（分析化学专业论文）分子印迹及相关技术在农药三唑和腈菌唑分子识别中的应用.pdf

摘要 摘要 分子印迹技术是指一种可以合成对指定分子具有专一性识别位点的聚合物的技术。近年 来，分子印迹技术因其卓越的分子识别性能，在色谱分离，固相萃取，人工受体，酶模拟催 化剂，以及传感器等研究领域引起了广泛的关注。本文应用分子印迹技术，分别以三唑醇、 腈菌唑为印迹分子，采用本体聚合法、原位聚合法制备了不规则型、连续整体型具有特定识 别和分离性能的分子印迹聚合物，用平衡吸附实验研究了其吸附性能。并用作高效液相色谱 固定相实现了腈菌唑与类似物的分离，同时考察了分子识别过程中的影响因素。本文分为如 下三个部分： 第一章：介绍了分子印迹技术的原理、研究应用和进展状况。 第二章：采用本体聚合的方法合成了对农药三唑醇有特异性作用的分子印迹聚合物。通 过平衡吸附实验，评价了其对三唑醇的亲和力和选择性。与非印迹聚合物相比，分子印迹聚 合物对三唑醇表现了较强的亲和力：以甲基丙烯酸为功能单体，三唑醇为模板的分子印迹聚 合物，通过s c a t c h a r d 分析，结果显示，该印迹聚合物上存在两种吸附位点。用多点结合模型 计算两类不同结合位点的离解常数为k 。= 2 8 0 1 0 - 4m o t l ，k 。，= 9 7 1 x 1 0 - 3t o o l ，。底 物选择性实验表明，与其它结构相似的分子相比，该聚合物对三唑醇显示很强的结合能力。 第三章：采用原位聚合法，以腈菌唑为印迹分子，制备了具有特定识别性能的棒状分子印 迹聚合物。将所得的聚合物用作高效液相色谱的固定相，研究了对结构类似物拆分能力。结 果表明，在以甲醇：水= 6 ：4 的条件下两种结构类似物可以得到基线分离。同时考察流动相中 醋酸含量对分离的影响，论证了分子印迹聚合物选择性专一的作用机理，其作用机理是多种 作用的综合结果，除了形状识别以外，氢键作用在分子识别中起到至关重要的作用。 关键词分子印迹聚合物；高效液相色谱；结构类似物；三唑醇，腈菌唑 a b s t r a c t i i i i a b s t r a c t m o l e c u l a ri m p r i n t i n gi sat e c h n i q u et op r e p a r ep o l y m e r sw i t hr e c o g n i t i o ns i t e s h a v i n ga p r e d e t e r m i n e ds e l e c t i v i t yf o rg i v e nm o l e c u l e s m u c hm o r ea t t e n t i o nh a sb e e np a i dt ot h i st e c h n i q u e i nr e c e n ty e a r s ，m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ( m i p s ) h a v eb e e na p p l i e dt oc h r o m a t o g r a p h i c s m d o n a r yp h a s e ，a r t i f i c i a la n t i b o d i e s ，c a t a l y s t s ，s e n s o r sa n dd m ga s s a yt o o l s i nt h i st h e s i s ，a m o l e c u l a r t e m p l a t es y n t h e t i c p o l y m e r h i g h l ys e l e c t i v e f o r l r i a d i m e n o l ( m y c l o b u t a n i l ) w a s p r e p a r e d b ym o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u ef m i t ) a n dh a v eb e e nu s e da sh p l cs t a t i o n a r yp h a s e s t h e b i n d i n gc a p a c i t yw a ss t u d i e db ye q u i l i b r i u mb i n d i n gt e s t e f f e c t so fm o b i l ep h a s ec o m p o s i t i o no i l r e t e n t i o na n ds e p a r a t i o nf a c t o r w e r ei n v e s t i g a t e d t h e r ea r et h r e ec h a p t e r si nt h i st h e s i s i nc h a p t e ri ，t h ep r i n c i p l eo f m i t ，p o l y m e r i z a t i o nm e t h o d s ，a p p l i c a t i o no f t h i st e c h n i q u ea n di t s t h t u r ed e v e l o p m e n t sw e r ei n t r o d u c e d i nc h a p t e ri i ，am o l e c u l a ri m p r i n t i n gp o l y m e rp a r t i c u l a re f f e c tf o rt r i a d i m e n o lw a sp r e p a r e db y m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e i t sb i n d i n ga n ds e l e c t i v i t yt ot r i a d i m e n 0 1w e r ee v a l u a t e db yb a t c h a d s o r p t i o ne x p e r i m e n t s t r i a d i m e n o l - i m p r i n t e dp o l y m e re x h i b i t e dh i g h e ra f f i n i t yt oi r i a d i m e n o l c o m p a r e dt on o n - i m p r i n t e dp o l y m e r , , s c a t c h a r da n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h ei m p r i n t e dp o l y m e ru s i n g m e t h a c r y l i ca c i d ( m a a ) a sf u n c t i o n a l m o n o m e rc o u l df o r mt w ok i n d so fb i n d i n gs i t e sb y n o n c o v a l e n ti n t e r a c t i o n s t h em u l t i p l e - s i t e sb i n d i n gm o d e lw a su s e dt oc a l c u l a t et h em a x i m u m n u m b e ro fb i n d i n gs i t e sa n dd i s s o c i a t i o nc o n s t a n t s t h ed i s s o c i a t i o nc o n s t a n t sw e r ee s t i m a t e dt ob e 2 8 0 1 0 。4 m o l a n d9 7 1 1 0 3 m o l l t h es e l e c t i v eb i n d i n ge x p e r i m e n tf o r s u b s t r a t e s i n d i c a t e dt h a tt h ep o l y m e rg a v em u c hh i g h e ra l 五i n i t ya n ds e l e c t i v i t yf o rt r i a d i m e n o lt h a na n a l o g u e s i nc h a p t e rh i ，m y c l o b u t a n i lh a sb e e ne m p l o y e da st e m p l a t e sf o rt h ep r e p a r a t i o no fi n - s i t u m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e rr o d s f o ru s ea sl i q u i dc h r o m a t o g r a p h i cs t a t i o n a r yp h a s e s t h e p r e p a r a t i o np r o c e d u r ew a ss i m p l ea n de a s y t h er e c o g n i t i o no ft h em o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r r o dw a se v a l u a t e db yc o m p a r i n gt h er e t e n t i o nv a l u e so f m y c l o b u t a n i la n di t sa n a l o g u e s t h en l i x t u r e o ft h et w oc l o s ea n a l o g u e s m y c l o b u t a n i la n dp a c l o b u t r a z o lc a nb eb a s e l i n es e p a r a t e dw h e nt h e m o b i l es o l u t i o ni sc o m p o s e do f m e t h a n o l ：w a t e r - - 4 ：6 e f f e c t so f a c e t i ca c i dm o b i l ep h a s ec o m p o s i t i o n o i lr e t e n t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d m o l e c u l a rr e c o g n i t i o nm e c h a n i s mo fm y c l o b u t a n i l i m p r i n t e d a b s t r a c t i i i i p o l y m e rw a sp r o p o s e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a th y d r o g e n o l y s i se f f e c td o m i n a t e dr e t e n t i o n m e c h a n i s mi nn op o l a t - i t ym e d i aa sw e l la ss h a p e r e c o g n i t i o n k e y w o r d sm o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r , h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，c l o s e a n a l o g u e s ，t r i a d i m e n o l ，m y c l o b t r m n i l 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明： 所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了致谢。 作者签名：x c a _ 槐 么盗日期：塑! 年羔月日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布 论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密回。 ( 请在以上相应方格内打“”) 作者签名： 导师签名： 日期：2 受! 年鱼月日 日期：年月日 第l 章综述 1 1 引言 第1 章综述 在自然界中，分子识别在生物活性方面发挥着熏要作用，大多数生物分离技术都依赖于 分子识别作用，为了合成一种对给定分子( 目标分子) 有识别能力的聚合物，科学家们进行了各 种尝试。分子印迹的出现源于免疫学，早在二十世纪三十年代b r e i n l 和h a u r o w i t z ，而后是 m u d d 提出一种当抗原侵入时生物体产生抗体的理论，后来出p 砌i n g 做了进一步说明。它 的基本点是抗体在形成时其三维结构会尽可能的同抗原形成多重作用点，抗原作为一种模板 就会“铸造”在抗体的结合部位。后来“克隆选择”理论否定了p a l j 培的抗体形成学说， 但这种学说却为分子印迹理论奠定了基础。从p a u l i i l g 理论出发，1 9 4 9 年，d i c k e y 。成功地 将甲基橙印迹在硅胶表面上，首次提出了“分子印迹”( m o l e c u l a r i i n 啪g ) 的概念。令人 遗憾的是，在之后一段时间内很少有人问津。真到1 9 7 2 年，w u l f f 。”研究小组报道成功制各 出人工合成的有机分子印迹聚合物，分子印迹技术才逐渐为人们所关注。1 9 9 3 年瑞典m e s b a c h “报道了非共价分子印迹聚合物的合成和应用，极大地拓宽和促进了分子印迹技术的研究领 域和应用范围。之后越来越多的对分子印迹技术感兴趣的研究人员经过近十多年的共同努力， 将该项技术逐步引向成熟，并在分离提纯。、免疫分析。1 、模拟酶。j 以及生物传感器等 方面显示出应用潜力和广泛的应用前景。 分子印迹技术的核心是制各分子印迹聚合物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e d p o l y m e r s ，m 口s ) ， 分子印迹的基本过程如图1 - 1 所示：印迹分子( 又称模板分子) 同具有官能团的功能单体相 互作用在交联剂的作用下形成了具有大孔、网状的聚合物，通过溶剂洗脱或在一定条件f 水解除去印迹分子，聚合物中就形成丁与印迹分子空间匹配的具有多重作用点的空穴。当印 迹分子进入m i p s 之后，就会与这些识别位点相互作用，其结构和功能基团均和“空穴”相匹 迹分子进入m i p s 之后，就会与这些识别位点相互作用，其结构和功能基团均和“空穴”相匹 河北大学理学硕士学位论文 配；而非印迹分子则因为体积大小和功能基团不匹配而不能有效地进入“空穴”，从而对之 不具有特殊的识别作用。显然“空穴”中作用位越多，作用部分隆质和类型越广泛，则m i p s 与印迹分子之间的亲合性和选择性就越高。印迹分子及其结构类似物在m i p s 上表现出较强 器譬 圆竺簿 坟蝶、 图1 1 分子印迹过 l 不煎圈 的亲和作用，保留能力强；相反其他化合物亲和能力和保留能力均较差。这样的空穴可以与 待分离混合物中的印迹分子进行特异性的亲和作用，从而达到分离、纯化等目的。 根据印迹分子同聚合物单体官能团之间作用形式的不同，分子印迹聚合物可以分为共价 键、非共价键和半共价键三种类型。 共价键型1 v i i p s 共价键型1 v i i i 最早由w u l f f 等提出，共价键型m i p s 的合成方法又称预组装法。聚合前 印迹分子与功能单体反应，形成诸如硼酸酯、西夫碱、亚胺、缩醛等衍生物的共价键，再通 过交联剂聚合生成高分子聚合物，用水解等方法除去印迹分子即得到共价键型分子印迹聚合 物。目前已获得针对一些糖类及其衍生物m 、氨基酸及其衍生物o 、芳香酮“、铁转移蛋 白“、联辅酶“”等化合物的m i p s 。共价键型m i p s 对印迹分子的限制较大，并且共价作用 较强，形成的复合物也较稳定，在进行分子识别时选择性较好。但共价键作用强也导致了分 子识别结合速度和达到热力学平衡较慢，不适合快速分析；另外共价印迹和抽提过程复杂( 印 迹分子实际上是被单体衍生化) ，从而限制了共价型m i p s 的应用。 非共价键型i v ! l i p s 非共价型也称作自组装型( s e l f a s s e m b l i n g ) ，印迹分子和功能单体通过非共价作用( 如 氯键作用、静电引力、金属螫合、电荷转移、范德华力和疏水作用等) 形成超分子复合物， 第1 苹综述 利用自由基聚合原理形成高度交联的共聚物，然后抽提出印迹分子，当印迹分子再次进入聚 合物网络时，就会通过非共价作用与结合位点再结合。非共价法合成m i p s 操作起来比较简便， 亲和性和选择性较高，类似于抗体，可供选择的功能单体更为广泛，可以使用多种单体同时 印迹，合成方法多种多样，极大地拓宽了m i p s 的应用范围。该方法一定程度上依赖印迹分子 与功能单体是否能通过弱的相互作用形成比较稳定的复合物，比较稳定的复合体系可以使聚 合物具备较大浓度的选择性亲和识别位点，因此选择合适的功能单体与印迹分子产生较强的 相互作用是非常必要的。目前应用最多的是非共价型m i p s 。 半共价键型 、 i p s w h i t e c o m e 等o4 谰4 一乙烯基苯基碳酸酯作单体，通过共价作用同印迹分子形成复合物， 用碱水解时失去一个c q 打开共价键，在相应位置上便产生一个非共价型的分子识别位点， 该位点上的酚基可以通过氢键进行分子识别。这种方法被称为“牺牲空间法”( s a c r i f i c i a ls p a c e r m e t h o d ) 分子印迹技术。该法实际上是把分子自组装和分子预组装两种方法结合起来形成的方 法。首先印迹分子与功能单体以共价键的形式形成印迹分子的衍生物( 单体一印迹分子复合物) ， 这一步相当于分子预组织过程，然后交联、聚合，使功能基固定在聚合物链上，除去印迹分 子后，功能基留在空穴中。当印迹分子重新进入空穴中时，印迹分子与功能单体上的功能基 不是以共价键结合，而是以非共价键结合，如同分子自组装。 制备分子印迹聚合物的聚合方法和一般聚合方法一致。设计分子印迹体系时的关键是要 考虑选择与印迹分子尽可能有特异结合的单体，然后选择适当的交联剂和溶剂。_ l v u l f f “认 为一个理想的分子印迹聚合物应具备以下性质：( 1 ) 具有适当的刚性，聚合物在脱去印迹分子 后仍能保持空穴原来的形状和大小；( 2 ) 具有一定的柔性，使底物与空穴的结合能快速达到平 衡；( 3 ) 具有一定的机械稳定性、热稳定| 生，使其能在较高温度环境下使用，因为对于一般的 相互作用来说，较高的温度在动力学上更为有利；( 4 ) 亲和位点的可接近1 陛，以利提高分子识 别过程的效率。 河北火学理学硕士学位论文 1 3 2 影响分子印迹聚合物合成的因素 影响m i p s 制备的因素主要有印迹分子的性质，功能单体，交联剂，引发剂和引发条件以 及制孔剂种类等等。 印迹分子 可用于分子印迹的分子很广泛，如碳水化合物“6 。刀，氨基酸及其衍生物1 8 - 2 1 ，有机胺融出! ， 羧酸类渤3 ，甾类3 ，核酸啪3 维生素3 ，蛋白质啪1 等均已成功地用于分子印迹的制备中。 通常这些分子中都含有强极性的基团( 如羧基和氨基) ，因为强极巨基团能够和功能单体形 成更为稳定的分子复合体系，因此易于制备高效能的m d s 。由于氢键具有方向性和饱和性， 作用力较强，因此能与功能单体形成氢键、并能够产生其他协同非共价作用的印迹分子往往 能够形成具有较好选择性和亲和性的聚合物。除了选择单个印迹分子以外，还可选择两种印 迹分子进行分子印迹。 功能单体的选择 一般根据印迹分子的结构或官能团来选择功能单体。制备共价型m i p s 的功能单体较少， 主要有4 一乙烯苯硼酸、4 一乙烯苯甲醛、4 一乙烯苯胺、4 一乙烯苯酚等，其中硼酸基团与邻二醇 基团形成的酯键效果较好，易于形成和断裂，在糖类及其衍生物m i p s 的制备中有重要价值。 可供制备非共价型m i p s 的功能单体较多。以甲基丙烯酸( m 从) 为代表的羧酸类单体最常用。 其它较常用的单体如丙烯酰胺类、磺酸类、杂环弱碱类等，m a a 的羧基能与许多官能团发生 较强的分子间作用，如与羟基、醚、羧基、酰胺、脲等形成氢键以及与氨基发生离子交换作 用。从而能与许多印迹分子相结合，其印迹聚合物的高选择性和高亲和能力，可以和免疫分 析中的抗体相媲美叫。氢键是各类分子之间最普遍、最常见的非共价作用力，所以m a a 对于 在非极陛或弱极眭有机相中对各类印迹分子进行分子识别研究具有非常大的应用前景。但在 强极性有机溶剂或水中制备m i p s 时，由于强极性有机溶剂会减弱甚至破坏氢键作用，m a a 的 应用就受到了限制。因此对于不易溶于非极性溶剂或弱极陛有机溶剂中化合物寻找适合的功 能单体，使印迹分子与功能单体间以较印迹分子一极性溶剂闻氢键作用更强的氢键作用或者 使印迹分子与功能单体间以比氢键作用更强的离子作用相结合，以利于在强极f 生有机溶剂和 水中进行识别。为此郭洪声等昭”研究比较了m a a 和丙烯酰胺( a m ) 两种单体对v i i p s 性 能的影晌，发现在极性溶剂乙腈中制备的丙烯酰胺基体m i p s 明显比甲基丙烯酸基体m 母s 第1 章综述 有更高的选择结合特性。这是因为酰胺基团的介电常数和偶极距明显大于羧酸基团，在极性 溶剂中酰胺能比羧酸形成更强的氢键。迄今选择性较好的蛋白质l 、4 1 s 是由丙烯酰胺单体合 成的阻r3 3 1 。三氟甲基丙烯酸( r 孙d a a ) 由于三氟甲基有强烈的吸电子效应，单体的酸性较强， 适合于碱性化合物的分子印迹。2 - 乙烯吡啶和4 _ 乙烯吡啶都具有较强的碱性，可以与印迹分 子的羧基产生较强烈的离子作用。使用时也可以将不同类型的功能单体混合使用，如m a a 与2 一乙烯基吡啶。使用混合单体时，印迹分子与单体间形成复合物作用力的种类和数量增加， 所以m 璎s 的选择性可能比仅一种单体生成的m p s 更高，这些具有较强酸性或碱眭的功能单 体依靠与印迹分子之间形成的强的离子作用将在极陛有机相中分子识别、水相中药物识别、 生物识别研究领域发挥作用。所以选择合适的功能单体非常重要。 交联剂的选择 交联剂是制备m p s 的一个重要因素。交联剂的类型及用量直接影响单位质量m i p s 中可 交联的功能单体的数目和交联度，而单位质量m 疋s 中可交换的功能单体的数目和交联度又 直接影响m 疆s 的选择性和结合容量。预聚溶液中交联剂的溶解性减少了对交联剂的选择。 起初人们用二乙烯基苯作为交联剂，但后来发现丙烯酸类交联剂能制备出更高特异性的聚合 物。王进防等人采用2 - 乙烯基吡啶+ 丙烯酰胺复合功能单体，以三甲氧基丙烷三甲基丙烯 酸酯为三元交联剂制备了苯甲氧羰基一l 一色氨酸印迹手性固定相，并与二元交联剂印迹相同氨 基酸衍生物的情况进行了对比，发现三元交联剂在较小的用量下就可使分子印迹聚合物达到 足够的交联度，实现印迹分子对映体的基线分离。从而提高单位质量m s 中可结合的位点 数目，可以使m p s 有更高的柱容量、分离度和选择性。 溶剂的选择 溶剂在分子印迹制各中发挥着重要作用，这种作用在自组装体系中尤为重要。聚合时溶 剂控制非共价键结合的强度，同时也影响聚合物的形态。在极性溶剂中，印迹分子主要靠疏 水作用与功能单体结合；在非极性溶剂中则主要靠氢键等作用与功能单体结合。一般情况下， 极性强的溶剂会降低印迹分子与功能单体间的结合，尤其是干扰氢键的形成，生成的m i p s 识别性能较差，故应尽可能采用介电常数低的溶剂，如甲苯、氯仿、二氯甲烷等。但是也有 人采用甲醇、水等高极 生溶剂合成了m i p s ，此时印迹分子与功能单体主要依靠疏水作用结合。 另外，聚合物的形态也受溶剂的影响。溶剂使聚合物溶胀，从而导致结合部位三维结构的变 化，引起弱的结合。通常进行识别或分离时用的溶剂最好与聚合用溶剂相一致，以避免产生 溶胀问题。 c 洞北大学理学硕士学位论文 引发剂与引发方式 聚合反应常用的引发剂为偶氮二异丁腈( a i b n ) 或偶氮二( 2 ，4 - 二甲基) 戊腈( a b d v ) ，可 在加热或u v 照射下引发。加热引发通常在引发剂的分解温度附近，如用a i b n 通常选择5 5 6 ( ) ，以便使引发剂分级产生自由基进一步引发聚合反应。在较低温度下聚合能够使印迹分 子一功能单体复合物稳定性增加，有益于改善h i p s 的选择性。低温适于制备热不稳定的印迹 分子的h i p s 。为消除空气( 氧气) 对反应的影响，聚合反应引发前需对反应液进行超声处理并 向反应容器充氮气。此外还可以采用y 射线辐射引发的方法，因为谢线辐射引发的聚合速率受 聚合温度的影响不大。 1 3 3h i p s 的聚合方法 h i p s 的制各方法日趋多样化，近年来m p s 的制备有了很大发展，已经有无定形粉末、 整体柱、球和膜等多种形态。采用的聚合方法包括本体聚合、原位聚合、乳液聚合、沉淀聚 合、悬浮聚合、表面印迹法、多步溶胀与两步溶胀法等制备技术。 本体聚合法是将反应体系置于安培瓶中，充氮气抽真空后用热引发或光引发手段来得到 块状的印迹聚合物，经过研磨、筛选、漂洗等处理得到适合分析的一定粒度范围的无定形 m i p s 颗粒。制备方法简单，重现性好，因而是目前普遍采用的方法。但通常存在以下缺点： 后处理过程繁杂，研磨过程中会不可避免地产生一些不规则粒子和相当大量的过细粒子，这 些过细粒子需经过沉降除去，因而费时费力，使产量大大降低，印迹点在合成过程中被包埋 在聚合物内部，使得其利用率低，表现为低的吸附量。 原位聚合针对本体聚合的缺点，m a t s u i 等人采用原位聚合1 3 删的方法。将合适比例的印 迹分子、功能单体、交联剂、引发剂和制孔剂充分混合作用后，在不锈钢色谱柱管中直接进 行聚合得到连续棒状的m p s 分离介质。此法得到的m i p s 省去了研磨筛选等复杂操作，并且 可以获得较好的柱体结构，在连续整体的m 口s 柱体内，分布着一些输运流动相和溶质的大 孔结构，这样可以有助于降低柱压降。同时由于孔径分布较为均匀，比表面相应增大，可用 于识别的位点数量较多分布较均匀，有利于改善分子识别过程中的选择性，在色谱分离过程 中也可以提高柱效。这项技术同样也被应用在毛细管电泳中4 3 1 。但是整体柱分子印迹固定 相对小分子物质的分离效率低，在h p l c 中的使用寿命不够长，有必要对此制备方法进行进 一步的研究以适应实际应用的需求。制备微球形1 v i p s 的方法主要有两种：一种是在悬浮分 散体系中，通过交联剂和印迹分子一单体复合体系本身形成聚合物微球”“，按照溶剂( 致 6 第1 章综述 孔剂) 、分散剂( 表面活性剂) 、稳定剂等聚合条件和聚合方法的不同又可以分为乳液悬浮 聚合法，分散聚合法，种子溶胀聚合法和沉淀聚合法等。不同方法在制备不同性质印迹分子 和不同粒径的m i p s 方面各有优势，在实际工作中上述方法并没有严格的划分出界限。另一 种是在硅胶或三氧化二铝等微球形介质表面印迹形成微球o “在硅胶颗粒表面印迹，其机理类 似于键合，此法得到的m i p s 微球接近于h p l c 色谱固定相，因而近来得到许多学者的关注。 分子印迹聚合物膜可以用作分离材料或化学传感器的基本材料，因而在实际中有很广阔 的应用前景。k o b a y a s h i “7 1 等以茶碱为印迹分子用相转变法合成了聚丙烯腈一丙烯酸超滤膜。 将丙烯睛一丙烯酸共聚物溶于二甲亚砜中，加入茶碱于5 0 过夜。然后将此聚合物溶液涂覆 于玻璃平板上，浸入水中聚合物凝结成膜。渗透实验表明茶碱对印迹膜有很强的键合能力。 分子印迹聚合物膜洗脱干燥后可直接使用，但这类聚合物膜由于交联度较高，易折碎，影响 了这类聚合物膜的实际应用。 1 3 。4 分子印迹聚合物的表征 m i p s 性质的表征到目前还没有一个统一的理论描述，主要原因是因为m i p s 的应用范围 很广泛，在不同的应用领域，可以有不同的表征方法。例如在色谱固定相、手性分离和【置l 相 萃取应用中，一般用分离因子a 、分离度r s 、保留时间t 。、结合常数k a 、离解常数瞄、富集 系数等来表征m i p s 的选择性的好坏；而在化学传感器的应用中，则需要借用各种电化学参数 如电流、电容、电导、电压以及各种光学参数和质量参数如光强度和质量等来表征。在催化 应用领域则以催化效率、反应速度、结合量等参数来描述i l p s 的催化活性。对分子印迹聚合 物的结构表征，仍沿用对传统聚合物的表征方法，如通过b e t 法和压汞法进行比表面积测定、 孔容测定、以及孔径大小及其分布测定。对分子印迹聚合物的化学成分分析，仍沿用对传统 有机化合物特别是高分子聚合物的分析方法，如元素分析、重量分析、热分析、核磁共振光 谱、红外光谱、荧光探针等。 1 4 吸附等温线和结合位点分布 吸附等温线可以为小分子配体与受体之间的结合能、结合方式、位点分布方面提供重要 的信息”1 ，在i v i p s 中，可溶性的配体与固体吸附位点相互作用，其吸附等温线由平衡时被吸 附的浓度对自由配体浓度作图得到，吸附等温线可以用不同的模型拟合，最简单的是理想的 l a n g l n u i r 吸附等温线模型( 1 ) ，该模型假设吸附剂只有一种吸附位点，被吸附物质之间的相 7 河北大学理学硕士学位论文 互作用可以忽略： c 9 2 t 矗万 口，c口，c 孽3 可盖寻+ 赢 犯j g = a c l 4t aa n d 月= n u m e r i c a lp a r a m e t e r s )闭 翌- 上几垦 【cl k “k 。 ( 4 ) 式中，a 和1 3 为数值常数参量，q 为饱和容量( 吸附位点密度) ，b 为吸附能。 此外( 2 ) 式是b i l a n g m u i r 吸附等温线模型，假定吸附剂表面是不均一的，且具备两种结合位 点；( 3 ) 式是f r e u n d l i c h 等温线模型假定没有饱和吸附容量，但具有不同结合能的结合位点平 均分布；( 4 ) 式是s c a t c h a r d 分析方程用于静态平衡吸附测定，可判断有几类结合位点，并计 算平衡离解常数和饱和吸附量。在m p s 中，根据不同的功能单体，不同的溶质浓度，可以 选择不同的等温线模型拟合。驯。 测定溶质与分子印迹聚合物之间相互作用的吸附等温线常采用静态吸附法“”和前流分析 法”。本文采用静态吸附法考察了三唑醇m i p s 的吸附等温线，并用s c a t c h a r d 分析法讨论 了其吸附特性。 1 5 分子烙印技术的应用与展望 1 5 1 在色谱分析中的应用 分子印迹聚合物用于色谱分析主要有以下两方面的工作：样品前处理( 分离、提纯、浓 缩) 和手性物质的分离。m i p s 广泛的研究领域之一是利用它的特异识别性去分离混合物。近 年来，无论是小分子。( 如氨基酸、药品和碳氢化合物) ，还是大分子( p n 蛋白质) 已经被用 在各种印迹技术中，并且将制备的介质用在h p l c 、t l c 和c e 分离中。样品前处理分子印迹聚 合物作为吸附剂，真正用于试样的前处理是s e l l e r g r e n 6 3 ”于1 9 9 4 年首先报道的以他合成的 五咪( p e n t a m i d i n ，一种抗原虫菌药) 为印迹的印述聚合物，该聚合物作为吸附剂完成了对 r 第1 章综述 生物液体试样尿中五咪的提取、纯化和浓缩，使之达到能够直接检出的浓度。最近z a n d e r 等人报道了他们的最新工作，他们以尼古丁作为印迹制备的分子印迹聚合物，在分析口香糖 中所含的尼古丁及尼古丁氧化物时得到了非常高的回收率和良好的重现性。他们制备的聚合 物在选择性上明显优于传统的c i s 吸附剂和没有印迹反应的同种聚合物。用于手性拆分，近 来分子印迹手| 生拆分工作发展迅速。目前市场上大约有5 0 0 多种旋光性药品，而9 0 被作为 外消旋混合物管理，而手性混合物是一种旋光性药品，往往具有毒副作用。正是基于这一事 实，这些年来，一些国家食品和药物管理局对新的手性药品提出了要求，对映体必须被分离 和分别管理，并进行各自的毒理和药理实验，这就要求提高分离技术。分子印迹能满足这一 技术要求，k e m p e 8 1 等以( s ) 一萘普生为印迹分子制各分子印迹聚合物用于萘普生消旋混合物 的拆分，得到了很好的效果，分离度为o 8 3 。其拆分方法己不仅限于h p l c ，所研究的拆分对 象包括药物、氨基酸及其衍生物、肽及有机酸等。 1 5 2 抗僻：和受体模拟物 印迹聚合物被研究的另一个应用领域是它作为抗体和受体模拟物的适用性。研究发现， m i p s 具有类似于抗体或受体的高度特异识别性，因此可被用来代替抗体而用于免疫测定中。 许多分子印迹聚合物的吸附实验都是基于竞争胜放射配体结合这一原理的。如以茶碱和镇静 剂为印迹的印迹聚合物显示了惊人的专一性识别能力。当这些印迹聚合物被用于竞争性实 验时，对于结构相近的物质的结合能力或者完全没有，或者远低于与印迹分子的结合能力。 抗茶碱印迹聚合物完全能够区分印迹分子和结构上非常相似的咖啡因。而茶碱和咖啡因化学 结构上只有一个甲基的区别，用一般的方法是很难把两者区分开的。更隙入的是这些分子印 迹聚合物与这些药物的单克隆抗体的交叉反应几乎是相同的。抗茶碱分子印迹聚合物用于检 测病人血浆样品中茶碱的含量是完全符合医学检测要求的。这证明印迹聚合物抗体和受体完 全可以作为生物抗体的理想替代品和有益的补充。 1 5 3 固相萃取 s e ll e r g r e n 首次报道了将分子印迹聚合物用于固相萃取，近年来，相继又有一些报道出 现，这种方法可用于医药、食品和环境分析样品的制备。通常样品的制备都包括溶剂萃取， 由于分子印迹的出现，可以用固相萃取替代，并且可利用分子印迹聚合物选择性富集目标分 析物。由于印迹聚合物既可在有机溶剂中使用，又可在水溶液中使用，故与其他萃取过程相 比，具有独特的优点。将印迹聚合物应用于固相萃取的报道较多，主要化合物有2 一氨基吡 9 洞北大学理学硕士学位论文 啶、s 一萘普生、苯达松、尼古丁、三嗪类等。 1 5 4 用作生物传圈禹海醮鞫才料 化学或生物传感器，都是由识别元件和与其紧密接触的转换器组成的，它将对分析物产 生的应答信号转变成输出信号。关于环境检测、生物医疗、食品分析等的传感器都是将生物 分子( 如酶、抗体) 作为其特异识另元件。由于生物分子物理化学稳定性差，这导致了人造 受体得到了广泛重视。分子印迹聚合物用作传感器的敏感材料是分子印迹技术的一个重要研 究方向。分子印迹聚合物敏感材料与近年来研究较热的生物敏感材料相比，具有耐高温、高 压、酸、碱和有机溶剂，不易被生物降解破坏，可多次重复使用，易于保存等优点。而且， 较生物材料易得，可以用标准的化学方法合成出来。因此，分子印迹聚合物有希望成为取代 生物材料的理想替代品。 1 5 5 展望 由于m i p s 具有高稳定性和强选择性，它在许多领域中皆表现不凡，但这并不表明m l p s 的研究已经相当深入，自1 9 7 2 年w u l f f 等人首次报道了人工合成的m 啤s 以来，在短短3 0 年中，m i t 得到了飞速的发展，然而也产生了许多新的问题。 首先，多数的m i p s 主要在非极陛介质中制备，并且在水溶液中的使用受到了很大的限制， 因此利用特殊的分子间作用力，如金属配位键等，在强极性溶剂中制备m i p s 还需要进一步研 究。印迹聚合物的“印迹”容量低。因为一些结合位常被埋藏在聚合物的三维结构中而不能 被利用。 其次在m i p s 作高校液相色谱固定相的研究中如何提高柱效是迫切需要解决的问题，因此 新兴的制柱技术的研究也可作为m i p s 固定相发展的方向，i i p s 与c e c 技术的结合还处于刚 起步阶段，在这方面还大有潜力可挖。 由于常用制备m i p s 的单体种类有限，目前大多数功能单体只适用于小分子物质，所以模 拟生物体中非共价键多种作用，设计合成新型功能性单体也是m i p s 技术发展的保障，发展新 的i v i p s 聚合方法，如电聚合、用结构上与印迹分子相似的物质制备m i p s 、分层次分子烙印、 m t p s 纳米颗粒的制备、水溶性m p s 的设计合成及 m i p $ 的计算机辅助设计等。 随着分子印迹技术研究的不断深入和应用领域的不断扩展，人们越来越清楚的看到分子 印迹技术具有广阔的应用前景和深刻的理论意义，也必将吸引越来越多的研究者从事这方面 的工作。 1 0 第2 章三唑醇分子印迹聚合物的吸附特性 第2 章三唑醇分子印迹聚合物的吸附特性 2 1 引言 分子印迹是近几十年来迅速发展起来的一种制备对特定目标分子具有高的选择性聚合物 的技术。3 。该技术对印迹分子表现特异的选择性和识别能力，因其良好的专一陛，在药物脚”、 环境”1 以及分离富集。”和检测等方面得到了很好的应用。三唑醇是一种广泛使用的广谱杀 虫药物，广泛应用于种子病菌的防治，但使用中也存在农药残留问题，因此控制并检测其在 食品中的含量，对达到最佳的防治效果及最小的毒副作用有非常重要的意义。本文以三唑醇 为印迹分子，氯仿为溶剂，以甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，合 成了对三唑醇具有类似于酶或受体结合部位特征的具有特效选择性吸附的一种新型分子印迹 聚合物。结果表明，与同样化学组成的非印迹聚合物相比，三唑醇分子印迹聚合物对农药三 唑醇有很高的选择吸附能力。并用平衡吸附方法研究了印迹聚合物对其印迹分子的吸附性能 及其对类似物质的选择陛。 2 2 实验部分 2 。2 1 蔼：剂与仪器 三唑醇( y r i a d i m e n o l ，t f i ) 多效唑( p a c l o b u t r a z o , p a c ) 1 比虫啉( i m s d a c l o p r i c k i m i ) 购自江苏 盐城黄隆实业有限公司；偶氮二异丁腈( 删) 购自上海天莲精细化工有限公司，使用前纯 化：甲基丙烯酸( m a a ) 购白天津市化学试剂六厂；乙二醇二甲基丙烯酸酯( e d m a ) 为 a c r o s 公司( 北京百灵威公司进口) 产品；甲醇、乙腈购自天津康科德公司；醋酸购自天津 化学试剂三厂；三次蒸馏水。所用试剂除甲醇、乙腈是色谱纯外，其它均为分析纯。 b e c k m a n 液相色谱系统( 1 1 2 高压泵) ；紫外可调检测器( k r a t o s s p e c t r o f l o w7 8 3 ) ；i - 1 w - 2 0 0 0 色谱工作站( 南京千谱软件有限公司) ：超声波发生器 ( c s f i a 上海超声波仪器厂) ；恒温水浴箱( g a l e nk a m p 英国) 。 2 2 2 分子印迹聚合物的制备 三唑醇分子印迹聚合物( p ( t r i ) ) 的合成 1 l 洞北大学理学硕士学位论文 称取印迹分子三唑醇l m m o l 于2 5 0 m l 圆底烧瓶中，加入氯仿1 5 m l 使之溶解、再加入姒a 6 m m o l ，于超声波中超声1 h 以使三唑醇与m a a 充分作用。然后再加入e d m a3 0 m m o l 和0 0 6 4 6g m b n ，超声o 5h ，充分混溶后，通池脱氧1 5r a i n ，真空状态下密封，将其放入5 5 的恒温 水浴中反应2 4 小时后取出，制得块状聚合物。将获得的块状聚合物研碎，过2 0 0 目筛后得到 的颗粒用三蒸水漂洗，倾析法除去悬浮的微细粒子，然后用1 0 醋酸水溶液洗至无印迹分子， 最后用三蒸蒸馏水洗涤除去残留的乙酸，将颗粒放入真空干燥箱中烘干即得所用的印迹聚合 物( p ( t r i ) ) 。 非印迹聚合物( p ( b ) ) 的合成 除不加印迹分子三唑醇外，其余与上述制备方法相同，得空白印迹聚合物( p ( b ) ) 。 2 2 3 印迹聚合物平衡吸附实验 操作条件所用色谱柱为自装c1 8 柱( 4 6 i i n x1 5 0 m ) ：以甲醇为流动相，流速l u l l m i n ， 进样量1 0 p l ，检测波长2 5 4 n m ，温度为室温。 标准溶液的配制准确称取三唑醇0 0 0 3 7 9 于2 5 m l 容量瓶中，用乙腈溶解定容，摇匀并 稀释成一定浓度梯度( 浓度分别为：0 2 5 、0 j 、1 、1 _ 5 、2 、2 5 、3 f f i l o l l ) 。在上 述操作条件下，用 舻l c 测定。待仪器基线稳定后，连续注入数针标样溶液，待相邻两针三唑 醇的峰面积变化小于1 0 9 6 后，进行职l c 分析。以标样的峰面积对标样的浓度进行线性回归， 得回归方程。 平衡吸附实验称取一定量的粒状三唑醇印迹聚合物p ( t r i ) ( 3 0 0 r a g ) 1 0 份，蚤于1 0 m l 磨口锥形瓶中，加入3 0 m l 不同浓度的三唑醇乙腈溶液( o 一5