成的抗体对 麻疯树幼苗的根、茎、叶进行w e s t e r n 杂交检测。本章报道了麻疯树种子中s l ，3 葡聚糖酶粗酶的提取条件的优化、b l ，3 葡聚糖酶的纯化程序，也对其 性质、毒性及分布情况进行了研究，为进一步开发麻疯树资源提供实验基础。 3 璺型盔兰整主兰堡鲨兰 一 1 材料和方法 1 1实验材料 1 1 1 材料 麻疯树成熟种子采自四川攀西地区。在2 5 c 下麻疯树幼苗培养在装有无菌 蛭石的直径为6c m 的花盆中，正常生长一个月后，收集根、茎、叶用于蛋白质 的提取。小白鼠和大白兔购自四川大学华西医学中心动物实验场。 1 1 2 药品、试剂与器材 s e p h e d e xg 1 0 0 、s e p h a d e xg 7 5 干粉- p h a m a c i a 进口分装：s p - - s e p h a r o s e f f ( 2 5 m l ) 、h i p r e p1 6 6 0s e p h a c r a ys 一1 0 0 h r a m e r s h a mb i o s c i e n c e s ；中分 子量蛋白质标准、叠氮钠上海华舜公司：等电点蛋白质标准b i o r a d ：考马 斯亮蓝r - 2 5 0 、g 一2 5 0 、丙稀酰胺、n ，n 一甲叉双丙稀酰胺f l u k a 公司；牛血 清白蛋白( b s a ) 、甘露糖、弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂一s i g m a 公司：山 羊抗兔i g g a p ( 二抗) 、n b t b c i p 染色试剂盒一华美生物工程公司，t w e e n2 0 _ b i b 公司。其他化学药品为进口或国产分析纯试剂。 b s z 一1 0 0 自动部分收集器、h l 2 d 定时数显恒流泵一上海沪西分析仪器厂； g e n t r i f u g e5 4 1 5 d 与5 8 0 4 r 离心机- - e p p e n d o r f ；凝胶成像系统- - o c n e g e n i u s b i o i m a g i n gs y s t e m 。 1 2 实验方法 1 2 1 麻疯树b - i ，3 葡聚糖酶的粗级分离 参考赵永芳f m l 和陶慰孙等n 2 】所述筛选最佳提取条件。 碴酸煞冱选煎线壁量焦煎酸篮终鏖煎箍鎏：取优质种仁1 4 0g ，用3 0 0m l5 m m o l l 磷酸缓冲液( p b s ) ( 舍0 2m o l l 的n a c t ，p h7 2 ) 浸泡过夜。匀浆 后磁力搅拌4h ，高速离心( 1 6 ，0 0 0 g ，4 ，2 0m i n ) ，八层纱布过滤以去油 脂，得第一次抽提液和残渣。在残渣中加3 0 0m lp b s 进行第二次抽提。将两 次抽提液合并，共7 0 0m l 。将蛋白抽提液分成七份，每份1 0 0m l ，分别加入 3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、9 5 饱和度的( n 地) 2 s 0 4 以沉淀蛋白 质，边加边用1m o l l 的n a o h 调p h 值，以维持p h7 2 左右。搅拌2 0m i n 后静置过夜以沉淀蛋自质。分别用终浓度为3 0 9 5 的( n h 4 ) 2 s 0 4 溶液洗涤蛋 型业盔兰竖：竺! 堡堕墨一一 白质沉淀再次离心( 1 6 ，0 0 0 g ，2 0m i n ，4 c ) ，弃去上清液，分别用1 0 m l 的p b s 溶解蛋白质沉淀。收集蛋白质沉淀，用p b s ( 含o 2m o l l 的n a c i ，p h 7 ) 搅拌透析除盐4h 更换一次透析外液。滤去沉淀物，收取各上清液即得 蛋白质粗提液。十二烷基磺酸钠线形梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s g r a d i e n t p a g e ) 后凝胶成像系统g e u et o o l s 分析目的蛋白的含量。 量焦堡室的趟笪蕴堡：按参考赵永芳 1 t b 的方法配制广泛缓冲液( 每升混合液内 含柠檬酸6 0 0 8g ，磷酸二氢钾3 8 9 3g ，硼酸l - 7 6 9g ，巴比妥5 2 6 6g ) ，滴 加0 2 m o v l 的n a o h 调至所需p h 值，得到p h3 0 、p h4 0 、p h5 0 、p h6 0 、 p h7 0 、p h8 0 、p h9 0 、p h1 0 0 、p h1 1 0 、p h1 2 0 的溶液，溶液中加n a c i 至浓度为1m o l l l 。称取种仁5g ，液氮研磨，加5 0 m l 不同p h 值的溶液分别 溶解，静置1h 。4 c 下1 6 ，0 0 0 g 离心2 0m i u ，取上清液电泳检测。 曩焦签奎的盐矗王鎏廑缝选：分别选用含0 ，o 0 5 ，0 2 ，o 5 ，1 0 ，1 5 ，2 0m o l l n a c l 浓度的p b s 缓冲液提取蛋白质样品。按梁红等【i3 】的方法，称取种仁5g ， 液氮研磨，加5 0m l 不同盐离子浓度条件的p b s 分别溶解，静置1h 。4 c 下 1 6 ，0 0 0 g 离心2 0r a i n ，取上清液电泳检测。 i 2 2 麻疯树0 - i ，3 葡聚糖酶的纯化 取蛋白质粗提液6 m l 上样于充分平衡的s e p h a d e x g 7 5 ( 2 6 c m 8 5c m ) ， 上样后用同样的缓冲液洗脱，速度为1 6m l h ，每管收集4m l ，共收集l1 0 管。 收集0 一l ，3 葡聚糖酶活性峰，经p e g 一2 0 ，0 0 0 浓缩后上样于s p s e p h a r o s e f f ( 1 8 c m x 2 0 a 1 1 ) 离子交换桂，用提取缓冲液洗脱后，收集活性峰，再用5 0 0m l 含o 一1 0 m o l ln a c i 的p b s 进行梯度洗脱。经浓缩后取2m l 蛋白液上样于s e p h a c r a y s 1 0 0 ( 1 6c r u x 6 0 ) 预装柱，在f p l c 上进一步过柱纯化，流速为0 8m l m i n ， 收集活性峰，纯度检测。 1 2 3 酶活检测 按照w a n g ”j 的方法进行。 将反应底物l a m i n a r a n 用5 0m m o l l 的n a a c ( p h5 5 ) 配成o 6 ( m a s s v 0 1 ) 的溶液。取l m ll a m i n a r a n 溶液与0 sm l 待颡口洗脱峰混和，4 0 c 温 育5 0r a i n 。每1 0m i n 取一次样，测定生成的糖的含量。酶活性定义为n m o l e s 5 婴型查兰竖：! 兰堡堡兰 葡萄糖m g m i n 蛋白质。中性糖含量的测定采用s o m o g y i ，以甘露糖作为标 准。 1 24 酶活性峰的纯度检测、亚基组成及分子量的确定 s d s - g r a d i e n tp a g e ：按a n s u b e le ta 1 i 1 6 a l 配制s d s g r a d i e n tp a g e 胶。 溶液a ( 丙烯酰胺贮存液) ：2 9 2 9 丙烯酰胺0 8 9 双丙烯酰胺，加蒸馏水至 1 0 0 m l ，通风柜中搅拌至完全溶解。 溶液b ( 4 分离胶缓冲液) ：6 0 m l2 m o l l i r i s ( p h8 8 ) ；加入盐酸至p h 8 8 ， 加蒸馏水至1 0 0m l 。 溶液c ( 4 浓缩胶缓冲液) ：5 0m l l m o l l i r i s ( p h6 8 ) ；加入盐酸至p h 6 8 ： 加蒸馏水至1 0 0m l 。 1 0 的过硫酸铵：1 0g 过硫酸铵，加入蒸馏水定容至1 0 0m l 。 1 0 s d s ：1 0gs d s ，加入蒸馏水定容至1 0 0m l 。 分离胶：3 0m l 浓度5 ( 轻液) d d h 2 08 7 5 m l 溶液a 2 5m l 溶液b3 7 5m l 1 0 s d s 1 5 0ul 蔗糖0 t e m e d8 “l 1 0 的过硫酸铵 8 0i il 浓缩胶：5 m l d dh 2 03m l 溶液a o 6 7m l 溶液c 1 2 5m l 1 0 s d s 5 0ul 1 0 的过硫酸铵 7 0ul t e m e d7pl 6 2 0 ( 重液) 0m l 1 0m l 3 7 jm l 1 5 0ul 2 2 5g 8 弘l 8 0ul 婴坐叁兰塑! 兰垡堡塞 一一 1 0 x 电泳缓冲液：3 0 9 t r i s ，1 4 4g g l y ，l o g s d s ，分剐溶解于蒸馏水中，再定 容到1 0 0 0m l 。 垩基间的整撞直式丝拴型：为检测亚基间的连接方式( 二硫键或次级键) ，以王 镜岩n 7 鸪和郭尧君u 8 “所述为依据，按下列方法处理样品： 还原蛋白质的上样缓冲液i 的配制：t r i s - h c i1 0 0 l l r l o l l ，p h6 8 ；g l y c e r o l 2 0 ( w ，v ) ； s d s 4 ( w v ) ：d i t h i o t h r e i t