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灰树花漆酶高产菌株的发酵及其酶学性质研究 摘要 随着科技的同益进步，人们不但对高水平的生活追求提高了，而且对生活环境以及 环保要求提到了前所未有的高度。漆酶作为一种纯天然，无污染的材料在生活中的应用 日益广泛，并且不断的被人们所认可。本实验首次用液体发酵法对食用菌灰树花进行漆 酶研究，液体发酵优点在于，生长周期短、污染少、环境可控，得到的灰树花漆酶的酶 活最高达到1 7 9 9 0 u m l 。完全可以应用于工业大规范生产。 本文主要研究了以下三方面内容： 1 样品制备稳定性的研究 灰树花发酵产漆酶的最佳时间为1 0 天；在不同温度下，该酶的反应速度以及耐受 情况都表现不同的活力，漆酶的最适温度约为4 0 。c ；漆酶在不同的p h 下，其表现活性 不同，p h l 8 3 0 都表现出较高活力，在p h 3 0 达到最高活力，3 0 为其最适反应p h ；可 以看出0 。c - - 4 0 条件下漆酶相对稳定，相对剩余酶活较高，当温度在4 0 时相对剩 余酶活力最高，为8 9 ，温度大于4 0 后酶活迅速下降，6 0 时相对酶活仅为4 0 漆酶在p h 2 8 3 4 时酶活力表现很强的稳定性，并且相对酶活力都在6 0 以上，但是当 超过p h 超过3 4 时，相对酶活急剧下降，随着p h 的继续增大到5 2 的时候，相对酶活 继续下降为2 0 ；金属离子对漆酶活力的影响：c u 2 + ，c 0 2 + 对漆酶有显著的激活作用， f e 3 + 对酶活有一定的抑制作用，而a g 坝0 完全抑制漆酶的活性，n a + 、k + 、m 9 2 + 、z n 2 + 对酶影响相对c u 2 + ，c 0 2 + 不大。灰树花粗漆酶沉淀比较丹宁法，乙醇法，丙酮法，硫酸 铵法，从得率和纯度上得出硫酸铵沉淀法最适合。 2 灰树花漆酶的液体发酵条件的研究优化 应用正交实验、均匀分析灰树花漆酶的液体发酵条件。结论得出：灰树花菌株摇 瓶振荡培养产生的漆酶比静止培养产生的漆酶活力高，摇床培养1 0 天，装液量为 5 0 m l 2 5 0 m l ，转速为1 2 0 r m i n 时漆酶活力最高。通过设计正交实验，用s p s s 软件分 析的结果可以明显的看出：灰树花产生的漆酶的最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为蛋白胨， 最适温度为2 6 0 c ，最适p h 值为3 0 ，最适产酶培养基：葡萄糖1 0 9 蛋白胨5 9 ，添加 n a 2 h p 0 4 0 4 7 5 9 ，k h 2 p 0 40 4 5 3 9 ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 9 、c a c l 2 2 h 2 0 0 0 1 3 9 ， 酵母提取物1g 、v b l2 5 m g 、痕量溶液l m l ，最后定容至1 0 0 0 m l 狄树花产生的漆酶 的酶活最高达到1 7 9 9 0 u m l 。 关键词：漆酶；发酵；酶学性质 f e r m e n t a t i o na n de n z y m a t i cc h a r a c t e r i s t i c so fg r i f o l a f r o n d o s a h y p e r - p r o d u c i n gl a c c a s e a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to ft e c h n o l o g y , p e o p l en o to n l yp u r s u i n gt h eh i g h e rs t a n d a r do fl i v i n g ，b u ta l s o h a v i n gas i g n i f yr e q u i r e m e n tf o rt h ee n v i r o n m e n t a lc o n s e r v a t i o n l a c t a s ea san o - p o l l u t i o na n dp u r i f y n a t u r a ls u b s t a n c e ，w h i c hi sb e i n gu s e dm o r ea n dm o r ew i d e l yi no u rd a i l yl i f e a n dt h ev a l u e sa r eg r a d u a l l y a c c e p t e db yp e o p l e i nt h i sr e s e a r c h ，t h eg r i f o l af r o n d o s al a c c a s e sc h a r a c t e r i s t i c sw e r ei n i t i a ls t u d i e db y s u b m e r g e df e r m e n t a t i o n t h em e t h o dh a dg r e a ta d v a n t a g e s ，w h i c hh a das h o r t e rg r o w t hc i r c l e ， l o w e r - p o l l u t i o n ，a n d t h ep r o d u c t i o ne n v i r o n m e n tc o u l db ec o n t r o l l e de a s i l y t h eg r i f o l af r o n d o s a l a c c a s e se n z y m ea c t i v i t yw a su pt ol7 9 9 0 u m l a n dt h er e s u l tc o u l db ec o m p l e t e l yu s e di ni n d u s t r y m a n u f a c t u r e t h i sa r t i c l em a i n l yd i s c u s s e dt h r e ea s p e c to fc o n t e n t ，t h r o u g has e r i a li n v e s t i g a t i o na n da n a l y s i s ，a n dt h e m a i nr e s u l t sw e r es h o w na sf o l l o w i n g ： 1 s t u d i e do nt h eh i g h l ys t a b i l i t yo ft h ep r e p a r a t i v es a m p l e s ：t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nt i m ew a s10d a y s f o rp r o d u c tl a c c a s e a td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s ，l a c c a s e sr e a c t i o nr a t ea n de n d u r a n c ew e r ed i f f e r e n t t h e s u i t a b l et e m p e r a t u r ew a s4 0 * ( 2 a td i f f e r e n tp h ，t h e yh a dt h ed i f f e r e n tc h a n g e ，r a n g ef r o m1 8t o3 0 ，w h i c h h a dah i g h e re n z y m ea c t i v i t ya tp h 3 0 ，a c t i v i t yw a st h eh i g h e s t t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，w h e nt h er e a c t i o n t e m p e r a t u r ec h a n g e df r o m0 ct o4 0 ，l a c c a s e se n z y m ea c t i v i t yw a ss t a b i l i z e a t4 0 ，i th a dt h eh i g h e s t r e l a t i v e l ye n z y m ea c t i v i t y , w a su pt o8 9 ，w h e nt h et e m p e r a t u r eo v e r4 0 * ( 2 t h ee n z y m ea c t i v i t yw a ss h a r p d e c r e a s e d a t6 0 。c ，r e l a t i v e l ye n z y m ea c t i v i t yw a sj u s tt o4 0 w h e np h 2 8 - 3 4e n z y m ea c t i v i t yw a sv e r y s t a b i l i t y , w h i c hw e r ea l la b o v e6 0 b u tw h e nt h ep ho v e r3 4 ，t h er e l a t i v ee n z y m ea c t i v i t yw a ss h a r p d e c l i n e a tp h5 2 ，i tj u s tu pt o2 0 m e t a l l i ci o nf u n c t i o n ：c u 2 + ，c 0 2 + h a dt h eo b v i o u sa c t i v a t i o nt o l a c c a s e ，f e + h a dc e r t a i ni n h i b i t o r ya c t i o ne x a c t l yt ot h ee n z y m ea c t i v i t y , a n da g + c o m p l e t e l yi n h i b i t e dt h e e n z y m ea c t i v i t y c o m p a r i n gw i t ht h ec u 2 + ，c 0 2 + n a + ，k 十，m 9 2 + ，z n 2 + h a dal o w e rf u n c t i o no nt h ee n z y m e a c t i v i t y i no r d e rt og e tab e t t e rm e t h o do fp r e c i p i t a t i o nt op r o d u c tla wl a c c a s e ，t h et a n n i np r o c e s s ，e t h a n o l p r o c e s s ，a c e t o n ep r o c e s sa n da m m o n i u ms u l f a t ep r o c e s sw e r er e s e a r c h e d f i n a l l yc o m p a r i n gw i t hy i e l da n d p u r i t y , g e t t i n gt h eb e s tm e t h o dw a sa m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n 2 o p t i m i z a t i o nr e s e a r c ho ng r i f o l af r o n d o s al a c c a s el i q u i df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ：a n a l y z e dt h e p r o d u c t i o nc o n d i t i o n so fl a c c a s eb yo r t h o g o n a lt e s ta n du n i f o r md e s i g n ，t h er e s u l td e m o n s t r a t e d ：s h a k i n g c u l t u r ew e r eb e t t e rt h a ns t a t i c t h eb e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa sf o l l o w s ：s h a k i n gi n c u b a t o rr a i s e sf o r10 d a y s ，c u l t u r ef l u i dw i t h5 0 m l 2 5 0 m l ，a n dt h es p e e do fr o t a r yw a s12 0 r m i n 。t h ee n z y m ea c t i v i t yw a s h i g h e s t t h r o u g ho r t h o g o n a lt e s td e s i g na n da n a l y s i sw i t ht h es p s ss o f t w a r e ，t h er e s u l to b v i o u s l ys h o w e d t h a t ：t h eb e s tc a r b o ns o u r c ew a st h eg l u c o s e ，t h eb e s tn i t r o g e ns o u r c ew a st h ep r o t e i np e p t o n e ，a n dt h eb e s t t e m p e r a t u r ew a s2 6 t h eo p t i m u mp hw a s3 0 t h eo p t i m u me n z y m em e d i u mc o n d i t i o n si n c l u d e dt h a t ： g l u c o s e10 9 , p r o t e i np e p t o n e5 9 ，a n da f f i xi o n ，n a 2 h p 0 40 4 7 5 9 ，k h 2 p 0 40 4 5 3 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 5 9 ，c a c l 22 h 2 00 0 1 3 9 ，y e a s te x t r a c t i o n ! g ，v b i2 5 m g , t r a c ea m o u n ts o l u t i o n1 m l ，c o n s t a n tv o l u m et o 10 0 0 m l t h em a x i m u me n z y m ea c t i v i t yo fg r i f o l a f r o n d o s al a c c a s e w a su pt o17 9 9 0 u m l k e yw o r d s ：l a c c a s e ；f e r m e n t a t i o n ；e n z y m ec h a r a c t e r i s t i c s 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者躲芸j 与 签字日期：阳g 年月力日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 学位论文作者签名芝量 0 次 签字r 期：0 产孑年月砂日 翩虢套秽 签字胁渺年 一良 上林农业人学硕l ：论义厌树仡漆酶高产菌株发酵及j 酶学性质的研究 弟一草剐舌 灰树花 g r i f o l a f r o n d o s a 又名贝叶多孔菌，俗称栗蘑，在分类系统中属于担子菌亚门、 多孔菌科、树花属。狄树花富含灰树花多糖、维生素、人体必需的氨基酸和微量元素，经 常食用可预防和治疗肝脏系统、胃肠道疾病，被世界卫生组织确认为“天然、营养、保健” 功能为一体的1 6 种珍稀食用菌之一。长期以来人们主要对狄树花多糖进行大量研究，而 对其漆酶的研究尚属首次，因灰树花漆酶具有广阔的市场空间，所以本实验通过不同方式 对灰树花培养，找到最适合的培养条件，以提高灰树花的产量，为大量生产提供理论依据。 漆酶( l a c c a s e ，e c1 1 0 3 2 ) 是一种含铜的多酚氧化酶，和植物中的抗坏血酸氧化 酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白同属蓝色多铜氧化酶( b l u em u l t i - - - c o p p e r o x i d a s e ) 家族。1 8 8 3 年，日本学者吉m ( y o s h i ) t l 】首次从日本紫胶漆树( r h y sv e r n i c i f l u a ) 漆液中发现一种可催化漆 固化过程的蛋白质；1 8 9 4 年，b e r t r a n d 2 l 将这种蛋白质命名为漆酶( l a c c a s e ) 。漆酶广泛分 布于真菌分泌物、高等植物【3 ”、少量细菌【6 7 1 和昆虫【8 】中。分泌漆酶的真菌主要分布于担 子菌亚门的白腐真菌【9 1 。按其来源漆酶主要分为漆树漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶。漆酶 具有较强的氧化还原能力，例如漆树漆酶能够催化木质素的聚合过程【l 州，而真菌漆酶则 能催化木质素的降解、去除有毒化合物的毒性作用、促进真菌色素的合成等，因此， 真菌漆酶在环境保护、生物检测、造纸工业、食品工业等领域具有广泛的应用前景引。 真菌漆酶的概述 1 1 真菌漆酶的结构及催化反应机理 1 1 1 真菌漆酶的分子结构特征 漆酶分子结构中一般含有4 个铜原子，根据磁学和光谱学生质不同可将漆酶分子中4 个铜原子分为3 类：i 型c u 2 + ( t 1 c u ) 和i i 型c u 2 + ( t 2 c u ) 各1 个，是单电子受体，呈顺磁性；i i i 型c u 4 + ( t 3 c u ) 两个，是耦合离子对，双电子受体，反磁性。i 型c u 原子形成单核中心，铜 对漆酶的影响非常大，下图为漆酶的三维立体结构图。 古林农业人学硕l ：论文灰树仡漆酶高产菌株发酵及j e 酶学性质的石j f 究 1 1 2 真菌漆酶的催化反应机理 漆酶的三维结构图 ( b ) c o p r i n u sc i n e r e u s ( c c l ) 主要表现在底物自由基的生成和漆酶分子中4 个铜离子的协同作用。当漆酶催化酚类 如氢醌氧化时，产物中除醌外还有聚合物和c o 、c c 偶联产物。在0 2 存在下，还原态漆 酶被氧化，0 2 被还原为水。漆酶催化底物氧化和还原是通过4 个铜离子协同地传递电子和 价态变化实现的。如下图所示。 c 洲： ：lc l l c i l c i l ：笪塑 底物电粥 ( 氧化态) i c l i 舢a 矿! 坠：夕c u - , c u - i ，- ( 0 。：0 ) - ! 墅 ( 还原态) 郴快瑚，慢 1 1 3 真菌漆酶的活性中心 加 付c n 畦二。 底物 ( 知劭幻。 l 丑u i( 氧l 陶 首先底物结合于酶活性中心i 型铜原子位点，通过_ c y s - - h i s 途径将电子传递给三 核铜簇位点，该位点又把电子传递给氧，使其还原成为水，同时底物形成自由基，它们可 以自身结合或相互偶联，形成聚合物或偶联产物19 1 。 2 古林农业人学硕i j 论文 灰树挖漆酶高产菌株发酵及j 酶学性质的研究 柚 1 1 4 真菌漆酶的底物 1 - 参1 4 5 3 字零 ( a ) b a c u l u ss u b t i l i s ( c o a ) ；( b ) r i g i d o p o r u sl i g n o s u s ( r i l ) 初步统计它催化氧化不同类型的底物己达2 5 0 个。按底物结构可归纳为六类：( 1 ) 酚及 其衍生物：约占漆酶底物总数一半，主要是多元酚及其衍生物和0 c 奈酚及其衍生物，后者 取代基多在酚羟基的邻、对位，随着取代基的种类、数目和在芳环位置的不同，反应活性 也有差异：( 2 ) 芳胺及其衍生物：其结构特点与酚类底物相似，主要是多氨基及其衍生物： ( 3 ) 羧酸及其衍生物：一般指芳环羧酸基邻或对位连有羟基、烷氧基或胺基等的芳香酸，碳 链e 连有酚或非芳胺基团的非芳香酸：( 4 ) 甾体激素和生物色素：如雌甾二醇、0 1 , 卵胞激素、 己烯雌酚、胆红素苏木色精等：( 5 ) 金属有机化合物：如二茂铁( f e h ) 及其衍生f e r ( r c h 2 0 h ， c o o 一，c h 2 f e 等) ；( 6 ) 其他非酚底物：除了早期发现的亚铁氰化钾、抗坏血酸等外，近年 来还发现了1 苯基2 ( 3 ，4 二甲氧基苯基) 乙二醇等【2 4 2 5 1 。 1 2 真菌漆酶的应用 目前在实验室、工业生产中漆酶的应用主要有3 种：游离酶、固定化酶和固定化细胞 技术。实际应用过程中，环境条件变化会导致漆酶变性失活，特别是游离酶与反应物混合 在一起，难以实现重复利用，限制了漆酶制剂的产业化应用。肖亚中等人【2 6 j 用壳聚糖作载 体，固定化真菌漆酶，酶活收率达5 8 5 ，其p h 值适应范围在4 0 - 7 0 内有较好的稳定性， 最适温度为5 5 左右( 游离5 0 v ) ，且热稳定性较好。固定化胞技术是在固定化酶技术的基 础上发展起来的。陈敏等人【2 7 】利用p v a 包埋活性炭与微生物，并对有机磷农药水胺磷的降 解进行了实验研究，结果表明固定化细胞对温度、p h 值和水胺磷浓度的适应范围有所扩大。 1 2 1 在环境中的应用 工业“三废”、化学农药分解时往往含有有毒的酚或芳胺，将它们用固定化漆酶处理， 生成醌或聚合物后分离出去而起到解毒的作用。b o l l a g - 等t 2 8 1 用固定化漆酶处理纸厂废水， 有效地除去甲基酚；以硅藻土等为载体固定化漆酶催化农药分解成2 ，4 一二氯酚，氧化生 古林农业人学硕f j 论义 灰树仡漆酶商产菌株发酵及j e 酶学性质的研究 成的不溶性低聚物容易除去。氯酚类有机化合物及其衍生物，对环境和人类健康造成严重 危害。一般认为，在氧存在下，漆酶氧化聚合氯酚类物质，通过降低这些有毒物质的溶解 度可减少其毒性。其中包括氯酚、甲基酚和甲氧基酚等。d a n n i b a l e 等【2 9 】将漆酶先吸附， 再用戊二醛共价结合在壳聚糖载体上可有效地去除废水中的酚类化合物。香菇( l e n t i n u l a e d o d e s ) 分泌的漆酶固定于e u p e r g i tc 上，酶对温度和p h 值稳定性提高，用这种固定化酶可 去除废水中大部分的酚类化合物，可用于厌氧消化处理废水的预步骤【3 们。 1 2 2 生物漂白和脱色 传统的化学漂白法是采用氯或氯化物对纸浆漂白，含氯的漂白废液中有很多有毒的氯 化有机物( 如三氯甲烷、各种氯代酚、二呃英等等) ，有致癌、致畸、致突变作用，从而对 环境和生态造成严重破坏。利用微生物或其产生的酶与纸浆作用以达到脱除木素、改善纸 浆可漂性的过程称为生物漂白。纸浆中的有色物质主要来自木素的芳香化合物，故木聚糖 酶仅起助漂作用，不能真正替代化学漂剂。 因此，近十多年来，直接用木素降解酶进行生物漂白已引起人们的广泛关注。用于纸 浆漂白研究的木素降解酶中，漆酶用于纸浆漂白的研究是最晚的，但研究最多，进展最显 著，成为最具潜在应用前景的氧化酶【3 l 】。自1 9 9 0 年【3 2 】报道了漆酶在传递电子的介体帮助下 能氧化非酚型木素化合物以来，漆酶介体生物漂白成为研究热点。1 9 9 4 年，一项称之为l m s 生物漂白的专利技术问世【3 3 1 ，更显示出漆酶在纸浆生物漂白和提高纸浆漂白质量等方面的 诱人前景。 1 2 3 食品加工 饮料加工在饮料加工过程中利用漆酶可以氧化酚类物质，使其聚合，这既可使果汁在 加工过程中快速澄清，又解决了果汁长时间储存所产生的后浑浊问题；且不用p v p ( 聚乙烯 吡咯烷酮) 、活性碳及吸附剂处理，污染问题少d es t e f a n o 成功地将彩绒革盖菌漆酶吸附在 琼脂糖凝胶4 b z p i i d a c u 2 + 上，采用该法固定化吸附率高，稳定性高，对环境适应能力 强，并且载体可以回收利用。有报道显示可将固定化的漆酶用于苹果汁的澄清( 酚类、黄 烷醇和有色化合物分别降低了4 8 6 、4 7 和4 3 ) 和儿茶酸的去除( 7 5 ) 【3 4 j 。 1 2 4 生物检测 生物电极是以固定化生物体组成作为分子识别元件的敏感材料，与氧电极、膜电极和 燃料电极等构成生物传感器，将被测物的浓度与可测量的电信号关联起来。在发酵工业、 环境监测、食品监测、临床医学等方面得到广泛的应用。将漆酶吸附在碳上制成固定化酶 电极，能有效催化负极氧化还原，可精确测量浓度在2 o x l 0 5 7 o x l f f 4t o o l l 范围的多酚、 多胺基苯等底物35 1 。r e n a t os f r e i r e ( 2 0 0 1 ) 等人将彩绒革盖菌漆酶的羧基与碳二亚胺戊二 4 古林农业人学硕l j 论义灰树仡漆酶高产菌株发酵及j 酶学性质的研究 醛结合后固定在碳纤维电极上制成生物传感器，用于监测污水中酚类化合物时，最适p h 值为5 0 电压为一1 0 0m v 。固定化漆酶在2 个月后仍有相当高活力3 6 1 。酶法免疫分析用漆酶 作酶法免疫分析( e 1 a ) 的标记酶，其抗原、漆酶的结合灵敏度有很大提高，同时对培养基 中变价金属离子含量具有更低的敏感性3 7 1 。 1 2 5 在能源领域的应用 目前，世界所需能源，以及有机化工原料，绝大部分来源于石油、煤和天然气。这些 能源储量有限，而且能造成地球环境危机，应用生物燃料电池( b i o f u e l c e l l ) 可以使清洁环 保的能源利用成为现实。生物燃料电池是利用酶或者微生物组织作为催化剂，将燃料的化 学能转化为电能【3 8 】的。近年来，科学工作者致力于开发无隔膜的酶生物燃料电池。在无隔 膜电池方面，研究较多的是，利用漆酶在阴极催化氧还原生成水【3 9 4 0 1 。然而底物的p h 值变 化会对漆酶的活性产生定影响。当底物p h 值为5 时，电池具有较好的电流输出：当底物 p h 值为7 时，漆酶的活性下降到只有其最大值的l ，在优化的实验条件下，可使漆酶活性 达到其最大活性的5 0 i 4 1 1 。目前这类电池的工作寿命较短，所以还不适合于实际应用，仍 需进行深入细致的研究。 1 2 6 其它因素对酶收率的影响 无论在生活中还是在生产应用中，漆酶都有很大的实际价值和广泛的应用前景，提高 酶活收率是我们迫切需要解决的，目前酶沉淀所用的方法有沉淀法、盐析法、层析法，还 有电泳、超滤等本文对各方法进行了比较研究。单宁沉淀法中单宁( 鞣酸) 含呈酸性的酚性 羟基，既可以起酸碱反应，又可以起氧化还原反应，其疏水性芳香环还可以与疏水结合而 形成疏水键；蛋白质可视为两性电解质，分子中含有氨基、酚基等活性基团，因此，单 宁与蛋白质可以发生酸碱反应、氧化还原反应、疏水性结合等等各种物理化学反应，这些 反应机制又受p h 、离子强度、反应物浓度与种类、温度等多种因素的影响。 硫酸铵沉淀法对活性损伤小，沉淀可长时间保存。同时，各种蛋白结构不同，硫酸铵 与之作用的起始沉淀浓度和完全沉淀浓度也各不相同，从而可对粗提液中的酶进行预提 纯，除去太部分杂蛋白。以往硫酸铵沉淀浓度范围的确定，多采用测定沉淀中的蛋白质含 量，但往往因实验的样品量步，沉淀中溶液的残留，硫酸铵引起的溶液体积改变等等因素 带来较大的误差。本文提出的确定目标酶的硫酸铵沉淀浓度范围方法方便、可靠，结合 s d s - - p a g e 电泳法可观察到蛋白质含量的变化。所以本试验采用硫酸铵沉淀法加层析法 结合。 古林农业人学硕f j 论义狄树仡漆酶产菌株发酵及j e 酶学性质的研究 2 真菌漆酶发酵研究进展 2 1 真菌漆酶的基因结构与表达 随着分子生物学技术的发展，国内外已经对漆酶基因克隆并进行了性质分析，研究漆 酶编码基因及漆酶基因的表达调控机制，有助于阐明不同漆酶在发育过程中所起的重要作 用【4 2 1 。 真菌漆酶的基因外显子序列长度一般介 于1 5 0 0 b p 2 0 0 0 b p ，相应的氨基酸残基数约为 5 0 0 ，整体的序列同源性并不高，但是不同酶蛋白中结合铜原子区域的保守性相当高。基 因中含有的相当多的内含子，其中一些也高度保守。经比较发现，白腐菌中的内含子虽然 序列同源性不高，但它们在铜结合区域的保守性相当高，而且不同来源的漆酶基因内含子 的位置也大多是保守的。这两方面可以作为分析酶的同源性和菌株间的亲缘关系依据之 一。漆酶在不同真菌中的产生似乎与不同芳香类化合物的存在有关，因此不同的真菌中存 在不同的转录激活机制，特别是对于那些诱导表达的种类。 2 2 影响真菌漆酶合成的条件 2 2 1 碳源和氦源对真菌漆酶合成的影响 王宜磊等研究杂色云芝( c o r i o l u sv e r s i c o l o r ) 漆酶的产酶条件中，发现淀粉是该菌株 较好的碳源，其次是麦麸【4 3 】。在培养基中连续添加2 0 的葡萄糖，产酶量可超过 3 0 0 u k a t m l 。在简单碳源和复杂碳源对遐状革耳菌( p a n u sc o n c h a t u s ) 产酶活力的影响方 面，以麦芽汁或土豆汁为碳源比以葡萄糖为单一碳源时漆酶酶活提高1 5 和1 7 倍m j 。 氮源方面：据报道，蘑菇属一种在碳源如甘油、葡萄糖、果糖、甘露醇、阿拉伯糖、 麦芽糖、蔗糖、纤维素或纤维二糖充足的条件下，限制培养基中的氮源，漆酶的产量明显 提高1 4 5 j ；席单等研究糙皮侧耳菌漆酶的发酵时发现，大豆粉可以有效的促进糙皮侧耳菌漆 酶的酶活【4 6 i 。 2 2 2 金属离子对真菌漆酶合成的影响 漆酶的产生显著受c u 2 + 的调控，没有c u 2 + 存在时，产酶活性低，增加c u 2 + 浓度后产 酶活性增加，但是过多的c u 2 + 又对漆酶产生抑制作用【4 7 1 。 m n 升离子对漆酶合成有一定的影响，据报道，有些白腐真菌在不添加m n 2 + 离子的培 养基中生长时，漆酶酶活明显降低。m n 2 + 离子在多数真菌漆酶在其合成的木素降解酶系中 占主导地位，但当加入并增大m n 2 + 离子浓度，漆酶的合成受到抑制，而其它木质素降解 酶的合成量却得到提高。 6 古林农业人学硕l ? 论义 灰树仡漆酶高产菌株发酵反j e 酶学性质的研究 2 2 3 培养方式培养基培养条件对漆酶合成的影响 目前研究最多的是液体培养，但也有固体培养的报道，据报道在固体培养条件下，漆 酶和锰过氧化物酶的产量都较液体培养条件下大为提高，然而固体培养条件下营养物质、 诱导剂、微量元素、温度及p h 值等生理条件对漆酶的影响尚未见详细考察【4 8 1 。在液体培 养中，大多采用振荡培养，但是也有在静止培养条件下漆酶产量较高的报道【5 们。在液体培 养中，对基础培养基进行优化时，大多根据碳源、氮源、c n 比、无机盐和微量元素对 漆酶酶活的影响进行选择；另外在培养基中加入某些天然物质，配成半合成培养基对提高 漆酶的产量也非常有利。例如有相关报道，在合成培养基中加入土豆汁洋葱、柠檬浆、木 素及稻草等，均可提高漆酶的产量；在合适的时间向培养基中加入适当浓度的诱导剂，也 可以提高漆酶的产量；表面活性剂和某些金属离子对漆酶产量的提高也有一定的作用。 2 3 真菌漆酶菌种的筛选和选育 产漆酶的菌株多为真菌，近年来已经对漆酶产生菌进行了广泛的研究，但是选育漆酶 高产菌株仍是当前的研究热点。随着分子生物学和基因工程的发展，构建产漆酶的工程菌 株也逐渐成为研究的热点。王岁楼【4 8 】等人对1 株产漆酶活性较高的灵芝原生质体的制备、 再生及紫外诱变育种进行了研究，获得了1 株突变株g 3 0 1 漆酶，其活性比对照菌株提高2 8 3 倍。刘卫晓1 4 9 】等人从产漆酶白腐菌提取总r n a ，利用r t - _ p c r 的方法克隆到漆酶的c d n a ， 并将其克隆到表达载体重组，质粒经线性化、电激转化通过底物显色反应筛选到漆酶生产 工程菌株。该菌株产酶活力高，且产酶活力较稳定，培养过程中不易染菌。 2 4 其他因素 除了合适的培养基外，还要考察环境条件对菌体产漆酶的影响。需考虑的因素有菌龄、 装液量、接种量、培养温度、培养时间、初始p h 值、摇床转速及培养液黏度等。不同的 菌种对这些条件的要求也不同。朱明旗【5 l 】等人发现亚香栓菌( 丁s u b s u a v e o l e n s ) 是产生漆酶 的最好菌株，对其发酵产酶条件的研究结果表明，其产酶最适碳源为葡萄糖，最适氮源为 硝酸铵，起始最适p h 值为6 0 ，最适培养温度为2 8 ，5 d 时酶活达最大值，培养基装量 对产酶影响不大。 7 古林农业人学颀f j 论文 狄树仡漆酶，蔫产菌株发酵及j e 酶学件质的研究 1 材料和方法 1 1 菌种 第二章样品制备稳定性研究 灰树花 g r i f o 肠加，z 面s 口】又名贝叶多孔菌，俗称栗蘑，在分类系统中属于担子菌亚门、 多孔菌科、树花属。本实验菌种来自上海食用菌研究所。 1 2 培养基 1 2 1 菌种扩大培养和斜面保藏培养基 p d a 斜面培养基：马铃薯2 0 0 9 、葡萄糖2 0 9 l 、琼脂2 0 9 l 、水1 0 0 0 m l 1 2 2 菌株产酶筛选培养基( 基础培养基) l 天冬酰胺 2 9 葡萄糖1 0 9 痕量溶液l m l 蒸馏水定容至1 0 0 0 m l 1 2 3 液体产酶培养基( l ) 葡萄糖1 0 9l 一天冬酰胺5 9 ，添加如下物质，最后定容至1 0 0 0 m l n a 2 h p 0 4 0 4 7 5 9k h 2 p 0 4 0 4 5 3 9 m g s 0 4 7 h 2 0 0 5 9c a c l 2 2 h 2 0 0 013 9 酵母提取物l g v b l 2 5 m g 痕量溶液( 注1 ) l m l l 1 3 常见菌株产漆酶活力检测 漆酶的活性测定通常采用测氧法，分光光度或荧光分析法和高效液相色谱法。本文 漆酶采用分光光度法测定。 1 4 培养方法和酶液制备 将狄树花菌种接种p d a 活化培养基进行复壮( 2 5 恒温静止培养4 d ) 。然后接种至菌株 产酶筛选培养基进行菌丝体培养( 2 5 恒温静止培养4 d ) ，然后将菌丝体接人液体产酶培养 基进行液体发酵培养，培养条件为2 6 、1 2 0r m i n 液体摇床培养。 8 古林农业人学倾f j 论义 灰树化漆酶高产菌株发酵及j e 酶学件质的研究 酶液制备：将发酵酶液经8 层纱布过滤除去菌丝体，低温离心机6 0 0 0r m i n 离心1 0m i n 即可【5 2 】。 1 5 漆酶活力测定 该酶与底物反应，用7 5 2 型分光光度计4 2 0n l i l 下测定3m i n l 为a o d 。酶活性单位定义： l m i n 内催化氧化1 p m o l 底物生成产物所需的酶型”1 。 1 6 酶的最适反应温度 0 5m m o l l 的a b t s 在i o 。c 、2 0 。c 、3 0 * 0 、4 0 v 、5 0 c 、6 0 。c 的各温度下与酶液反应， 在4 2 0n l t l 下用分光光度计测其酶活。以酶活最高的酶活力为对照( 1 0 0 ) ，相对酶活( ) = ( 各温度条件下的酶活力最高酶活力) x1 0 0 。 1 7 酶的最适反应p h 将相同量的酶液置于不同p h ( 1 8 、2 2 、2 6 、3 0 、3 4 、3 8 、4 2 、4 6 、5 0 、5 4 、5 8 ) 缓冲液中【5 4 1 ，立即进行酶活力的测定；以酶活最高的酶活力为对照0 0 0 ) 相对酶活 ( ) = ( 各p h 条件下的酶活力最高酶活力) x 1 0 0 。 1 8 酶的热稳定性 于i o 。c 、2 0 。c 、3 0 。c 、4 0 。c 、5 0 。c 、6 0 。c 、7 0 。c 温度范围内，将酶置于不同温度下保 持4h 后，在常温下测其剩余酶活力。以最初酶活力为对照0 0 0 ) ，剩余酶活( ) = ( 各温度 条件下的剩余酶活力最初酶活力) 1 0 0 。 1 9 酶的p h 稳定性 将酶液在不同p h 条件下，保持4 h 后，再测定剩余酶活力。以最初酶活力为对照( 1 0 0 ) ， 剩余酶活( ) = ( 各p h 条件下的剩余酶活力最初酶活力) l o o 。 1 1 0 金属离子对漆酶活力的影响 分别配制5m m o l f l 的n a c l 、k c i 、e a c h 、m g s 0 4 、f e c l 3 、c u s 0 4 。5 h 2 0 、m n c h 、 z n s 0 4 5 h 2 0 、c o c l 2 、a g n 0 3 盐溶液5 5 5 6 】。将酶液加入到以上盐溶液中，立即进行漆酶活 力测定。 9 古林农业人学硕i j 论文 灰树化漆酶高产菌株发酵及j e 酶学性质的研究 2 结果与分析 2 1 灰树花发酵中的酶活变化 将培养1 0 天的菌种转接到液体培养基中， 测粗酶活性。测定随时间的增长漆酶的变化， 1 6 0 0 0 31 4 0 0 0 姜一, - - - 41 2 0 0 0 喜 1 0 0 0 0 ； 。8 0 0 0 趸嚣6 0 0 0 耋蘧4 0 0 0 奢 2 0 0 0 卤0 在摇床中2 6 0 c ，1 2 0 r m i n 培养l o d 后取样， 设三个重复。如下图2 1 所示。 051 0 1 52 02 5 天数 表2 - l 漆酶酶活时间曲线图 f i g 2 1e f f e c to f t i m eo ne n z y m ea c t i v i t yo f s t r a i n sp r o d u c t i o n 由上图可知漆酶在第十天的时候活力达到最大值，在前十天随着时间的增长漆酶酶活 不断增大，漆酶量持续增加，但是当达到最大值后，漆酶活力呈下降趋势，估计是培养基 中的营养物质被消耗掉造成的。所以测漆酶的最佳时间是液体培养第十天。 2 2 酶的最适反应温度 在不同温度下，该酶的反应速度以及耐受情况都表现不同的活力，以i o 。c 、2 0 。c 、3 0 、4 0 。c 、5 0 。c 、6 0 c 、7 0 c 不同的温度为横坐标，所测相对酶活力为纵坐标，作图2 2 ： 1 0 吉林农业人学颂i j 论义 扶树仡漆酶高产菌株发酵及j e 酶学性质的研究 ，一、 长 v ! g 逡 簧 霹 02 0 4 06 08 0 温度 表2 - 2 温度对漆酶活性的影响 f i g 2 - 2e f f e c to ft e m p e r a t u r eo ne n z y m ea c t i v i t yo fs t r a i n sp r o d u c t i o n 随着温度的升高，漆酶的相对酶活没有显著的变化，在4 0 。c 的时候漆酶的相对酶活达 到最大值，所以为了是漆酶保持稳定，温度必须小于4 0 。c 。 2 3 酶的最适反应p h 设定p h 梯度为1 8 、2 2 、2 6 、3 0 、3 4 、3 8 、4 2 、4 6 、5 0 ，测定p h 对漆酶活力的 影响。见下表2 3 所示： 1 0 0 9 0 8 0 集7 0 。6 0 鎏i ： 侈c 罂3 0 2 0 1 0 o l 2456 p h 表2 - 3 p h 对漆酶活力的影响 f i g 2 - 3e f f e c to fp ho ne n z y m ea c t i v i t yo f s t r a i n sp r o d u c t i o n 从上图可以得出呈一个倒钟形分布，漆酶在不同的p h 下，其表现活性不同。从 p h l 8 3 0 都表现出较高活力，在p h 3 0 达到最高活力，所以p h 3 0 为其最适反应p h 。 踮佰加钙弱的 摹)占一=u时o一：l时一。配 摹_)喜ai_譬qi瓮一幺 古林农业人学硕l ：论文狄树仡漆酶- 盎产菌株发酵及j c 酶学性质的研究 2 4 酶的热稳定性 设定温度为i o 。c 、2 0 。c 、3 0 。c 、4 0 。c 、5 0 c 、6 0 c n 定相对酶活，得出酶的热稳定性， 图2 4 ： 1 0 0 9 0 芑 8 0 鼙7 0 簧6 0 血 * 5 0 4 0 1 02 03 04 05 06 0 温度 表2 - 4 温度对漆酶稳定性的影响 7 0 f i g 2 - 4e f f e c to ft e m p e r a t u r eo ne n z y m es t