（高分子化学与物理专业论文）己酰化壳聚糖的合成及研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 壳聚糖作为甲壳素的n 脱乙酰化产物，不仅在自然界大量存在，而且具有 很多特性，比如：生物相容性、生物降解性、抗菌性、对蛋白质的吸附性等。因 此，壳聚糖及其衍生物被广泛的应用于很多领域。但是由于壳聚糖的刚性结晶结 构，使得它只能溶于酸性环境中，不溶于水和一般的有机溶剂。这就极大的限制 了它在很多领域的应用。所以，有必要对壳聚糖进行化学改性。 本文主要以甲烷磺酸做溶剂，以己酰氯为酰化试剂，合成不同取代度( d s ) 的已酰化壳聚糖( h c ) 。用f t - 1 r ，1 hn m r 分析其化学结构，表明随着加入己 酰氯的增加，取代度增加。 h c 在室温下能方便的被压制成片。考察了不同取代度的h c ，不同载药量 和不同成片压力对布洛芬释放情况的影响。随着取代度的增加，布洛芬的释放量 增加；同一取代度的h c 对布洛芬的释放量随着载药量的增加而增加，随着成片 压力的增加而下降。将h c 和p c l 按一定比例共混电纺，能制备得到形态较好 的h c p c l 纳米纤维。将h c 小棒埋植n d , 鼠体内考察其体内降解和组织相容性。 实验表明，随着取代度的增加，h c 降解速度加快。另外，与p l g a 相比，己酰 化壳聚糖的炎症反应较轻，生成的纤维囊壁较薄，表明其有良好的组织相容性。 h c 能溶于一般的有机溶剂，因为有游离的氨基可以对其进行进一步的改 性。，它有良好的加工性能，生物相容性和在体内可生物降解降解，所以能在生 物医用领域有很好的应用。例如能制成植入剂，达到药物的缓控释，或者制成无 纺布，做为伤口敷料等医用材料。 上面研究表明，己酰化壳聚糖综合了疏水性生物降解高分子的可加工性、降 解速度易调节性与天然高分子的功能性、优良生物相容性，再加上其简单的合成、 后处理过程，有望在药物控制释放与组织工程等生物医学工程领域得到广泛应 用。 关键词：己酰化壳聚糖，生物降解，组织相容性，药物释放 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t a st h en d e a c e t y l a t e dd e r i v a t i v eo fc h i t i n ，c h i t o s a ni sn o to n l yn a t u r a l l y a b u n d a n tb u ta l s oh a sm a n yd i s t i n c t i v ep r o p e r t i e s ，s u c ha sb i o c o m p a t i b i l i t y , b i o d e g r a d a b i l i t y , a n t i m i c r o b i a la c t i v i t ya n dr e m a r k a b l ea f f i n i t y t op r o t e i n se c t t h e r e f o r e ，c h i t o s a na n dc h i t o s a nd e r i v a t i v e sh a v eb e e na p p l i e di nm a n yf i e l d s h o w e v e r , d u et oi t sr i g i dc r y s t a l l i n es t r u c t u r e ，c h i t o s a nc a no n l yb ed i s s o l v e di na c i d i c c o n d i t i o n i t sp o o rs o l u b i l i t yi nb o t hw a t e ra n dc o m m o no r g a n i cs o l v e n t sl i m i t si t s e f f e c t i v eu t i l i z a t i o ni nm a n yf i e l d s s o ，i ti sn e c e s s a r yt om o d i f yi t ss t r u c t u r et h r o u g h v a r i o u sm e t h o d s i nt h i sw o r k ，h e x a n o y lc h i t o s a n ( h c ) w i t hd i f f e r e n td e g r e eo fs u b s t i t u t i o n ( d s ) w e r es y n t h e s i z e db ya c e t y l a t i o nr e a c t i o nu s i n gm e s 0 3 ha sas o l v e n ta n dc a p r o n y l c h l o r i d ea sa c y l a t e dr e a g e n t t h e i rc h e m i c a ls t r u c t u r e sw e r ev e r i f i e db yf t - i ra n d1 h n m r s p e c t r a s b yv a r y i n gc h i t o s a nu n i t c a p r o n y lc h l o r i d ef e e dr a t i o ，t h es u b s t i t u t e d d e g r e el e v e lo f h e x a n o y lc h i t o s a nc a l lb ea d j u s t e d i tw a sf o u n dt h a th cc a nb ec o n v e n i e n t l yf o r m u l a t e di n t o t a b l e ta tr o o m t e m p e r a t u r e ，e f f e c to fd so fh c ，d r a gl o a d i n ga n dc o m p r e s s i o ns t r e s sf o rp r e p a r i n g t a b l e t so nr e l e a s eb e h a v i o ro fi b u p r o f e nw a si n v e s t i g a t e d t h er e l e a s i n gr a t ew a s f a s t e ra th i 曲d sl e v e lt h a nl o w w h i l ea tt h es a m ed sl e v e l ，t h er e l e a s i n gr a t e i n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo fd r u gl o a d i n g ，d e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo f c o m p r e s s i o ns t r e s s h c p c lc o m p o s i t en a n o f i b r o u ss c a f f o l d sc o u l da l s ob ep r e p a r e db yb l e n d i n g h c p c la tag i v i n gr a t i ou s i n ge l e c t r o s p i n n i n gt e c h n o l o g y t h eb i o d e g r a d a t i o na n dh i s t o c o m p a t i b i l i t yo f h cw e r ee v a l u a t e db yi m p l a n t i n g h cc y l i n d e r si n t or a t s i tw a sf o u n dt h a tt h ed e g r a d a t i o nr a t eo f h ci n c r e a s e dw i t ht h e i n c r e a s eo f t h ed s i na d d i t i o n ，h cd e m o n s t r a t e daf a v o r a b l et i s s u er e s p o n s ep r o f i l e c o m p a r e dw i t hp l g a ，w i t hs i g n i f i c a n t l yl e s si n f l a m m a t i o na n d f i b r o s i s i tc a nb ec o n c l u d e dt h a th e x a n o y lc h i t o s a nc o m b i n e st h ea d v a n t a g e so fb o t h b i o d e g r a d a b l eh y d r o p h o b i cp o l y m e r sa n dn a t u r a l - o c c u r r i n gb i o m a c r o m o l e c u l e s ，i e ， t h ea d j u s t a b l eb i o d e g r a d a t i o nr a t ea n dp r o c e s s i n gp r o p o e r t i e so ft h ef o r m e ra n dt h e i i 浙江大学硕士学位论文 e x c e l l e n tb i o c o m p a t i b i l i t ya n dd e r i v a r a t i o nc a p a c i t yo ft h el a t t e r i na d d i t i o n ，h cc a l l b es y n t h e i z e db yav e r ys i m p l es c h e m e a l lt h e s eu n i q u ec h a r a c t e r i s t i c so fh cm a k ei t u s e f u lf o rc o n t r o l l e dr e l e a s ea n dt i s s u ee n g i n e e r i n g k e yw o r d s ：h e x a n o y lc h i t o s a n ，b i o d e g r a d a t i o n , t i s s u ec o m p a t a b i l i t y , d r u gr e l e a s e i t i 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 壳聚糖做为一种天然的高分子材料，大量存在于自然界中，具有生物相容性、 生物降解性、抗菌性，并且对蛋白质有显著的亲和力。这些性质使得壳聚糖及其 衍生物在生物技术、药剂学、纺织、食品、化妆品和其他工业领域引起广泛的注 意【l 一2 】。最近几年，壳聚糖还被用于多肽、疫苗、基因传递及组织工程支架中 3 6 】。 但是壳聚糖的刚性结晶结构导致它在水中和有机溶剂中的溶解性很差，限制了它 在很多领域的应用。所以，很有必要对壳聚糖进行改性。 下文对壳聚糖的改性做了一个综述，主要阐述了壳聚糖改性的方法，改性 后的性质及应用。 第一节增加水溶性 壳聚糖，聚一b 一( 1 ，4 ) 一d - 葡糖胺，能通过甲壳素在碱性环境中脱酰基得到。 由于具有良好的生物相容性、抗菌性，壳聚糖做为各种功能性材料，包括做为一 种生物医用材料已经得到深入的研究 7 8 。但是在生物学领域，很多酶必须在 中性p h 条件下才能发挥作用，而壳聚糖只能溶于酸性环境。如果水溶性的壳聚糖 能够被制备出来，他们将在更多的领域得到更为广泛的应用。 1 1n h 2 不完全乙酰化 k u b o t a 9 等将壳聚糖用n a b 0 3 处理降解得到一系列低分子量的壳聚糖，在 醋酸水溶液中和乙酸酐反应，使n h 2 不完全酰化，制备得到高水溶性的壳聚糖 ( n 一不完全酰基化壳聚糖) 。n 一不完全酰基化壳聚糖的水溶性随着分子量的下 降而增加。 1 2n i l ：饱和脂肪酰化 h i r a n o 1 0 等采用了两种方法制备了n 一饱和脂肪酰化壳聚糖：n 一酰基壳聚糖 的n 脱酰基反应或者是饱和脂肪酸酐和壳聚糖的n 一酰化反应。两种方法得到 浙江大学硕士学位论文 的产物产率不同，分别为4 5 7 2 和7 5 8 5 。新型的n 一饱和脂肪酰壳聚糖 能溶于水，并且不同酰基的壳聚糖衍生物溶于2 的氢氧化钠水溶液和2 的醋 酸水溶液所需要的取代度范围不同。但是制备得到的棕榈酰化和硬脂酰化的壳聚 糖，由于引入的脂肪链太长，所以在任何取代度范围内都不溶于水。 1 3 季胺化 壳聚糖的季铵盐衍生物有两个主要的优点：1 ) 在生理p h 范围具有水溶性， 能在生物医学中被广泛应用。2 ) 在多糖主链上带永久的正电荷，可以增加药物 对粘膜的透过性，从而促进药物的吸收；并能和d n a 形成复合物，做为基因传 递的载体。目前，季胺化壳聚糖在药剂学、生物技术领域被广泛应用。 m e r w e 1 1 等合成了n 三甲基壳聚糖盐酸盐，这种季胺化壳聚糖在所有p h 范围的水溶液中都能溶解。 h o l a p p a 1 2 等以6 - 0 三苯甲基壳聚糖为n 一酰化反应的中间体，通过5 步 合成，得到氨基全部取代的乙酰三甲铵基壳聚糖盐。这个合成步骤还能够通过改 变酰化反应中n 一氯乙酰三甲铵基氯的当量来调节取代度。由于甜菜碱( n 三甲 铵基乙内酯) 存在于自然界中，无毒性，所以得到的季铵盐的壳聚糖衍生物与 n 三甲氨基壳聚糖相比，有更多的生物化学，生物学，药剂学性能。 1 4n h 2 上m i c h e a l 加成 s a s h i w a 和a i b a 1 3 等将丙烯酸和壳聚糖上的氨基m i c h a e l 加成，所得到的 丙烯酸化壳聚糖( 图1 1 ) 有很好的水溶性。而且反应条件温和，直接在水溶液条 件下反应，是对壳聚糖的一种温和的化学改性。 繇幔o h 图i 1 丙烯酸化壳聚糖 他们研究了各种含丙稀醛基的试剂和壳聚糖的m i c h a e l 反应【1 4 】，包括：丙 2 7 浙江大学硕士学位论文 烯酸乙二醇酯，丙烯酸丙二醇酯，丙烯酸聚乙二醇酯，丙稀酰胺，及丙稀酸三甲 氨基乙醇酯等。发现能通过反应的温度、反应时间、反应物的量来控制取代度。 聚乙二醇丙烯酸酯改性后的壳聚糖衍生物尽管显示出水溶性，但是冻干后变成水 不溶性。 h i t o s a h i 1 5 等还将n 一羧乙基壳聚糖乙基酯做为中间体，用亲水性的胺类 取代，合成亲水性的壳聚糖衍生物( 图1 2 ) 。 僻o 鲁h 骼o ht r n h ， h 2 0 ，e t o h 1 陇 o a c o h h 2 0 ，e t o h x = o h ，o e t ，o rn h - r r _ ，o h八o h x ，n h 2 八八n h 2 图1 2n - 羧乙基壳聚糖乙基酯为中间体合成亲水性壳聚糖衍生物 o k a d a 1 6 等将壳聚糖的氨基做为亲核试剂和乙基丙烯酸酯在磷酸缓冲液甲 醇( 5 ：3 ，v ，v ) 在4 0 下进行类似于m i c h a e l 亲核加成反应 ( 图1 3 ) ，得到2 - n 一2 一 乙氧羰基乙基壳聚糖，产物中的乙氧羰基又可做为亲电试剂被亲核试剂加成。将 产物在氢氧化钠中水解，得到钠盐，能很好的溶于水。 傣罨o h 00 7 n 、霉3 铲o 静h 暑t 魄崎。馥。专n 图1 3 壳聚糖和乙基丙烯酸酯的反应 浙江大学硕士学位论文 1 5n i l ：上接枝多糖 p a r k 1 7 等将葡糖过酰胺键接到壳聚糖的氨基上，得到含有糖基的壳聚糖 ( s b c s ) ( 图1 4 ) ，s b c s 上的氨基可以进一步乙酰化改性。s b c s 虽然不能溶于 中性和碱性的水溶液，但是和未改性的壳聚糖相比，能溶于更宽p h 范围的水溶 液中。 s b c s 的酰化程度对其水溶性的影响较大，酰化度在2 9 - - 6 3 的s b c s 能 溶于所有p h 值水溶液。这可能是由于葡糖基的亲水性，以及n 一乙酰基破坏了壳 聚糖氨基之间的氢键引起的。接上的葡糖基增加了可生物降解性。改变壳聚糖骨 架上的葡糖基和n 一乙酰基的量，能调节改性后壳聚糖的降解性。n 一乙酰s b c s 在所有p h 值范围内都能溶的性质，在生物医用领域有很好的应用。 0 1 k 心1 o 塔二。p + i 。j “ ，o hi o o hi h d h o - 个6 ：o o h 图1 4 葡糖酰化壳聚糖( s b c s ) 1 66 _ o 接枝多糖 k u r i t a 1 8 等以n 一邻苯二甲酰壳聚糖做为溶于有机溶剂的关键中间产物，在 甲壳素和壳聚糖的c - 6 位上接上n 一乙酰一d 一葡糖胺和d 一葡糖胺的支链( 图1 5 ) 。 得到的枝化衍生物和原料相比，能溶于中性的水，有很好的吸湿性。并且接枝的 甲壳素能被溶菌酶降解，降解度随着接枝度的增加而下降。接枝的壳聚糖有很好 的抗菌活性，对b s a ( 牛血清蛋白) 有很好的吸附性。这些性质使得接枝的壳聚 糖和甲壳素在很多方面有很好的应用，比如用作化妆品的保湿剂，药物传递的载 体，生物医用领域的可降解材料，食品加工中的增粘剂和防腐剂，医用纤维和纺 织品的抗菌剂。 这种方法的优点在于系列的改性都在比较温和的条件下进行，合成了分枝的 氨基多糖。甲壳素和壳聚糖的三种功能基团能通过这一过程被有效的区别开来， 所有反应都能被有效控制。 4 浙江大学硕士学位论文 o h h 0 1 1 h o 、o 一。 ij 。l 图1 56 - 0 糖胺接枝壳聚糖 1 76 _ o 上琥珀酰化 s h e n 等 1 9 合成了一种新的水溶性舻琥珀酰化壳聚糖( 图1 6 ) 。壳聚糖上 的氨基用邻苯二甲基保护。o _ 琥珀酰壳聚糖是一个有用的中间体，由于氨基的存 在能对壳聚糖进一步改性，在生物医用领域会有很好的应用 图1 60 - 琥珀酰化壳聚糖 1 86 - o 上接枝a 一甘露醇 k u r i t a 2 0 等在壳聚糖6 一羟基上接上甘露醇，以n 邻苯二甲基壳聚糖为 主要中间体，得到旺一甘露醇- g 。壳聚糖( 图1 7 ) 。枝化度可以达到0 6 。得到的 产物能很好的溶于水。由于舡甘露醇基的存在，得到的产物对伴刀豆球蛋白有 很好的亲和性，能被溶菌酶降解，降解率在很大程度上受到枝化度的影响。并 且，枝化的壳聚糖表现出良好的抗菌性能。 o p o ，0 h o 卜 n h 2 图i 7o 一甘露醇- g 一壳聚糖 、卜f上 l1i，1毫 浙江大学硕士学位论文 1 9n ，o _ 适度乙酰化 s a s h i w a 2 1 等以m e s 0 3 h 为溶剂，用a c c l 或a c 0 2 ，制备n ，o - e , 酰化的壳 聚糖。并考察脱乙酰度( d d a ) 、数均分子量( m 。) 对水溶性的影响，分析了酰 化产物的化学结构。c 谱表明，o - 乙酰化基团主要是取代在c 6 的位置。保留部 分氨基，并且使o _ 乙酰基团取代度在l 左右是产物能溶于水的重要参数。且当 脱乙酰度在2 l - - 8 1 的范围内时，能制备得到溶于水的d 乙酰化壳聚糖。除 了o 一n 一上的适度取代，适度的m w ( d p 7 6 ) 也是一个很重要的参数。与壳聚糖 相比，n ，o 一乙酰化壳聚糖显示出很好的生物降解性能，酯键能够被水解，同 时在降解时生成游离的乙酰基。 第二节增加疏水性 壳聚糖及其衍生物能被人体酶部分的生物降解，非毒性且有利于人体。当它 们被用于治疗受伤组织，能加快治愈过程，避免过敏反应和其它一些不希望产生 的反应，并且有杀菌效果。但是不溶于一般的有机溶剂，所以很难直接商品化应 用。对壳聚糖的各基团进行修饰后，能增强其在一般有机溶剂中的溶解性。 2 1n 一烷基化 m a t o 。s c u 2 2 等将用脂肪酰氯( c 6 一c 1 2 ) 将壳聚糖n 酰化来增加其疏水性， 并且改变其结构性质。未修饰的壳聚糖表现出很低的有序性和很低的片剂破碎强 度。用短链脂肪酰氯酰化后的壳聚糖表现出很好的溶胀性。 r o d r i g u e s 2 3 通_ 过将壳聚糖和十八烷基酰氯( 硬脂酰氯) 、十二烷基酰氯( 月 桂酰氯) 反应，在壳聚糖的羟基和氨基上接上长烷基链使壳聚糖疏水化，且产物 的取代度可控。对这类壳聚糖衍生物的溶解性和溶胀值的测定，表明这类衍生物 有望成为一种很好的药物传递系统模型。 于广利等 2 4 】通过甲烷磺酸酰氯体系低温均相制备乙酰化甲壳质、己酰化 甲壳质、十二酰化甲壳质及己酰化n 一苄基甲壳胺，获得脂溶性n 一苄基己酰甲 壳胺的反应条件，并对各酰化产物在不同溶剂中的溶解性能进行试验，发现乙酰 6 浙江大学硕士学位论文 化甲壳质溶于甲酸中，己酰化、十二酰化甲壳质溶于甲酸及乙醇中，n 一苄基己 酰甲壳胺溶于甲酸、乙醇、苯及乙酸乙酯中。 2 2n 邻苯二甲基化 f a n g 2 5 等通过微波照射加热，把壳聚糖和邻苯二甲酸酐反应，得到n 一邻 苯二甲酸酐壳聚糖。能溶于有机溶剂，是一种很好的壳聚糖改性的中间体。 n i s h i m u r a 2 6 等合成n 一邻苯二甲基壳聚糖( 图1 8 a ) ，能溶于d m f 、n ，n - 二 甲基乙酰胺，二甲亚砜和毗啶等有机溶剂。6 - 0 上能继续取代上大基团，如三苯 甲基( 图1 8 b ) 等。得到的产物还可以在3 - 0 上继续反应，取代上酰基( 图1 8 c ) 。 反应都在较温和的条件下进行，各步反应得到的产物保护了壳聚糖上个各个功能 基团，它们能分别脱保护，定位的选择性的引入其他功能基团。 o - f n p h 廿1n p h t h 图1 8 an - 邻苯二甲酸酐壳聚糖图1 8 b6 - 0 三苯甲基取代 图1 8 c3 - 0 酰基取代 2 3c - 3 、c 一6 上酰化 由于存在氨基，壳聚糖是一种阳离子聚电介质。壳聚糖膜曾被用于在水溶液 中进行氯离子的活性传导。在壳聚糖膜的自然状态( 干的状态) ，它对电子的传 导很低，在湿的情况下( 水里溶胀) ，它的氨基被部分质子化，有利于在膜中进 行离子传导。但是由于分子问作用形成的很强的胶束状结构或分子间氢键的作 用，壳聚糖膜在水中的溶胀性很差，这明显的阻碍了膜中的离子转移。为了破坏 壳聚糖的刚性结晶结构和可溶性壳聚糖衍生物，尝试了很多方法。一些化学改性， 将酰基或烷基引入到c 一6 ，c 一3 上，能增加在有机溶剂中的溶解性。 v e l d e 2 7 2 8 等合成了联丁酰基壳聚糖( d b c ) ( 图l ，9 ) ，红外和核磁表征发 现在壳聚糖单元链节的c - 6 ，c - 3 位上的0 h 都被取代，最大的取代度为2 8 。改 性后的膜的一些性质有了显著的改变。随着取代度的增加，膜的结晶度下降：同 、 时，它们的溶胀指数( s i ) 增加到一个最大值然后慢慢下降热稳定性增加；热稳 浙江大学硕士学位论文 定性增加；与未改性的膜相比，水合后的改性膜的离子传导率有显著的增加，其 中适当接枝度的膜的离子传导率可以增加高于一个数量级。 d b c 易溶于一般有机溶剂，并有成膜和成纤性，通过对它的生物相容性、抑 菌性、和对酶降解的敏感性的研究，发现可以将它做为伤口敷料材料。这种合成 方法，为开发新型的功能生物材料开辟了一条道路 2 9 。 o c o c 3 h 7 。r 图1 9 联丁酰基壳聚糖( d b c ) 第三节两亲性壳聚糖 两亲性壳聚糖同时具有亲水亲油的两亲性质，无须加入表面活性剂即可降低 水溶液的表面张力，在保持原有优良性能的同时，具有乳化、增溶和增稠等性质。 它能做为药物载体，制成亲水凝胶、微球、膜等多种形式用于药物释放，能使药 物恒速、持久的进入体循环。同时，有些两亲性壳聚糖能自发形成胶束，可用做 难溶性药物的增溶剂。 3 1n 一棕榈酰化 u c h e g b u 3 0 等将疏水性的棕榈酰基团接枝到乙二醇壳聚糖上，得到一种两 亲性的壳聚糖( 图1 1 0 a ) 。利用棕榈酰基问的疏水相互作用，冷冻干燥后形成非 共价键交联的水凝胶( 图1 1 l b ) 。 由于在实验中使用了非共价交联和冷冻干燥的方法，使得凝胶既有较大的孔 隙率又有很好的水合能力。这种物理交联的水凝胶，可以通过控制其疏水程度来 浙江大学硕士学位论文 改变凝胶的微结构，从而，在做为药物释放体系时能起到控释的作用。此外，这 种水凝胶是可生物降解的，和共价交联的水凝胶相比，有更好的生物相容性。 图t 1 0 an - 棕桐酰化乙二醇壳聚糖( g g p )图1 1 i bn 一棕榈酰化乙二醇壳聚糖交联机理 将棕榈酰化乙二醇壳聚糖( g c p ) 进一步季铵盐化e 3 1 ，得到一种新型聚皂一 季铵盐化棕榈酰乙二醇壳聚糖( g c p o ) 。g c p q 作为一种可溶的两亲性聚合物，由 于分子间存在着疏水性缔合，能在低浓度下形成疏水团，在高浓度下形成凝胶， 所以对非极性的药物有增溶性，且凝胶形式的g c p q 比液体状态的增溶效果好。 进一步研究确认，g c p q 具有良好的血液相容性且无细胞毒性，预示着它在 生物医用领域有良好的应用前景。 3 2n h 2 上分别引入亲水、疏水基团 k g u l l 6 3 2 等将烷基链接枝到水溶性的改性壳聚糖( n - 亚甲基磷酸壳聚 糖，n m p c ) 上，使壳聚糖同时具有亲水性和疏水性的支链，以控制其在水中和在 有机溶剂中的溶解性。研究合成了一种新的壳聚糖衍生物表面活性剂，n 一月桂 烷一n 一亚甲基磷酸壳聚糖( p c ) ( 图1 1 2 ) 。磷酸亚甲基有亲水性，而烷基链 有疏水性，使得l m p c 有两亲性。l m p c 能增加乳剂的稳定性，并且能对疏水性化 合物起到增溶的作用，所以能在药剂和化妆品领域得到广泛的应用 9 浙江大学硕士学位论文 图1 1 2n - 亚甲基磷酸壳聚糖( i l p c ) 张灿 3 3 等以天然的壳聚糖为原料，其2 - n t t ：辛醛形成s c h i f f s 碱，用 k b 也还原得到n 一辛基壳聚糖，然后在其剩余的2 n k 上和m e o - p e g - c h o 反应，再 用k b h 4 还原，制备得到n 一辛基一n p e g 化壳聚糖衍生物。在n h 。上既有疏水的长 烷基链，又有亲水的p e g 链，在水溶液中可以自发形成胶束，有望成为难溶性药 物增溶的载体。 3 3o ，0 一棕搁酰化 在m e s o , h 中选择性的保护壳聚糖的氨基，合成0 ，0 一二棕榈酰化壳聚糖 ( d p c t ) 3 4 】( 图1 1 3 ) 。通过l a n g m u i r b l o d g e t t ( l b ) 技术测定d p c t 的两亲 性行为和对胆固醇的可混性。由于氨基在反应过程中被保护，未与棕榈酰氯反应， 可以进一步用戊二醛交联。实验表明，无论在极性还是非极性溶剂中，这种交联 的两亲性壳聚糖都能有效的吸附胆固醇。 踅 憋 l n h z 图1 1 30 ，0 一二棕榈酰化壳聚糖( b p c t ) 蛰 r。h；1。1 浙江大学硕士学位论文 3 4 对羧甲基壳聚糖( 伽) 的再改性 羧甲基壳聚糖( c m c ) 具有良好的水溶性、生物相容性和吸湿保湿性能，还 具有促进上皮细胞生长、延缓细胞衰老、促进皮肤伤口愈合和抗菌性等，目前常 被用于日用化工和医药领域 3 5 3 6 1 。 羧甲基壳聚糖本身几乎不具有表面活性，在应用时需要和表面活性剂共存。 但是两者相互作用，会对实际的应用性能产生直接的影响。在羧甲基壳聚糖分子 中引入疏水基团，使其同时具有亲水亲油的两亲性，无需加入表面活性剂就可降 低水溶液表面张力，在保持原有优良性能的同时，具有乳化、增溶和增稠等性质。 s u i 3 7 等将羧甲基壳聚糖与烷基缩水甘油醚在碱性条件下反应，合成了一 系列新型的两亲性化合物，对其表面性质的研究结果表明，对同一衍生物，在所 研究范围内，取代度越高，表面张力的能力及效率越高；对同一取代度的不同衍 生物，疏水链越长，降低表面张力的能力越强。 进一步研究( 2 - 羟基一3 一丁氧基) 丙基一羧甲基壳聚糖( h b p c m c h s ) 3 8 ， 发现它能自发形成胶束，胶束的平均粒径在3 0 0 n m ，同时测定了其i 临界胶束浓度。 h b p c m c h s 具有高增溶性，有望成为一些不溶药物的纳米载体。 第四节增加渗透性 粘膜给药聚合物体系作为药物传递的控释体系，在近年来越来越重要。粘膜 给药，能够通过局部或系统的方式将药物传递到需要的部位，优化胃肠粘膜表面， 加快药物的渗透，并在有些情况下能抑止降解酶的活性。 一系列研究表明，将壳聚糖改性后，其衍生物的粘膜吸附性能增强，可以延 长药物在消化道内的滞留时问，延缓药物的释放，提高药物的生物利用度。此外， 由于壳聚糖携带大量的氨基，具有一定的抗酸性，可抑制质子向粘膜的扩散，因 此还可以起到保护胃肠粘膜的作用。 从分子水平研究壳聚糖极其衍生物用做吸收促进剂的机制，认为其分子上携 带的正电荷能连接到细胞膜上，使得细胞问紧密结合蛋白的结构发生改变，从而 导致跨膜通道的开放，而且此作用是可逆的。 浙江大学硕士学位论文 与过去常用的吸收促进剂，如各种表面活性剂( s d s 、胆盐、脂肪酸等) 、 氨基酸衍生物、螯合剂、环糊精等相比，壳聚糖极其衍生物具有无毒、对粘膜上 皮的紧密结构不造成损伤的优点。 4 i 羧甲基化 在壳聚糖n h 2 上引入羧甲基，得到单一n 一羧甲基壳聚糖( m c c ) 3 9 】( 图1 1 4 ) ， 将其做为大分子药物的肠渗透促进剂。研究表明它能增强低分子量肝素的薄壁细 胞渗透性，是对阴离子大分子药物的传递和肠吸收有很好作用的一种功能性高分 子。 图1 1 4n - 羧甲基壳聚糖( m c c ) 4 2 巯基化 将壳聚糖2 n h 2 巯基化，能增加壳聚糖对粘膜的渗透性。用于改性的试剂主 要有半胱胺酸、巯基乙酸、2 一亚氨基环四硫醚等 4 0 - 4 2 1 ，机理是和壳聚糖上的氨 基形成酰胺键或者是脒键。 s c h n u r c h 4 3 等将巯基乙酸( t g a ) 接枝到壳聚糖的氨基上( 圈1 1 5 ) ，得到 t g a 一壳聚糖。提高了壳聚糖的粘膜吸附性能，增加巯基化壳聚糖在肠粘膜的滞留 时间，并且它能被糖苷酶生物降解。所以，接了巯基乙酸基团的壳聚糖有望成为 很好的粘膜给药系统。 匿o 令h 。秘冬o h 。 o s h 图l _ 1 5 巯基乙酸接枝壳聚糖合成路线 o j l o h h s _ 浙江大学硕士学位论文 在此基础上，又改进了合成了壳聚糖巯乙基脒( c h t e a ) ( 图1 1 6 a ) 和 壳聚糖一巯丁基脒( c h - t b a ) ( 图1 1 6 b ) 4 4 。研究了c h t e a 的反应条件和性 质，发现接枝度主要取决于壳聚糖的浓度和羟胺对硫乙酰基的脱乙酰度。对含有 c h t e a 的片剂进行稳定性实验，发现能稳定4 8 h ，延长了崩解时间。这是由于 二硫键是c h t e a 结构的一部分，有利于片剂基质的相互粘接，并且能增加c h - - t e a 的粘膜吸附性能。 在生理环境下，硫醇基的氧化作用形成二硫键，在这个条件下，壳聚糖一t b a 显出凝胶性质。1 5 的c h t b a 溶液在p h 5 5 的条件下形成共价交联的凝胶。随 着硫醇基团的增加，粘度增加。由于硫醇基团的存在，粘膜吸附性增加 4 5 。 图l 1 6 ac h - t e a t ) 一n h 2 + a h s 图1 1 6 bc h - t b a 通过乳液溶剂挥发法将c i n - t b a 制备成微球 4 6 。微球的粒径为1 8 7 o 3 ui f l 微球碎片的尺寸小于1 0ue l ，所以在滴鼻给药后，微球碎片的沉积不会被排 除在下级呼吸道中。在制备过程中，由于c h t b a 存在6 5 的二氧化硫基团， 可以和巯基通过分予间活着分子内作用形成二硫键，增加稳定性。和未改性的壳 聚糖相比，巯基化的壳聚糖表现出更高的生物相容性、粘膜吸附性，透皮性增加。 制备成微球是多肽类药物透皮给药的很好途径。在壳聚糖上引入巯基，反应过程 比较简单。c h t b a 和c h t e a 由于存在着带正电荷的脒键，能和粘膜上的阴离子 基团进行离子问相互作用，对粘膜的渗透性比c h - t g a 更好。 4 3 季胺化 粘膜细胞之间存在的紧密键连，成为药物透过的屏障。壳聚糖c 2 位上的氨 基质子化后，能够和细胞膜上的阴离子基团相互作用，从而破坏上皮细胞之问的 ，r 峰 嘭 浙江大学硕士学位论文 紧密链接，使得亲水性的大分子化合物，如多肽等能够透过。 但是，壳聚糖是一种聚阳离子化合物，在小肠、结肠、直肠的中性或碱性 p h 环境下不溶。这一性质限制了它在这些环境下做为透皮吸收促进剂的应用。 n 一三甲基壳聚糖氯化物( t m c ) ，做为壳聚糖的季胺化衍生物，在水中有超强的 溶解性，能促进亲水性和大分子药物的吸收。尤其在中性条件下对细胞壁的渗透 性增加 4 7 一- 8 1 。 t h a n o u 和k o t z 6 4 9 等首先发明了一步反应得到n 一三甲基季胺化壳聚糖盐 酸盐的方法。考察了反应的次数，每步反应的时间及碘甲烷的量对取代度的影响。 指出由于n - 二甲基壳聚糖盐酸盐的形成，高取代度的t m c 需要经过两次反应。 三次反应后，由于。上也被甲基化，极大的减弱了壳聚糖衍生物的水溶性。并 且考察了取代度对壳聚糖分子量的影响 5 0 - 5 u 。实验表明，随着季胺化程度的增 加，t m c 的分子量下降，粘度下降。这是由于随着反应步骤数、反应时间的增 加，聚合物处于一个强碱性环境种，并且在合成t m c 时，温度升高。 考察季胺化程度分别为4 0 ( t m c 4 0 ) 和6 0 ( t m c 6 0 ) 的n 三甲基壳聚糖 ( t m c ) ，对小肠的c a c o 一2 单层细胞透过性的影响。在相同浓度条件下，t m c 6 0 对渗透性的促进作用大于t m c 4 0 。两种季胺化壳聚糖对c a c o 一2 单层细胞的生长 都没有影响，故而是非细胞毒性的。实验表明，t m c 需要有高的正电荷强度来 改进对小肠上皮细胞细胞壁的透过性 5 2 。 将t m c 和壳聚糖盐酸盐、壳聚糖谷氨酸盐比较，考察它们对小肠上皮细胞 c a c o 2 单层细胞的渗透促进性【5 3 】。虽然在p h 6 2 0 时，t m c 对细胞的渗透促进 性要低于其他壳聚糖盐，但是t m c 在中性和碱性的p h 条件下有很好的水溶性， 而其他壳聚糖盐是不溶的，所以它们对渗透促进无效。研究表明，壳聚糖的正电 性，所带正电荷的密度，及壳聚糖衍生物的结构，是影响它们透皮渗透性的重要 因素。 m e r w e 5 4 等对以微型片剂作为固体口服给药剂型来传递t m c 和一种多肽 ( d d a v p ) 的情况进行了研究。研究表明t m c 做为一种促进剂，能促进多肽类 药物的吸收。 1 4 浙江大学硕士学位论文 4 4 接上荧光基团做为研究手段 为了更好的增强壳聚糖的吸附性，需要对各成分之间的相互作用机理进行深 入的研究。所以合成了荧光异硫氰酸盐标记的壳聚糖 5 5 ( 图1 1 7 ) 作为大分 子荧光团，研究壳聚糖和黏蛋白的相互作用机理。 倚锚 h c t 曲t k d a 血b 扯 图1 1 7 荧光异硫氰酸盐标记的壳聚糖 第五节提高基因转染效率 基因治疗是未来医药领域中极具潜力的发展方向，近年来应用前景备受关 注。基因治疗的关键问题之一在于开发安全、高效的基因转染体系。 作为一种天然的碱性多糖，壳聚糖有良好的生物相容性、耐血清性和独特的 跨细胞膜特性，并且有有无刺激、无致敏、无抗原性、无致突变等优点。 但是基因转染要经历如下过程：( a ) 释放系统进入靶细胞，( b ) 跨细胞膜运 输，( c ) 被内涵体吸收和降解，( d ) 质粒d n a 转运到细胞核。所以质粒d n a 被导入靶细 胞，经过转录并最终将遗传信息翻译成相应的蛋白质，必须克服一系列障碍。 为了取得高转染率，将壳聚糖通过一系列改性后，使之具有下列优点：l 、 浙江大学硕士学位论文 增强d n a 在细胞膜上的吸附，使d n a 质粒在细胞膜上浓度增加，从而增强对细胞膜 的透过性；2 、能更好的和d n a 复合，使d n a 免受d n a s e 的降解：3 、能形成凝胶等 将d n a 包裹其中，达到d n a 在体内的控制释放。 5 1 季铵化壳聚糖盐载体 t h a n o u 5 6 等合成了三甲基季胺化壳聚糖( 图1 1 8 ) ，将它做为非病毒基因 传递载体。合成的季胺化壳聚糖能溶于水，并且能够调节其阳离子强度。实验考 察了随着季胺化程度的增加，正电荷增加对细胞生长和基因转染的影响。同时也 考察了分子大小( 壳聚耱低聚物和聚合物分别季胺化) 对细胞毒性和转染率的影 响。 壳聚糖低聚物和聚合物分别季胺化，并和d n a 质粒复合，通过凝胶电泳考 察其稳定性。研究表明，所有衍生物的细胞毒性都小于p e i ，随着季胺化程度的 增加，细胞毒性增加。所有相同的季胺化程度，壳聚糖高聚物的细胞毒性高于壳 聚糖低聚物。所有的衍生物对d n a 质粒的转染率都高于p e i 。 图1 1 8 季胺化壳聚糖盐酸盐 5 2 半乳糖基改性的壳聚糖载体 虽然在一定情况下，壳聚糖一d n a 复合物纳米微粒在没有任何配体一受体作 用下可以被细胞摄入，但是，要进入特定的靶向细胞，需将壳聚糖以不同的生物 特异性配体修饰。 在n 一三甲基的季胺化壳聚糖的基础上，在6 o 上接枝上四个乳糖基团，形 成乳糖簇，得到化合物t c g a l 4 a 2 0 1 5 7 1 ( 图1 1 9 ) 。由于接上了糖基，细胞表面 的受体对它有特异的识别性。将其与d n a 质粒静电复合，作为通过受体介导的 基因传递载体，能使d n a 选择性的结合到指定的细胞表面，提高其在细胞表面 的密集度，从而提高d n a 传递的有效性。t c g a l 4 a 2 0 对r c a l 2 0 血凝素有很 1 6 t 浙江大学硕士学位论文 高的亲和力，有将基靶向的传递到肝实质细胞的能力。 图1 1 9t c - ( ；a 1 4 a 2 0 5 3 去氧胆酸改性的壳聚糖载体 以每1 0 0 个脱水葡糖酐接枝5 1 个去氧胆酸基的比例，加入e d c ，通过耦合 作用在壳聚糖上接枝去氧胆酸 5 8 】。合成得到的去氧胆酸一争壳聚糖( 图1 2 0 ) 是疏 水性的，能在水溶液里自组装形成成颗粒。在p h = 7 2 的p b s 中，形成的自组装 颗粒粒径为1 6 2 - 1 - 1 8 n m 。自组装的颗粒能和d n a 质粒形成复合物，这种复合物 做为一种含有可生物降解聚合物材料的传递系统，可用于将基因传递到哺乳动物 细胞中。 p a r k 5 9 等用不同量的三硝基钠处理后的不同分子量的壳聚糖和去氧胆酸接 枝，得到疏水性壳聚糖。由于分子量不同，形成的自组装颗粒大小也不同，范围 在1 3 0 - 3 0 0 n m 之间。当壳聚糖的分子量大于4 0 k d a 时，由于壳聚糖链的刚性结 晶结构，自主装颗粒可能是圆柱形的竹节状结构，而不是球状的结构。自组装颗 粒和d n a 质粒形成的复合物的结构取决于壳聚糖自组装颗粒的形状和结构，复 合物的结构对c o s 一1 细胞的转染率有很大的影响。这种通过控制壳聚糖衍生物 的自组装颗粒大小和结构的方法将被广泛的应用于基因传递和一般药物的传递 中。 浙江大学硕士学位论文 图1 2 0n 一去氧胆酸接枝的壳聚糖 5 4 十二烷基化壳聚糖载体 将基因释放到目标细胞核的整个过程中，保护d n a 不被酶解是十分必要的。 将十二烷基壳聚糖和d n a 通过静电相互作用形成复合物 6 0 ，测定不同温度下 d n a 和其在复合物中的紫外吸收发现，由于十二烷基壳聚糖的保护作用，d n a 分子热稳定性提高。d n a 酶解实验表明，原始d n a 被酶解成碎片，而被十二烷 基壳聚糖保护的d n a 保持完好。 第六节改进其他性质 6 1 对酶的固定作用 由于甲壳素和壳聚糖的性质：可以通过化学反应、物理吸附方便的固定生物 活性物；低堆密度、粗孔结构、低毒性，使得它们成为一种很好的支持物，用于 固定生物活性物。在甲壳素和壳聚糖上固定酶，可以用戊二醛，比较方便，但是 在操作过程中可能使得醛基水解。 为了保持酶的活性，通过共价键在温和条件下固定是种很好的方法。巯 基可以和酶上的巯基形成二硫键，所以，带巯基的壳聚糖是一种很好的固定酶的 底物。 k u r i t a 等 6 1 将酸性磷酸酶固定到两种含巯基的甲壳素上，2 一巯基甲壳素和 1，y1，j 浙江大学硕士学位论文 6 一巯基甲壳素( 图1 2 1 ) 。研究发现适合固定的最佳p h 值为4 5 和4 8 。固定的 酶在p h 值为6 0 和5 5 上有最大活性，几乎和溶解的酶一样。6 一巯基甲壳素 酶结合物在重复使用后，仍保持很好的活性，但是2 一巯基甲壳素酶在使用几次 后