（分析化学专业论文）生物和环境样品中高选择性分离分析方法研究.pdf

摘要 摘要 实际生物和环境样品组成复杂、检测时基质干扰严重，故对实际样品的研究需 采用高选择性的分离分析方法。使用特异性强的方法，将样品的分离与预富集一 体化，是解决这一问题的关键。近年来发展起来的样品前处理技术，如雕目萃取 和固相微萃取，有很多优越性，针对不同分析物质发展高选择性的萃取吸附材料 成为当前研究的热点。本研究选取生物和环境体系中存在的抗生素磺胺甲恶唑 ( s m x ) 、牛血清白蛋白( b s a ) 、葡萄糖苷和牛血纤维蛋白原( b f g ) 4 种重要 物质，针对每种物质的特性，结合分子印迹、免疫分析和酶与专一性抑制剂相互 作用等多种分析新技术，发展高选择性的固相萃取固定相或固相微萃取纤维涂层 材料，建立了一系列高选择性的分离分析新方法。论文共分为五章。各章内容概 括如下： 第一章：综述固相萃取和固相微萃取技术，以及萃取吸附材料的研究进展， 概述了与本论文研究相关的一些高选择性分离技术，包括分子印迹、抗原抗体免 疫分析和酶与专性抑制剂的相互作用。介绍了本论文课题的提出和主要研究内 容。 第二章：分子印迹聚合物在线固相萃取和表面等离子体共振技术联用的s m x 间接抑制免疫分析法。 制备了s m x 分子印迹聚合物涂层的毛细管，对制备条件如功能单体和印迹 分子的比例、功能单体和交联剂的比例以及聚合时间等进行了优化。扫描电子 显微镜观察到最优化涂层厚度为1 9 8 n m 。将毛细管连接到b i a c o r e 3 0 0 0 生物传 感器上，用于表面等离子体共振免疫检测前的在线固相萃取和预富集。根据抑 制免疫分析，制备了s m x 芯片，作为a n t i s m x 单克隆抗体( m a b s ) 的检测芯 片，检测未被抑制的a n t i s m xm a b s 的浓度。a n t i s m xm a b s 被毛细管富集的 s m x 抑制后，流经传感器芯片的浓度减小。减小的量与样品中s m x 的浓度成 正比。方法线性范围为0 0 4 1 0n g m l ，灵敏度为0 0 1n g m l ，可直接用于低浓 度实际样品的检测。具有操作简单，自动化程度高，灵敏度高的优点。 第三章：b s a 在c d s 量子点表面印迹的新型蛋白质印迹方法。 蛋白质印迹技术是近几年发展起来的用于蛋白质特异性分离的新方法。对于 b s a ，表面印迹是使用较多的方法，但到目前为止，其吸附容量较小。半导体量 子点是一种新型纳米材料，其比表面积大和表面缺陷多的特点，有利于物质的吸 附。本研究合成了l 半胱氨酸修饰的水溶性c d s 量子点，将其掺杂在b s a 的分 子印迹预聚合溶液中，合成在量子点表面印迹的b s a 分子印迹聚合物。对聚合 摘要 条件和吸附条件进行了优化。合成的量子点和分子印迹聚合物颗粒大小均为纳米 级别。当聚合物重新结合模板分子后，量子点的荧光发射强度大大减小。荧光淬 灭的原因是量子点和模板分子b s a 之间的荧光共振能量转移。考察了该新型聚 合物对模板分子b s a 的吸附行为，符合l a n g m u i r 单层吸附，化学吸附为控速步 骤。该掺杂了量子点的分子印迹聚合物的吸附容量比未掺杂的提高了1 4 2 4 m g g ，证明了将量子点用于蛋白质表面印迹以提高吸附容量的可行性。 第四章：p d 葡萄糖苷特异性固相萃取固定相的合成、表征及应用。 p d 葡萄糖脒是p d 葡萄糖苷酶的特异性抑制剂，而p d 葡萄糖昔是p d 葡萄糖苷酶催化作用的底物，因此可推测b d 葡萄糖脒和d d 葡萄糖苷之间也 有特异性的相互作用。该研究模拟b d 葡萄糖脒的结构，通过p d 葡萄糖胺和 2 亚胺基硫代烷盐酸盐反应，使糖基通过n 糖苷键与脒苷元链接，吡喃糖环一 侧胺基保持带正电的活化状态。然后再连接到由马来酰亚胺基活化的凝胶树脂 上，作为s p e 的固定相。用红外、核磁、紫外可见吸收光谱等方法验证了产物 的结构。在这种状态下，合成的b d 葡萄糖脒固定相不仅能与p d 葡萄糖苷化 合物进行选择性地可逆结合，而且自身也非常稳定。结合的p d 葡萄糖苷能被 p d 葡萄糖溶液洗脱下来。结果表明，该固定相是通过糖苷中糖环的特异性进行 识别的。 第五章：碳纳米管( c n t s ) 作为萃取纤维涂层分离牛血浆中b f g 的固相微萃 取方法。 c n t s 是近年来发展起来的新型碳材料，其疏水性强，比表面积大。研究将多 壁碳纳米管( m w c n t s ) 和单壁碳纳米管( s w c n t s ) 用有机键合剂粘于固相微 萃取装置的萃取纤维上，直接对蛋白质进行吸附富集，研究其对牛血纤维蛋白原 和牛血清白蛋白的吸附性质，并对吸附条件进行了优化。改变溶液p h 值或离子 强度，可将吸附的蛋白质洗脱下来，并对洗脱条件进行了优化。结果表明：无论 是m w c n t s ，还是s w c n t s ，其对大分子蛋白质牛血纤维蛋白原的吸附能力远 大于其对小分子蛋白质牛血清白蛋白的吸附。在一定条件下，c n t s 可选择性地 吸附b f g 。涂层了c n t s 的纤维比传统的聚二甲基硅氧烷纤维选择性好。该方法 可直接用于从牛血浆中粗略除去牛血纤维原并定量。方法操作简单，可有望直接 用于活体检测。 关键词：固相萃取固相微萃取高选择性分子印迹聚合物抑制免疫检测 磺胺甲恶唑牛血清白蛋白牛血纤维蛋白原p d 葡萄糖苷 i i a b s t r a c t a b s t r a c t t h ec o m p o s i t i o ni nr e a lw o r d ss a m p l e s ，s u c ha sb i o l o g i c a la n de n v i r o n m e n t a l s a m p l e s ，i sr e l a t i v e l yc o m p l i c a t e d t h ei n t e r f e r e n c eo fm a t r i xt ot a r g e tc o m p o u n di s s e r i o u sw h 。e nd i r e c t l ya n a l y z e d ，s oa n a l y t i c a lm e t h o d sw i t hs t r o n gs e l e c t i v i t ya r e r e c o m m e n d e di nr e a lw o r ds a m p l ea n a l y s i s u s i n gm e t h o d sw i t hh i g hs p e c i f i c i t yt o i n t e g r a t es a m p l es e p a r a t i o na n dp r e c o n c e n t r a t i o ni st h ek e ys t e pt os o l v et h i sp r o b l e m s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) a n ds o l i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o n ( s p m e ) a r es a m p l e p r e t r e a t m e n tt e c h n o l o g i e sd e v e l o p i n gr a p i d l y t h e s e y e a r s t h e yh a v em a n y a d v a n t a g e s o v e rt r a d i t i o n a l m e t h o d s d e v e l o p m e n t o fd i f f e r e n th i g h s p e c i f i c a d s o r p t i o nm a t e r i a l sf o rd i f f e r e n tt a r g e tc o m p o u n d si st h eh o ts p o tn o w a d a y s i nt h i s r e s e a r c h ，f o u ri m p o r t a n tc o m p o u n d si nb i o l o g i c a la n de n v i r o n m e n t a ls a m p l e s ， i n c l u d i n ga n t i b i o t i cs u l f a m e t h o x a z o l e ( s m x ) ，g l u c o s i d e ，b o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) a n db o v i n es e r u mf i b r i n o g e n ( b f g ) ，a r ec h o s e na st h et a r g e t c o m p o u n d s i n c o n s i d e r a t i o no fs p e c i a lc h a r a c t e r i s t i c so fe a c hc o m p o u n d ，s p e c i f i cs p es t a t i o n a r yo r s p m ef i b e rc o a t i n gi sd e v e l o p e d c o m b i n i n gw i t hs u c hn e wa n a l y t i c a lm e t h o d sa s m o l e c u l a ri m p r i n t i n g ，i m m u n o a s s a ya n di n t e r a c t i o nb e t w e e ne n z y m ea n di t ss p e c i f i c i n h i b i t o r , as e r i e so fn e wa n a l y t i c a lm e t h o d sw i t hh i g hs e l e c t i v i t yi se s t a b l i s h e d t h e r e a r ef i v ec h a p t e r si nt h i sd i s s e r t a t i o na n dt h ec o n t e n to f e a c hi sa sf o l l o w s ： c h a p t e r1 ：t h eb a s i cc o n c e p t so fs p ea n ds p m ea r eb r i e f l yd e s c r i b e d d e v e l o p m e n to fr e s e a r c hi ne x t r a c t i o na n da d s o r p t i o nm a t e r i a l si sr e v i e w e d t h e n ，s o m en e w a n a l y t i c a l m e t h o d sw i t h h i g hs e l e c t i v i t y , i n c l u d i n gm o l e c u l a r l yi m p r i n t i n g ， i m m u n o a s s a ya n ds p e c i f i c i n t e r a c t i o nb e t w e e ne n z y m ea n di t si n h i b i t o r , a r e i n t r o d u c e d a tl a s t ，h o wt ob r i n gf o r w a r dt h er e s e a r c hi d e aa n dm a i nc o n t e n t so ft h e r e s e a r c ha r ei n t r o d u c e d c h a p t e r2 ：an e wi n d i r e c ti n h i b i t i v ei m m u n o a s s a yu s i n g s u r f a c ep l a s m o n r e s o n a n c e ( s p r ) c o u p l e dw i t hm o l e c u l a r l yi m p r i n t i n gt e c h n o l o g yf o rs m x as m x m i pc o a t i n gc a p i l l a r yw a sp r o d u c e d t h ep r e p a r a t i o nc o n d i t i o n s ，s u c ha s r a t i oo fm o n o m e rt o i m p r i n t i n gm o l e c u l e ，r a t i oo fm o n o m e rt oc r o s s l i n k e r ， p o l y m e r i z a t i o nt i m ea n ds oo n ，w e r eo p t i m i z e d t h es c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) i m a g ei l l u s t r a t e dt h a tt h et h i c k n e s so ft h ec o a t i n gw a s19 8 n m t h ec a p i l l a r y w a sc o n n e c t e dt oab i o s e n s o rb i a c o r e 3 0 0 0a n du s e da sa l li n t u b es p ea n do n 1 i n e p r e c o n c e n t r a t i o nd e v i c eb e f o r ei m m u n o a s s a y as m xs e n s o rc h i pw a sp r o d u c e da n d i i i a b s t r a c t u s e dt od e t e c tt h ec o n c e n t r a t i o no fu n i n h i b i t e da n t i s m xm o n o c l o n a la n t i b o d i e s ( m a b s ) t h ea n t i s m xm a b sw a si n h i b i t e db ys m xe x t r a c t e db yt h em i pc o a t i n g a n dt h ed e t e c t e dc o n c e n t r a t i o nb yt h es e n s o rc h i pd e c r e a s e da c c o r d i n g l y t h er e d u c e d m a b sc o n c e n t r a t i o nw a s1 i n e a rw i t he x t r a c t e ds m xa m o u n t t h ec a l i b r a t i o nc u r v e w a sg e n e r a t e db yl i n e a rf i to v e rt h er a n g eo f0 0 4 10n g m l t h el i m i to fd e t e c t i o n w a so 0 1n g m l t h i sm e t h o dw a sa p p l i e dt ot h ed e t e c t i o no fl o wc o n c e n t r a t i o n s a m p l e ss u c c e s s f u l l y i ti se a s y t ob eo p e r a t e d ，a n dh a sh i g hs e n s i t i v i t y a n d a u t o m a t i z a t i o n c h a p t e r3 ：an e wp r o t e i ni m p r i n t i n gm e t h o do fi m p r i n t i n gb s a o nt h es u r f a c eo f c d sq u a n t u md o t s p r o t e i ni m p r i n t i n gi san e wm e t h o df o rs p e c i f i cr e c o g n i t i o no ft a r g e tp r o t e i n s f o rb s a ，s u r f a c ei m p r i n t i n gi sm o s tf a v o r a b l e b u tt h ea d s o r p t i o nc a p a c i t yi sn o t g o o de n o u g h s e m i c o n d u c t o rn a n o c r y s t a l s ，a l s oc a l l e dq u a n t u md o t s ( q d s ) ，a r en e w n a n o s c a l em a t e r i a l s t h e yh a v el a r g es p e c i f i cs u r f a c ea r e aa n dm a n ys u r f a c e d e f i c i e n c i e s ，w h i c hi si nf a v o ro fa d s o r p t i o n i nt h i ss t u d y ，ab s a s u r f a c ei m p r i n t i n g m e t h o dw a sd e v e l o p e db yt h ei n c o r p o r a t i o no fw a t e rs o l u b l el c y s t e i n e - q d si n t o m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ，w h i c hc a l lo f f e rs h a p es e l e c t i v i t y p r e p a r a t i o na n d a d s o r p t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d s i z eo ft h eq d sa n dq d s m i pp a r t i c l e sw a s n a n o s c a l ei l l u s t r a t e db ys e mi m a g e s p h o t o l u m i n e s c e n c ee m i s s i o no fc d sw a s q u e n c h e dw h e nr e b i n d i n go ft h et e m p l a t e t h eq u e n c h i n go fp h o t o l u m i n e s c e n c e e m i s s i o n si sp r e s u m a b l yd u et ot h ef l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e rb e t w e e n q u a n t u md o t sa n dt e m p l a t em o l e c u l eb s a t h ea d s o r p t i o ni sc o m p i l e dw i t hl a n g m u i r i s o t h e r ma n dc h e m i c a la d s o r p t i o ni st h er a t e c o n t r o l l i n gs t e p t h em a x i m u m a d s o r p t i o nc a p a c i t yw a s14 2 4m g gl a r g e rt h a nt h a to fu n d o p e db s am i pm e t h o d t h i ss t u d yd e m o n s t r a t e st h ev a l i d i t yo fq d s c o u p l e dw i t hm i pt e c h n o l o g yt oa n a l y z e b s a c h a p t e r4 ：p r e p a r a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o na n de v a l u a t i o no fn e ws t a t i o n a r yp h a s e f o rs p eo fp - d - g l u c o s i d e s g l u c o s y l a m i d i n ei sh i g h l yp o t e n ta n ds e l e c t i v ei n h i b i t o ro fg l u c o s i d a s ea n d g l u c o s i d e sa r es u b s t r a t eo fg l u c o s i d a s ec a t a l y t i cr e a c t i o n s o ，i ti sp r e s u m e dt h a tt h e r e m i g h tb es p e c i f i ci n t e r a c t i o nb e t w e e ng l u c o s y l a m i d i n ea n dg l u c o s i d e s i nt h i ss t u d y , a p o s i t i v e l yc h a r g e db - d - g l u c o s y l a m i d i n ew a si m m o b i l i z e dt h r o u g hao n e p o ts y n t h e s i s p r o c e d u r ei n v o l v i n g t h ea d d i t i o no f1 3 - g l u c o s y l a m i n ea n d2 - i m i n o t h i o l a n e h c i s i m u l t a n e o u s l yt oam a t r i xm o d i f i e dw i t hm a l e i m i d og r o u p sv i a a na p p r o p r i a t es p a c e r i v a b s t r a c t t o g i v eas p es t a t i o n a r yp h a s ef o r p d g l u c o s i d e s d u r i n gs y n t h e s i s ，i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y , n u c l e a r m a g n e t i cr e s o n a n c es p e c t r o s c o p ya n du l t r a v i o l e t v i s i b l e s p e c t r o s c o p y w a su s e d t o c h a r a c t e r i z e p r o d u c t s t h es y n t h e s i z e d 1 3 d g l u c o s y l a m i d i n es t a t i o n a r yp h a s ei ss t a b l ea n dc a ni n t e r a c tw i t h1 3 - d g l u c o s i d e s s e l e c t i v e l ya n dr e v e r s i b l y t h er e t a i n e d1 3 - d - g l u c o p y r a n o s i d ec o u l do n l yb ee l u t e db y 1 3 - d 。g l u c o s es o l u t i o n i ti n d i c a t e st h a tt h eb i n d i n go ft h ed d g l u c o s i d ew a so f 霉p e c i f i cn a t u r et h a tc o r r e s p o n d st ot h eg l y c o ns u b s r t a t e s p e c i f i c i t yo ft h e1 3 - o g l u c o s i d e c h a p t e r5 ：an e ws p m em e t h o do fe x t r a c t i n gb f gf r o mb o v i n ep l a s m au s i n g c a r b o nn a n o t u b e s ( c n t s ) c o a t i n gf i b e r c n t sa r eak i n d o fn o v e l a n d i n t e r e s t i n gc a r b o n m a t e r i a lw i t h h i g h h y d r o p h o b i c i t ya n dl a r g es p e c i f i cs u r f a c ea r e a i nt h i si n v e s t i g a t i o n ，c o m m e r c i a l p o l y d i m e t h y l s i l o x a n e ( p d m s ) f i b e rw a sc o a t e dw i t hs i n g l e w a l ln a n o t u b e s ( s w c n t s ) a n dm u l t i - w a l ln a n o t u b e s ( m w c n t s ) b yo r g a n i cb o n d i n ga g e n t ，t os t u d y t h e i ra d s o r p t i o na n de x t r a c t i o na b i l i t yo fp r o t e i n s ，a n db o v i n ef i b r i n o g e n ( b f g ) a n d b s aw e r es e l e c t e da st h et a r g e tp r o t e i n s t h ea d s o r p t i o nc o n d i t i o n sw e r e o p t i m i z e d t h ea d s o r b e dp r o t e i n sc o u l db ed e s o r b e dw h e nc h a n g i n gt h ep ha n di o n i cs t r e n g t ho f t h e a d s o r p t i o nb u f f e r t h ed e s o r p t i o nc o n d i t i o n sw e r ea l s oo p t i m i z e d e i t h e r s w c n t so rm w c n t sa d s o r b e db i g g e rp r o t e i nb f g m o r e s t r o n g l yt h a nb s a t h e y c a l ls e l e c t i v e l ya d s o r bb f gi nc e r t a i nc o n d i t i o n s t h ef i b e r sc o a t e dw i t hc n t sh a d a d v a n t a g e so v e rp d m sf i b e ri ns e l e c t i v i t y i tc o u l db eu s e dt os e p a r a t ea n dp u r i f y b f g i nb o v i n eb l o o dp l a s m aa n dq u a n t i f yi t sc o n c e n 仃a t i o n t h i sm e t h o di se a s yt ob e o p e r a t e da n dh o p e f u lt ob ed i r e c t l ya p p l i e dt oi n v i v od e t e c t i o n k e yw o r d s ：s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，s o l i dp h a s em i c r o e x t r a c i t o n ，h i g h s e l e c t i v i t y , m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r , i n h i b i t i v e i m m u n o a s s a y , s u l f a m e t h o x a z o l e ，b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b o v i n es e r u mf i b r i n o g e n ， 1 3 - d g l u c o s i d e s v 仪器方法缩略语表 g c g a sc h r o m a t o g r a p h y 气相色谱 g c m s g a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y 气相色谱一质谱联用 h p l c h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱 i r i n f r a r e ds p e c t r o s c o p y 红外光谱 m i p m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r 分子印迹聚合物 m s m a s ss p e c t r o m e t r y 质谱 n i p n o n i m p r i n t e dp o l y m e r 非印迹聚合物 n m rn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e 核磁共振 s e m s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e 扫描电子显微镜 s p es o l i dp h a s ee x t r a c t i o n 固相萃取 s p m e s o l i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o n 固相微萃取 s p rs u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e 表面等离子体共振 u v - v i s u l t r a v i o l e ! ：! ! ! ! ! ! ! ! 堕坐竺! ! 竺型 整丛里里堕堕堂堂 v i 有机试剂缩略语袁 有机试剂缩略语表 v i i 中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写 过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确 的说明。 作者签名： 签字日期： 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥 有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交 论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人 提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 耄二名： ：越 导师签名：虹 作者签名：踅聋犟 导师签名：些选 签字日期： 2 1 2 选习 签字日期： 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 现代光电拄术以及计算机技术的发展大大促进了仪器分析的j 是展，追求无样品 处理的直接分析是仪器分析发展的理想目标，然而实际环境和生物样品等实际样 品组成复杂、基体干扰严重，导致分析结果不准确。如果直接使用仪器测定，往 往满足不了灵敏度与选择性的要求。因此，通常需要对实际样品进行预富集、分 离等复杂的样品前处理工作。 传统的样品前处理技术包括沉淀、蒸馏、结晶、过滤、离心、液一液萃取等， 大多具有操作复杂、处理周期长、工作强度大、离线处理样品易使样品损失和污 染、难以实现自动化、重现性差并且需要使用对环境不友好的有毒有机试剂等缺 点。为了克服这些缺点，近年来，一些新型的样品前处理技术得到了迅速的发展， 如固相萃取和固相微萃取等。 1 2 固相萃取 21 固相萃取技术原理 1 9 7 9 年- o n g e 等首次提出固相萃取( s o l i d - p h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) 【1 】，随后 这种样品预处理技术在近几十年得到了迅速发展。它是以液相色谱分离机理为基 础建立起来的分离和纯化方法，利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸 附，与样品的基体和干扰化台物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到 分离和富集目标化台物的目的。图1 1 为典型的s p e 柱装置。 一 1 8 0 d a 体积 7 6 0 3 5 0 6 1 0m m 基线噪音一般小于o 1r u 基线漂移一般小于0 3r u 每分钟 结合常数k a 1 0 3 1 0 7m 。l 解离常数k d 5 x 1 0 - 6 - 1 0 1m 亲和性 1 0 4 2 1 0 1 0m 。1 浓度分析 1 0 1 0 。l lm 折射率分辨率 1 0 。7 r i u 中国科学院电子所的l i 课题组建立了一种用s p r 传感器检测s m x 浓度的直 接抑制免疫分析法【1 4 】。此方法将预培养过的s m x 样品和a n t i s m x 抗体溶液直 接通过传感器芯片，然后检测未被s m x 抑制的抗体与芯片上预键合的小分子的 结合值。但是预培养的过程冗长，操作复杂，样品基质影响大。 3 6 第二章分子印迹聚合物【苦1 相萃取和表面等离子体其振联用的s m x 抑制免疫分析 2 1 3 分子印迹技术 分子印迹技术是二十世纪八十年代迅速发展起来的一种化学分析技术，通常被 人们描述为创造与识别“分子钥匙”的人工“锁”技术 1 5 1 7 】。分子印迹聚合物 ( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r , m i p ) 制备过程如下：( 1 ) 在一定溶剂( 也称致 孔剂) 中，模板分子( 即印迹分子) 与功能单体依靠官能团之间的共价或非共价 作用形成主客体配合物；( 2 ) 加入过量交联剂，通过引发剂引发进行光或热聚合， 使主客体配合物与交联剂通过自由基共聚合在模板分子周围形成高联的刚性聚 合物；( 3 ) 将聚合物中的印迹分子洗脱或解离出来。这样在聚合物中便留下了与 模板分子大小和形状相匹配的立体孔穴，同时孔穴中包含了精确排列的与模板分 子官能团互补的由功能单体提供的功能基团，如果构建合适，这种分子印迹聚合 物就象锁一样对此钥匙具有选择性( 如图2 3 ) 。这便赋予该聚合物特异的“记忆” 功能，即类似生物体系中自然的识别系统，这样的空穴将对模板分子及其类似物 具有选择识别特性。 订 平c 0 墨 p r o a r r a n g c mc n t - - - - - _ - 戮e x t r a c t i o n 戮 图2 3 分子印迹聚合物制备过程示意图 目前，根据模板分子和聚合物单体之间形成多重作用位点方式的不同，分子印 迹技术可以分为两类： ( 1 ) 共价键法( 预组装方式) 聚合前模板分子与功能单体发生化学反应形成硼酸酷、西夫碱、亚胺、缩醛等 衍生物，通过交联剂聚合形成高分子聚合物，用水解等方法除去印迹分子即得到 共价结合型分子印迹聚合物。 ( 2 ) 非共价键法( 自组装方式) 非共价键法是制备分子印迹聚合物最有效且最常用的方法。这些非共价键包括 静电引力( 离子交换) 、氢键、金属鳌合、电荷转移、疏水作用以及范德华力等。 3 7 第二章分子印迹聚合物固相萃取和表面等离子体共振联用的s m x 抑制免疫分析 其中最重要的类型是离子作用，其次是氢键作用。 m i p 具有以下优良的特性：( 1 ) 预定性，即它可以根据不同的目标化合物和不 同的目的制备不同的m i p ，以满足各种不同的需要；( 2 ) 识别性，即m i p 是按照 模板分子定做的，可专一地识别；( 3 ) 实用性，即它可以与天然的生物分子识别 系统如酶与底物、抗原与抗体、受体与激素相比拟，但由于它是由化学合成的方 法制备的，因此又有天然分子识别系统所不具备的抗恶劣环境的能力，如m i p 可耐高温和强酸强碱，从而表现出高度的稳定性和长的使用寿命。 本研究利用m i p 的高选择性，制备s m x 印迹聚合物涂层的毛细管柱，将其连 接于b i a c o r e3 0 0 0 生物传感器上，对分析样品中的s m x 进行在线s p e 和预富集， 然后用表面等离子体共振技术进行间接免疫分析，可不经预处理直接分析实际样 品。实验过程中对m i p 的制备条件和检测条件进行了优化。方法可直接用于实 际样品的检测，不仅简化了分析过程，缩短了分析时间，而且比传统的直接免疫 分析法具有更高的灵敏度。 2 2 实验部分 2 2 1 仪器和试剂 b i a c o r e3 0 0 0 生物传感器，c m 5 传感器芯片( 瑞典b i a c o r ea b 公司) ；场发 射扫描电子显微镜j s m 6 7 0 0 f ( 日本j e o l 公司) ；石英毛细管( 北京华瑞博远 科技发展有限公司) 。 磺胺甲嗯唑，磺胺噻唑( s u l f a t h i a z o l e ，s t ) ，磺胺嘧啶( s u l f a d i a z i n e ，s d ) ，牛血 清白蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b s a ) ，乙二醇二甲基丙烯酸酯( e t h y l e n eg l y c o l d i m e t h a c r y l a t e ，e g d m a ) ，y 甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷( y - m e t h a c r y l o x y p r o p y l t r i m e t h o x y s i l a n e ，y m a p s ) ，1 乙基3 ( 3 二甲基氨丙基) 碳化二亚胺 ( 1 - e t h y l 3 ( 3 d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i i m i d eh y d r o c h l o r i d e ，e d c ) 和n 羟基 琥珀酰亚胺( n h y d r o x y s u c c i n i m i d e ，n h s ) ( 美国s i g m a 公司) ；4 一乙烯基毗啶( 4 v i n y l p y r i d i n e ，4 - v p y ) ( 美国a l f aa e s a r 公司) ；偶氮二异丁氰腈( 2 ，2 - a z o b i s i s o b u t y r o n i t r i l e ，a i b n ) ，n ，n 二甲基甲酰胺和正十二醇( 国药集团化学试剂有限公 司) ；1g la n t i s m x 单克隆抗体( m a b s ) 标准溶液( 北京大学生命科学学院) 。 p h7 4 的p b s 缓冲液( p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e ) ：将p b s 标准缓冲液( 瑞典b i a c o r e a b 公司) 用二次蒸馏水稀释1 0 倍。其余试剂均为分析纯试剂。 第二章分子印迹聚合物阎相萃取和表面等离子体共振联用的s m x 抑