（化学工程专业论文）磁场—趋磁细菌复合工艺处理含重金属离子废水.pdf

中文摘要 本文提出全新的磁场一趋磁细菌综合治理重金属废水的理论及复合工 艺。对该工艺所涉及的趋磁细菌混合菌的生物种属和磁特性及其处理重金属 废水的机理进行深入研究，确定了复合工艺最佳操作条件，探讨了两种重金属 离子存在时竞争性吸附动力学机理，另外还研究了在外加磁场作用下，废水中 趋磁微生物的复杂受力和运动。 研究过程中先对从污水处理厂取回的活性污泥进行趋磁细菌富集培养。 将活性污泥分别在厌氧、微好氧和好氧条件下培养，然后通过扫描电镜和透 射电镜分别观察混合菌的形态和特征，并对菌进行了筛选和分离，为吸附重 金属离子提供实验基础和分析依据。 利用所获得的混合菌对各种不同的重金属离子进行静忿吸附实验) 确定 适合用该细菌处理的金属种类，并对处理各种金属离子的操作条件进行了研 究，为以后的动态实验提供参考操作条件。在对趋磁细菌吸附单一重金属离 子过程的研究基础上，对两种重金属离子同时存在时产生的竞争性吸附的机 理进行分析，建立理论模型并求其解析解。 通过对生物吸附重金属离子行为的研究发现，生物吸附受p h 值影响较 大，而且存在最佳p h 值范围，不同的重金属离子种类最佳p h 值也不相同； 生物吸附主要是细胞表面吸附，在很短的时间内即可达到吸附平衡；在室温 范围内，温度对生物吸附的影响不明显。 在对吸附了重金属离子的趋磁细菌与水体的分离过程中，利用多悬丝分 离器和多平板分离器，分别研究了不同磁场强度对分离过程的影响，并在扫 描电镜下观察了悬丝上被捕集的趋磁细菌的形态和结构。 另外，在外加磁场作用下，对废水中趋磁微生物的复杂受力和运动进行 分析研究，并建立了运动方程对趋磁微生物的运动轨迹进行描述。 关键词：重金属离子，磁化，趋磁细菌，复合工艺，竞争性吸附。 a b s t r a c t an o v e lc o m p r e h e n s i v ew a s t e w a t e rt r e a t m e n tt e c h n o l o g yi s p u tf o r w a r d ， d i s c u s s e da n dp r o b e d ，c o m b i n i n gh i 鲈g r a d i e n tm a g n e t i cs e p a r a t i o n ( h g m s ) w i t hm a g n e t o t a c t i cb a c t e r i a ( m t b ) t h eg e n r ea n dc h a r a c t e r i s t i c so fm t b m i x t u r ea r ei d e n t i f i e da n dt h eo p t i m u mo p e r a t i o nc o n d i t i o n sc o n f i r m e d m o r e o v e r , c o m p e t i t i v ea d s o r p t i o n k i n e t i c so ft w oh e a v ym e t a li o n si s e x p l o r e d ，a n d a d d i t i o n a l l y , t h em o v e m e n tm e c h a n i c so f m t bi nt h ee x t e r n a lm a g n e t i cf i e l d a st h ef i r s ts t e p ，b a c t e r i af r o ma c t i v em u da r ea c c l i m a t e do nd i f f e r e n tc u l t u r e c o n d i t i o n s ：a e r o b i c ，s l i g h t l ya e r o b i ca n da n a e r o b i c t h em i x e db a c t e r i aa r et h e n m a n a g e dt ob ei s o l a t e da n ds c r e e n e do u t t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h eb a c t e r i a ( m t b ) i nt h es l u d g e ，e f f e c t i v et ou p t a k eh e a v ym e t a l s ，c a ne a s i l yb ed e c i p h e r e d t h e i rn u m b e ri sc o u n t e db ym p nm e t h o d ，a n ds o m eo ft h ec h a r a c t e r sa r e o b s e r v e db ye l e c t r o nm i c r o s c o p e s i m u l t a n e o u s l y , a b s o r p t i o n t e s t so ns o r t so fh e a v ym e t a li o n sa r ec o n d u c t e di n p r e s c r i b e ds t a t i c w a s t e w a t e r a n dc o n s e q u e n t l y , t h ek i n d so fh e a v ym e t a li o n s s u i t a b l ef o rm t ba b s o r p t i o na r es e l e c t e d t h e n ，t h eo p e r a t i o nc o n d i t i o n sa r e s t u d i e df o rc o n t i n u o u se x p e r i m e n t s b a s e do nt h es t u d yo f b i o a d s o r p t i o no f s i n g l e h e a v ym e t a li o n ，t h ec o m p e t i t i v ea d s o r p t i o nk i n e t i c so ft w oh e a v ym e t a li o n s i s s t u d i e d ，an u m e r i c a lm o d e ld e v e l o p e da n da n a l y t i ca n dn u m e r i c a ls o l u t i o n sa r e o b t a i n e d d u r i n gt h es t u d yo ft h em i c r o b i ca b s o r p t i o nt oh e a v ym e t a li o n sw i t h i n m a g n e t i cf i e l d ，t h ec o u r s ei sf o u n dt ob ea f f e c t e dg r e a t l yb yp hv a l u ea n dt h e r ei s a no p t i m u mp hv a l u es c o p ef o rac e r t a i nm e t a l ，v a r y i n gw i t ht h eg e n r eo f b a c t e r i a t h ea b s o r p t i o ni sm a i n l yo nt h es u r f a c eo ft h em i c r o b es oi tc o u l dr e a c ht h e a b s o r p t i o ne q u i l i b r i u m s o o n t h ea b s o r p t i o ni sa l s o s l i g h t l y a f f e c t e d b y t e m p e r a t u r e u n d e rt h eo p t i m u mo p e r a t i n gc o n d i t i o n s ，s e p a r a t i o no fm t bc a r r y i n gh e a v y m e t a l sf r o mt h ew a s t e w a t e rf l u i di ss t u d i e du s i n gs e p a r a t o r sw i t hp a r a l l e l e d s t r i n g sa n ds l a b sr e s p e c t i v e l y v i s i b l ep i c t u r e sb ys c a ne l e c t r o n i cm i c r o s c o p y h e l pt od e s c r i b et h es h a p e so fm t b w i t ht h ea i do fm a g n e t i cf i e l d ，t h em o v e m e n to fm t bi s s t u d i e d s p o r t e q u a t i o n si nt w od i r e c t i o n sa r ed e v e l o p e d t od e s c r i b et h eb e h a v i o ro fm t b k e yw o r d s ：h e a v ym e t a li o n s ，m a g n e t i z a t i o n ，m a g n e t o t a c t i c m a g n e t i cb a c t e r i a ， c o m p o s i t et e c h n o l o g y , c o m p e t i t i v ea d s o r p t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得叁盗盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：字同期：_ 尹时年萝月，j - 同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨壅盘鲎有关保留：使用学位论文的规定。 特授权墨洼盘茔可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名 签字日期：z 痱月r 日 新虢毒多泐 签字同期：j ”j 年9 月，r 同 前占 月l j舌 任何一个地区或环境，只要有人类的日常生活和生产活动存在，就必然会 产生污水，而这些污水如果未经任何处理就排放到水环境中，就不可避免地 造成水环境的污染，危害人类的身心健康，危害工农业生产。近年来，随着 工农业生产的迅速发展，含重金属离子有机废水的排放量在逐年增加，对自 然水体的污染同益严重。重金属一般指原子量在2 1 - - 8 3 之间的金属，工业废 水中所含重金属毒物主要是指圾、c r 、n i 、p b 、c d 、m o 、z n 等，其来源 主要为冶金、机械、化工、电镀、纺织等行业。因此，污水处理技术的不断 发展和工程应用已经成为维系社会经济可持续发展的必要组成部分。 处理重会属离子的传统方法有很多种，主要有化学沉淀、离子交换、吸附、 氧化还原、电解和萃取等。但是，随着人们对水质要求韵提高，对污染的控 制及其管理措施日益严格，传统的方法就逐渐显示出会带来二次污染的缺点， 达不到新的排放标准。况且传统方法处理费用高，处理目标单一。例如，当 溶液浓度降到1 o 1 0 。3c 质量分数) 以下时，传统的方法就难以达到排放标 准。 另外，随着水体污染的f 1 益严重，单一的处理方法经常不能完成净化任 务a 因此，基于物理、化学和生物学原理的各种污水处理工艺不断出现。其 中生物处理技术的应用最为广泛，已经成为污水和有机工业废水处理的主流 工艺。 采取人工措施，以促进污染物在自然环境中被消耗从而减少的过程，就 是废水生物处理的实质。其机理是在废水中只培育能使污染物减少的生物， 则污染物被这种生物所摄取并作为能源而消耗，从而使废水得到净化。另外， 大多数微生物与重金属离子存在亲和性，这种亲和性来源于其自身生长的新 陈代谢需求。它们可以不断在微生物细胞或细胞团的外部积累。 另据报道有一种趋磁细菌( m a g n e t o t a c t i cb a c t e r i a ，m t b ) ，由于在细胞内 含有铁磁性颗粒( 尺寸范围为3 0 6 0 n m ) 在微弱的地球磁场作用下呈链状 排布在微生物的长度方向，使得这类生物具有永磁偶极距和磁定向性。因此， 在外加磁场作用下，m t b 会沿一定的方向游动。趋磁细菌与重余属离子存在 亲和性，如果金属离子是顺磁性的，随着它们不断在微生物细胞或细胞团的 外部积累，溶液中的金属离子浓度很快降低。被离子包裹的微生物细胞变成 了磁性颗粒，在外加磁场的作用下，这种有机颗粒可以沿着舰定的方向迁移， 最终沉积在固体表面上。通过高梯度磁分离技术( h g m s ) 可以加速累积速 前言 度。 本论文将趋磁细菌的磁特性和对重金属离子的吸附特性结合，用于处理 含重金属离子的废水。该方法具有效率高、能耗低、投资小，运行费用低、 体积小，结构简单、处理量大、维护容易、适用范围广等一系列优点。还可 以在此基础上创造条件有效回收一些贵金属，例如铂、金；另外，无副产物 ( 如氢气等) 产生，容易控制，无二次污染。 本文利用自行设计的磁分离器，开发了新型磁场一趋磁细菌复合工艺净化 含重金属的废水。在进入磁分离器前，向废水中加入趋磁细菌，充分混合， 在分离器内，吸附有重金属离子趋磁细菌在磁场中作定向运动，并将其去除。 查阅国内外文献、专利数据库情况表明，目前尚未发现有关磁场一趋磁细 菌复合工艺处理重会属废水的报道。 本文主要进行了趋磁细菌培养、影响因素等方面的研究，同时还对趋磁 细菌吸附重金属以及在磁场中的运动模型进行了详细的研究。引天综合治理 概念，提出趋磁生物理论并对其应用进行深入研究，以开发新的废水处理方 法。 第一章文献综述 第一章文献综述 重金属一般指原子量在2 l 8 3 之间的金属。工业废水中所含重金属毒物 主要指豫、c r 、c u 、n i 、p b 、c d 、m o 、z n 等，其来源主要为冶金、机械、 化工、电镀、纺织等行业。含有以上重金属离子的废水排入自然水体将严重 危害人体健康以及农业和渔业生产。因此，转化和回收废水中的重金属使排 放液达到国际排放标准，具有重要的社会现实意义0 , 2 】。 1 1 重金属离子的去除方法综述与评价 ， 废水中重金属离子的去除方法按主要机理可分为分离法和转化法。按照 治理过程重金属化学形态的变化可分为：化学形态改变法( 化学处理法、电 解法等) 和化学形态不变法( 蒸发、蒸馏、结晶，离子交换、电渗析、高梯 度磁分离法等) ；按照处理手段分类可分为物理法( 蒸发浓缩、反渗透膜分 离等) 、化学法( 中和法、硫化法、特殊试剂法等) 、物理化学法( 电解法、 液膜分离、离子浮选法、电渗析法等、活性炭吸附法 3j ) 、生物法( 活性污泥 法、生物膜法f 、植物法【5 1 等) ，以废治废法【6 1 等等( 见表1 1 ) 。 常用的传统处理方法如下【7 】： 1 1 1 中和法( n e u t r a liz a t ；o n ) 在含有重金属的废水中，投入中和剂，使之生成氢氧化物沉淀而被除去 的方法。使用中和法，必须了解重金属离子与氢氧根离子作用时，最适宜的 p h 值及处理后的残液在溶液中的金属浓度。若以表示重会属离子m ( o h ) 。表 示其生成的氢氧化物，则其反应式为： m “+ + n o h 一斗m ( o h ) 。山 以岛表示氢氧化物的溶度积，表示水的离子积，则： k ，。= 【m “】【o h r l g m ” _ l g k ，。一 l g k 。，一印厅 根据公式可以计算出各种重金属离子浓度随p h 值的变化并绘出 i g e m ”卜p h 图。根据离子完全沉积的要求，即残留离子浓度 1 0 5 t o o l l ，可 从图中查出每种离子沉积的最佳d h 值。 第一章文献综述 1 1 2 硫化法( s u i f u r a t i o n ) 在含重金属离子的废水中加入硫化钠或硫化氢等硫化物，使重金属离子 与硫离子反应，生成难溶的硫化物沉淀的方法。由于重金属离子与硫离子有 很强的亲和力，所生成的硫化物其溶度积很小，因此用硫化法去除重余属离 子是一种有效的方法。 1 1 3 还原法( r e d u c t i o n ) 含重金属废水与还原剂接触使金属由高价还原为低价而后再加沉淀剂除 去的方法。常用的还原剂有金属铁( f e ) 、硫酸亚铁( 凡s 仉) 、二氧化硫( 2 ) 、 亚硫酸盐等。例如，用废钢屑在酸性溶液中还原o “为o “； c r 2 0 ；一十1 4 h + + 6 f 台2 + = 2 c r + 6 ，台3 + + 7 月，0 ( 1 - 1 ) - 还原后的c r “被o i ：r 沉淀： o ”+ 3 0 h 一= c r ( o g ) ，山( 1 2 ) 由于p h 值对o “的还原反应影响很大，在处理过程中要注意保持一定的 p h 值。 1 1 4 离子交换法( i o ne x c h a n g e ) 用离子交换树脂把溶解在废水中的离子交换到离子交换体中，去除或者 回收重金属的方法。它是在固相离子交换剂和液相电解质问进行的，其原理 如下： 一r 一日+ + a ”+ 叶r n - - a ”。+ n b 一 ( 1 - 3 ) 式中：只。为交换树脂上固定的阴离子基团；曰+ 为可被交换的活动离子；a ”为 溶质离解形成的阴离子。 当溶液浓度较小而且离子交换达到动态平衡时反应的平衡常数服从下述 关系式： ：黑桀等(1-4)ab ” r 一+ ” 由于离子交换树脂价格昂贵，交换容量有限，因此只适用于处理含量低、 毒性大、有回收价值的重会属。 4 第一章史献综述 1 1 5 吸附法( a d s o r p t i o n ) 吸附法是利用吸附剂吸附溶于废水中重金属离子的一种方法，经常使用 的吸附剂有腐植酸吸附剂、活性炭吸附剂和硅酸盐类吸附剂等。 用腐植酸物质处理重会属废水，国内外开展了很多研究工作，已生产了 一批硝基腐植酸类物质的吸附剂，在处理电镀废水、染料废水时含表面活性 剂废水等均取得了很好的效果。应用结果表明：腐植酸树脂处理废水时，适 宜的p h 值范围为3 8 ；适宜温度范围为1 0 6 0 ；吸附平衡时间为l h r ； 适宜重金属离子浓度 f o 时颗粒爿能被磁场吸引而从磁场中分离出来。 废水流过高梯度磁分离器时，当导磁填料对废水中污染物的磁力作用大于 其他力的合力时，污染物被吸在填料上；切断磁路后，磁力消失，被填料捕 集到的污染物用压缩空气或水反冲洗f 来，从而达到从废水中去除污染物的 目的。 第一章文献综述 进抖t 且：浮静董 嘏廿站芯 可嗣电避场鞋自 铁i l l 性j 直车l 接收档及滑漓 图1 6 高梯度磁分离装置示意图”1 f i g 1 - 6s k e t c ho fh i g hg r a d i e n tm a g n e t i cs e p a r a t o r 1 6 2 高梯度磁分离器的特点和经济效益1 2 l 舯 1 ) 处理废水速度快、容量大、效率高，且温度及气候的变化不影响处理效 果。过滤速度可达1 0 0 5 0 0 米小时，对某些废水可高达1 0 0 0 米小时。 含有数百至数千p p m 的悬浮物的废水经处理后，悬浮物一船可降至3 0 1 0 p p m 以下，一台磁分离器处理废水每小时可达数十到数百立方米。 2 ) 直径在1 微米以下的微细颗粒，仍能被高梯度磁分离器吸附而有效地去 除。， 3 ) 设备简单、操作简便、维修费用低、占地面积小。处理废水量为1 0 0 0 米 日的高梯度磁分离器占地1 5 2 8 米，仅为一般沉淀池的十分之一。 4 ) 处理废水反应时间短。高梯度磁分离器反应时间由2 0 分钟缩短到1 2 分 钟：沉淀时间由1 5 小时缩短到5 分钟；因而整个过程废水停留时间只需 8 分钟左右，比传统混凝过程大为加快。 5 ) 处理成本降低。丌山屯化纤浆厂处理以制药沈涤水力药剂时，处理成本 非常低，每立方米废水仅花6 分钱。该厂以氯化水加酸再与生化出水混 合，并用石灰和硫酸调节p h 值，进行高梯度磁分离处理，成本为o 0 8 元米3 水。高梯度磁分离电耗较低，但大型设备与小试模型耗电相差很 悬殊，在磁场强度和安匝数都相同的情况下，功率消耗一般是分离器直 径一次方的函数，而处理水量却是分离器跃径二次方的函数，因此大的 设备耗电比小设备耗电要少得多。 6 ) 易再生、可在高温下( 可达6 0 0 k ) 使用；可减少或不使用化学药品，消除 一次污染。 7 ) 高梯度磁分离法可处理的废水种类很多。目前己应用的有炼钢厂和轧钢 第一市豆献综述 厂废水、电镀废水、脱脂废水、含油废水、石油化学工业废水、食品工 业废水、玻璃工业废水、印刷废水、染色废水、喷涂废水等。此外，还 适合用于废水的三级处理。 1 6 3 趋磁细菌载体磁分离原理f s l l 载体磁分离就是利用物理手段有选择性地增强待分离目的颗粒磁性的方 法，即把磁性相添加到目的颗粒的悬浮液中，通过目的颗粒和磁性颗粒选择 性粘附束提高目的颗粒的磁性，再通过磁分离方法分离出目的颗粒。 趋磁细菌表面膜在处理过程中不易破坏，在水溶液中性能稳定。从面防 止磁粉的团聚，保持其高分散性和相界面比表面积。磁粉表面有机膜具有可 键合的氨基，无须表面处理可直接进行选择性修饰活化，以磁固夔各种目的 粒子。经过磁固载的目的粒子，通过高梯度分离方法分离出目的粒子。趋磁 细菌用于磁固载时，其中的磁粉性质保持不变，同时不改变固载对象的性质。 磁小体的磁性能优良。表面膜可以选择性活化，因此趋磁细菌是一利很好的 磁固化载体。 趋磁细菌磁固载的方式主要包括： 1 ) 吸附固定法。利用吸附剂把目的颗粒和趋磁细菌吸附在一起，使目的颗粒 磁性增强。常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷等。 2 ) 包埋法。即将目的颗粒与趋磁细菌包裹在多孔载体中，使目的粒子磁性增 强。常用凝胶包埋法，常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、明胶等天 然凝胶，以及聚丙烯酰胺等合成凝胶。 3 ) 结合法。即选择适宜的修饰剂，对趋磁细菌表面进行修饰活化。使之通过 共价键或离子键与目的颗粒结合起来。趋磁细菌的表面有机膜必须根据目 的颗粒性质进行选择性修饰，以强化对颗粒的磁固载能力。例如：分离老 鼠球蛋白时，用戊二醛作修饰剂分离大肠杆菌时用s p p p ( 苯膦酸二苯砜 酯) 作修饰剂，分离m r n a 时用甲脓活化处理。 处理含重会属离子的废水时，向废水中加入一定量的絮凝剂及趋磁细菌。 废水中的重金属离子等有害杂质与趋磁细菌粘合在一起，利用高梯度磁选除 去经磁固载的有害杂质。另外，细粒的磁载体为细菌、病毒、藻类和其它有 机成份提供了有效的吸附表面，并成为絮凝物凝聚的晶核，当这种有磁性的 凝聚物通过高梯度磁滤器的钢毛滤层时被i 吸附，从而使细菌、病毒和藻类等 从水中分离出来。 与普通的磁固化技术相比，趋磁细菌具有固载能力强，载体与污泥容易 第一章文献综述 分离，从而得以循环利用，因而可以克服利用细粒磁铁矿作载体处理废水的 不足，大大提高处理效率和降低成本，从而推动微生物技术在工业废水和难 降解的有机污染物处理中的实际应用。 1 7 本项研究的产生基础和取得进展的可能性 曹宏斌t 8 2 1 和李鑫钢【8 3 8 4 1 已在电场作用下的生物膜传质课题中做了大 量前期工作，建立了描述扩散和电迁移共同作用下的生物膜传质模型。其材 料准备方法( 菌种培养，挂膜，生物膜微切片，生物膜结构参数测量，生物 膜胞外高分子聚合物在线萃取等) 和测试手段及设备( 共聚焦激光扫描电镜) 均可为本课题所利用。 在一个完备的重金属离子去除流程中，电场和磁场的应用一般分属不同 的阶段。h g m s 的作用是清洁水体和增浓污染物或减小再生过程的流体负荷， 使再生过程( 有电解法参与) 效率大大提高i ”j 。 c i 皿叫黼b 幻枷_ e h 醇雠c _ b _ l m - 们_ 妇 图1 7 完备的重金属离子去除系统8 6 】 f i g 1 - 7i n t e g r a t e dh e a v ym e t a li o n sr e m o v a ls y s t e m 电场和磁场是伴生的物理现象，但两种物理场中重盒属的沉积方法不尽 相同。电场中重金属在电极上还原成为金属单质或以碱的形式沉淀。随着电 解过程的进行电极周围生物的厚度逐渐增加，电阻加大，金属析出过程逐渐 减慢。另外，电流对微生物有抑制作用| 8 “，使对重金属离子具有i 殳附作用 的有益菌群规模受到限制。在磁场中，随着央带离子的微生物在生物膜表面 的积聚和生物膜厚度的增加，生物膜本身的金属离子i 吸附能力也呈增加趋势。 微生物本身生长= 在地球磁场中，甚至在高密度天然永磁物质附近，对磁场具 有一定的适应能力。 第一章文献综述 1 8 本课题研究内容 本课题旨在采用磁场一趋磁细菌复合工艺净化重金属废水。具体地说， 就是将废水中加入趋磁细菌，利用趋磁细菌对水体中的重金属离子进行吸附， 然后在磁场分离器中将其分离。具体研究内容如下： 1 ) 趋磁细菌富集培养方面的研究。将污水处理厂取回的活性污泥分别在厌 氧、微好氧和好氧条件下培养，然后通过扫描电镜和透射电镜分别观察 混合菌的形态和特征，并对各种菌的生物特性进行研究。 2 ) 对趋磁细菌吸附单一重金属离子，以及两种离子的竞争吸附进行实验研 究。研究趋磁细菌吸附重金属离子的行为，为下一步采用连续吸附工艺 去除重金属废水提供必要的操作参数。在趋磁细菌吸附单一重会属基础 上，对两种重金属组分同时存在时产生的竞争性吸附建立理论模型。 3 1 利用自行设计的磁场分离器对吸附重会属离子的趋磁细菌进行分离影响 因素的研究。 4 ) 利用自行设计的磁场一趋磁细菌复合工艺处理含重金属离子废水。 5 ) 在外加磁场作用下，对废水中趋磁微生物的复杂受力和运动进行研究。 第二章趋磁宣 i 蔼酌富集培养及分离 第二章趋磁细菌的富集培养及分离 趋磁细菌的分布很广，自从b l a c k m o r e 发现趋磁细菌以柬，人们在地球 的不同区域的海水湖泊以及土壤中陆续的发现了具有这种特性的细菌。通 过研究不同趋磁细菌的生存环境，发现不同的菌种生活在水体的不同深度， 从而在水体中形成了一个纵向的分布，这种分布是由菌种的生活习性以及不 同深度处溶解的氧和硫的浓度决定的。一般情况下，随着水层深度的加深， 氧的溶解浓度下降，而溶解的硫的浓度增加，因此，在上层水面，主要是以 微好氧和兼性好氧细菌为主，下层水面则以厌氧菌为主。 本章主要描述微生物的驯化、分离和富集培养，然后用自行设计的收集 器对趋磁细菌进行收集，通过扫描电镜( s e m ) 和透射电镜( t e m ) 观察驯 化前后趋磁细菌的形态的变化及微观结构，找到一种比较好的富集培养方法， 用生物方法分离实验用的混合菌种，并对每种菌株进行单独研究。 e 1 趋磁细菌的富集培养 活性污泥取白天津市纪庄子污水处理厂曝气池，p h = 6 7 0 ，经过生理盐 水过筛洗涤三次后，重力沉降，弃去上清液，沉淀，然后将污泥分别进行厌 氧、微好氧、好氧三种方法的培养，其中好氧菌分为曝气和敞口两种，按一 定比例加入适当培养液，使混合微生物代谢、生长，以后每隔两天定期更换 培养液，培养条件如表2 - 1 所示。 培养一个月以后厌氧培养条件下的污泥变为灰白色，味臭。微好氧的仍 然是黑色，味臭。而好氧和好氧曝气的污泥则是灰色的，没有臭味。 另外将培养好的厌氧微生物取出一半，置于烧瓶中，加入c 厂“进行驯化。 对于重会属驯化，尚需配加一定数量的培养基，培养基的组成就是在厌氧微 生物的培养基中再另外加入1 1 6m g l 。的尬c r 2 0 ，驯化液也需定期更换，其 后续操作流程类似于混合微生物培养过程。整个驯化过程需要1 个月左右。 第二帝趋磁细菌的富集：i 养及分离 2 2 趋磁细菌的收集 根据反扣法原理1 6 9 8 7 ，设计出一个趋磁细菌收集器( 如图2 1 所示) 。操 作如下：从富集培养瓶的泥水界面处用无菌毛细管吸取细菌培养物，取己灭 菌的趋磁细菌收集器，放入细菌培养物，并用无菌水充满( 注意收集器内不 得有气泡) 。最后将一块磁铁放在收集器底部，s 极向下并挨近收集器取样口。 趋磁细菌将向s 极泳动并聚集在s 极附近。收集3 4 h 关闭活塞，用无菌注射 器从取样孔吸取趋磁细菌。 第一章趋磁细菌的富集培养及分离 2 3 趋磁细菌电镜观察 图2 - 1 趋磁细菌收集器 f i 晷2 - 1c o l l e c t o r o f m t b 透射电子显微镜( t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ，t e m ) 收集到的 是透过样品的电子，物像形成来自电子的散射作用与干涉作用。其放大倍数 可高达数十万倍。透射电镜结合超薄切片制样技术即可观察到微生物细胞内 部的精细结构：而扫描电子显微镜( s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ， s e m ) 收集到的是从样品表面反射山来的电子并使它们成像。其放大倍数介于光学 显微镜( o p t i c a ll i g h tm i c r o s c o p e ，o l m ) 和透射电子显微镜之间，较常用 的放大倍数为5 0 0 5 0 0 0 倍。扫描电镜所显示的图像极具有立体感。 2 3 1 电镜标本预处理 混合微生物培养、驯化工作完成后，取1 0 支洁净的5 m l 离心试管，其 中5 支用来盛装t e m 样品，分别为厌氧菌、c r “驯化后的厌氧菌、好氧菌、 好氧曝气菌和微好氧菌，而其余二三支用来盛装s e m 样品，分别是厌氧菌、好 氧菌、微好氧菌。 取3 m l 培养的微生物分别放入盛装s e m 样品的离心管中，再取3 m l 收 集的趋磁细菌分别放入盛装t e m 样品的离心管中，依次进行标记，然后置 于离心机中，于2 0 0 0 r m i n 下离心沉降1 0 m i n ，取出后弃去上清液，快速加入 第一帝趋磁纠茁的富策培养及分离 从冰箱中取出的2 5 的戊二醛溶液进行预固定，并将样品置于0 。c 冰箱中保 存。最后将微生物样品送交天津医科大学电镜测试组和天津大学分析中心进 行测试。 23 2 透射电镜样品制备 为获得清晰的透射电镜图像，用来观察的超薄切片应满足下述要求【8 88 9 l ： 1 ) 细胞精细结构保存良好，未产生明显的物质凝聚、丢失或添加人工效应； 2 )切片厚度应为5 0 n m 左右，最多不超过1 0 0 r i m ，较薄的切片可获得高分 辨率，但反差较差：较厚的切片反差较好，但结构层次重叠，分辨率较 低： 3 )切片应能承受电子束强烈照射，观察中，包埋介质不发生变形或升华； 4 )切片应具有良好的反差： 一 5 )切片应均匀，并且没有皱褶、刀痕、震颤及染色剂沉淀等。 超薄切片的制作过程比较复杂，需要经过取材、固定、清洗、脱水、浸 透、包埋、切片及染色等步骤。 。 经预处理后的微生物标本经低速离心弃去培养液后，以2 5 的戊二醛溶 液进行预固定几小时或更长的时间，用p h = 7 o 7 4 的磷酸缓冲溶液清洗几 小时，中问更换几次溶液，然后用1 四氧化饿溶液作后固定，并用缓冲溶 液清洗半小时以上，然后用丙酮或乙醇脱水其顺序为7 0 ，8 0 。9 0 各 一次，每次5 1 5 分钟，1 0 0 脱水3 次，每次5 1 5 分钟。随后，采用环氧 丙烷浸透1 5 3 0 分钟，e p o n 8 1 2 型包埋剂浸透几小时。接着于6 0 下加温 2 4 3 6 小时进行聚合，再对聚合后样品进行修块，并用l k b v 型超薄切片 机切片，最后，先用醋酸双氧铀溶液染色3 0 4 5 分钟，接着用柠檬酸铅溶液 染色3 0 分钟。 2 3 3 扫描电镜样品制备 将经过自口期预处理的微生物标本分别以低速离心沉降收集，弃去培养液， 注入新配制的p h 为72 7 4 ，浓度为2 5 的戊二醛固定液做前期固定。以 上述缓冲溶液浸洗后，用1 四氧化锇溶液作后固定。浸洗后以酒精脱水，其 浓度呈上升梯度。用h c p tf 型f 缶界点干燥仪进行液念二氧化碳临界点十燥。 然后将样品固定于样品台上，用j f c 1 1 0 0 型离子溅射仪金靶镀膜，制备 完后其样品厚度约j 1 0 n m 。 第二二章趋越钏菌的富集埔养发分离 2 ，3 4 微生物样品t e m 、s e m 分析 样品制备完成后，分别采用j e m 1 0 0 c xi i 透射电子显微镜、 j e o l - j s m 2 5 s 扫描电子显微镜观察若进行拍照。 2 3 4 1t e m 分析 1 ) 铬离子驯化后厌氧m t b 通过透射电镜可以观察到经过收集后的细菌形状比较单一。经过铬离子 驯化后厌氧m t b 的形状是球形( 如图2 2 ) 。 圜2 2 铬离子驯化后厌氧m t b 透射屯镜 ， f i g 一2 2t h et e mp i c t u r eo f a n a e r o b i cm t bd o m e s t i c a t e db yc r “ 2 、厌氧m t b 通过电镜可以看到收集的细菌为球菌，形状如图2 3 所示。 削2 3 厌氧m t b 透射电镜 f i g 2 3t h et e mp i c t u r eo f a n a e r o b i cm t b 第一章趋磁细菌的富集培养发分离 3 ) 好氧m t b 好氧培养条件下的趋磁细菌的形状类似球形，但不规则( 如图2 - 4 所示) 另外通过电镜观察到的好氧m t b 数量很少。 图2 - 4 好氧m t b 透射电镜 r i g 2 - 4t h et e mp i c t u r eo fa e r o b i cm t b 4 ) 好氧曝气m t b 通过透射电镜可以观察到收集到的细菌数量很少，形状为柱型见图2 5 。 图2 - 5 好氧曝气m t b 透射电镜 f i g 2 5t h et e mp i c t u r eo fa e r o b i cm t ba d d e da i r 5 ) 微好氧m t b 通过透射电镜可以看到，收集到的趋磁细菌以球菌为主，而且数量很多 第一二章趋磁细菌的富集培养及分离 形状如图2 6 所示。 图2 - 6 微好氧m t b 透射电镜 f i g 2 6t h et e mp i c t u r eo fm i c r oa n a e r o b i cm t b 2 3 4 2s e l l 分析 1 ) 厌氧r d t b 图2 7 列出了厌氧条件下培养的活性污泥中微生物的s e t h 图像。低倍下观 察可发现污泥呈龟裂状，有众多裂隙存在。由无定形性细颗粒粘结成大小不 等的团块状，微生物呈群落或分散存在于团块内和l 刨隙中。高倍下可观察到 其中有小型球菌、大型球菌、短杆菌和少量丝状菌存在。小型球菌直径0 5 “m 0 7 um ，成团或分散存在。短杆菌大小为0 5 1 2 l am ，0 6 1 4um ， 2 5 um 。丝状菌体少量，直径在0 1 8 0 3 un l 之问。 放大2 0 0 倍放大4 5 0 0 倍 蚓2 7 厌氧m t b 扫描【乜镜幽 f i g 2 7t h es e mp i c t u r eo fa n a e r o b i cm t b 第一二章趋磁细菌的富集培养及分离 2 ) 微好氧m t b 图2 - 8 所示为微好氧培养条件下活性污泥中微生物的s e m 图像。低倍下可 观察到污泥呈大小不等的团块，而且团块之间存在裂隙和间隙。微生物群落 像珊瑚礁一样，成簇或是分散地存在团块的裂断面上。高倍下可以看到有很 多球菌，菌落内球菌排列紧密，直径在0 6 um 左右，深部的球菌较小一些， 近间隙部位的球菌稍大一些。 放火2 0 0 倍 放人4 5 0 0 倍 图2 - 8 微好氧m t b 扫描电镜图 f i g 2 8t h es e mp i c t u r eo fm i c r oa n a e r o b i cm t b 3 ) 好氧m t b 图2 - 9 所示为好氧培养条件下活性污泥中微生物的s e m 图像。低倍下可 以观察到污泥呈小片层、团块及丝状物粘结成的网络，非菌体成分减少，空 隙扩大、增多。球菌菌落、菌群较明显，数量多，存在于网络的间隙中。球 菌直径在0 6 1 ”m 之间。短杆菌长1 2 i tm ，直径0 5 m ，为丝状茵围绕。 丝状菌体较粗者有分支、分叉，较细者缠绕及交错形成网络，直径由0 1 0 7u i n 。 放人2 0 0 倍放人4 5 0 0 图2 - 9 女，氧m t b 扫描电镜幽 f i g 2 9t h es e mp i c t u r eo f a e r o b i cm t b 第一章趋磁细菌的富集培养及分离 2 4 用m p n 法测量五种污泥中m t b 的数量 液体稀释法又称m p n ( m o s t ) r o b a b l en u m b e r ) 法，又叫最可能数法、最 自然数法或最近似值法，是用统计数学方法柬计算水样中某种待测菌的含量 的一种方法。此方法适用于容易在液体培养基中生长并被检查出来的微生物。 由于m t b 细胞内含有磁性颗粒，而且主要是铁的氧化物和铁的硫化物，在 含有m t b 的污泥中加入两滴氢氧化钠，经过十天左右的时间，污泥变为深 红色，所以可以用此方法卡h 略地计算出污泥中m t b 的数量，从而对比出五 种培养条件下m t b 的量。具体步骤如下一u 】： 2 4 1m t b 的收集见本章2 2 节，此处不再详述。 2 4 2 稀释菌液 将1 瓶9 0 m l 和5 管无菌水排列好，按1 0 ，1 0 ，1 0 一，1 0 ，1 0 ， 1 0 4 依次编号。在无菌操作条件下，用1 0 m l 的无菌移液管吸取1 0 m l 菌液置 于第一瓶9 0 m l 无菌水( 含玻璃珠) 中，将移液管吹洗三次，用手摇1 0 m i n 将颗粒状样品打散，此即为1 0 叫浓度的菌液。用l m l 无菌移液管吸取l m l 浓 度1 0 _ 1 的菌液于一管9 m l 无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为1 0 _ 2 浓 度菌液。同样方法，依次稀释到1 0 。从五种培养瓶中分别取菌液，重复此 操作五次。 2 ，4 3 培养 在室温条件下培养2 1 5 天。 2 4 4 检验 检查结果时，在每个管中滴入2 滴氢氧化钠，如果有红色沉淀，表明有 铁离子存在。 培养1 2 天后，加两滴氢氧化钠，再过九天后，好氧和好氧曝气培养条件 的瓶中没有红色沉淀出现，证明这两种培养条件下污泥中含m t b 量很少。 微好氧培养条件的1 0 ，1 0 ，1 0 ，1 0 ，1 0 1 的瓶子内都有深红色的沉 淀，而1 0 _ 6 的瓶子中没有沉淀。所以微好氧菌中的趋磁纠菌近似数量为 第一章趋磁细菌的富集培养及分离 1 0 0 0 0 0 c f u m l ，而铬离子驯化后厌氧菌中的趋磁细菌的近似数量是1 0 0 c f u m l ，厌氧菌是1 0 0 0 0 c f u m l ，由此结果可以看出m t b 的适宜生存条件是 微好氧。 5 微好氧菌中m t b 分数测量 平板菌落计数法是教学、生产、科研中最常用的活菌计数法，它不仅适 用于多种材料，而且即使样品中含有很少也可以测定。常用于测定水、土壤、 食品及一些发酵制品中的活菌数，在生产和科研中，测定细菌总数的目的是为 观察细菌在食品中某种培养基中的繁殖动态，对被检样品进行卫生评价提供 依据：二可以为育种时采用不同的处理方法提供条件。 菌落总数是指被检样品经过处理，在一定培养条件下培养后，所得l m l 检样中所含细菌菌落的总数。由于一个活细胞能形成一个菌落，因此，菌落 数就是待测样品所含的活菌数。先收集趋磁细菌( 见图2 2 ) ，然后分别将培养 的微好氧菌和收集的趋磁细菌进行如下测量实验。具体步骤如下所述。 2 5 1 检样稀释及培养 1 ) 以无菌操作，将被检样2 5 毫升混匀放入含有2 2 5 毫升无菌水的无菌锥形 瓶( 瓶内先放置适当的玻璃珠) ，经充分振荡，制成i ：i 0 的均匀稀释液。 2 ) 用l 毫升吸管1 ：1 0 稀释液1 毫升，沿管壁馒慢注入含9 毫升无菌水的试 管内，吸入吸出反复2 3 次，制成1 ：1 0 0 的均匀稀释液。 3 ) 按上述2 ) 的操作继续稀释，每次1 0 倍，直到最后稀释度的菌悬液做倾 注法平皿计数时，每个培养皿的菌落在3 0 3 0 0 之间。 4 ) 对被检样品所含菌体浓度的估计或通过预备实验，选择2 3 个为一个稀 释度，从稀释度最高的悬浮液取1 毫升放入平皿内，每个稀释度作2 3 个平吼。 5 ) 稀释液移入平皿后，及时将保温至4 5 左右的营养琼脂培养基注入平皿 约1 5 毫升，并摇动平皿使培养基和菌液混合均匀。 6 ) 待琼脂凝固