（茶学专业论文）茶红素分离制备及清除自由基活性的初步研究.pdf

摘要 茶红素是一类复杂的红褐色的不均一性酚性化合物的混合物，相对分子量在 7 0 0 - - 4 0 0 0 0 之间，主体成分为儿茶索类的聚合体。茶红素具有异质性，其单体 很难分离纯化，它的结构、组成及性质也都不甚清晰。目前，有关茶红素的制各 报道也较少，主要是有机溶剂提取法和色谱分离法。近六十年来，茶红素化学的 研究一直是国际上茶叶界关注的焦点之一，但茶红素的开发利用至今为止未能取 得突破性的进展。 本文首先采用超声浸提、有机溶剂分级萃取、乙醚沉淀从祁门红茶中分级 制各了五种不同极性的茶红素部分p b p 1 p b p 一5 。经h p l c 检测，五个部分均 无儿茶素、咖啡碱、茶黄素的残留，纯度较高。其次对五种不同极性的茶红素部 分的还原力以及清除自由基能力进行测定，结果表明p b p 1 p b p 一5 均有还原力。 在1 3 2 1 5 0 肛1 1 1 l 范围内，随着浓度的升高，p b p l p b p 一5 的还原力逐渐上升。 随着茶红素极性的增加，其还原力逐渐降低；在f e n t o n 体系中，p b p 1 p b p 5 在1 3 _ 2 1 0 0 “g m l 范围内，随着浓度的升高，其清除- o h 能力逐渐上升，并且随 着茶红素极性的增加，其清除能力逐渐减弱；在邻苯三酚自氧化体系中，p b p 1 p b p 5 在1 3 2 l o o p g m l 范围内，对0 2 的最高抑制率为4 8 2 2 ，抑制率主要 分布在1 0 2 5 之间；在d p p h 体系中p b p 一1 p b p 一5 在1 3 2 1 0 0 g m l 范围 内，随着浓度的升高，其清除d p p h 自由基能力逐渐增强，并且随着茶红素极性 的增加，其清除能力逐渐减弱。所有这些结果表明，茶红素与其主要前体物质儿 茶素和茶黄素相似，仍具有一定的自由基清除能力。这可能与其结构中仍然保留 了一些活性酚羟基和苯骈卓酚酮结构有关。本研究结果为茶红素这类红茶中 含量最丰富的多酚类物质的生物学活性研究以及其开发利用提供了前期理论基 础。 关键词：茶红索分级分离自由基 a b s t r a c t t h e a r u b i g i n sa r eh e t e r o g e n e o u sa c i d i cp h e n o l i cp i g m e n t si nb l a c kt e a , w h i c ha r e m a i n l yf l a v a n o lp o l y m e r sw i t ham o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o no f7 0 0 4 0 0 0 0a n d c o n t r i b u t et ot h ec o l o ra n dt a s t eo fb l a c kt e a b e c a u s eo ft h e i rh e t e r o g e n e i t y ， t h e a r u b i g i n sa r ed i f f i c u l tt ob ep u r i f i e df r o mb l a c kt e a ，w h i c hl e a dt ot h el i m i t e d i n f o r m a t i o no nt h e i rs t r u c t u r e ，c o m p o s i t i o na n dc h a r a c t e r i s t i c s b yf a r , t h e r ea r eaf e w r e p o r t so nt h e i rp r e p a r a t i o n ，w h i c ho n l y f o c u s e do nt h es o l v e n te x t r a c t i o na n d c h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o n i nt h ep a s ts i x t yy e a r s ，t h e a r u b i g i n sh a v ei n t r i g u e dm a n y r e s e a r c hg r o u p st oe x p l o r e ，b u tt h e r es t i l lh a v en ob r e a k t h r o u g ho nt h e i rc h a r a c t e r i s t i c i nt h i s p a p e r , f i v et h e a r u b i g i nf r a c t i o n sn a m e da f t e r p b p - 1 t op b p - 5w e r e p r e p a r e df r o mk e e m t mb l a c kt e aw i t hs o l v e n te x t r a c t i o na n de t h y le t h e rp r e c i p i t a t i o n a l lo f t h e mw e r ef r e eo f c a t e c h i n s ，t h e a f l a v i n sa n dc a f f e i n eb yt h ea n a l y s i so f h p l c i nt h er e d u c i n gp o w e rt e s t s ，t h ef i v et h e a r u b i g i nf r a c t i o n sa tt h ec o n c e n t r a t i o no f 1 3 2 - 1 5 0 1 t g m lh a db e e ns h o w nt o h a v ear e d u c i n gp o w e ri nad o s e d e p e n d e n t m a n n e r w i t ht h ep o l a r i t yi n c r e a s eo ft h e a r u b i g i nf r a c t i o n s ，t h er e d u c i n gp o w e rw a s t e n dt od e c r e a s e i nt h ef e n t o ns y s t e m ，t h es c a v e n g i n ga c t i v i t i e so ff i v et h e a r u b i g i n f r a c t i o n st oh y d r o x y lr a d i c a l sw e r er a i s e d 、i t ht h ei n c r e a s eo ft h e i rc o n c e n t r a t i o n f r o m1 3 2 9 9 m lt o1 5 0 p g m 1 w i t ht h ep o l a r i t yi n c r e a s eo ft h e a r u b i g i nf r a c t i o n s ， t h e i rs c a v e n g i n gc a p a c i t yw a sd e c r e a s e d i nt h ep y r o g a l l o la u t o o x i d a t i o ns y s t e m ， f i v ef r a c t i o n sa tt h ec o n c e n t r a t i o no f1 3 ，2 1 5 0 9 9 m lh a das l i g h ti n h i b i t i o no ft h e f o r m a t i o no fs u p e r o x i d ea n i o nw i t ht h em a x i m a li n h i b i t i o na s4 8 2 2 t h e i n h i b i t i o np e r c e n t a g ew a sm a i n l yr a n g e df r o m1 0 t o2 5 i nt h ed p p hs y s t e m ，a l l o ff r a c t i o n sa t1 3 2 - 1 0 0 i t t g m le x e c u t e ds c a v e n g i n ga c t i v i t i e si nad o s e - r e s p o n s ew a y a ss i m i l a ra st h ep e r f o r m a n c ei nt h ef e n t o ns y s t e m m o r e o v e r , t h e i rs c a v e n g i n g a c t i v i t i e st od p p hr a d i c a l sw e r ed e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo ft h ep o l a r i t y t h o s e r e s u l t sh a v es h o w nt h a tt h e a r u b i g i n sa sl i k ea st h e i rm a j o rp r e c u r s o r s c a t e c h i n sa n d t h e a n a v i n sa r ec a p a b l et oe l i m i n a t ef r e er a d i c a l s ，w h i c hm a i n l yd u et o t h e c o n t r i b u t i o no ft h er e s i d u eo ft h ea c t i v ep h e n o l i ch y d r o x y lg r o u p sa n d b e n z o t r o p o l o n eg r o u p sa tt h et h e a r u b i g i nm o l e c u l e t h e a r u b i g i n s t h em o s ta b u n d a n t p o l y p h e n o l i cs u b s t a n c e si nb l a c kt e am a yh a v eap o t e n t i a lt oe x e c u t eb i o l o g i c a l e f f e c t sa f t e rt e ad r i n k i n g k e y w o r d s ：t h e a r u b i g i n s f r a c t i o n a t i o n f r e er a d i c a l s i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 j 佗、 研究生签名：苎l _ 二七 时间： 工。r 7 年，月工z 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 圣笙 时间： 2 。7 年月幻日 第一导师签名：时间： 口 年b 肿百 引言 1 文献综述 茶叶起源子我国，我国是最早发现、栽培、秘甩茶的国家。茶现已成为继承之后 的世界上消费量最大的饮料之一。茶叶是由茶树( c a m e l l i as i n e n s i sl ( o ) k t m t z ) 的 叶子加工而成，按照茶鲜时发酵程度与加工工艺的不同。将茶计分为绿茶、黄茶、黑 茶、自茶、青茶和红茶六大茶类。绿茶为不发酵茶、乌龙茶为半发酵茶，而红茶则为 全发酵茶t 1 一。在红茶加工过程中，茶鲜叶中的儿茶素类等多酚类物质在内源酶多酚 氧化酶和过氧化物酶的催化作用下，发生氧化缩聚反应，而形成有色的色素类物质， 茶黄素( t h e a t l a v i n s ，1 1 f s ) 和茶红素( t h e a r u b i g i n s , t r s ) ，这些色素物质统称为茶色 素( t e ap i 班n e n t s ) 【3 1 。 茶鲜叶中含有丰富的多酚类物质，主要包括儿茶素、黄醌及黄酮醇类、花青素 和花白素类、酚酸和缩酚酸等四大类物质。多酚占茶叶干物质总量的2 0 3 5 。而 在茶多酚总量中。儿茶素类约占7 0 8 0 ( 结构如图l 所示) 。儿茶素主要包括表 没食子儿茶素没食子酸酯( e g c g ) 、表儿茶素没食子酸酯( e c g ) 、没食子儿茶素( g c ) 、 表没食子儿茶素( e g c ) 、表儿茶素( e c ) 、儿茶素( + c ) 等，其中又以e g c g 和e c g 为主唧。 r - - r zr f l o 心r 2 州 3 r i h 。8 产驴i 口y i r o h 心叩i i o o l 妇l e c h i n e l 内a l l e e a t e e h l n 一曲c 扣h g 硼l i b 卅，i a a i i b 曲砸p l l l c a w 矗嗍l 目l h l c h h o r i o h p l l o e m e e h l n 田i 茶叶中主要儿篆素结构 f i g 1 鼬u 咖mo f m a j o rc n t e c b f n si nt a t 炷：酬1 0 ，且没予醺基l 印i 酬。d i 瞅表儿茶曩i 喇扣i h 蛐h 岫= e o c ，表投t 子儿茶素；印i 臼蛐缸拳i 咿e o 。- 衰儿著蠢波 子麓醣i 印i 删i 咖d l i n 删i 吐产卿衰没食子儿蔫囊衰没t 于酸醇id 鼬h i 心儿茶素i 删l o c 啦蜘o c 投于儿蓑蠢 侧电 一 仑 茶黄素类是一类具有苯骈卓酚酮结构的混合物，主要由儿茶素类和没食子儿茶素 类配对氧化缩聚合成。在红茶中主要由四种茶黄素类物质组成。即茶黄素、茶黄素3 单没食子酸酯、茶黄素3 单没食子酸酯、茶黄素3 ，3 双没食子酸酯，其结构如图l 。 在中国红茶中，茶黄索类的含量一般为o 3 1 5 ，高的可达1 7 ，它们是红茶茶汤 的主要黄色色素，滋味辛辣，具有强烈的收敛性，是红茶重要的滋味因子之一【4 】。 h h o 爨_ o 代o o h 。hk 互天h r l = r 产h茶黄素 ( t h e a t l a v i n ，t f i ) r i 娟脚畸i茶黄素3 - 单没食子酸醣 ( t h e a t l a v i n - 3 - g a l l a t 岛t f - 3 - g ) r l - hr ，g茶黄素- 3 - 单没食子酸醣 m 砌m n - 3 g 啦i 峨t f - 3 - o ) r l = r f 吣 茶黄素3 3 双没食子酸酯 ( t h e a f l a v i n - 3 ，3 - d i g a l l a t e , 1 1 = d g ) o = 没食子酰基 圉2 幕黄嚣类的基本结构圈 f i g 2m a j o rt h e a t l a v | u si nb l a c k t “ 茶红素在红茶中的含量在9 1 9 。其具有较强的刺激性和收敛性，但与茶黄素 类相比其刺激性和收敛性较弱。它与茶黄素类物质一起，成为红茶汤滋味和色泽的主 体【3 1 。有关茶红素的结构、组成及性质都不甚清晰。 现代药理学研究表明，茶多酚( 其主体成分为儿茶素，约占其总量的8 0 左右) 具有明显的抗衰老、抗高血压、保护心血管、防癌抗癌、降血脂、抗菌杀菌、抗过敏、 甚至有防治爱滋病的功效。不仅如此，儿茶素的氧化产物茶黄素，由于仍保留了大量 的活性羟基，并增加了苯骈卓酚酮和羧基等活性基因，也具有较强的抗氧化和清除自 由基作用，甚至在某些方面的药理功效比儿茶索还要高。而茶黄素与茶红素的混合物 茶色素也具有很好的药理学功能，现已被用于防治心脑血管疾病、动脉粥样硬化、降 血脂、降血压等的药物原料。它们对动脉粥样硬化等心血管疾病、高血压、龋齿等都 有一定的防治效果，甚至对爱滋病病毒逆转录酶和多种d n a 聚合酶有特异性抑制作 用1 4 】。但迄今为止，大量的茶色素研究主要集中茶黄素上。由于茶红素的异质性，其 组分与结构十分复杂至今还未能分离出单体，其结构、组成及性质都不甚清晰。现对 已有的研究结果综述如下。 1 1 茶红素的理化特性 在茶叶加工过程中，会形成多种色素物质，其对构成茶叶品质特点及不同茶类的 形成具有重要作用。在红茶的加工过程中，正是由于多酚类物质氧化形成了茶黄素和 茶红素等色素，使红茶具有了红汤红叶的品质特征。 2 茶红素类是一类复杂的不均一性红褐色酚性化合物，包括多种相对分子质量差异 极大的异源物质，其相对分子质量为7 0 0 , , - - 4 0 0 0 0 ，甚至更大些。茶红素主要由儿茶素 类氧化缩聚而成，主体成分为儿茶素类的聚合体，前导物除几茶素类外，还有原花色 素、花青素、酚酸、黄酮醇及其苷，甚至有核酸、多糖、蛋白质，氨基酸等物质。它 既包括有儿茶素酶促氧化聚合、缩合反应产物，也有儿茶素氧化产物与多糖、蛋白质、 核酸和原花色素等产生非酶促反应的产物【4 ，一。 茶红素色泽棕红，能溶于水，水溶液呈酸性，深红色，刺激性较弱，是构成红茶 汤色的主体物质，对茶汤滋味与汤色浓度起极重要的作用，还参与“冷后浑”的形成。 此外，其还能与碱性蛋白质结合生成沉淀物存于叶底，从而影响红茶的叶底色泽。 根据溶解性质和色谱性质，茶红素被分为相应的几大类。r o b e r t s ( 1 9 5 7 , - - 1 9 6 2 ) 按 照在不同溶剂中的溶解度把茶红素分为三类：茶红素si ( 溶于乙酸乙酯) 、sia ( 即 溶于水又溶于乙醚) 和s l l ( 溶于水) t 7 s l 。b a i l e y 等( 1 9 9 1 ) 侈l 根据茶红紊在反向 高效液相色谱法的色谱学行为将其分成三类：第一类为不被柱吸附的部分；第二类为 可溶性部分，检测时会出现可辨析峰；第三类为不可溶部分，检测时出现 h u m p 型 不可辨析峰。 1 2 茶红素与红茶品质 在茶叶色素中，有的是鲜叶中已经存在的，称为茶叶中的天然色素，如叶绿素和 胡萝i - 素；有的则是在加工过程中由一些物质经氧化缩合而形成的，如茶红素和茶黄 素。根据其溶解性，茶叶色素通常分为脂溶性色素和水溶性色素两类，脂溶性色素主 要对茶叶干茶色泽及叶底色泽起作用，而水溶性色素主要对茶汤有影响删。与茶鲜叶 中存在的天然脂溶性色素叶绿素和胡萝卜素不同的是，红茶中的茶色素则为一类水溶 性色素，主要由茶红素和茶黄素组成。它们是构成红茶外形色泽、汤色及叶底色泽的 成分，其含量及变化对茶叶品质起着至关重要的作用例。 茶黄素是红茶中的重要成分，对红茶的色、香、味及品质起着决定性的作用。是 红茶汤色“亮”的主要成分，也是汤味强度和鲜爽度的重要成分，同时还是形成茶汤 “金圈”的最主要物质。 茶红素是红茶中含量最多的多酚类氧化产物，占红茶干物总量的9 0 o 1 9 ，约占 红茶中多酚类物质的7 5 左右。茶红素色泽棕红，能溶于水，极性较茶黄素强，水溶 液呈酸性，深红色，刺激性较弱，是红茶汤色“红”的主要成分，也是茶汤浓度和强 度的重要物质，对茶汤滋味与汤色浓度起极其重要的作用。参与“冷后浑”的形成。 此外，其还能与碱性蛋白质结合生成沉淀物存于叶底，从而影响红茶的叶底色泽纠。 红茶品质要求汤色红艳明亮，滋味浓、强、鲜爽，带“金豳”。通常认为茶红素 含量太高有损品质，使滋味淡薄，汤色变暗，而含量太低，茶汤红浓不够。汤色优劣 3 则决定了茶黄素和茶红素的含量及组成比例，t f s 、t r s 含量高，比例较大( 一般 t f s 0 7 ，t r s i o ，t r t f = 1 0 1 5 时) ，汤品质优良。如t f s 少，汤亮度差；t r s 少，汤红浅，说明发酵不足。 1 3 茶红素的形成途径 在红茶的制茶发酵中，茶红素类主要是在多酚氧化酶和过氧化物酶的催化下，由 儿茶素类氧化缩聚而成，其主体成分为儿茶素类的聚合体。除儿茶素b 环上的邻二 羟基极为活泼外，c 2 、c 4 、c 6 、c 8 位上的氢也很活泼，易发生聚合反应，形成二 聚体双黄烷醇类或茶红素类物质。另外，儿茶素的二聚物茶黄素类、双黄烷醇类还可 继续氧化聚合、缩合而生成茶红素类物质。由于儿茶素氧化聚合反应产物仍存在活性 羟基以及儿茶素类氧化形成的邻醌类物质的高还原性，它们还可与多糖、蛋白质、核 酸和原花色素等物质反应而形成高聚合的茶红素类物质。萧伟祥等在综合自己和前人 的研究基础上提出了茶红素类形成的综合示意图，如图3 1 6 j 。 田3 茶红素形成途径示意圈( 萧伟祥，1 9 9 7 ) 3 s c h e m a t i cd h g r a mo f t h e a r u b j g l n sf o r m i n gp a t h w a y 盎：q - q u i n o n e 讳臣：g a - s a l t i e a c i d 我于t ；c a t c e t e c h 0 1 讳苯二酚；t h c a t t a g a l l i n ，莱黄播天；e 肌唧i 妇棚毗喇， 囊蓁董t ：脚舯坼- 量“o x i d a n ，多爵氯化；p o d i r 孤山过氯化糟碑；t f s = 妇m q a v i n s ，莱冀蠢：1 舾由喇l 蝴噶。蓉缸 蠢 4 1 4 茶红素的可能结构 由于茶红索的异质性，其结构、组成及性质都不甚清晰。r o b e r t s ( 1 9 6 2 ) 研究表 明，在e c g 或其它儿茶素邻醌的作用下，茶黄素分子中连接于苯骈卓酚酮结构上邻 苯二酚被氧化成邻醌，随后该醌型环被打开，并断裂脱去一个羧基( 形成c 0 2 ) 再经 一定的结构变化而形成茶红素。茶红素结构中含有一个与卓酚酮环相连的二羧酸结 构，如图4 a 所示【i o l 。b r o w n 等( 1 9 6 9 ) 1 1 1 2 根据茶红素化学降解的研究结果指出， 茶红素为原花青素类物质( 儿茶素的聚合物) ，可被降解形成儿茶素和几茶素没食子 酸酯，花色素和没食子酸。b a i l e y 等( 1 9 9 2 ) 1 1 3 1 从红茶中分离出一棕褐色的茶红素部 分，该茶红素部分不含蛋白质、咖啡因和黄酮苷，由儿茶素和儿茶素没食子酸酯聚合 而成的原花青素。然而，c a t t e l l 等( 1 9 7 6 ，1 9 7 7 ) 1 1 4 ，l 习对乙酸乙酯可溶的茶红素部分进 行研究后认为，茶红素不是原花青素，而是由儿茶素) h 茶素没食子酸酯形成的五聚 体，五聚体中既含有可水解也有不可水解的儿茶素单元问连接键，并且还含有苯骈卓 酚酮结构。 o z a w a 等( 1 9 9 6 ) n 6 】用化学降解的方法阐明了茶红素的部分结构，茶红素是由 儿茶素和儿茶素没食子酸酯通过4 、6 、8 位c 和2 、5 、6 位c 相互连接而成的不均 一的聚合物，其结构如图4 b 所示。而d a v i e s 等( 1 9 9 9 ) 指出茶红素既可能d 3 ) l , 茶 素之间通过c 4 - c 8 位聚合而成，又可能由茶黄素与儿茶素之间通过“c 8 位聚合而 成，其可能结构如图4 e 。h a s l a m ( 2 0 0 3 ) u s l 推测茶红素是由没食予几茶素( e c r c 和 e g c g ) 之间通过b 环的连苯三酚结构氧化偶联而成的聚合物，其结构如图4 d 。 m e n e t ( 2 0 0 4 ) 等( 1 9 j 用激光降解吸附( m a l d i - t o f ) 质谱对红茶中正丁酵可溶的 茶红素部分进行了色谱分析，结果表明一些茶红素的结构与茶黄素类结构相似；一些 茶红素为儿茶素的聚合体，且儿茶素单元3 位羟基或多或少被没食子酸酯化；其它的 一些茶红素为儿茶素二聚体上没食子酸酯部分与另一儿茶素二聚体上b 环上的邻苯 二酚部分进一步氧化形成的具苯骈卓酚酮结构的儿茶素四聚体。如图4 e 所示， 茶红素的可能结构归纳如图4 所示尽管这些结构均为推测的可能性结构，但从 中也可发现，茶红素结构中可能既含有儿茶素结构，也含有茶黄素结构。也就意味着， 茶红素既可由儿茶素氧化形成，也可由茶黄素氧化形成，亦可由儿茶素与茶黄索共同 氧化形成，正如图3 所示。 5 6 |-_置乏缸n爵gi苦：66_|u苗容一毒矗oq萤_尊薹趸1) 窖兽声芒墨暑jo暑0暑。=焉o叶-嚣笛 1 5 茶红素的分离制备 有关茶红素的制备报道较少，主要是有机溶剂提取法和色谱分离法。有机溶剂提 取法主要有：b r o w n 等( 1 9 6 9 ) t l 】根据r o b e r t s 对茶红素的分类中茶红素极性的差异，分 别用乙酸乙酯、正丁醇、酸性正丁醇对茶汤进行萃取并去杂后，制备了五种茶红素， 即溶解于乙酸乙酯的为1 1 0 1 ，溶于正丁醇的t r - 2 ( 甲醇乙醚不溶) 和t r - 3 ( 丙酮乙 醚不溶) ，溶于酸性正丁醇的h ( 甲醇乙醚不溶) 和t r - 5 ( 丙酮乙醚不溶) 。k d s h n a n 等( 2 0 0 6 ) 1 2 0 l 在b r o w n 等方法的基础上改用索氏提取器进行固液萃取从红茶中分离纯 化出五个茶红素部分( p b p 1 p b p 5 ) ，五个部分均不含儿茶索，茶黄素和咖啡碱。 色谱分离制备茶红素主要有s e p h a d e xl h - 2 0 柱色谱、高速逆流色谱、离心沉淀色 谱等。c a t t e l i 等( 1 9 7 6 。1 9 7 7 ) 【1 4 1 5 】和n a z a r i k a 等( 1 9 8 4 ) 2 1 搬据茶红素分子量和极性 的差异，应用s e p h a d e xl h - 2 0 柱色谱对茶红素进行了分级制备，6 0 丙l 野( v v ) 洗脱。 将茶红素细分成三个部分。d e g e n h a r d t 等( 2 0 0 0 ) 1 2 2 j 应用高速逆流色谱( h s c c c ) ， 以乙酸乙酯一正丁醇一水( 2 ：3 ；5 ) 为溶剂系统，对x a d 7 处理后的红茶水提物进 行分离，制备了一较纯的茶红素部分。按r o b e r t s 对茶红素的分类进行分析后表明，该 茶红素主要由5 0 0t r s 、2 5 t r s i 和2 5 t r s i a 组成。次年，d e g e n h a r d t 等( 2 0 0 1 ) 1 2 3 1 应用离心沉淀色谱( c p c ) 分离制备出了一个亲水性的茶红素部分，经h p l c 分析 为一较宽的o a u s s i a n 峰。茚三酮反应和费林试剂反应显示该茶红素可能含有蛋白质和 多糖。 由于茶红素的异质性，分子量分布范围较竞，要对其单体进行分离纯化极其困难， 至今尚无分离制备出茶红素单体的报道。另从已有的报道来看，近五十年来，茶红素 的纯化仍停留在对红茶中的茶红素进行细分，以得到一至数种不同性质的茶红素部 分，但仍然是混合物。茶红素的分离制备工作进展极其缓慢。 1 6 茶红素的定量 由于无法对茶红素单体进行分离纯化。因而无法对其进行精确定量。目前，红茶 中的茶红素定量方法仍然停留在5 0 年以前r o b e r t s 所创建的分光光度法，测定茶红素总 量。r o b e r t s 法利用t f s 、t r s 极性的差异，将红茶水提取液用乙酸乙酯萃取t f s 和t r s i ， 而t r s i i ( 指不溶于乙酸乙酯层而溶于正丁醇层的茶红素) 留在水层。然后再用n a h c 0 3 除去乙酸乙醅层中的t r s i ，得到碡部分，t r s i 部分留在水层，这样t f 和t r s i 便可分 开；t f s 和t r s 溶于正丁醇，故用正丁醇提取茶汤可得t f s 、t r s i 和t r s i i 。根据各部分 在3 8 0 r i m 和4 6 0 r i m 处的吸收值和r o b e r t s 测定的换算系数，计算出仃s 和t r s 部分的含 量。此法是以红茶为对象，有着一定的局限性，不适宜于红茶提取物和茶多酚体外氧 化后的提取物如茶色素中t r s 部分的精确测定。这是因为这些提取物在t f s 和t r s 的含 量和组成上与红茶中的差别较大，不适宜用此两法中的换算系数。另外儿茶素的氧化 7 产物茶色素为混合物，t f s 和t r s 在组成上比较复杂，其主要单体不易分离纯化， 从而很难建立起h p l c 测定法。目前所用h p l c 大多是进行t f s 和t r s 的一些定性分析 1 2 4 1 ，而定量分析仍未见诸报道嘲。 1 7 茶红素的生物学活性 茶与健康是自上个世纪九十年代以来国际上的一大研究热点，但绝大多数研究都 集中在茶多酚和茶色素的研究上，对茶红素的研究仍处于起步阶段。茶多酚是一类以 儿茶素为主体的多酚类物质，主要由绿茶中提取而来，而茶色素是茶叶中多酚类及其 衍生物的混合物，主要成分为茶红素类和茶黄素类，其中茶红素的含量约占4 0 9 闭 ( 不同方法制备的茶色素其茶红素的含量会有一定的差异) 。茶色素可由红茶中直接 提取而得到，也可由茶多酚通过体外酶促氧化、自动氧化或化学氧化而制得。 现代药理学研究表明，茶多酚与茶色素具有较强的抗氧化和清除自由基功能，有 明显的防癌抗癌、抗衰老、抗高血压、保护心血管、降血脂、抗菌杀菌等功效。分子 药理研究表明它们可以通过抑制癌细胞分裂酶原激活的蛋白激酶( m a p k ) 和活化蛋 白- 1 ( a p - 1 ) 的活性、引诱调亡、控制细胞周期、干扰受体键合及受体活性、抑制侵 染和血管生成等作用达到防癌抗癌的功效【2 7 2 s 。然而所有这些药理作用的药效成分绝 大多数都集中在儿茶素与茶黄素的研究上。相对于儿茶素和茶黄素的结构相对简单、 易分离纯化等特点，茶红素的结构复杂、不易分离纯化，大大限制了其药理学活性的 研究，茶红素药理学活性研究处于刚刚起步阶段。 如前所述，茶红素主要为儿茶素和茶黄素的高聚物，从结构上分析仍然含有一定 量的活性酚羟基和苯骈卓酚酮结构，推测其可能也具有较好的药理学功能。已有少量 研究表明，茶红素与其前体物质儿茶素、茶黄素相似，具有抗氧化、抗癌、抗肿瘤、 抗突变、抗炎、抗白血病和抗神经毒素之功效。 1 7 1 抗氧化 y a s h i n o 等( 1 9 9 4 ) 2 9 1 研究发现，在由叔丁基氢过氧化物( t - b h p ) 引诱的大鼠肝 脏脂质过氧化模型中，茶红素与茶黄素一样，具有很好的抗脂质过氧化的功能，其效 力比常见的天然抗氧化剂谷胱甘肽、抗坏血酸、维生素e 和化学合成抗氧化剂丁基羟 基茴香醚( b h a ) 、二丁基羟基甲苯( b 耵) 等的效力要高。 1 7 2 抗癌、抗肿瘤 l i a n g 等( 1 9 9 9 ) 1 3 0 】在表皮癌细胞系( a 4 3 1 ) 和小鼠成纤维细胞系( n i h 3 t 3 ) 中 研究表明，茶红素可以抑制表皮生长因子( e g f ) 所引起的表皮生长因子受体( e g f r ) 的自动磷酸化，同时，对血小板衍生生长因子( p d f ) 所引起的血小板衍生生长因子 ( r ) 的自动磷酸化也有轻微的抑制作用。从而茶红素可能与红茶中的茶黄素、儿茶 s 素一起起到抗肿瘤细胞增殖的作用。在人前列腺肿瘤细胞( p c 3 ) 的研究中发现，茶 红素与染料木素存在协同作用。茶红素本身不能抑制该细胞的生长，但与染料木素一 起时却可显著抑s s j p c - 3 细胞生长1 3 l 】。 ，l o d o v i c i 等( 2 0 0 0 ) 1 3 2 1 报道，乙酸乙酯不溶茶红素可显著抑制由l ，2 二甲基肼诱 发的大鼠结肠粘膜硎a 断裂，从而预防肠癌的发生。d h a w a n 等( 2 0 0 2 ) 郾i 报道，茶 红素和茶黄秦均可阻断由杂环胺诱发的人淋巴细胞的d n a 断裂，而对正常人淋巴细 胞没有伤害。茶红素p b p - 1 p b p 3 可通过抑制苯并芘诱发的细胞色素c y p 4 5 0 s 同功 酶活力增强，达到抑制苯并芘诱发的d n a 加合物的形成。起到对癌症的化学预防作 用阻，朔。 1 7 3 抗突变 ， 茶红素具有抑制致癌剂所诱发的细胞色素c y _ p 4 5 0 激活，从而可有效抑制一些食 物源致癌剂所诱发的突变翊。在s w i s s f l 色小鼠实验中，正丁醇可溶茶红素和茶黄素 可有效抑制环磷酰胺( c p ) 7 ，1 2 二甲基苯并蒽( d m b a ) 和苯并芘所诱发的染色体 畸变( c a ) 和姐妹染色单体交换( s c e ) 0 7 , 3 引。此外，在s a l m o n e l l a t a 9 7 a 、t a 9 8 、 t a l o o 和t a l 0 2 等菌株中，对于突变齐日迭氮化钠、4 硝墓邻苯二胺、过氧化氢异丙苯、 2 - 氨基芴和丹酮所引趋的突变，茶黄素类和茶红素类具有显著的抗突变作用。此外， 在s 9 菌株中的激活实验中，茶黄素类和茶红素类亦具有显著的抗突变作用【3 9 】。 1 7 4 抗炎 在三硝基苯磺酸( t n b s ) 引诱的小鼠大肠炎试验中，茶红素可显著减轻小鼠的 腹泻，并可减轻小鼠肠的结构损伤，显著减少嗜中性粒细胞的穿透损伤，降低脂质过 氧化、抑制丝氨酸蛋白酶活力。抑制n o 和超氧阴离子的释放，抑制核因子( n f k a p p a b ) 的激活，从而从多种途径起到抗炎的作用 柏】。 1 7 5 抗白血病、抗神经毒素 在髓自血病细胞系( u 9 3 7 ) 和慢性粒细胞白血病细胞系( c m l ) 中的研究表明， 茶红索和茶黄素均可抑制二个细胞系的细胞生长和d n a 合成，从而可能起到抗白血 病的功能 4 1 l 。 s a t o h 等( 2 0 0 1 ，2 0 0 2 ) 的小鼠实验研究表明，正丁醇可溶茶红索部分具有对抗 破伤风毒素和肉毒杆菌神经毒索的功效 4 2 4 j l 。 1 8 茶红素的应用前景 1 3 1 茶红素在医药领域的应用前景 目前，许多研究者都发现红茶与绿茶一样，都具有不同程度的抗氧化、抗癌、抗 突变、抗病毒、抑菌、消炎以及防辐射的作用m 4 5 , 4 6 , 4 7 1 。尽管现有实验结果均表明， 9 茶黄素表现出了较强的活性。但茶红素含量是茶黄素含量的5 1 0 倍，且水溶性比茶 黄素更好，可能在体内表现出更好的生物学活性，是一类值得探索其医药应用前景的 物质。 1 8 2 茶红素在食品领域的应用前景 合成色素虽然成本低廉、色泽鲜艳、稳定性好，但医学毒理学和生物学研究发现， 大多数人工合成的色素对人体有不同程度的伤害。在很多国家，多种合成色素已被禁 止或严格限量在食品中使用【船l 。随着人们“回归自然”呼声的增高以及对天然食用色 素某些生理活性作用的逐步认识，开发安全优质天然色素以取代合成色素已是一种必 然趋势。 茶红素色泽棕红，水溶性好，水溶液呈酸性，深红色，刺激性较弱。现已发现茶 红素存在一定的保健功能，有望开发成为一新型的天然保健食用色素。 1 9 研究目的意义、主要内容和课题来源 茶红素是决定红茶品质的重要因子之一。其色泽红艳，并初步探明有一定的生物 学活性，在食品和医药领域存在潜在的开发价值。人们对于茶红素的生物学活性的认 识就如对其化学结构一样，缺乏清晰的认识。而茶红素作为几茶素和茶黄素的高聚物， 从结构上分析仍然含有一定量的活性酚羟基和苯骈卓酚酮结构，推测其可能也具有较 好的生物学活性。 由于茶红素的异质性，其结构、组成及性质都不甚清晰。本研究拟以祁门红茶为 原料，采取液液萃取法，利用茶红素在不同溶剂中溶解度的不同来分级分离制备茶红 素，并对分级后的茶红素开展清除自由基能力的研究，利用f e n t o n 反应体系、邻苯 三酚自氧化体系和d p p h 体系，探讨不同级分的茶红素在对羟基自由基、超氧阴离子 自由基和d p p h 自由基的清除能力上的差异，以期为这类红茶中含量最丰富的多酚类 物质的开发利用提供前期理论基础。 本课题锝到了安徽省自然科学基金项目( 项目号：0 5 0 4 1 0 3 0 4 ) 和安徽省教育厅 自然科学研究项目( 项目号；2 0 0 5 k j l 7 3 ) 的资金资助。 i o 2 材料与方法 2 1 材料 三级祁门红茶购自安徽省茶叶进出口公司，粉碎备用。 标样：没食子酸( g a ，沪试a r ) ，e c ( 表儿茶素) 、+ c ( 儿茶素) 、c - c o ( 没食 子儿茶素没食子酸酯) 、e g c g ( 表没食子儿茶素没食予酸酯) 、e c k 2 ( 表没食子儿茶 素) 和e c g ( 表儿茶素没食子酸酯) 均购自s i g m a 公司，纯度均9 0 ( h p l c ) ， 茶黄素( t f ) 、茶黄素单没食子酸酯( t f m g ，为茶黄素- 3 单没食子酸酯和茶黄索3 单没食子酸酯的混合物) 和t f d o ( 茶黄素3 ，3 双1 投食子酸酯) 为实验室自制纯度 均盖8 0 ( h p l c ) 。 表没食子儿茶素没食子酸酯( e p i g a j l o c a t e c h i ng a l l a t e ，e g c g ) 自制( i - i p l c 检测 纯度 9 5 ) 等。 2 2 主要仪器、设备与试剂 2 2 1 主要仪器设备 m e t t l e rt o l e d o 千分之一电子天平( 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司) ； b p 2 l + 万分之一电子天平 乙二胺西乙酸 二钠( e d t a n a 2 ) ，硫酸亚铁( f e s 0 4 ) ，磷酸氢二纳( n a 2 1 - 1 p 0 4 ) ，磷酸二氢钾( k h 2 p 0 4 ) ， 磷酸二氢钠( n a i - i z f 0 4 ) ，邻苯三酚( 焦性没食子酸) ，t r i s ( 三羟甲基氨基甲烷) ，盐 酸( h c l ) 抗坏血酸( v c ) ，9 5 乙醇，番红等试剂均为国产分析纯if o l i n - c i o c a l t e u 试剂和d p f h ，购自s i g m a 公司；液相用色谱级试剂乙腈、甲醇及冰醋酸等均为美国 t e d 队公司产品。 2 3 实验方法 2 3 1 祁门红茶含水量和水浸出物含量测定 含水量测定采用1 0 3 。c 恒重法( 仲裁法) 嗍；水浸出物含量测定采用国家标准 ( o b t8 3 0 5 2 0 0 2 ) 法进行测定【5 0 l 。 2 3 2 祁门红茶中多酚总量及主要多酚类物质含量的测定 ( 1 ) 祁门红茶中多酚总量测定 祁门红茶中多酚总量的测定采用f o l i n - c i o c a l t e u 法【5 l l 。 ( 2 ) 茶样中主要多酚类物质( 儿茶素、茶黄素) 和咖啡碱的测定 标准溶液配制；准确称取一定量的g a 、e c 、e g - c g 、e g c 、e c g 、g c g 、+ c 、 t f 、t f m g 、t f d g 、咖啡碱，超声溶解于5 0 的乙醇溶液中，配制成标准母液，经 稀释得系列标准液，冰箱中冷藏待用。 h p l c 测定条件：w a t e r s6 0 0 泵，2 4 8 7 双波长紫外检测器：p h e n o m e n e xg e m i n i5 1 a n c 1 82 5 0 x 4 6 m m 柱，在线氦气脱气，流速为1 0m l m i l l 1 ，室温，检测波长2 8 0 n m ， 进样体积5 p i 。梯度洗脱条件，两相梯度洗脱，a 相为0 1 5 h a t ，b 相为乙腈，a 相在0 5 0 m i n 由9 2 线性变化至5 0 。 标准曲线的制定：将系列标准液分别进样，得出i - i p l c 图谱。以各标准溶液的浓 度为横坐标，h p l c 对应的色谱峰峰面积为纵坐标，绘制各标样的标准曲线，得到1 1 种组分的线性回归方程和相关系数。 茶样中1 1 种主要组分的定量：根据上述标准曲线进行定量。 2 3 3 茶红索的分级分离制备 参照b r o w n 等( 1 9 6 9 ) i l l 】和k r i s h n a n 等( 2 0 0 6 ) 例的方法，按图5 的实验流程， 从祁门红茶中分级分离制备p b p - 1 p b p 5 五个茶红素部分。 2 3 4 各茶红素级分清除自由基活性测定方法 2 3 4 1 还原力的测定方法 茶红素溶液配制：将不同极性茶红素部分母液浓度配制成1 5 0 p g r a l ( w v ) ，然后 依次进行1 5 倍稀释，得系列标准浓度1 0 0 1 t g m l ( w v )