莲房中金丝桃苷的分离鉴定及药材质量标准研究.doc

莲房中金丝桃苷的分离鉴定及药材质量标准研究【摘要】 目的 制定莲房药材质量标准,为该药资源的开发利用提供科学依据。方法 药材对照品的分离鉴定，建立TLC鉴别方法及HPLC含量测定方法。结果 分离得到对照品金丝桃苷；TLC鉴别斑点清晰；HPLC含量测定金丝桃苷在0.04160.832 g范围内线性关系良好，平均回收率为99.5%(n=6)。结论 可较全面反映其内在质量，为有效评价莲房质量和开发莲房资源提供依据。 【关键词】 莲房 金丝桃苷 质量标准 The Research on the Isolation and Identification of Hyperin in Receptaculum Nelumbinis and Quality Standard of Receptaculum Nelumbinis WANG Ji-sen,LIU You-ping,CHENG Bei,SHI Yu-hua,CHEN Hong-ping (School of Pharmacy,Chengdu University of TCM,Chengdu 611730，China) Abstract：Objective To establish the quality standard of the Receptaculum Nelumbinis to provide the science evidence for the development and exploitation of the resources of this herb.Method The reference substance had been isolated and identified.The TLC identified method and the HPLC assaying method had been established.Results The reference substance Hyperin had been successfully isolated and TLC differential spots were distinct.The linear correlation of the Hyperin determined by HPLC method was good in the range of 0.04160.832 g.The average recovery rate of Hyperin was 99.5%(n=6).Conclusions It can overall reflect the internal quality control,effectively estimate the quality of Receptaculum Nelumbinis and provide the evidence for the developing the resources of Receptaculum Nelumbinis. Key words:Receptaculum Nelumbinis;Hyperin;quality standard 莲房为睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥花托，具有化瘀止血的功效。中国药典2005版一部莲房项下仅有显微理化鉴别及一般检查，还很不完善，缺少现代药材质量控制指标。本文以从药材中分离得到的金丝桃苷为指标性成分，建立了薄层色谱鉴别方法、高效液相色谱含量测定方法。可较全面反映其内在质量，为有效评价莲房质量和开发莲房资源提供依据。 1 仪器与试药 1.1 仪器 日本岛津高效液相色谱仪（Shimadzu SPD-10aVP紫外检测器）；R-201型旋转蒸发仪（上海申胜生物技术有限公司）；BP211D（十万分之一），BP121S（万分之一）型电子分析天平（德国Sartorius公司）；BUG25-12超声波清洗机（25kHz,500W,上海必能信超声波有限公司）；SGW-4显微熔点测定仪（上海精密科学仪器有限公司，温度未校正）；Bruker Avance 600 核磁共振仪（瑞士Bruker公司）。 1.2 材料 莲房药材于2006年10月购自湖南省湘潭市。 1.3 试剂 柱层析用聚酰胺（江苏临江试剂化工厂）；薄层层析硅胶G（青岛海洋化工集团有限公司）；薄层层析聚酰胺薄膜（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）；色谱甲醇、乙腈（美国Fisher公司）；其它试剂均为分析纯（成都化学试剂厂）。 2 方法与结果 2.1 对照品的提取分离及鉴定 取莲房粗粉8 kg，用95%乙醇回流提取三次，回收乙醇得浸膏560 g将其悬浮于水中，依次用石油醚，氯仿，乙酸乙酯，正丁醇萃取，回收溶剂。取乙酸乙酯部位与层析聚酰胺（100200目）湿法上柱，氯仿-甲醇梯度洗脱。并反复聚酰胺柱分离，Sephaex LH-20纯化，得化合物（300 mg）。该化合物的13C-NMR谱数据与文献报道金丝桃苷的13C-NMR谱数据一致1。根据以上理化鉴定及1H-NMR、13C-NMR谱鉴定并与文献报道数据对照，可推断其为金丝桃苷。 2.2 薄层色谱鉴别 取莲房药材粉末1 g，加60%乙醇10ml，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加1 ml甲醇使溶解，作为供试品溶液。另取金丝桃苷，加甲醇制成每1 ml中含0.5 mg的对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录B）试验，吸取上述两种溶液各5 l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-冰醋酸-水（3：2：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干。喷以10%三氯化铝乙醇溶液，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图1. 2.3 金丝桃苷含量测定 2.3.1 色谱条件与适应性 Hypersil ODS(250 mm4 mm,5 m)柱；流动相为甲醇-乙腈-0.3%磷酸（27964）；检测波长为355 nm；流速0.8 ml/min。色谱图见图2.2.3.2 线性关系考察 精密称取金丝桃苷对照品适量，加甲醇制成每1 ml含52 g的溶液，作为对照品溶液。再分别精密吸取1、5、10、15、20 ml对照品溶液 ，加甲醇稀释至25 ml。精密吸取上述溶液各20 l，注入色谱仪，测定峰面积积分值，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，计算得回归方程Y=5944592X-19303，r=0.999 8，金丝桃苷在0.04160.832 0 g范围内呈良好线性关系。 2.3.3 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液,重复进样5次，测得峰面积RSD为1.10%. 2.3.4 稳定性试验 精密吸取同一样品溶液，每隔2 h进样，共5次，测得峰面积RSD为0.81%. 2.3.5 重复性试验 照拟定样品制备方法平行制备5份供试品溶液并测定，测得平均含量为0.15%，RSD为1.38%. 2.3.6 加样回收率试验 精密称取已知含量的莲房药材，精密添加一定量金丝桃苷对照品，按样品制备方法制备样品溶液，并按上述色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表1.表1 加样回收率试验测定结果 2.3.7 样品测定 取莲房细粉约1 g，精密称定，加入20 ml 75%甲醇，加热回流提取1 h，放至室温，过滤，滤液转移至25 ml量瓶中，加75%甲醇溶剂至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 l，按拟定色谱条件测定，结果见表2. 表2 不同批次莲房中金丝桃苷含量 3 讨论 本研究中首次使用定性和定量指标进行莲房药材的质量标准研究，以控制药材内在质量，为进一步开发利用莲房资源打下基础。在对照品分离过程中，曾拟用硅胶进行柱层析分离，但多种洗脱剂均显示有不同程度的脱尾现象，且分离度不佳。改用聚酰胺后，脱尾现象及分离度均得到明显改善。HPLC测定选择流动相时，也曾用甲醇-水（4060）、甲醇-0.1%磷酸（4060）、乙腈-0.1%磷酸（