（无机化学专业论文）以偶氮胂（羧）金属配合物为光谱探针测定蛋白质的研究.pdf

广亩评范土学礁士哪究t 学位论文 以偶氮胂( 羧) 金属配合物为光谱探针测定蛋白质的研究 研究生：石展望 导师：赵书林教授 中文摘要 蛋白质是生物体内最重要的物质之一，是生命的基础。蛋白质的定量分析既 是生物化学、药学和其它生物学科中经常涉及的分析内容，也是临床检验中疾病 诊断及检验疾病治疗效果的重要指标。而且，蛋白质的定量分析，还是许多生化 药物分离提纯的质量控制和食品检验的常规分析项目。因此，建立快速、准确、 高灵敏的蛋白质定量分析方法具有重要的理论和现实意义。 本文对偶氮胂( 羧) 金属配合物与蛋白质的结合反应进行了详细的研究，建 立了五种高灵敏的测定蛋白质含量的新方法。直接应用于生物样品分析，获得了 满意的结果。主要研究工作如下： 1 详细考察了偶氮肿 u - 钇( i ) 在p h2 3 2 5 的b r i t o n r o b i n s o n 缓冲介 质中与蛋白质的作用，建立了以偶氮胂i i i 一钇( 1 i i ) 为光谱探针，分光光度测定 蛋白质含量的新方法。该法线性关系好，灵敏度高。以人血清白蛋白( h s a ) 为 例，浓度在0 2 0m g l 范围内与配合物最大吸收波长( 6 5 2n m ) 处的吸光度降 低值成正比，相关系数r = o 9 9 9 9 ，表观摩尔吸光系数5 6 5 2 = 2 6 0 x 1 0 6 lm o l - 1c m 。生物体内常见物质基本不干扰测定。应用于人血清样品中蛋白质 总量的测定，结果满意。 2 将对乙酰基偶氮胂金属配合物用于蛋白质分析，建立了以对乙酰基偶氮 胂一钇( i i i ) 为光谱探针测定蛋白质含量的新方法。当以配合物的最大吸收波长 ( 6 5 3n m ) 为检测波长时，蛋白质( 以h s a 为例) 的浓度在0 - 2 0m g l 范围内 与配合物吸光度的降低值呈现良好的线性关系，表观摩尔吸光系数 如5 3 = 1 9 8 x 1 0 6 l - m o l - 1 c m 。该法简便，快速，灵敏度高，抗干扰能力强。成功 应用于人血清样品中蛋白质总量的测定。 3 首次研究了卢型金属配合物与蛋白质的结合反应。在p h0 7 5 - 1 5 的h c i - - n a a c 缓冲介质中，口型金属配合物偶氮硝羧一钡( i i ) 能与蛋白质在室温下 7m i n 内反应完全。基于此，建立了以偶氮硝羧一钡( i i ) 口型配合物为光谱探 针的快速、灵敏测定蛋白质含量的分光光度新方法。该方法对h s a 的表观摩尔 广西师范大学硕士研竟生学位论文 吸光系数旬1 0 - - - - 4 6 2 x 1 0 6l m o l - 1 c m 。应用于人尿液样品中蛋白质总量的测定， 结果与b r a d f o r d 法一致。 4 采用分光光度法研究了蛋白质与口型金属配合物对乙酰基偶氮羧一锶 ( i i ) 的结合反应，确定了反应的最佳条件，建立了以对乙酰基偶氮羧一锶( i i ) 为光谱探针测定h s a 、牛血清白蛋白( b s a ) 、卵蛋白( o v a ) 和人免疫球蛋白 ( h i g ) 等四种蛋白质含量的新方法。四种蛋自质的线性范围分别为：0 - 1 0m g l ， 0 1 0m g l ，0 - 2 5m g l 和o 一2 0m g l ；检测限分别为：0 0 1 7m g l ，o 0 1 8m g l ， o 0 4 8m g f l 和0 0 2 5m g l l 。将该方法应用于人尿液样品中蛋白质总量的测定， 结果与b r a d f o r d 法一致。 5 研究了卢型金属配合物间羧基偶氮羧一锶( 1 1 ) 与蛋白质的结合反应。 考察了各种因素对反应的影响，优化了反应条件，在最佳条件下建立了以间羧基 偶氮羧一锶( 1 i ) 为光谱探针测定h s a 、b s a 、0 、，a 和h i g 等四种蛋白质含量 的新方法。其浓度分别在o 一1 0m g l 、0 - 1 0m g l 、o 一2 0m g l 和0 1 5m g l 范围内服从比尔定律，在7 0 4n m 处表观摩尔吸光系数分别为：5 0 6 x 1 0 6 l - t o o l - 1c m 。，4 1 7 1 0 6l - t o o l - 1c m ，1 ，1 4 x 1 0 6l t o o l - 1 c m 。1 和8 0 4 x 1 0 6 l - t o o l - 1 c m 。应用于人血清样品中蛋白质总量的测定，结果与b r a d f o r d 法一致。 并初步探讨了该口型配合物与蛋白质的结合机理，认为其结合作用类似于阴阳 离子的静电作用。 关键词：偶氮胂( 羧) ，金属配合物，光谱探针，蛋白质 广两择范太学j 毳士婶宪t 学位论文 s t u d yo nt h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i nb yu s i n ga r s e n a z o ( c a r b o x y a z o ) - m e t a li o nc o m p l e x e s a ss p e c t r o p r o b e s p o s t g r a d u a t e ：s h iz h a n w a n gs u p e r v i s o r ：p r a f z h a os h u l i n a b s t r a c t p r o t e i ni so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tm a t e r i a l si no r g a n i s m ，a n da f o u n d a t i o no ft h el i f e 。t h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fp r o t e i ni sab a s i cr e q u i s i t e n o to n l yi nb i o c h e m i s t r y , p h a r m a c ya n do t h e rb i o l o g i c a ls u p e r s ，b u ta l s oi n c l i n i c a la s s a ya n df o o ds u r v e y , b e c a u s ep r o t e i nl e v e l sa r eo f t e nu s e da sa r e f e r e n c ef o rm e a s u r e m e n t so fo t h e rc o m p o n e n t si nb i o l o g i c a ls y s t e m s s oi t i so fg r e a ts i g n i f i c a n c et oe s t a b l i s hr a p i d ，a c c u r a t ea n ds e n s i t i v ep r o t e i na s s a y m e t h o d s t nt h i sp a p e r , f i v eh i g h l ys e n s i t i v en e wm e t h o d sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no f p r o t e i nw e r ed e v e l o p e db ys t u d y i n go nt h eb i n d i n gr e a c t i o n so fa r s e n a z o ( c a r b o x y a z o ) 一m e t a li o nc o m p l e x e sw i t hp r o t e i na n dh a v eb e e na p p l i e dt ot h e a n a l y s i so ft o t a lp r o t e i ni nb i o l o g i c a ls a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s t h e m a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa r ea sf o i l o w s ： 1 an e wm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n sb yu s i n ga r s e n a z oi i l y t t r i u m ( i i i ) c o m p l e xa sas p e c t r a lp r o b ew a se s t a b l i s h e d t h i sm e t h o di sb a s e d o nt h eb i n d i n gr e a c t i o no fp r o t e i nw i t ha r s e n a z oi i i y t t r i u m ( i i i ) c o m p l e xi n b r i t o n r o b i n s o nb u f f e ra tp h2 3 2 5 t h eb i n d i n gr e a c t i o ni sc o m p l e t ew i t h i n 3 0m i na tr o o mt e m p e r a t u r e ，a n dc a u s e sa b s o r b a n c ed e c r e a s ea t6 5 2n mo f t h ec o m p l e x t h ed e c r e a s eo fa b s o r b a n c ei sp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o n o fp r o t e i n t h ec a l i b r a t i o nc u r v ef o rh u m a ns e r u ma l b u m i n ( h s a ) i sl i n e a ru pt o 2 0m g l ，a n dt h ea p p a r e n tm o l a ra b s o r p t i v i t yo fb i n d i n gr e a c t i o na t6 5 2n mi s 2 。6 x 1 0 8l m o r t c m 。t h em e t h o dh a sb e e na p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no ft h e t o t a lp r o t e i ni nt h eh u m a ns e r u ms a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s 2 t h eb i n d i n gr e a c t i o nb e t w e e np r o t e i na n dp - a c e t y l a r s e n a z o y t t r i u m ( f i ) 1 1 1 广西师范大学硕士唧究生学位论文 c o m p l e xw a ss t u d i e da n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fr e a c t i o nw e r ec h o s e nb y s p e c t r o p h o t o m e t r y b a s e do nt h eb i n d i n gr e a c t i o n ，a n o v e lm e t h o dw a s e s t a b l i s h e df o rt h es p e c t r o p h o t o m e t r i cd e t e r m i n a t i o no fp r o t e i nb yu s i n g p - a c e t y l a r s e n a z o - y t t r i u m ( 1 ) c o m p l e x a s a s p e c t r a lp r o b e t h eb i n d i n g r e a c t i o ni s c o m p l e t e i nh a c - n a a cb u f f e ra td h3 7 _ 4 0 。a n dc a u s e s a b s o r b a n c ed e c r e a s ea t6 5 3n mo ft h ec o m p l e x t h ed e c r e a s eo fa b s o r b a n c e i sp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fp r o t e i ni nt h er a n g eo f0 - 2 0m g lf o rh s a a n dt h ea p p a r e n tm o l a ra b s o r p t i v i t yo fb i n d i n gr e a c t i o na t6 5 3n mi s1 9 8 x10 6 l m 0 1 - 1 c m f o rh s a ，t h em e t h o dh a s b e e na p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no ft h e t o t a lp r o t e i ni nt h eh u m a ns e r u ms a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s 3 t h i si st h ef i r s tr e p o r to nt h eb i n d i n gr e a c t i o nb e t w e e n 卢t y p ec o m p l e x a n dp r o t e i n i nh c i - n a a cb u f f e rm e d i u ma tp h0 7 5 1 5 ，p r o t e i n b i n d s n i t r o c a r b o x y a z o b a r i u m ( i i ) 卢t y p ec o m p l e xr a p i d l y ( w i t h i n 7m i na tr o o m t e m p e r a t u r e ) t of o r map r o d u c ts t a b l ef o r1 0h ，l e a d i n gt ot h ec h a n g eo ft h e a b s o r p t i o ns p e c t r u mo ft h ec o m p l e xa n dt h ed e c r e a s ei nt h ea b s o r b a n c ea t 7 10n m b a s e do nt h i s as e n s i t i v em e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o nm i c r o a m o u n t so fp r o t e i nw a sp r o p o s e d t h ec a l i b r a t i o nc u r v ef o rh s a i sl i n e a ri nt h e r a n g eo f0 - 2 0m g lw i t had e t e c t i o nl i m i to f0 0 15m g l v e r yf e wc o e x i s t i n g s u b s t a n c e si n t e r f e r ew i t ht h ea s s a y t h em e t h o dh a s b e e na p p l i e d t o d e t e r m i n a t et h et o t a lp r o t e i ni nh u m a nu r i n es a m p l e sw i t ht h es a m er e s u l t sa s b yt h eb r a d f o r dm e t h o d 4 b a s e do nt h es t r o n ga b s o r b a n c eo fp - a c e t y l c a r b o x y l a z o s t r o n t i u m ( i i ) 夕 t y p ec o m p l e xa t7 12n mw h i c hc a nb ed e c r e a s e db yt h ea d d i t i o no fp r o t e i ni n h c i - n a a cb u f f e ra tp h0 8 1 0 。an o v e lq u a n t i t a t i v em e t h o dw a sd e v e l o p e df o r t h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s t h el i n e a rr a n g e s o fc a l i b r a t i o nc u r v e sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fh s a b o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) ，e g ga l b u m i n ( o v a ) a n dh u m a ni m m u n o g l o b u l i n ( h i g ) w e r e0 1 0m g l ， 0 10m g l 。0 2 5m g la n d0 2 0m g l r e s p e c t i v e l y t h ed e t e c t i o nl i m i t sw e r e 0 0 17m g lf o rh s a ，o 0 18m g lf o rb s a ，o 0 4 8m g lf o ro v aa n d0 0 2 5m g l f o rh i g t h em e t h o dh a s b e e na p p l i e dt ot h ea n a l y s i so ft o t a lp r o t e i ni nh u m a n i v 广西师范太学硕士研究生学位论文 u r i n es a m p l e sa n dt h er e s u l t sw e r ei na c c o r d a n c ew i t ht h o s eo b t a i n e db yt h e b r a d f o r dm e t h o d ，w h i c hi n d i c a t e st h a tt h ep r e s e n tm e t h o di sn o to n l ys e n s i t i v e ， s i m p l e ，b u ta l s or e l i a b l ea n ds u i t a b l ef o rp r a c t i c a la p p l i c a t i o n s 5 t h eb i n d i n gr e a c t i o nb e t w e e nm c a r b o x y l l c a r b o x y l a z o s t r o n t i u m ( i i ) 卢 t y p ec o m p l e xa n dp r o t e i nw a ss t u d i e d u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s f o u r p r o t e i n s ，i n c l u d i n gh s a ，b s a ，o v aa n d h i gw e r et e s t e d ，t h ea p p a r e n tm o l a r a b s o r p t i v i t i e so ft h eb i n d i n gr e a c t i o na t7 0 4n ma r e5 0 6 xl0 6l - m 0 1 - 1 c m 一1f o r h s a 4 1 7 x 1 0 6 l - m o r l c m 。f o rb s a ，1 1 4 x 1 0 6 l t o o l - 1 , c m f o ro v a ，8 0 4 x 1 0 6 l m 0 1 - 1 c m f o rh i ga n dt h el i n e a rr a n g e so fc a l i b r a t i o nc u r v e sa r eo - 1 0m g l ， 0 10m g l 0 - 2 0m g la n do 一15m g l ，r e s p e c t i v e l y t h em e t h o dh a sb e e n a p p j i e dt od e t e r m i n a t et h et o t a lp r o t e i ni n h u m a ns e r u ms a m p l e sw i t ht h e s a m er e s u l t sa sb yt h eb r a d f o r dm e t h o d m o r e o v er ，t h em e c h a n i s mo ft h e b i n d i n gr e a c t i o nw a se x p l o r e dp r i m a r i l y i tw a s c o n s i d e r e dt h a tt h ee l e c t r o s t a t i c f o r c ew a st h em a i nb i n d i n gf o r c e k e y w o r d s ：a r s e n a z o ( c a r b o x y a z o ) ，m e t a li o nc o m p l e x ， s p e c t r o p r o b e p r o t e i n v 广西师范土学j 蠢士研究生学位论文 第一章前言 蛋白质是一类重要的生物大分子，它在生物体内占有特殊的地位。蛋白质和 核酸是构成细胞内原生质的主要成分。而原生质是生命现象的物质基础。核酸只 是遗传物质的载体，蛋白质才是生理功能的执行者。没有蛋白质就没有生命【l 】。 由于蛋白质的结构复杂，种类繁多，功能多样，所处的微观环境复杂，相互 影响微妙。因此，蛋白质分析的研究领域非常广阔，从基础的蛋白质定性、定量 分析到分子水平的蛋白质结构、性能、活性和相互作用研究，均属于蛋白质分析 的研究范畴。对蛋白质进行的分析测试工作主要有：提取与溶解，分离纯化，定 性定量分析，结构测定及作用机理研究等。蛋白质的定量分析既是生物化学、药 学和其它生物学科中经常涉及的分析内容，也是临床检验中疾病诊断及检验疾病 治疗效果的重要指标。而且，蛋白质的定量分析，还是许多生化药物分离提纯的 质量控制和食品检验的常规分析项目，某些生命物质如酶、多肽、蛋白质等的分 离纯化更是离不开蛋白质的定量测定。因此，蛋白质的定量测定在生命科学、临 床医学和化学研究中占有十分重要的地位。如何快速、准确、灵敏地测定蛋白质 的含量，仍是目前生物无机及分析化学领域里最活跃的研究领域之一。 1 蛋白质的测定方法 测定蛋白质含量的方法很多，如分子光谱法( 吸光光度法、荧光光度法和共 振散射法) ，高效液相色谱法，毛细管电泳法，浊度法，凯氏定氮法，斑点滤膜 结合法等。 在上述方法中，分子光谱法因具有简便快捷、成本低、灵敏度高、重现性好 等优点而备受人们关注【2 _ 9 】。由于蛋白质结构中含有芳环结构的氨基酸残基，因 而可利用蛋白质的内源光谱性质进行紫外光谱和荧光光谱法测定。但是蛋白质的 内源光谱很弱，这两种方法在检测灵敏度方面常常不能满足需要，所以，人们建 立了各种光谱探针分析法。所谓蛋白质的光谱探针，就是能与蛋白质发生相互作 用的物质( 有机分子、金属离子或金属配合物) ，这些物质与蛋白质结合后光谱性 质发生变化，从而可以提供蛋白质浓度或结构方面的信息。利用蛋白质光谱探针 可以测定微量蛋白质，研究蛋白质与光谱探针的作用机理，探索蛋白质结构与功 广西师范太学硕士研究生学位论文 能的关系。蛋白质光谱探针按其形式可分为：染料探针、余属探针和金属配合物 探针等：按其表达信息特征可分为：吸收光谱探针、荧光光谱探针和共振散射探 针等。 1 1 吸光光度法 测定蛋白质含量的吸光光度法有紫外吸收法、金属探针法、染料探针法和金 属配合物探针法等。 1 1 1 紫外吸收法 由于蛋白质分子中常含酪氨酸( t y r ) 、色氨酸( t r p ) 、苯丙氨酸( p h e ) 等芳香氨 基酸残基，在紫外2 8 0n m 处有最大吸收，其吸收值与蛋白质的浓度成正比，故 可用2 8 0n m 处吸收值大小来测定蛋白质含量。该法简单、快速、不消耗样品， 低浓度的盐类不干扰测定，因此在蛋白质和酶的生化制备中广泛应用。但是只有 几种氨基酸残基有紫外吸收，不能严格的定量，一般用于半定量测定。另外，核 酸和肽可引起较大的干扰。为消除其干扰，发展了2 8 0n m 与2 6 0n m 的吸收差 法及2 1 5n m 与2 2 5n m 的吸收差法。 1 1 2 金属探针法 以金属作为探针测定蛋白质的方法有双缩脲法、l o w r y 法、二喹啉甲酸法、 银染色法和胶体金属染色法等。 1 1 2 1 双缩脲法 双缩脲法 1 1 , 1 2 1 是基于蛋白质双缩脲反应的方法。含有两个或两个以上肽键的 物质和碱性的硫酸铜反应后，形成紫色的配合物，最大吸收在5 4 0n m 处，吸光 度的大小取决于蛋白质的浓度。本法主要优点在于不同种类蛋白质产生的颜色类 似，它是最常用的血清总蛋白的测定方法，并且不受温度的影响。其缺点是灵敏 度低，干扰较大，且操作复杂。m a t s u s h i t a 等 1 3 4 6 1 对双缩脲法进行了改进，使之 不断完善。 1 1 2 2l o w r y 法 l o w r y 澍1 7 1 是l o w r y 等人于1 9 5 1 年建立的，至今生物化学领域中最常用 广西师范土学硕士研霓t 学位论文 的方法之一。它结合了双缩脲法中铜盐反应及f o l i n c i o c a l t e a u 试剂( 主要是磷钼 酸和磷钨酸盐) 反应的特点。首先在碱性溶液中形成铜一蛋白复合物，然后这一 复合物还原磷钼酸和磷钨酸盐，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的 复合物在7 4 5 7 5 0n m 处有最大的吸收峰，颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比， 呵根据7 5 0n m 的光吸收值大小计算蛋白质的含量。该法的优点是不同蛋白质之 间的差别很小。缺点是干扰物质多，反应速度慢，使蛋白质发生不可逆变性。后 来，不断有人对该方法进行了改进，使方法的适用性大大地提高 1 8 - 2 3 】。 1 1 2 3 二喹啉四甲酸法 二喹啉四甲酸法是2 0 世纪8 0 年代提出的一种改进l o w r y 法。其原理是： 在碱性环境下蛋白质分子中的肽键结构与c u 2 + 络合生成络合物，同时将c u 2 + 还 原成c u + 。而二喹啉四甲酸可敏感特异地与c u + 结合，形成稳定的紫红色配合物， 在5 6 2n m 处有高的吸收值。该配合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，可根 据吸收值的大小来计算蛋白质的含量。汪洪亮等口5 1 将其用于脑脊液等样品中微 量蛋白质的测定。该法的灵敏度较高，对o 5 - 1 0m g l 的蛋白质可精确测定，与 l o w r y 法相比几乎没有干扰物质的影响，且不同蛋白质问信号差异小 2 6 1 。缺点是 反应时间长，且受葡萄糖的干扰较大。 1 1 2 4 银染色法 k r y s t a l 等2 7 1 基于蛋白质和银的结合能力，发展了以银为探针的微量蛋白质 测定的方法。蛋白质样品用甘油醛处理后与银氨溶液混合，1 0m i n 后加入硫代 硫酸钠终止反应，测定4 2 0n m 处的吸光度。蛋白质一银复合物形成快，显色稳 定，并且碳水化合物和非离子表面活性剂等物质几乎不干扰钡4 定。该法线性范围 宽，灵敏度较高。 1 1 2 5 胶体金属染色法 利用蛋白质与胶体金属的亲和作用，发展了胶体金属如金【2 8 、钯为探针 的微量蛋白质的测定方法。胶体钯可检测到1 0 0n g 的牛血清白蛋白，但强碱和 高浓度的盐以及十二烷基硫酸钠( s d s ) 干扰测定，且不同蛋白质间的信号有较大 的差别。 1 1 3 染料探针法 广西师范土学硕士研究生学位论文 染料探针法即染料结合法，是目前在蛋白质的临床分析中应用最为广泛的光 度分析方法。它是利用蛋白质与染料结合成沉淀或改变结合染料的吸光特性，借 助染料颜色的减退或变化的程度来测定蛋白质的含量。在作为染料探针的分子 中，大部分都含有能电离成阴离子的亲水性基团如羟基、磺酸基、酚羟基及不带 电荷的疏水性基团，如苯环。当溶液p h 值小于蛋白质的等电点时，蛋白质键亚 胺和n 端氨基质子化成阳离子，带负电的有机小分子通过与它的静电作用吸附 到蛋白质表面；同时由于一些非静电力如疏水作用、范德华力的协同作用，使两 者结合的更加紧密3 0 】。由于该法具有简便、快速、经济、准确等特点而受到人 们的普遍关注 3 1 32 1 。最早用于测定蛋白质的染料是甲基橙，随后又发展到其它偶 氮类试剂、三苯甲烷类试剂以及卟啉类试剂等其它类试剂。 1 1 。3 。1 偶氮类染料 自从b r a c k e n 3 3 1 以甲基橙作为蛋白质光谱探针以来，偶氮类染料用于蛋白质 的测定引起了研究者的广泛兴趣。 张华山等人研究了十种变色酸偶氮类染料与蛋白质的作用及所引起的光 谱性能变化，详细探讨了染料结构及实验条件对反应的影响，并用双波长法测定 了最大结合数和结合常数。他们发现，双偶氮比单偶氮变色酸染料的灵敏度高； 含水溶性较好的酸性基团越多，灵敏度越高。最大结合数越小，结合常数越大， 表明染料与蛋白质的作用越强。 童沈阳、李克安等人【”1 研究了一系列偶氮类染料探针( 变色酸、酸性铬蓝k 、 埃铬蓝s e 、钙镁试剂、偶氮磺i i i 、偶氮胂i i i 、羧基偶氮胂i i i 和溴偶氮磺i i i ) 在酸性条件下与蛋白质的作用情况，推测s 0 3 。基团是与蛋白质作用的主要基 团。另外，该小组还研究了偶氮辟k 3 6 1 、硝基磺酚d 3 ”、硝基磺酚s j 3 8 、氯磺酚 s 【：3 9 】、氯磺酚k 4 0 1 、锌试剂、镀试剂i i 4 2 、钍试剂i 【4 3 】等偶氮类染料与蛋白质 的结合反应。 张正奇等人于2 0 0 1 年建立了偶氮胂m 【、偶氮胂i 【4 5 】探针法，线性范围分别 为3 3 2 5 4m g l 、1 3 2 - 2 3 1m g l ，可不经任何预处理直接测定血清、花生等生 物样品中蛋白质的含量。2 0 0 2 年他们又对7 一苯基偶氮一变色酸 4 ”、偶氮氯膦 i i i 47 染料探针进行了研究。 刘绍璞等人也研究了一些偶氮类染料与蛋白质的作用，如变色酸2 b 4 8 1 、铬 广玉坪范土学硕士舛究生学位论文 监s e 4 ”、偶氮羧1 1 5 0 1 。 此外还有一些学者也对偶氮类染料做了类似的工作 5 1 - 5 4 】。 1 1 3 2 三苯甲烷类染料 溴甲酚绿( b r o m o c r e s o lg r e e n ，b c g ) 是染料结合法中使用最早也最为广 泛的染料探针 5 5 - 5 7 】。在p h4 2 的琥珀酸缓冲溶液中，b c g 与蛋白质的结合使溶液 由黄色变为绿色，最大吸收峰1 ：1 4 4 4 5n m 红移至6 2 8n m 处，且其吸光度与蛋白质 的浓度成正比。该方法简单、快速、灵敏度高、试剂稳定，但专一性稍差。 19 7 6 年，b r a d f o r d 5 8 1 提出了考马斯亮兰( c o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u e ，c b b ) g 2 5 0 法。这一方法基于c b bg 2 5 0 有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓 度的乙醇及酸性条件下，c b bg 2 5 0 溶液呈淡红色，当与蛋白质结合后，产生 蓝色结合物。在5 9 5n m 处蛋白质一染料结合物的吸光度服从比尔定律。该法简 单、快速、干扰少，是一种经典的测定蛋白质的方法。但其检测灵敏度低、线性 范围窄、线性关系也较差。因此，许多学者在改进b r a d f o r d 法方面做了大量细 致的工作 5 9 - 6 1 】，使之更加完善。 溴酚蓝( b r o m o p h e n o lb l u e ，b p b ) 是一种研究较早，性能优良的染料探针。 在p h3 1 2 时，b p b 与蛋白质结合，最大吸收峰位于6 1 0n m 处，反应速度快， 稳定性好6 2 1 。孙明洪等【6 3 】在b p b 中加入一定量的有机溶剂以改变球蛋白的氨基 酸残基结构，使b p b 与球蛋白和白蛋白的反应基本一致，可用于尿中总蛋白的 测定。魏永巨等6 4 1 研究了在酸性溶液中b p b 与蛋白质的相互作用，认为静电力 是主要的结合力，还解释了吸收光谱图中等色点的形成。 近年来，许多三苯甲烷类染料均被开发利用。溴甲酚紫旧、铬天青s 6 6 1 、乙 基紫吲、乙基曙红【6 8 j 、曙红b 6 ”、埃铬青r 等也已见于报道。 1 1 ，3 3 卟啉类染料 ，d ，y ，6 一四( 对磺苯基) 卟啉( t p p s 4 ) 7 1 1 和d b ，y 6 一四( 对羧苯基) 卟 啉( t c p p ) 7 2 1 都已用作蛋白质的光谱探针。其中t p p s 4 是一个较为理想的染料探 针，与c b bg 2 5 0 比较具有试剂稳定、蛋白质不易被沉淀和变性、不污染器皿 等诸多优点。其反应在p h2 0 左右进行，线性范围为1 - 1 0m g l ，灵敏度不低于 c b bg 2 5 0 法。 1 i 3 4 其它染料 广由师范土学硕士研究生学位论文 除上述染料探针外，已见报道的其它染料还有酸性品红1 7 3 】、二甲苯蓝f f 7 4 1 、 苯胺蓝1 7 5 】、固氯f c f 76 1 、伊红y 【7 7 】、四氯苯醌【7 8 】、茜红素s 【7 9 】、花菁染料【8 0 、四 溴荧光素、四碘荧光素 叫、3 ，6 一二氯荧光素等。 1 1 4 金属配合物探针法 金属配合物探针法是2 0 世纪8 0 年代兴起的一种方法。其机理可能是：金 属离子与含有一o h 或- - c = o 的有机染料相遇时，氧原子中的孤对电子可顺利进 入杂化轨道，形成稳定的配合物：在酸性条件下，配合物遇到结构不对称的蛋白 质分子时，互相极化产生静电作用而形成新的大分子；另外，大分子内部易形成 氢键，蛋白质分子中的芳香氨基酸残基与有机染料分子中的芳香结构通过疏水作 用丽相互靠近，使两者的结合更加紧密，从而改变了原体系的光谱性能，进而能 定量测定蛋白质的含量 ”。该法在灵敏度、选择性方面都较染料探针法优越，特 别是不同蛋白质问的响应差异较小。 1 9 8 3 年，f u j i t ay 阻1 等首次提出以金属配合物作为探针测定蛋白质。在p h 18 - 4 0 酸性条件下，邻苯三酚红( p y r o g a l l o lr e d ，p r ) - - m o ( v i ) 配, 合物溶液为红 棕色，当其与蛋白质结合后溶液变为蓝色，该蓝色结合物在6 0 0n m 处有最大吸 收。该方法灵敏度高，线性范围宽( 0 - 4 0m g l ) ，操作简单，抗干扰能力强， 且试剂不吸附比色池。但试剂对白蛋白和球蛋白的响应不一致。加入适量的 s d s ，球蛋白和自蛋白的反应灵敏度有所改善。汪洪亮 8 5 1 将该法用于尿液、腩 脊液、羊水及凝胶层析液中微量蛋白质的测定，获得了满意的结果。 此后，以f u j i t ay 为首的科研小组在该领域做了大量的工作。1 9 8 4 年他们 提出邻苯二酚紫( p y r o c a t e c h o lv i o l e t ，p v ) - - m o ( v i ) 法婵。在p h3 0 和p v a 存在下，p v - m o ( v ) 配, 合物与蛋白质发生结合反应，溶液由棕黄色变为蓝色，最 大吸收峰位于6 8 0n m 处。方法的灵敏度与b r a d f o r d 法相同，比p r m o ( v i ) 法高，且表面活性剂或药物几乎不干扰测定。后来有学者建立了蛋白质- - m o ( v i ) p v o p 体系光度法测定蛋白质。该体系用于尿液、血清和豆浆中总蛋白的测 定，结果满意 8 7 】。1 9 8 9 年他们又提出3 ，4 ，5 ，6 四氯茜素紫( t c 1 g a l l ) - - m o ( v i ) 法【8 8 】。在t r i t o nx 1 0 0 和p v a 存在下，t c 1 g a l i - - m o ( v ) 配合物与h s a 通过 疏水作用形成结合物，最大吸收在6 4 0n m 处。由于三阶导数光谱的应用，方法 广西师范太学硕士研究t 学位论文 灵敏度很高。它还可用于苏氨酸含量的测定。1 9 9 0 年他们建立了邻磺酸基苯基 荧光酮( o s u l f o p h e n y l f l u o r o n e 。s p f ) 一u ( v i ) 体系 8 9 。在p h 3 5 的h c i n a a c 缓冲液中，t r i t o nn 一1 0 1 存在下，h s a 与s p f u ( v i ) 配合物通过疏水作用结合， 检测波长为5 5 5a m ，检测范围为2 - 5 0m g l 。方法用于血清样品的测定结果与 b c g 法一致，灵敏度为b c g 法的6 倍，对于不同生物样品中自蛋白的偏差较 b c g 法小。1 9 9 1 年他们又建立了s p f t i ( ) 体系【9 0 】。随后又陆续_ 丌发了铬天青 b ( c h r o m a z u r o lb ) 一b e ( h ) 、3 ，4 5 ，6 一四氯一2 一羧苯基荧光酮( t c l c p f ) 一 m n f i i ) 【9 2 】、5 - b r - p a p s c o ( i i ) 93 1 、邻苯二酚紫- - s n ( i v ) ”1 等光谱探针。 b o r a t y n s k i ，j a n u s z 于19 8 5 年提出了双硫腙a g ( i ) 法”】。检测波长为5 5 5 n m ，检测范围为0 1 - 2m g 0 5m l 。方法简单、快速、经济、灵敏，但核酸干扰 严重。 s a t i o ，y u t a k a 等人于1 9 8 6 年提出了铬天青s - a i ( i h ) 法 9 ”。检测波长为6 3 0 n m ，检测范围为1 0 - 2 0 0m g 8m i ，灵敏度为b c g 的8 倍，肝磷脂和胆红素不 干扰测定。 国内对金属配合物探针法研究得较晚，2 0 世纪9 0 年代才有一些学者开始从 事该领域的研究，并从理论和实践上解决了许多实际问题。 1 9 9 3 年，汤桂娜等 9 1 报道了以4 ，5 - 二溴苯基荧光酮( d b p f ) - t i ( i v ) i 配合物 为光谱探针测定蛋白质的方法。在p h2 7 3 7 的柠檬酸钠一盐酸缓冲介质中， t w e e n - 8 0 存在下，蛋白质与d b p f t i ( ) 配合物形成蓝色结合物，最大吸收位 于6 0 5n m 处，线性范围为0 - 6m g l 。方法的灵敏度高，干扰小，操作简单， 重复性好，直接用于尿样中总蛋白的测定，结果满意。 1 9 9 4 年，童沈阳等9 8 对铬天青s - - f e ( i i ) 与蛋白质的结合反应进行了研究。 用吸收光谱法研究了变色反应的机理，并制作了b s a 和卜球蛋白的工作曲线， 但未进行样品测定。1 9 9 6 年他们又研究了在碱性介质中钙试剂c u ( i i ) 作为光谱 探针与蛋白质的反应【9 9 1 ，提出了用双波长技术直接测定一个蛋白质分子结合探 针个数的方法，并对反应机理进行了初步探讨。同年，他们还报道了以溴邻苯三 酚红( b p r ) - z n 0 d 配合物为光谱探针在碱性介质中测定蛋白质【1 0 m 。该法可以 选择性地测定白蛋白，其灵敏度与b c g 法相近。随后又开发了氯磺酚s c u ( n ) t 1 1 和偶氮脾k - - c u ( i i ) 【1 0 2 1 光谱探针。 7 广西师范大学埙士唧竞t 学位论文 1 9 9 9 年，沈含熙等1 0 3 1 提出了以水杨基荧光酮( s a f ) - m o ( v i