（分析化学专业论文）时间分辨荧光免疫分析法中eu3标记技术.pdf

中 文 摘 要 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 分 析 法( t r f i a ) 将 稀 圭 宜 子 恻醚主 和 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 测 量 有 机 地 结 合 起 来 ， 如 何 制 备 优 质 的e u + u i 迪是 提 高t r f i a 灵 丝 度 的 关 键 本文着重探讨了以e u 十 作为标记离子，二乙烯三胺五醋酸醉 ( c y- d t p a ) 韭鲤查鲤迎， 来 标 记 牛 m丝里 自 一 ( b s a ) 的 最佳条件。 本文共分两大部分，第一部分阐述了稀土离子标记技术的原理、 应用及进展， 第二部分重点 研究了 反 应溶液的p h值、 c y d t p a用量、 加入c y d t p a后的反应时间 和加入e u 3 + 后的反应时间对标记物荧光 强度的影响，旨 在选出标记率和免疫活性都最佳时的标记条件。 关键词:e u + 标记技术t r f i a c y d t p a b s a abs t ract t i m e - r e s o lv e d fl u o i m m u n a s s a y ( t r f i a ) c o m b i n e s o r g a n i c a l l y t h e l a b e l l i n g t e c h n i q u e s u s i n g r a r e e a r t h i o n s w i t h t i m e - r e s o l v e d fl u o r o m e t ry. h o w t o p r o d u c e e x c e l l e n t l a b e l s i s t h e k e y o f d e v e l o p i n g t h e s e n s i t i v e o f t r f i a . i n t h i s p a p e r , t h e b e s t c o n d i t i o n s o f l a b e l l i n g b o v i n s e r u m a l b u m e n ( b s a ) a r e s t u d i e d i n w h i c h e u 3 + is u s e d a s a l a b e l a n d c y c l e d i e t h y l e n e t r i a m i n e p e n t a a c e t i c a n h y d r i d e a s a c h e l a t e a g e n t w i t h t w o f u n c t i o n g r o u p s t h i s p a p e r d iv i d e s i n t o t w o p a r t s . i n p a r t i，t h e p r i n c i p l e , a p p l i c a t i o n a n d d e v e l o p m e n t o f t h e l a b e l l i n g t e c g n i q u e s a n d d e v e l o p m e n t i f t h e l a b e l l i n g t e c g n i q u e s w i t h t h e r a r e e a r t h i o n s a r e r e v i e w e d . i n p a r t ii ,t h e fl o r l r e s e n c e i n t e n s i ty c h a n g e s w i t h t h e p h o f t h e r e a c t i o n s o l u t i o n ,t h e q u a n t i ty o f c y d t p a ,t h e r e a c t i o n t i m e a f t e r a d d i n g c y d t p a o r t h e re a c t i o n t i m e a f t e r a d d i n g e u 3 + .t h e c h a n g e s e f f e c t e d b y t h o s e f a c t o r s a r e t e s t e d e m p h a t i c a l ly . t h e p u r p o s e o f t h i s p a p e r i s t o s e l e c t t h e l a b e l l i n g c o n d i t i o n s i n w h i c h n o t o n l y t h e l a b e l l i n g r a t e b u t a l s o l a b e l l i n g i m m u n o a c t i v i ty a r e t h e b e s t . k e y w o r d s : e u 3 + l a b e l l i n g t e c h n i q u e t r f i a c y d t p a bs a 第一部分 理 论 第一部分理论 时间分辨炎光免疫分析 ( t i m e - r e s o l v e d f l u o i n m u m o a s s a y简称 t r f 工 a )是国外八十年初，继 r i a后在 f i a技术基础上发展起来的一种 新型非放射配给配基超微量分析技术。这种分析技术具有灵敏度高标记 物容易制备，操作简便，迅速等许多优点，虽问世较短，发展却十分迅 速。 第一章稀土离子时间分辨荧光免疫分析理论 夸 1 - 1 稀土离子荧光性质 在元素周期表中，稀土元素属于m族 ，稀土元素包括抗 ( s c )， 忆 ( y )两元素和钢系元素在内，一共有 1 7种元素。稀土元素常以氧化态 形式存在。由于稀土元素性质十分相似，常共生于同一矿物中，很难进 行分离和提纯。稀土元素具有特殊的物理，化学性质，因此稀土金属和 化合物有着广泛的应用价值。目前稀土元素和其化合物己成为现代尖端 科学技术不可缺少的特殊材料。例如超导材料，电子材料，合金材料， 玻璃陶瓷，石油化工。 稀土化合物是一类荧光材料，既可作为基质的组成部分，又可作为 激活离子，钦和忆等稀土化合物是固体激光器的重要材料，稀土系统金 第一部分 理 论 属具有较高的磁矩和有价值的磁学性质，袒，馆，镜，悯具有高的热中 子俘获截面，是核工业中重要材料之一。稀土元素还在超导材料，金属 材料，玻璃陶瓷，石油化工等方面得到应用。另外稀土元素还广泛应用 于农业，可促进植物的生长发育、应用于医学研究，生物大分子结构研 究等。 一、 稀土元素的荧光光谱 以铜系为例 门，其基态电子组态有两种基本类型 x e 7 4 f 6 s “ 和 x e 4 f 。 一 ， 5 d 6 s z ， 其中e u 的基态电子组态属于4 f 5 d 6 s z a 稀土离子的吸收光谱范围比较宽，它由下列三方面组成: ( 1 ) f ” 组态内的能级间的跃迁:主要是 f ” 的基态向激发态的跃迁造 成的。 ( 2) 组态间的能级跃迁:自4 f 向 4 f - 5 d 跃迁，一般在紫外区出 现，谱带较宽。 ( 3) 配位体向稀土离子跃迁:即电荷离子发生的电荷密度从配位体 的分子轨道向稀土离子轨道进行重新分配的结果，谱带具有教强的强度 和教高的宽度。 稀土离子的 f - f跃迁谱带的分裂为 1 q o c m ， 左右，f - f跃迁的吸收 光谱是类线状的光谱 . f - f跃迁引起的发光光谱的类线状，随配位体环 境的变化而变化。 这一性质决定了稀土元素是作为发光材料， 发光探针， 荧光和激光物质的一族重要元素。 以 e u ” 为例，e u 的电子组态为 4 f 8 ， 之所以具有荧光和激光性能， 是由于 4 f组态内的跃迁而产生荧光光谱。荧光光谱或激光光谱，均属 于稀土离子的发射光谱。稀土离子的荧光与其它物质的荧光一样，当受 紫外光或激光，x射线等激发后，会以荧光形式发射。激发光的波长和 发射荧光的强度，均随稀土离子不同而异。 在溶液中，稀土离子或者它们的化合物，在紫外线等高能射线的激 第一部分 理 论 发下，可以从基态跃迁到激发态，在返回到能级低的能态时，就会发射 出荧光。其中 s m , e u , t b , d y a 等能产生强的荧光，例如 e u 3 和 t b 在水溶液中都能发荧光，它们与鳌合剂及生物大分子结合后，仍保留发 荧光的特性。 在稀土有机配合物反光体中，稀土离子的电子跃迁，来自三方面的 跃迁:f - f跃迁; 4 f - 5 d跃迁;电荷跃迁。e u , t b , s m , d y 等属于 f - f 跃迁，由于 f - f 跃迁的吸收光强度很低，使得稀土离子与吸光系数高的 有机配体结合在一起，经分子内能量传递，获得发光率很高的三价稀土 有机配合物。 二.稀土离子的荧光特点 普通物质的荧光光谱分为两部分:激发光谱和发射光谱。普通物质 的荧光光谱 s t o k e s位移较小，如荧光素的 s t o k e s位移仅为 2 8 n m 。因 此激发光谱和发射光谱通常有部分重叠，互相干扰严重。加之影响因素 较多，荧光寿命短 ( 小于1 0 0 n s ) ，易淬灭。 稀土离子的荧光光谱也包括激发光谱和发射光谱。通常游离的稀土 离子荧光信号是相当微弱的，但当稀土离子与有机配体形成配合物时， 产生分子内和分子间能量传递，使稀土离子的荧光强度显著增强。 稀土离子的荧光光谱不同于普通荧光光谱，它具有较大的 s t o k e s 位移 ( 大约 2 9 0 n m ) ，发射光谱 ( 6 1 5 n m或 6 4 3 n m )和激发光谱 ( 3 3 7 n m ) 不会相互重叠。 稀土离子发射光谱峰范围相当窄 ( 6 1 5 n m ) ， 特异性很强。 荧光寿命为 1 0 - 1 0 0 w s ， 甚至更长，比 普通荧光寿命高出儿个数量级。检 测时采用适当的延缓时间，可非常显著地降低来自散射光，样品和试剂 的本底荧光强度 ( 1 - l o n s )的干扰。 由于不同的稀土离子特征荧光强度衰变时间 ( 即荧光寿命)不同。 稀土离子特征荧光强度衰变一半，所需的时间也不同。例如 e u a 荧光强 度衰变一半， 所需的时间为4 3 0 p s ， 远远长于s m , + 所需要的时间( 4 1 p ) o 第一部分 理 论 稀土离子在不同的溶剂中其荧光寿命也不相同，例如在水溶液中 e u 的 5 d o 能态的荧光寿命为 0 . 1 - 1 . o m s ，而在非水溶液中为 2 - 2 . 5 m s , 在氖溶剂中为4 - 4 . 5 m s 。 固态时e u 3 的荧光寿命为5 - 6 m s ; 而t b 离子s d q 的荧光寿命比 e u 离子 d o 荧光寿命长，在水溶液中 t v 的荧光寿命为 0 . 4 - 5 m s , e u , t b 等离子的荧光寿命对温度不敏感。 另外，稀土离子的配位体不同荧光寿命各异，因此可以通过对稀土 离子荧光强度的测量，来研究e u , t b 等稀土离子的环境变化。 1 - 2时间分辨荧光免疫分析基本原理 时间分辨荧光免疫分析 ( t r f 工 a )原理和通常荧光免疫分析 ( f i a ) 基本相同，只是标记物和测量不同。t r f i a使用的示综物不是荧光素， 而是三价稀土离子，如 e u 3 , t b 3 , s m + 和 d y 3 i 等。这些稀土离子通过具有 双功能基结构的鳌合剂，在水溶液中很容易与抗原分子以共辘双键结 合，形成稀土离子一鳌合剂一抗原鳌合物。当标记抗原，待测抗原共同 竞争抗体，起免疫反应后，免疫复合物中抗原抗体结合部分，就含有稀 土离子。采取一些办法将结合部分与游离部分分开，利用时间分辨荧光 分析仪，即可测定复合物只的稀土离子发射的荧光强度，从而确定待测 抗原的量 2 o 另一类时间分辨荧光分析 ( t r i f m a )原理与 t r f 工 a相同，所不同的 是，稀土离子通过鳌合剂与抗体分子上的游离氨基共价键结合，形成稀 土离子一 鳌合剂一 抗体标记鳌合物，用于建立双位点夹心免疫分析【 3 0 在正常情况下，免疫复合物中的稀土离子自身荧光信号极微弱。如 加入一种酸性增强溶液，稀土离子从免疫复合物中解离出来，和增强液 中的5 一 二酮，三辛基氧化嶙，t r i t o n x - 1 0 0等成分形成一种微囊。后 者当激发光激发后，则稀土离子可以发出长寿命的极强的荧光信号，使 第一部分 理 论 原来微弱的荧光信号增强近 1 6 0 万倍。由时间分辨荧光仪检测。这类分 析法又称为解离一 增强时间分辨荧光分析法 d e l f i a ) a 另外一种时间分辨荧光分析法，是采用一种特殊的双功能瞥合剂一 4 , 7 一 二苯磺基一 1 , 1 4 一 菲罗琳- 2 , 9 一 二梭酸 ( b c f d a ) ，与稀土离子构成 非常稳定的鳌合物，再与链亲和素 ( 或链亲和素一 甲状腺球蛋白)偶联， 最终形成以固相形式的免疫复合物。在激发前不必加入酸性增强液，则 同样可以发射极强的荧光信号。用 c y b e r f l u o r 6 1 5型时间分辨仪测 荧光强度。达到定量测定样品浓度之目的。下面以 e u 3 鳌合物为例 加以阐明:将 e u 3 鳌合物与抗体偶联，构成一种新的 e u 3 + 一 抗体标记物， 它与待测抗原结合， 形成含有e u 3 免疫复合物。 后者在酸性增强溶液中， 形成新的微囊。 在紫外光( 3 4 0 n m ) 激发下， 发出高强度的荧光信号( 6 1 3 士5 n m ) ，可由时间分辨荧光仪 ( t r f仪)记录下来，既可确定抗原的 量。 第一部分 理 论 第二章 t r f i a中稀土离子标记技术的研究及应用 a - 1稀土离子标记技术 一稀土离子荧光与鳌合剂 稀土离子的荧光强度取决于下列两个因素: 1 配位体三线态接受来自激发单线态能量，并传递给中心离子的激 发振动态的能力。 z .稀土鳌合物傲发态通过无辐射去激活的程度。主要取决于中心离 子本身、配位体的性质、中心离子、配位体成键、溶剂等。根据 e u , t b 3 , 5 m 3 , 和 d y 3 - 本身的性质，它们的鳌合物能发出很强的离子荧光，同 时也存在极弱的配位体荧光和磷光。 二.鳌合剂种类 i 多氨基多梭基类鳌合剂 常用多氨基多梭基类的鳌合剂有 4 , 5 氨基一 乙二胺四乙酸( e d t a ) 醉、环化二乙烯三胺五乙酸 ( c c d p a )醉、异硫佩酸一 苯基一 乙二胺四乙 酸、 n z - p 一 异硫佩酸一 节基 一 二乙烯三胺四乙酸 ( d t t a ) , 1 - ( p - 偶苯基) - e d t a醉。乙二胺四乙 酸 ( e d t a ) 是一类具有溶解度高和稳定性强的双 功能鳌合剂。这些鳌合剂的共同特点是:它们分子内或带氨基梭基或带 异硫氰酸基狡酸等活性连接基团.它们中的一端能和稀土离子鳌合，而 另一端则能和抗体 ( 或抗原)分子上的氨基 ( 酪氨酸、组氨酸) 相连接， 构成 e u 3 + 标记抗体 ( 或抗原)的鳌合剂与 e 少 十 鳌合的能力很强，因而标 记共扼物比活度比r i a标记物的比活度要高，这样有利于提高分析方法 第一部分 理 论 的灵敏度 。 2 芳香梭酸类鳌合剂 常用芳香狡酸类的鳌合剂有 等。这类鳌合剂中的芳香环具有 b c p d a 、水杨酸、 电子的共扼体系， 苯甲酸及其衍生物 呈现出很强的光吸 收性质，因此，芳香梭酸类稀土配合物常常发出较强的荧光。 3 . 日 一 二酮体类鳌合剂 d 一 二酮体类鳌合剂有 6 : 0 一 蔡酞三氟丙酮 ( (3 - n t a ) 、苯甲酞三 氟丙酮 ( b t a ) .唆盼甲酞丙酮 ( t t a )和三甲基乙酸三丙酮 ( p t a )等。 表2 - 1 常用d 一 二酮体鳌合剂及分子 结构式 名称代母 分 子 结 构 式 乙肛 t x i 例 c ” 一 c - c h ,n 公公仔份孚 苯 甲队 丙刊 刁 二不甲队甲,; i f 人 d1 3 m 笨甲队三f . ( 丙仔 一 c - c e i ,1 一 g - 必 o 一 行 - c f , 吞 1 .? 队 一 a 1 内胡 l - a 1 吩 甲 从 乡id 05闷 口 一 n ta r ta c l i ， 一c 一c f ， q 0 g -11 ( j c h ， 一 $ - c f , 0 三11 j a z 1% -_ f c ,i , m f m a c 一 cl i , 一 c一cf , 石吕 翎ch洲 4 特殊功能鳌合剂 常见特殊功能的鳌合剂有乞 7 飞 :w1 1 7 4 和 w 2 d 14 鳌合剂等 是山芬兰试验室合成的异硫氰酸盐类似物。 第一部分 理 论 三. 稀土离子标记技术的应用 1 稀土离子标记小分子活性物质 小分子生物活性物质主要包括多肤类、甲状腺激素类、幽体激素类、 前列腺素类等及一些药物。而神经多肤、脑肠肤和多肤生长因子等肤类 激素在体内分布相当广泛，并在机体生长发育、生理代谢，尤其高级神 经活动中，发挥了相当重要作用。但由于这些活性物质分子量小，含量 极微，要求检测方法具有高灵敏度。 制备合格的稀土离子标记物，是建立小分子活性物质标记物必须具有高 比活性，又不损伤被标记物的免疫活性。 标记原理主要利用双功能基团鳌合剂中两个特殊基团:一个基团能 与活性物质 ( 载体或链亲和素) ，抗体 工 g g等游离氨基以共价键形式结 合，而另一个基团能与稀土离子以非共价键鳌合，形成稀土离子一 鳌合 剂一 生物活性物质标记复合物。 小分子活性物质的种类繁多，分子上所带基团差异甚大，因此制备标记 物的方法也多种多样，主要的标记方法有稀土离子直接标记法、间接标 记法两大类。常用双功能鳌合剂有:w 1 1 7 4 , b c p d a , d t p a a ， 异硫佩酸节 基一 d t t a a等。供标记的活性物质包括小分子半抗原，及其蛋白质或多 聚赖氨酸 ( p l l )结合物等 s 。小分子活性物质稀土离子标记物制备见 表 1 - 2 0 2 .稀土离子标记大分子活性物质 大分子生物活性物质主要包括蛋白质，酶，肿瘤相关抗原，抗体， 病毒链亲合素等。 稀土离子标记大分子活性物质，同样是利用双功能基团鳌合剂，主 要稀土离子有 e u , s m 、和 t b 。标记方法既可以标记行为大分子又 可以标记抗原或抗体和标记通用试剂。然而标记抗体有它的优点，尤其 在固相夹心法中。这是因为纯化抗体要比纯化抗原更容易，同时标记的 第一部分 理 论 酪氨酸和组氨酸残基，用稀土离子标记链亲合素、第二抗体、人蛋白等。 它们既是通用试剂，又具有放大作用，有利于提高分析方法的灵敏度。 表2 - 2 小分子生物活性物质稀土离子标记物制备 标记方法被标记 化和物双功能鳌合物 三价稀土离子 标记物形式 直接标记法 b s a id t p a a e u - d t p a - b s a 间接标记法 p l h k f d t p a a d t p a a e u - d t p a - p l e u - d t p a - h r p 通用试剂标记法 s a s a a b 2 - i g g s p a b c p d a d t p a a d t p a a d t p a a e u - b c p d a - s a e u - d t p a - s a e u - d t p a - a b , i g g e u - d t p a - s p a 多荧光标记法 t g和 s a b c p d ae u 十 一 b c p d a - t g - s a 一抗或单抗标记法 a b l mc ab 异硫氰酸苯 d t t a a e u 一 异硫氛酸苯基 d t t p - a b , ( m c a b ) 甲状腺球蛋白间接标 法 t gc d t p a a e u - c d t p a - t g ( 1) 多点标记法 多点标记是蛋白质类标记方法中最常用的方法。它利用双功能鳌合 剂，将 e u 十 标记在蛋白质一 n h : 上。根据所用鳌合剂及其功能不同，标记 方法又分为一步放和二步法。 一步法 将纯化 m c a b - i g g与 e u 异硫氰酸节基 一 二乙烯三胺四乙酸 鳌喝物反应过夜，经g f - 2 0 0 0 柱层析分离，收集标记物部分，加入b s a , 并计算出每摩尔 工 g g嵌入 e u 的氨基数，摩尔标记率为 1 5 - 2 0个 e u 丫i g g ，若采用重氮化的氨基e d t a 时，摩尔标记率仅达 5 a 二步法 将抗体 工 g g先与双功能鳌合剂结合，再和稀土离子鳌合，故 称为二步法。取纯化 m c a b - i g g与二乙烯三胺五乙酸醉 ( d t p a a )磁搅拌 反应，再行透析;另取 e u c 1 3加至经透析的 工 g g - d t p a中，室温，搅拌 反 应，经 s e p h a d e x x - 5 0 柱层析，收集 ” d 2 8 。 蛋白 质部分， 4 保存。 摩 尔标记率为 3 a (2) 双标记法 一-一 - 9 5 j4 生一一一一一一一一一 利用不同的三价稀土离子具有不同发射光谱和各自 不同的荧光寿命等特 点。适合于进行双标记和多标记，从而实现可同时检测的一个样品中， 两种以上的抗原或抗体。 e u 和 s m 3 的双标记:f u 和 s m 3 是常用于双标记分析的一对稀土离 子，用 e u 和 s m 是常用于双标记分析的一对稀土离子，用 e u 和 s m 及其鳌合剂，分别标记l h , f s h的 m c a b 。在增强液中加入稀土离子 y 3 + 和协同剂邻非罗琳。在不同发射光波长下，用荧光计分别测定 e u 和 s m 3 的荧光强度，y 3 能使 e u 3 ， 和 s m 3 + 的荧光信号大大增强，有利于提高 检测灵敏度。 3 .稀土离子标记核酸探针 将 t r f 技术因人引入到核酸探针定量分析，已成为分子生物学中的 检测方法， 引起人们的高度重视。 建立稀土离子标记核酸探针检测方法， 首先要制备好稀土离子标记的探针，针对不同核酸探针上结构不同，可 以分别采用下列方法。 (1) e u 3 + 标记第二抗体 i g g 将 d n a探针上偶联半抗原，当杂交后，加入第一抗体，产生免疫反 应，再加入 f u + 标记的第二抗体 工 g g 。最后检测杂交体上e u 荧光强度， 来定量d n a 的量。检测灵敏度为2 0 u g ，检测a d 2 d n a ，相当于5 x 1 0 5 个 分子。 ( 2) f u + 标记链亲合素 将 d n a探针生物素化，杂交后，加 e u 3 + 一 异硫氰酸节基一 e d t a - s a ; 或将生物素通过一个长臂分子接到核酸啼吮环上，杂交后，再加入 e u 3 - s a 。 灵敏度为l o p g ， 检测a d 2 d n a ， 相当于2 . 5 x 1 0 5 个分子。 若e u - s a 及夹心杂交法，检测大肠杆菌。 n a ，灵敏度可达 1 . 9 p g o ( 3) e 少十 标记多聚赖氨酸 第一部分 理 论 将 d n a探针标记补骨脂素，多聚赖氨酸 ( p l )经双功能鳌合剂( d t p a a ) 与 e u 偶联，制成 e u - p l ，后者再经异双功能基团与 d n a探针偶联， 形成e u - d t p a - p l 一 异双功能基团一 d n a 探针。检测灵敏度达5 p g a 互 2 - 2 有关稀土离子标记的t r f i a检侧方法 一双位点夹心法 双位点夹心分析原理:使用大分子活性物质抗原不同决定族的两种 以上的特异单克隆抗体。用 e u + 或 s m + 标记抗体，将另一种或两种单克 隆抗体包被在固相载体上。其免疫的反应原理。以人绒毛促性腺激素 ( h c g )为例.h c g ，分子量 4万，是一种糖蛋白激素，有a 和p 两种亚 基组成。h c g的分析是根据 h c g分子的一端和过量的0 亚基单克隆抗体 结合，而分子的另一端和 e u + 标记的亚基单克隆抗体结合。生成固相抗 体一 抗原一 标记抗体复合物，经漂洗出除去剩余标记抗体，然后加入增强 液，免疫复合物种的 e u 解离出来，生成一种经紫外激发后，能够发出 强烈荧光的新的鳌合物。用 t r f仪侧得荧光强度和 h c g标准浓度一 荧光 强度绘制标准曲线，便可查出待恻样品中h c g 的浓度。 二.固相竟争法 对一些小分子半抗原化合物， 因分子量小， 不能直接进行固相包被， 如多肤类，甲状腺激素类，幽体激素类极其某些药物等，都必须经过化 学偶联剂与载体蛋白质进行共价键结合，然后可包被聚苯乙烯微量滴定 条孔臂，制成固相抗原，宜用于建立t r f i a固相抗原分析法。 固相抗原竞争分析原理:以固相中的小分子活性物质、液相中的小 分子待测共同竞争与 e u 标记抗体相结合为特点。将小分子半抗原先和 载体蛋白质结合， 然后进行包被。 测定时， 将待测样品和e u + 标记抗体， 加至固相抗原孔中，经温育产生竞争免疫反应。洗涤除去剩余的 e u 标 记抗体，每孔加入 2 0 0 11 1增强液，振荡器上振荡 1 5 m i n ，结合到孔壁 第一部分 理 论 上的 合物 e u a ，从免疫复合物中解离下来，与5 一 二酮体鳌合， 而使荧光强度增强，后者可用 t r f仪测定。待测样品 形成新的鳌 的浓度和荧 光强度成反比。以 应用于皮至醇，地高辛和尿中雌二醇 ( e t ) 等检测。 2 - 3 有关稀土离子标记的 t r f i a的应用 t r f i a不仅在内分泌学、肿瘤等领域具有很高的应用价值，而且 在免疫学及微生物学研究中有着突破性的应用。 一在免疫学上的应用 t r f i a技术的问世，其本身就是标记分析技术的重大进展。这种超 灵敏度的新型免疫分析技术在给医学生物学的许多其他领域带来重大影 响的同时，也给免疫学自身提供了新的手段。 1 .测定细胞因子 8 0年代初，人们将细胞因子确认为由免疫细胞分泌的抗原非特异 的免疫调节因子。近年来，基因克隆的成功以及利用重组细胞因子进行 的深入研究表明，细胞因子不仅仅参与免疫应答反应，而且在炎症、肿 瘤等许多过程的发生和发展起重要的作用，它们的来源也不仅仅限于免 疫细胞，许多其他细胞和组织也能产生细胞因子。因此 准确地测量细 胞因子在生物样品中的含量，对于进一步了解它们的病理生理作用是十 分重要的。传统的测量方法有f i a , e 工 a 和生物分析法 ( b i o - a s s a y )等， 但这些方法往往不能满足日 益深入的研究的需要。o g a t a等 1 9 9 2年首 次报道用t r f i a测定肿瘤坏死因子。( t n f a)和白细胞介数一 6 ( i l - 6 ) o k n o p f 等 9 1 还报道应用e u a 标记的链亲合素为示踪剂， 用固相夹心t r f i a 法测量血清 i l - 3 。方法以b c p d a鳌合剂，引入生物素一 链亲合素系统， 最后的荧光直接固相测量。方法稳定，灵敏度高、测量范围宽，为 2 0 - 2 5 0 0 0 p g / m l ，优于传统的e l i s a 法。 2 .在w e s t e r n b l o t 定量分析蛋白质中的应用 第一部分 理 论 通常在对某一蛋白质进行 w e s t e r n b l o t分析时，先经过 s d s - p a g e 电泳，接着将分开的蛋白质的区带转印到固相支持物上，然后再用特异 的抗体和适当的检测技术来测量被转引的蛋白质。传统的测量示踪剂有 1 2 5 1 , 酶、 荧光素、 化学发光剂等。 1 9 9 2 年d i a m a n d i s 等首次报道用 e u l , 标记物为示踪剂检测经 w e s t e r n b l o t转引的蛋白质。结果既可以通过 在紫外灯下肉眼观察， 也可以拍照待以后分析， 还可以通过 c y b e r f l u o r 时间分辨荧光仪定量测定。由此可见，应用 t r f i a测量印迹蛋白技术， 方法简单，既不需要 x光胶片，也无需酶底物，既可以定性，也可以定 量，灵敏度高可能是一种有前途的蛋白质分析手段。 3 . a 9 定补体 补体成分在多种神经疾病发病机制中起重要作用。补体可以通过免 疫化学的方法 ( 如免疫电泳等) 或红细胞溶血法测量， 但灵敏度低。 r i a 法使用放射性物质又很麻烦。1 9 9 3 年 g a i l l a r d 等报道用 t r f i a法测定 脑脊液中的补体c , ) a 4 . 测定抗体分泌细胞及其分泌产物 1 9 9 4年 r u e d l等 1 0 报道应用 t r f i a技术测定细胞培养液中的细胞分 泌产物，如 i g g , i g m , i g a , i l , t n f等，从而对抗体分泌细胞 ( a n t i b o d y - s e c r e t i n g c e l l s , a s c ) 进行精确地测定。 他们采用脾细胞 体外作为带测样品。 t r f 工 a测定细胞奉命物，与 传统的 e l i s a和 e l i s p o t法比较，相 关性很好，但灵敏度高于后者。由于 t r f i a高灵敏度和精确定量测量的 特点，它在细胞培养方面的应用将比较仅限于抗体分泌士兵的测定，而 且可以被用来测定许多其他的细胞分泌物，如细胞因子、生长因子等。 此外，该技术在这方面另一有远大前景的应用是用来筛选杂交瘤细胞产 生的单克隆抗体。 5 . 测定细胞介导的细胞活性 某些免疫细胞 ( 如 n k , l a k , t杀伤细胞等)的活性，可以通过细 胞介导的细胞毒性 ( c e l l m e d i a t e d c v t o t o x i t v , c m c ) 来反映。所谓 c m c , 第一部分 理 论 是指杀伤细胞 ( 效应细胞)导致靶细胞的溶解作用。测定 c m c的方法， 目前最长用的是放射性同位素释放法。但放射性标记物的半衰期及使用 放射性物质带来的麻烦等缺点，促使人们在 c m c分析中采用非放射性手 段，如乳酸脱氢酶法、生物发光释放法和荧光法等。令人遗憾的是，这 些方法的灵敏度尚不能与放射性同位素释放法相比。1 9 8 6年 b l o m b e r g 最先将 t r f i a技术应用于 c m c的测定，他利用 e u d t p a释放法测 n k细 胞溶解靶细胞的功能;1 9 8 8年 g t a n b e r g等用 t r f i a测定杀伤性 t淋巴 细胞活性;1 9 9 0年 m a l e y用 t r f i a测定细胞介导的、补体介导的以及 抗体依赖的细胞活性;1 9 9 2年 c u i等又将该技术应用于补体介导的细 胞溶解作用;1 9 9 3年 b l o m b e r g等又采用一种新的 e u a c a p t释放法测定 n k 细胞活性。这些方面均取得了理想的结果。 二. 在微生物学中的应用 1 . 用于病原微生物抗原抗体的检测 自1 9 7 9 年由s o i n i 和h e m m i l l a 提出t r f i a 的理论以来，该技术最 早的应用实例是被用来检测病度的抗原和抗体。由于具有灵敏度强的特 点，t r f i a己经越来越显示出其较传统免疫分析技术的优越性，在微生 物检测及应用于乙型肝炎病毒、脑炎病毒、流感病毒、马铃薯病毒、轮 状病毒、人类免疫缺陷病毒 ( h i v ) 、出血热病毒和梅毒螺旋体的抗原抗 体以及某些细菌和寄生虫抗体的检测。 2 . 应用于核酸杂交分析 核酸杂交分析已被广泛地应用到微生物学的研究和诊断中。开展核 酸杂交的关键是制得理想的标记核酸探针。8 0年代后期发展起来的稀 土离子 ( 主要是 e u 3 )标记的核酸探针，既克服了放射性核酸探针同位 素污染、半衰期短、操作繁琐等弊端，又克服了其他非放射性探针灵敏 度低的缺点，己经表现出广泛的应用价值和发展前景。 2 - 4 t r f i a中稀土离子的标记技术进展 第一部分 理 论 任何有生命力的新技术、新方法都是在实际中不断发展和完善的。 自1 9 7 9年 s o i n i 和 h e m m i i a首先提出t r f i a的理论，并于 1 9 8 2年创立 了不断发展和完善的历程。t r f 工 a是在 r i a , e 工 a等传统的标记免疫分 析技术基础上发展起来的，它随着当代免疫分析技术的发展而发展，并 吸收当代免疫学、分子生物学及细胞生物学的新技术新手段，成为最有 发展前景的超微量检测技术之一。 t r f 工 a的实验过程与其他的免疫分析技术相类似，只不过它的标记物 是稀土离子 ( f u * 等) ，取代了e 工 a中的酶及 r i a的放射性同位素。因此 高质量的稀土离子标记物的制备，是影响 t r f 工 a特征的重要因素。以下 是几种提高 t r f 工 a灵敏度的方法。 一通用标记技术 1 . b s a在 t r f i a中的应用:生物素一 亲合素系统 ( b s a )在 t r f e a 中的应用非常广泛， b s a - t r f 工 a以发展成为一类独立的t r f 工 a 分析模式。 2 . e u 3 - g 蛋白和 e u 3 - a 蛋白:a 蛋白和 g 蛋白均为 i g g f c 端受体 蛋白， 能够通过非免疫反应的机制与工 g g 的f e 端结合， 因此， 最近m a r k e l a 等【 1 1 将之与 e u 3 十 进行标记，作为通用标记物应用于孕酮、雌二醇等的 t r f i a之中。分析原理非常简单，抗原抗体反应完成后，加入通用标记 物 e u 3 - a蛋白 ( 或 e u 3 - g蛋白) ，再温育 1 5 m i n ，洗涤，加入增强液， 便可在上分辨荧光仪上测量。特别值得一提的是，1 9 9 3年才始见报道 的重组 g蛋白，重组技术改变了 g蛋白的某些特性，使其保留了与 f c 端结合的片段， ，并使其带有 1 3 个赖氨酸残基可供 e u 3 + 标记，但却去掉 了和清蛋白及 f a b端结合片段及疏水基团，从而极大提高了标记化合物 的质量，非特异结合下降，灵敏度得于提高。由此可见，随着分子生物 学的发展，基团重组技术将有利于高质量标记物的制备，从而给 t r f i a 的标记技术带来重大影响，使一种 e u 3 标记物可供多种化合物的检测。 二. 双标记 t r f i a 第一部分 理 论 所谓双标记 t r f 工 a技术，就是以不同的稀土元素标记两种待测物 的抗体 ( 或抗原) ，从而实现两种组分的同时检测。以l h 和 f s h的测定 为例，两者结构上均由。 和日 两个亚基组成，它们的a 链是相似的不同 之处在于 0 链。临床上经常需要同时测定这两种激素，以了解某些生殖 机能障碍的病理生理机制。h e m m i l a等仁 1 3 将抗( l 一 链的 m c a b包被微量 滴定条制成抗体; 抗 f s h - 0 一 链的m c a b 用e u 3 + 标记; 抗l h - 0 一 链的m c a b 用 t b 标记。免疫反应时，首先将标准液含 l h及 f s h两种标准品)或 血清样品与固相表面形成两种夹心复合物，最后加入增强液。测量时， 由于 t b 及 e u 3 两种元素发射光的荧光特征及延迟时间的不同，发射光 的波长不同 ( e u + 和 t b + 分别为 6 1 3 n m及 5 4 5 n m ) ，且波峰又都窄，荧光 是寿命分别为 1 0 2 0 w s和 1 4 8 p ) ，这样就很容易将两者区别开来.只要 在 a r c u s - 1 2 3 4型荧光仪上输入不同的参数，便可以连续自 动地得到结 果，非常方便。该法最小检出值 l h为 0 . i i u / l , f s h为 1 . o i u / l 。与单 标记的r i a 及t r f i a 法相关性良 好。 三. 提高标记率的手段 免疫分析中标记物的质量直接影响着方法的灵敏度 免疫活性的前提下，应当尽可能地提高标记物的比活性 在不影响标记 从而提高方法 的灵敏度 子相联的 在t r f 工 a 中， 特征荧光物质是通过双功能鳌合剂与蛋白 质分 鳌合剂对标记率及标记物的活性有很大的影响，因而合成新 的鳌合剂无疑是提高标记率的重要手段。 四. 标记物的纯化 o s m a n 等报道用疏水层析法纯化e u “ 十 标记物，来降低非特异极数， 从而提高方法的灵敏度。 用e u “ 标记抗体时，先常规过s e g h a c r y s - 2 0 0 柱，收集蛋白质峰，得到 e u 一 标记物，然后将所得的标记物进行疏水 层析纯化。 第_部分 实 验 第二部分实验 时间分辨荧光免疫分析是一种继 r i a后在 f i a技术基础上发展起来的 一种新型非放射配基超微量分析技术。时间分辨荧光免疫分析技术随着 标记方法及测定手段的不断改进，己日益显示其优越性和广泛的应用价 值，时间分辨荧光免疫分析技术和其它的配基分析基本相似，仅示踪物 和信号测量不同，因此制备符合标准的 e u 标记物是关键问题。有关标 记物制备技术的方法研究鲜有报道。本论文通过对牛血清白蛋白 ( b s a ) 的标记，对两步标记法有关问题进行了初步的实验研究，旨在选用最佳 的反应条件，制备优质的标记物， 并同时绘制了e u c l : 及b s a的标准曲线， 目的是为了测量标记 b s a的标记率。 一 试剂及化学药品 1 .毗绽分析纯天津市化学试剂二厂 2 .五氧化二磷分析纯天津市化学试剂六厂 3 .醋酸醉天津易发试剂厂 4 .无水乙醚分析纯天津市化学试剂六厂 5 .冰乙酸分析纯天津市水运工程科研所化学试剂厂 6 . t r i t o n x - 1 0 0 b a k e r a n a l y z e d s u r f a c t a n t j . t . b a k e r 第二部分 实 验 c h e m i c a l c o . ，p h i l l i p s b u r g , n . j . 0 8 8 6 7 . 2 m o 1 / 1 h c 1取 l o m l 浓盐酸 ( 分析纯石家庄市试剂厂) 后，用去离子水稀释到5 0 m 1 8 . 0 . 2 5 m o 1 / 1 n a h c o 3称取碳酸氢钠 ( 分析纯开原化学 试剂厂)1 . 0 0 0 0 g 溶于去离子水中，并稀释至2 0 0 0 m 1 9 . 0 . 1 2 5 m o 1 / l n a o h称取氢氧化钠 ( 分析纯天津市华东 试剂厂)0 . 5 0 0 0 g ，用去离子水溶解并稀释到1 0 0 m 1 1 0 . 二甲亚枫分析纯天津市天河化学试剂厂 1 1 . t t a分析纯北京化工厂 1 2 . t o p o化学纯北京化工厂 1 3 .令 r 苯二甲酸氢钾分析纯天津市化学试剂一厂 1 4 .三氧化二铺光谱纯j o h n s o n m a t t h e y c h e m i c a l s l i m i t e d 7 4 h a t t o n g a r d e n , l o n d o n , e . c . 1 e n g l a n d 1 5 .牛血清白蛋白 ( b s a )电泳纯中国医学科学院血 液研究所 1 6 .二乙烯三胺五醋酸 ( d t p a )化学纯北京化工厂 1 7透析袋m o l e c u l o r w e i g h t c u t o f f s p e c t r u m m e d i c a l i n d u s t r i e s , i n c . 二， 仪器 1 .搅拌机调速器7 4 0 1电动搅拌机调速器天津市二十 八中仪器厂 2 .熔点仪日本岛津公司 3 .磁力恒温搅拌器8 1 - 2 型上海县会行农机厂 4 水浴恒温振荡器s h z - s z 型江苏省太仓医疗器械厂 荧光分光光度计r f - 5 1 0 型日本岛津公司 第二部分 实 验 三. 合成环化二乙烯三胺五醋酸配 b s a属于小分子活性物质，要求检测方法具有高灵敏度，制备合格的 稀土离子标记物，是建立小分子活性物质 t r f i a的关键。优质的标记物 必须具有高比活性，又不损伤被标记物的免疫活性。 在本实验中，首先要合成一个具有双功能基团的鳌合剂一环化二乙 烯三胺五醋酸醉 ( c y d t p a ) ， 它是一种常用的多氨基按基鳌合物，由于 分子内带有氨基狡基的活性基团，因此它的活性端能与 b s a的游离氨基 以共价键形式结合，而另一端则与稀上离子 e u 以非共价键鳌合，形成 e u - c y d t p a - b s a复合物。标记是分两步进行的，c y d t p a先与蛋白质游离 氨基反应，然后再加 e u