（化学工程专业论文）固定化酶反应器的耦联及高纯度d蛋氨酸的制备.pdf

中文摘要 本文将固定化菌体与固定化酶实现了耦联，用于拆分乙酰- d l 蛋氨酸，先用 固定化菌体对乙酰- d l 蛋氨酸进行初拆分，再用固定化酶在填充床反应器内进行 高效拆分。通过乙酰d 蛋氨酸的水解并采用离子交换分离的方法制备了高纯度 的d 蛋氨酸。 考察了十种d e a e d h 弱碱性大孔树脂对氨基酰化酶的固定化酶活，研究 发现，d e a e d h 一8 作为固定化载体，具有较好的固定化效果，固定化酶活可达 1 3 4 0 1 4 2 0 u g ，酶活收率为3 9 左右。通过对载体结构分析发现，载体在固定化 酶后仍保持着良好的大孔状结构，并发现当载体的比表面较大时，具有较好的固 定化效果。 提出了固定化菌体与固定化酶反应器的耦联模型，并确定了耦联点为底物在 菌体反应器中达到7 5 的拆分率。底物首先通过固定化菌体的c s t r 反应器， 在反应3 2 h 后，进入固定化酶填充床反应器，层高度选为2 5 e r a ，线速度为1 1 8 m h ， 则拆分率可达到9 9 以上。 通过将乙酰d 蛋氨酸在酸性条件下的水解并经过离子交换柱分离的方法制 各了高纯度的d 蛋氨酸。通过研究得出乙酰d 蛋氨酸在酸性条件下水解的最佳 反应条件，脱乙酰率达9 7 8 7 ；分析得出了流出液中d 蛋氨酸浓度与p h 之间 的关系以及贯穿曲线的贯穿函数、交换区高度等参数。通过本方法制备的d 一蛋 氨酸纯度达9 9 7 4 9 ，脱乙酰收率为8 8 9 6 。 采用与乙酰d 蛋氨酸相同的水解条件，制备了高纯度的d 。l 苯丙氨酸。研 究了离子交换过程中的贯穿曲线和洗脱曲线，得出了流出液中d ，l 一苯丙氨酸浓 度与p h 之间的关系，并确定了洗脱过程的操作温度为7 0 。c 。通过本方法制备的 d 。l 苯丙氨酸纯度达9 9 6 5 9 ，脱乙酰收率为8 8 5 6 关键词：d e a e d h ，氨基酰化酶，固定化，耦联拆分，高纯度d 蛋氨酸 a b s t r a c t t h ec o u p l e dr e a t o r ( b s t ra n dp b r ) w a su s e dt o o p t i c a lr e s o l u t i o n o f n - a c - d l - m e t h i o n i n e b s t rw a sf i l l e dw i t hi m m o b i l i z e da s p e r g i l l u so r y z a ep e l l e t s ， w h i l ep b rw a sf i l l e dw i t hi m m o b i l i z e da m i n o a c y l a s e t h ef l u i dw a sf i r s tt r e a t e db y i m m o b i l i z e da s p e r g i l l u so r y z a ep e l l e t s ，a n dt h e nt h ee n z y m a t i cd e a e y l a t i o nw a s t r e a t e db yi m m o b i l i z e da m i n o a c y l a s ew i t hh i 曲r a t eo fc o n v e r s i o n a n das i m p l ea n d e f f e c t i v e t e c h n i q u e f o r o b t a i n i n gd - m e t h i o n i n e w i t l l l l i g h p u r i t y f r o m n - a c e t y l - d - m e t h i o n i n eb yi o n e x c h a n g ei sp r e s e n t e d t h ei m m o b i l i z a t i o no fa m i n o a c y l a s ew a sp e r f o r m e dv i ad i e t h y l a m i n o e t h y l d i v i n y lb e n z e n e ( d e a e - d h ) 羽kr e s u l ts h o w e dt h a td e a e - d h 一8w a ss e l e c t e da s t h eb e s ti m m o b i l i z a t i o nc a r r i e r , w h i l et h es p e c i f i ca c t i v i t yw a su pt o1 3 4 0 1 4 2 0 u g ， w h i l et h ea c t i v i t yy i e l dw a sa b o u t3 9 at h ea n a l y s eo fc a r r i e r s s t r u c t u r e i t m a i n t a i n e dm a c r o p o r o u sa f t e ri m m o b i l i z a t i o n t h ee f f e c tp e r f o r m e de x c e l l e n t ，w h e n t h es u r f a c ew a sl a r g e t h ec o u p l e dr e a t o rf i l l e dw i t hi m m o b i l i z e da m i n o a c y l a s ea n di m m o b i l i z e d a s p e r g i l l u so r y z a ew a sp r e s e n t e d w h e nt h er e s o l u t i o nr a t eo fs u b s t r a t ew a s7 5 i n t h er e a c t o ro fi m m o b i l i z e d a s p e r g i l l u so r y z a ea f t e r3 2h o u r s , t h em i x t u r ew a sf u r t h e r e n z y m a t i c a l l yd e a c y l a t e d b yt h ei m m o b i l i z e da m i n o a c y l a s e t h eh e i g h to ft h e i m m o b i l i z e da m i n o a c y l a s er e a c t o rw a s2 5 c m t h er e s o l u t i o nr a t ew a s 嬲h i i g ha s9 9 w h e nt h ev e l o c i t yo f f l o ww a sb e l o w1 18 m h e s o l u t i o no fn - a c - d l - m e t h i o n i n ew a sc a r r i e do u ti nb a t c hr e a c t o r ；t h er e a c t i o n t i m eo fs p e c i f i cc o n v e r s a t i o nc a l lb ec a l c u l a t e db yt h em o d e lw h i c hw a sp u tf o r w a r d i nt h ep a p e r t h e nt h ef u r t h u r er e s o l u t i o no fe n z y m a t i o nd e a c y l a t i o nw a sc a r r i e do u t i nc o n t i n u o u sr e a c t o r ( p a c k e db e dr e a c t o r ) ao n e - d i m e n s i o na x i a ld i f f u s i o nm o d e lo f r e a c t o rw a sp u tf o r w a r d b a s e do nt h em o d e l ，t h ep r e d i c tr e s u l tc o i n c i d ew e l lw i t ht h e e x p e r i m e n td a t a t h en a c e t y l d - m e t h i o n i n e p u r i f i e d f r o mt h em i x t u r eo f e n z y m a t i c a l l y d e a c y l a t e dn a c e t y l d l - m e t h i o n i n ew a sh y d r o l y z e di nt h ec o n d i t i o no fh y d r o c h l o r i c a c i d t h ed e a c y l a t i o nr a t ew a s9 7 ，8 7 。d m e t h i o n i n ew a ss u c c e s s f u l l ys e p a r a t e da n d p u r i f i e df r o mt h eh y d r o l y s a t eb ym a c r o p o r o u sc a t i o n i ci o n e x c h a n g ec o l u m n t h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e np ha n dd - m e t h i o i n ec o n c e n t r a t i o nw a si n v e s t i g a t e da n dt h e b r e a kt h r o u g hf a c t e ra n de x c h a n g ez o n eh e i g h tw a so b t a i n d e e x p e r i m e n t a lr e s u l t s i n d i c a t e dt h a t ，t h ep u r i t ya n dy i e l do fd m e t h i o i n ec a l lr e a c ha sh i g ha s9 9 7 4 9 a n d 8 8 9 6 , r e s p e c t i v e l y t h eh i g hp u r i t yd l - p h e n y l a l a n i n ew a sp r o d u c e di nt h es i m i l a rc o n d i t i o n sa s d m e t h i o n i n e t h eb r e a kt h r o u g ha n de l u t i o nc u r v e sw e r ei n v e s t i g a t e d i nt h e i o n e x c h a n g ep r o c e s s t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e np na n dd l - p h ec o n c e n t r a t i o nw a s o b t a i n e d ，a n dt h eo p e r a t i n gt e m p e r a t u r ew a s7 0 ci nt h ee l u t i o np r o c e s s t h ep u r i t y a n dy i e l do f d l - p h ec a l lr e a c h 觞h i g ha s9 9 6 5 9 a n d8 8 5 6 , r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：d e a e - d h ，a m i n o a c y l a s e ，i m m o b i l i z a t i o n ，c o u p l e dr e a c t o r , r e s o l u t i o n ，h i g hp u r i t yd m e t h i o i n e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得丞鲞蠢堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：物筛系签字同期：2 。p 1 年 7 月邳同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫盗盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤鲞盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：杨饰系 导师签名： 签字r 期：2 。门年7 月矽同 签字嗍：抄7 年( 月哆日 第一章文献综述 第一章文献综述 随着生命科学，特别是基因工程的迅猛发展，人们对组成生命的基本分子氨 基酸的研究也不断深入，而对氨基酸及其衍生物的生物学功能的了解不断深入， 氨基酸的应用范围也日益扩展。目前在自然界中已经发现以及人工合成的氨基酸 近4 0 0 种，它们主要用于食品、日用化工、农药、保健品和新药的合成制备以及 生命科学的研究，其中用于医疗和医药合成的药用氨基酸包括组成蛋白质的2 0 种天然氨基酸和多种非天然氨基酸，如各种d 一氨基酸【。 1 1 蛋氨酸的性质及市场分析 蛋氨酸即2 氨基4 甲硫基丁酸( d l c h 3 s c h 2 c h 2 c h ( n h 2 ) c o o h ) ，相对 分子质量1 4 9 2 1 ，是旋光性化合物，又名甲硫氨酸。天然为l 一型，是构成蛋白质 的重要组成。白色片状晶体或结晶性粉末，1 蛋氨酸水溶液的p h 值为5 6 6 1 ， 对热和空气稳定，对强酸不稳定，可导致脱甲基作用。从立体结构讲，它有左旋 体( l 型蛋氨酸) 和右旋体( d 型蛋氨酸) t 2 j 。l 一型或d 一型蛋氨酸均有相同的生 物活性。 蛋氨酸最初的商业价值是作为家畜饲料中的营养成分【3 。生产国主要有法 国、美国、日本和德国。据联合国粮农组织估计，目前市场对蛋氨酸的总需求量 约为2 5 0 - 2 6 0k t ，中国作为世界第二大饲料生产国，对蛋氨酸的需求更高，目 前我国主要依靠进口解决需求问题1 8 ，并且国内蛋氨酸生产装置与国外相比存在 很大的差距【9 1 。近年来，我国的饲料工业发展迅速，市场对蛋氨酸的需求量也 迅速增加，目前的生产量远远不能满足国内饲料等工业迅速发展的需求，每年都 需大量进v i t l0 1 。 近些年，人们更重视蛋氨酸的药用价值】。蛋氨酸作为氨基酸输液时，是 复合氨基酸的主要组分之一。蛋氨酸在动物体内几乎都被用作体蛋白质的合成 u 2 。在医药领域，蛋氨酸主要用于氨基酸输液和口服氨基酸制剂的生产，还用作 治疗药物、短肽药物和医药合成原料。 第一章文献综述 而且蛋氨酸作为医药级产晶的需求麓逐年增加。a l f a a e s a r 公司2 0 0 6 年最新的 产鑫撮价如表l l 所示。 袭1 1a l f a a e s a r 公司2 0 0 6 年蛋氨酸市场撤价 t a b l e l - 1t h ep r i c eo f m e t h i o i n i n ef r o ma l f a a e s a ri n2 0 0 6 可见，蛋氨酸的生产具有很大豹市场潜力【1 3 】。謦前的阆题是必须改变落后的 生产工艺，而采用世界上较为先进的生产工艺和技术，将各项收率提高，试剂消 耗下降，使其成本大幅度下降。根据中圈化工新闻网w w w c c i n c o m c a 的最新报 道，2 0 0 6 年8 胃湖北省八峰药化股份有限公司承担豹药用l 型氨基酸系列产品 国家高技术产业化示范工程，通过了湖北省发改娄组织的验收。建设年产5 0 0 吨 l 蛋氨酸生产线以及中心化验塞等配套设施，形成年产药用l 型氮基酸原料药 7 0 0 吨的生产规模填补了国内生产空白。而d - 蛋氨酸的工业化生产目前还没有文 献报道。 1 1 1l 蛋氨酸的应用 1 9 2 2 年m u e l l e r t l 4 】从蛋自震中分离窭蛋氨酸，1 9 2 8 年b a r f e r f q ：l c o y n e t l 5 】分析了 其结果为仅- 氨基1 1 丁酸的丫甲基硫醇衍生物。1 9 3 9 盔l z v i g n e a u d t l 6 】等人从动物营养 学角度磺究发现蛋氨酸有转警基律用。1 9 5 3 年，c a n t o n i 证实了蛋氨酸转晕基是 通过s 腺苷鬣氨酸( s a m ) 甲基化试剂实现的t i t 。l 蛋氨酸是人类和其他哺乳动 物体肉生长黧代谢过程爨必需鲍微量元素。人类的一些遗传疾瘾，鲡：胱硫醚尿、 高胱氨酸尿都是由于噩氨酸得不到正常代谢造成的f 1 8 】。蛋氨酸在人体叶酸代谢中 起着重要的俸鬟【蚓。蛋氨酸在生物体中的作用主要是通过s 。腺苷蛋氨酸( s a m ) 来实现，s a m 能够促使活化甲基和硫基，从而在体内完成1 0 0 多个反应。 o 蛋氨酸( l - m e 0 楚人类具有广泛应用价值的药物，包括调节俸内p h 帮电解 质平衡，是其他药物的辅助药物、营养药物等，是入类常用的8 0 0 种药物之一 2 0 1 。 第一章文献综述 1 1 2d 一蛋氨酸的应用 d 一蛋氨酸m e 0 是一种d 型氨基酸。d 氨基酸在医药领域的用途广泛，其 次在食品、化妆品、生化试剂领域也有应用价值。 ( 1 ) 用于合成治疗老年痴呆症药物，目前老年痴呆症药物市值在2 亿美元以 上，其中主要是阿尔茨海默性病人，在这类病人的脑组织中有淀粉样蛋白沉积， 导致脑内老年斑块形成，导致痴呆。目前国外对淀粉样蛋白沉积原理已经相当清 楚，并且已经证明如果用d 氨基酸合成脑内的部分类似肽，就可以治疗和预防 阿尔茨海默病，目前这已经是老年痴呆症药物的研究热点。 ( 2 ) 合成肽类抗疼止痛药。目前广泛使用的止痛剂是阿司匹林和扑热息痛， 但是他们都有一定的副作用，阿司匹林容易引起胃溃疡、胃出血，扑热息痛对一 部分人敏感，对重症患者、癌症患者不合适，而主要由d 氨基酸构成的肽类止 痛剂却没有上述缺点，而且作用持久高效。 ( 3 ) 用于肿瘤治疗。目前对癌症和肿瘤病人主要使用化疗，但是化疗对人体 正常细胞、肿瘤细胞、免疫系统( 尤其是造血系统) 都具有杀伤作用，副作用大。 为了减少化疗副作用，保护正常细胞，近年来国外开发了一系列有d 氨基酸构 成的肽类药物，这些药物可以使细胞分裂停留所谓的g 期不再继续分裂，在g 期的正常细胞在化疗时就可以大幅度地减少化疗的副作用。因此这些肽类药物在 肿瘤的联合治疗作用方面具有广阔的前景。 ( 4 ) 制备人体激素类似物。激素在人体内发挥着重要作用，人体内的一些肽 类对激素产生着调节控制作用，有些肽类本身就是激素，但是人体的自然肽量少， 而且随着年龄、疾病而发生变化，人体内的肽类由l 氨基酸构成，它们容易被 降解吸收，目前国外已经开发出了由d 氨基酸构成的人体自然肽的类似物，他 们在人体内发挥同样作用，而且降解缓慢。这类药物显示了良好的前景。 ( 5 ) 制备生长激素m 1 抑制剂。生长激素i l 1 是已经广泛用于临床的生物 工程药物，它是l 氨基酸构成的肽类药物，市场需求量巨大，用于治疗很多疾 病。但是开发与它作用相反的抑制剂，也非常重要，目前人类已经开发出了由 d 氨基酸构成的生长激素i l 1 抑制剂，其市场前景同样广阔。 ( 6 ) 合成直接刺激垂体分泌生长激素的肽类促进剂。目前已经有后叶加压素、 甲状腺释放素( t i m ) 、黄体释放素( l h r h ) 、黑色素促进剂( m s h ) 、胰高血 第一章文献综述 糖素用于临床，他们都能刺激垂体分泌激素，除t r h 外都是间接作用于垂体的， 嚣前国外已经开发了蠡d 。氨基酸构成豹童接作用于垂体的肽类促进素。 ( 7 ) 合成抑制神经紧张药物。肽类药物具有吗啡的性质，可以合成有效的抗 神经紧张药物。 ( 8 ) 用于角膜切除手术。目前很多视觉障碍都需要做角膜切除手术，如用激 光切除等，但是囊膜切除后必须尽抉恢复，曩翦圜外已经开发了出弘苯丙氨酸 等d 氨基酸为主要原料的角膜恢复剂。 ( 9 ) 其它用途。如合成毛发和表皮发生制剂、肽类蛋白酶抑制荆、n m d a 受体药物、烟酰胺乙酰胆碱受体、钙通道、钠通道、抗癫痫药，脑啡呔类药物。 1 1 3l 一蛋氨酸的生产方法 1 1 3 1 发酵法 通过发酵法生产的蛋氨酸为具有生物活性的l - 蛋氨酸。然而l - 蛋氨酸发酵 法生产中存在微生物麴变异和些发酵工艺问题，至今没有能够生产出高浓度的 蛋氮酸，随着l 蛋氨酸临床应用的增长，l 蛋氨酸的生产成为了研究的热点f 猢。 1 1 。3 2 不对称合成法 关于不对称合成的报道很多，但不对称合成法生产l 蛋氨酸的方法工艺复 杂，价格较离，难予正业纯生产。 1 1 3 3 生物拆分法 化学合成法合成鹣蛋氨酸均是混旋麴氨基酸，需要进行手性拆分翻。工业上 拆分蛋氨酸作用的酶是氨基酰化酶或含氨基酰化酶的菌体。 t o s a t 2 1 】等人实现了蔫固定化氨基酰化酶菌体实现d l - 蛋氨酸的连续拆分工 业化生产。m o r i n a g a 2 2 】报道了选用突变剂乙硫氨基络酸作用后的p e s u d o m o n a s f m5 1 8 ，出d 乙高半赋氨酸帮甲酵生产l 蛋氨酸。s o d a 2 3 】选用b a c i l l u ss p 。2 6 6 襄 v i b r i os p 2 5 6 ，由n ，氨基甲酰蛋氨酸生产l 蛋氨酸，产率分别为3 4 4 和2 5 5 。 y a m a s h i r o t 2 4 1 等选j 3 曩b a c i l l u sb r e v i s 嚣j 它的突变育种，由d l 5 乙内酰艨生产b 蛋氨 酸。v o e l k e la n dw a g n e r t 2 5 ) 等人选用彳俐”_ d 6 口c ，o ，s p d s m7 3 3 0 和彳妒窖曙讲ws p 通过d l 一5 甲基硫基乙基乙内酝艨生物转化得到纛。蛋氨酸。w a g n e r 2 翻等人选用 d s m 9 7 7 1 突变菌株，生物转化d l 5 ( 2 甲基硫基乙基) 乙内酰脲得到l 。蛋氨酸， 第一章文献综述 转化率为9 0 ，尽量增大d l - 5 ( 2 甲基硫基乙基) 乙内酰脲( 3 0 9 l 0 ) 浓度，酶系 统没有出现抑制现象。选用魏硫醚母合成酶生产毯氨基酸已有报道【2 强。t o k u y a m a a n dh a t a n o 2 s 】选用重组细胞( e s c h e r i c h i ac o l im m 2 9 4 ( d e 3 ) 和a m y c o l a t o p s i ss p ) 连续拆分反应器拆分n - 乙酰氨基酸豹收率达到9 9 。湖北省八峰药化股份有限公 司即采用了氨基酰化酶拆分技术，实现了年产5 0 0 吨l 蛋氨酸的工业化生产，其 主要麓反应过程如下： r d l 嘲e t r = c h 3 s c h 2 c h 2 + 人+ h o c h 3 r a c d l - m e t l - m e th a ca c d l m e t 图1 1 乙酰- d l 爨氨酸拆分原理 f i g l - l t h er e s o l u t i o np r i n c i p l eo f n - a c - d l - m e t c h 3 1 1 。4d 氨基酸的生产方法 组成人体内生命物质的2 0 种基本氨基酸除甘氨酸外，都有两种互成镜像的对 映体d 和l 型，历来认为生命物质只存在l 一氨基酸，随着分析方法的发展，人们 相继地在海洋动物、陆生动物、脊椎和无脊椎动物、种子植物和人体中发现了， 各种d 一氨基酸之后【2 9 川，d 一氨基酸才引起人们的重视并意识到d 一氨基酸作 为医药、农药和食品等的重要组成所起着的重要作用。 到目前为止，d 一氨基酸尚无工业生产报道，还在研究的制备d 氨基酸的 方法主要包括癸1 】： 1 ) 、不对称合成方法直接制备。这是种最简捷的方法。然而，由于不对称 催化剩的选择等因素，反应总牧率不高、光学纯度不够，嚣前绝大多数d 一氨基 酸还不能用此方法制铸。 2 ) 、由l 一氨基酸或消旋化氨基酸通过不对称转换制备。不对称转换由外消 旋体或l 一氨基酸直接制备d 一氨基酸，可获得高收率、高光学纯度的单一光学 异构体。 3 ) 、合成外消旋体然后拆分。这种通过化学合成制备外消旋体，在进行拆分 制餐d 一氨基酸是现在国内外认为有前途豹方法。根据拆分的手段和途径不弱， 拆分方法分为物理拆分、化学拆分、生物拆分等。 薹|专 第一章文献综述 物理拆分法中的结晶拆分法【3 2 】分为两种情况，优先结晶法和逆向结晶法。优 先续鑫法决定于在s 型旋光异构体的避饱和溶液孛，融或s 。型旋光异构体结晶 速度的差异，在合适的条件下可获得纯旋光活性异构体。逆向结晶法是在一种手 性外加扬的存在下进行结墨，这种外加物耱立体选择性地吸附在一种对跌体瑟体 表面而使晶体的生长速度下降几个数量级因此造成另一种对映体优先结晶。利 用对映体与手性试裁的反应速度不同，反应慢的在未反应物中占优势，结果谢得 到有旋光性的产物这种方法称为动力学拆分。烯酮、胺、醇及氨基酸类可利用 不对称还原、不对称酯化等的速率不同翼露绘以拆分【3 3 1 。 化学拆分法【”】是使外消旋体与手性试剂作用生成非对映体，利用非对映体物 理、化学性质的差异两将它们分开。针对氨基酸，手性试剂通常是旋光活性的酸 或碱。使氨基酸与手性的酸或碱作用，生成两种非对映体的盐，利用盐在溶剂中 的溶解度匏差异，通过结晶的方法将它们分开。分开后的葛# 对映体，用普通的酸 或碱中和，就可以得到氨基酸的旋光异构体，同时，游离如手性的酸或碱，循环 使用。拆分氨基酸的另可行方法是用旋光性的酸使氨基酸的氨基酰化或用旋光 性的酸使氨基酸的羧基酯化，生成非对映体，分离后，去掉酰基或烷氧基，可得 到游离的旋光氨基酸。 。生物拆分f 3 5 】是用完整的微生物细胞或从微生物细胞中提取的酶作为催化荆， 使外消旋体中的一种旋光晃构体选择性的降解或反应，从丽将两种对映异构 体分开。由于生物催化剂的立体选择性强、反应条件温和、操作简便、成本较低、 公害少，且能完成一些化学合成法难以宪成的反应。近年来，d 一氮基酸的生物 转化与拆分技术的研究文献固益增多，为生产d 型氨基酸提供了一条可行的路线 1 3 6 。 。 上述各种拆分方法都有其独到之外，然而不管那种拆分方法都具有一个共同 缺陷：由于外消旋体中只有5 0 的d 一型旋光异构体，即使能够完全拆分，从外消 旋体到d 型旋光异构体也只有5 0 的收率。但是，实际上不能完全拆分，致使旋 光异构体的拆分收率在2 0 - - 4 0 之间，通常为3 0 左右。要提高拆分收率，必 须通过各种方法将l 一型异构体消旋化，这需要耗费大量的入力、物力、财力， 拆分效率和效益都比较低。另外，在目前应用较多的化学拆分法的拆分过程中， 还会有对映体的夹带析出，影响光学纯度因此，研究新豹拆分方法制备d 一型氨 第一章文献综述 基酸具有非常重要的意义【3 7 1 。 据讫学化工霹2 0 0 6 年8 莠2 l 豳漕息，中国科学院成都有机化学公蠲自主研究 开发的“用青霉素酰化酶制备d 。氨基酸的方法”项目，近日通过了四川省科学技 术厅组织的鉴定，该方法采焉化学消旋和生物酶法拆分裰结合制各d 氨基酸方 法，制备出多种高光学纯度的d 氨基酸产品。 俞一军，许松文等t 3 s ：将n 乙酰d , l 苯霭氨酸经氨基酰化酶拆分后的副产物 n - 乙酰d 苯丙氨酸水解结晶制备出了d 型的苯丙氨酸，最高收率仅为6 3 ，光学 纯度仅为9 6 。但通过剽产物得到d 型的氨基酸的方法筒单易行，成本低廉，关 键是要提高收率和纯度。 本实验采用的l 蛋氮酸和d 蛋氨酸的生产工艺如图1 2 所示： 蛋氨黢二墼乙酰 酰化 图1 2l - 蛋氮酸及d 蛋氨酸生产工艺流程 f i g l - 2p r o c e s se n g i n e e r i n go f l - m e t a n dd - m e t 蛋氡酸 工艺贪绍：蛋氨酸经过酰化后得到乙酰- d l 蛋氨酸，用氨基酰化酶拆分，用 强酸性离子交换柱分离出拆分液中的。蛋氨酸产晶，在漏过液中剩余的主要是n 乙酰_ d 蛋氨酸和少量未反应的n 乙酰d l - 蛋氨酸。剩余液可选用醋酸酐消旋剩 余的乙酰d 。蛋氨酸，得到乙酰d l 蛋氨酸，实现原料液的充分利用，过程的总 收率接近4 5 ；也可将剩余液褥次用氨基酰化酶拆分，通过强酸性离子交换柱分 离，收集液为n 乙酰。d 蛋氨酸，水解拆分得到d 蛋氨酸。 由蛋氨酸得生产工艺可以看出，着想制得高纯度的d 一蛋氨酸产品，必须提 高乙酰- d l 蛋氨酸的拆分率，西前报道的蛋氨酸的拆分催化剂主要采用固定化菌 体和固定化酶。固定化菌体可以省去酶的提取、纯化等工艺过程，并且价格便宜， 固定化酶丽可用俸乙酰d l 蛋氮酸的高转亿率拆分。因此，可以将两者藕合拆分 乙酰d l 蛋氨酸，既降低生产成本，又可以获得高纯的l 蛋氨酸和d 蛋氨酸， 而固定化酶的关键就是对固定化载体的筛选。 第一章文献综述 1 2 氨基酰化酶的性质和来源 1 2 1 氨基酰化酶的性质【3 9 】 图1 3 氨基酰化酶的立体结构 f i g l - 3t h e ed i m e n s i o n a l 羽l e 曩l 把o f 袖o a c y l a s e 表1 1 2 氨基酰化酶钓性质 t a b l e l - 2t h ep r o p e r t yo f a m i n o a e y l a s e 性质氨基酰化酶 抑制裁c 矿c u 2 + m n 2 + n p 二乙基碳酸氢钠 金属离予催化剂c 0 2 + z n 2 + 最佳瀛度5 5 最健p h 7 0 氨基酰化酶( e c3 5 1 1 4 ) ，n - a c y l a m i n o a c i da m i d o h y d r o l a s e 或a c y l a s el ，具 有较强光学特异性，立体特异性为l 型，它能够将化学合成的n - 乙酰- d l 氨基 酸拆分( 水解) ，从而得到l 一氨基酸。 从米曲霉中提出的氨基酰化酶是个双亚基酰化酶，该酶的分子量为7 3 ，2 0 0 - 1 3 6 ，0 0 0 d a ，赢径约为2 n m 。分子中有1 2 个半胱氨酸残基，其中有4 个游离的。s h 和2 个二硫键，亚基之间没有二硫键。该酶固蔫于细胞辱管表面，每个亚基含 4 0 6 个氨基酸，其氨端为乙酰丙氨酸。每个亚基含一个z n 2 十，是一种含锌金腐酶 【4 0 1 ，如图1 3 和表1 2 所示。 1 2 2 氨基酰化酶的来源 氨基酰化酶酌来源广泛，存在于各种动物和穰物器官、微生物体内及荬发酵 第一章文献综述 液中。迄今为止，已经在米曲霉菌【4 1 1 、葡萄酒色青霉菌【4 2 1 、产碱杆菌【4 3 1 、芽孢 杆菌5 1 、阿拉伯乳酸杆斟矧、分枝杆菌【4 刀、嗜麦芽假单胞茵【4 8 1 等微生物中提 取得到，见表1 3 。其中用的比较多的是猪肾酶和米曲霉，两者相较，猪肾酶来 源广、便宜，但精制困难不宜用作固定化酶，且只适合蛋氨酸的拆分，产品难以 防止动物疾病的传染，产品不能销往国外，特别是伊斯兰国家。而米曲霉应用面 广是目前国际上应用最多的酶源。 表1 3 不同来源氨基酰化酶对酰化氨基酸水解能力比较 t a b l e l 3c o m p a r i s o no f r e l a t i v ea c t i v i t yo f l - a m i n o a e y l a s ef r o md i f f e r e n tr e s o u r c e s 从米曲霉3 0 4 2 中提取得到了米曲霉氨基酰化酶，其纯化倍数为5 4 2 9 ，比活 为6 4 7 6 6 u m g ，总收率为4 9 5 3 1 4 9 1 。王淑豪、刘阳【5 0 - 5 1 1 等人对米曲霉3 0 4 2 进 行了紫外诱变，通过诱变培养基进行优化培养、筛选，得到比出发菌株酶活高的 菌株。王荆5 2 1 采用这种菌株进行液体培养得到的酶活最高。 1 3 酶的固定化 1 3 1 常见固定化方法 目前，固定化酶在工业方面的应用研究报道越来越岁5 3 1 。酶和细胞的固定化 方法主要有以下四种：吸附法、包埋法、共价键结合法和交联法【5 4 】，四种方法各 有其优势和不足，如表1 4 所示。 1 3 2 氨基酰化酶固定化及其进展 固定化酶就是将酶结合在载体l ，或者限制在有限的空间内，能与反应溶液 第一章文献综述 分离，保留在反应器肉或能被回收并反复利用，与游离酶相比，有以下优点【5 5 】： 差) 稳定性增强 2 ) 酶能反复利用 3 可实现连续纯酶反应 可根据需要制成不同性质及形状的固定化酶 s ) 可以缩小复痰器的体积 酌反应条件容易控制 铃可提离反应产物瑟缝度鞫产率 8 ) 具体充分的利用资源、可以节省资源和起劐环境保护的作用。 表l 备种蠢定纯方法翡优缺熹的比较 t a b l e1 - 4c o m p a r i s o nt h em e r i ta n dd i s m e r i to fd i f f e r e n ti m m o b i l i z a t i o nm e t h o d 嚣翦，国肉舞报道懿各种露定诧酶方法主要集孛受包埋法和离子暖鬻法。 包埋法的研究如下：藻酸盐、聚丙烯酸酰胺、凝胶固定化络氨酸酶，循环使 震夕次蜃，酶活力势原来熬3 0 1 - 辩1 。选雳丙烯酸胺、戎二醛、遂硫酸铵雹埋法 固定化氨基酰化酶，拆分苯丙氮酸，酶的利用率为8 5 f 5 7 1 。丙烯酰胺、2 羟乙基 平基嚣烯酸盐包埋法黧定纯程胰凝乳蛋白酶，连续拆分七鼹期，酶活为最初酶 活的5 0 0 删。聚乙烯监胺功能基化的藻酸钙固定化氨基酰化酶拆分苯丙氨酸， 研究了鸯定纯酶麴铡备、酶活力帮连续拆分靠数，连续搽作羯羯2 5 天翱。藻酸 钙微胶囊包埋酶，酶泄漏现象消失【6 0 】。醋酸纤维膜固定化氨基酰化酶，酶膜的总 活力收率巍7 7 5 毒，低温保存，每过2 4 h 重复便瘸一次，酶貘重复使震1 0 次薏， 酶活力接近予原来的8 0 6 q 。 第一章文献综述 离子交换吸附法的研究如下：利用中空纤维固定化牛肾氨基酰化酶，固定化 酶常温下拆分一周稳定，但对热不稳定，4 0 条件下放置3 0 r a i n 活力下降3 0 【6 2 1 。 d e a e s e p h a d e xa 2 5 固定化由米曲霉中提取的米曲霉氨基酰化酶，固定化酶在 5 0 连续拆分3 0 d ，酶活仅损失3 5 【6 3 】。弱碱性阴离子大孔树脂d 3 8 0 固定化氨 基酰化酶，固定化酶活力以苯丙氨酸为底物计算是6 2 0 u g ，将树脂转化成c l 。型 固定化效果最好唧1 。功能基化丙烯酸酰胺丙烯酸甲酯交联共聚物固定化氨基酰 化酶，载体功能基是二胺基或多乙烯多胺解，该固定化酶活力高( 2 0 0 0 u g ) 【6 5 】。 不同结构的丙烯酸甲酯二乙烯苯交联共聚物，用多乙烯多胺，对其胺解进行功 能基化，进而固定化氨基酰化酶【6 6 】。大孔网状高分子载体对氨基酰化酶固定化， 吸附酶活力4 6 2 2 u g ，酶活力回收率4 5 7 8 【6 7 】，但是此方法很难重现，无法实 现工业化生产。 1 9 6 9 年c h i d a t a 等【5 3 1 以d e a e s e p h 孕d e x 为载体将氨基酰化酶固定化实现了 工业化生产，但因d e a e s e p h a d e x 是粒径较小的凝胶，流体力学性质以及机械 强度欠佳，而且酶活仅为7 0 0 u g 。包埋法无法重复使用，因此考虑到工业化生 产经济性，人们侧重吸附法固定化研究。这方面的研究如下：功能基为聚乙烯亚 胺聚合物( 分子量为2 5 0 0 0 ) 的弱碱性树脂固定化转化酵素、牛乳糖酶、葡萄糖 淀粉酶等，固定化牢固、不易脱落、可重复利用、稳定性提高【6 ”0 1 。功能基为硫 酸右旋糖苷固定化米曲霉中的d - g a l a c t o s i d a s e s 、k l u y v e r o m y c e sl a c t i s 等酶，在有 机溶剂中很稳定、适合骨架结构存在强亲水微环境的情况【7 q 。功能基为d e a e 载体固定化d 一氨基酰化酶，固定化酶活力2 6 5 0 u ( m l 凝胶) ，4 5 c 连续拆分 a e - d l m e t1 7 天酶活力为原来的9 0 【7 2 1 。 1 4 耦联反应器 固定化酶( 菌体) 反应器主要有间歇反应器、连续搅拌釜式反应器、填充床 反应器及流化床反应器。影响酶反应器选择的因素很多，一般可以从以下角度考 虑：固定化酶( 菌体) 的形状、底物的物理性质、酶反应动力学特性、酶的稳定 性、操作要求及反应器本身的造价等。 近年来，对于固定化菌体反应器研究很多 7 3 , 7 4 1 ，主要是填充床反应器和连续 搅拌反应器，然而固定化菌体本身硬度小，在较高的流速下，填充床反应器内的 1i 第一章文献综述 压降增大，则容易造成压密阻塞现象；在连续搅拌反应器中则容易使菌体受到剪 切力的影响。米曲霉菌体是一个多酶体系，而且菌体自身还有代谢反应，其拆分 乙酰- d l 蛋氨酸的效率和转化率都受到一定程度的限制。 固定化酶反应器是生化反应器研究的重点内容之一【7 5 , 7 6 1 ，由于氨基酰化酶固 定化载体研究一直没有得到很好地解决，因此目前的固定化酶反应器处于研究阶 段。因此，固定化酶的反应器具有很高的研究价值。 固定化菌体可以省去酶的提取、纯化等工艺过程，而固定化酶拆分乙酰d l 蛋氨酸的转化率高，因此可以将固定化菌体与固定化酶耦合拆分乙酰d l - 蛋氨 酸，既可降低生产成本，又可以获得高效分率的l 一蛋氨酸，也为d 蛋氨酸的制 各奠定了基础【7 7 】。 1 5 载体的性质及离子交换操作 固定化酶就是将酶结合在载体上，大孔弱碱性阴离子交换树脂相对凝胶型树 脂固定化酶效果好，树脂粒径大、机械强度好。因此研制开发一种固定化酶活高、 稳定性好、适合工业化生产的弱碱性树脂作为固定化载体成为研究的重点；并且 应用树脂的离子交换法提取精制氨基酸的研究也是氨基酸工业中研究的热点7 8 _ 8 l 】 o 1 5 1 载体的性质 树脂载体的结构及其性能直接影响固定化及分离的效果，主要参数包括以 下：比表面、孔径、孔径分布、含水量、功能基含量、树脂稳定性等。 1 5 2 离子交换操作系统的简要说明 8 2 】 1 ) 预处理 待处理的树液在进入离子交换系统之前，须进行预处理，以创造适于离子交 换操作的工艺条件。调整料掖中分离组分的浓度与介质p h 值，往往是预处理工 序的重要内容。 2 ) 吸附与洗脱 吸附工序是整个离子交换工艺的核心。这一工序的操作行为与分离性能，很 第一章文献综述 大程度上决定了离子交换分离工艺的成败优劣。但吸附操作并非工艺目的，只是 一种分离手段，函此待分离组分被橱脂吸附与大量杂质分离后，下一步操作便应 是卓有成效地将待分离组分从饱和树脂上洗脱( 也称淋洗) 下来。 3 漂洗与冲洗 为了提高分离效果，饱和树脂床在进行洗脱之前，须将床层中残留的料液及 积累盼机械杂质魇水漂洗除去。因为此漂洗液中含有分离组分，漂洗独领返回吸 附工艺系统小，以减少有用组分的损失。 饱帮树冕器洗脱后返回吸附王序，循环使用。为了维持吸附工序曲正常操作条 件，树脂返回前，须将床层中剩余的洗脱剂反洗除去。对于有用组分的提取、回 收来说，床层中剩余的洗脱液中含有用缀分，此洗脱液须缓冲洗后返回以减少有 用组分的损失。 ， 4 ) 再生 经洗脱詹的树脂可以循环使用，但有时由于工艺料液成分复杂，往往含有一 些特殊组分，它们一基被挺骀吸附后，很难用一般的方法洗脱。循环使用时，必 将导致树脂操作容量下降，这就是树脂中毒。须用浓酸、+ 浓碱在一定温度条件下 处理，以使树脂再生，恢复其交换能力。 1 s 3 流出曲线的概念 离子交换柱操作过程的行势，可用流出盐线袭征。流浅瞌线反映了恒速条件 下，不同时刻流出液中离子浓度的变化规律。若柱底流出液中发现交换离子，表 明此时交换柱已贯穿。在实际操作中，漏出酶第一个交换离子，很难被及时捕捉 到，为了检测方便，工程上规定，流出液中交换离子浓度达到进料液浓度的3 - 5 时，便认为交换柱贯穿。同样，流出液中交换离子浓度达到进料液浓度的9 5 9 7 时，便认为树脂饱