第十八章 分离纯化脂肪酸和油脂副产品的新技术.doc

第十八章 脂肪酸和油脂副产物的分离纯化新技术1Udaya N. Wanasundara, 2P. K. J. P. D. Wanasundara, 3Fereidoon Shahidi（1. 加拿大萨斯喀彻温省萨斯卡通POS试验场公司，2.加拿大萨斯喀彻温省萨斯卡通加拿大农业和农业食品萨斯卡通研究中心，3.加拿大圣约翰纽芬兰纽芬兰纪念大学）第一节 引言油脂是根据它们在有机溶剂中的溶解度不同而进行分类的一组化合物，包括几类具有相关性但化学和物理性质不同的化合物。大多数油脂的主要成分是甘油三酯（TAGs），准确的说它们是甘油和三个脂肪酸形成的酯。在从种子、果皮或果仁中萃取油脂时，伴随甘油三酯的其它化合物，如磷脂、色素、生育酚、甾固醇类等也分离出来。当油用作食用时，这些同时萃取出来的脂溶性物质使产品形成不良味道和非期望色泽，有时货架期缩短。随着食用油脂工业技术的发展后，毛油通过精炼得到主要成分甘油三酯（TAGs）。在精炼过程同时将几种具有较高商业价值的成分分离出来。越来越多的科学证据证实，这些成分具有潜在的健康益处和功能用途，已做出投入很多努力力量来分离和浓缩这些微量成分。虽然食用油脂的主要分子形式是甘油三酯，但也很有必要根据其化学成分来分离食用油，或用不同方式对其进行改性。第二节 制取脂肪酸的方法在以油脂为原料获得的产品中，脂肪酸的产量最大，其用途从矿物油的净化到用于食物、药品。自然界中，脂肪酸以游离状态或大部分以酯化形式存在。脂肪酸根据碳链长度和碳碳双键的数目分类。各类脂肪具有自己的脂肪酸特征组成。已经建立了从天然原料中分离（或浓缩）和提取特殊脂肪酸及其衍生物（及其酯、游离脂肪酸、甘油三酯等）的多种方法，但只有极少数方法适合大规模生产。这些可行方法包括色谱（吸附和分离）、分馏或分子蒸馏、酶水解、低温结晶、超临界流体萃取和尿素络合。每一种方法都有其优点和缺点。油脂中大多数的脂肪酸以甘油酯的形式存在，这些与甘油相酯化的甘油酯是构成油脂的主要组分。例如，在棕榈油中，脂肪酸的天然混合物可分为两个组成部分，即“软脂”，它含尽可能少的饱和脂肪酸，另一个是“硬脂”，含尽可能少的不饱和脂肪酸。不管采用那一种分离工艺，起始的脂肪酸混合物或“原料”应达到一定标准。对于原料而言，高质量产品的脂肪酸应未被破坏（如氧化、异构化最少），脂肪酸以甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯以及脂肪酸盐形式存在时杂质含量很低1。Guessrow最早报道了脂肪酸的分离2。将直链饱和脂肪酸与直链不饱和脂肪酸分离，首先要制备铅盐衍生物，将混合盐溶解在乙醚或乙醇中，然后将不可溶的饱和酸从可溶的不饱和酸中分离出来。这是一种非常有效的方法，但需要大量溶剂并且要预先制备脂肪酸盐，这使得该工艺很难应用到在商业规模化生产中采用3。工业化脂肪酸的经典分离工艺包括分盘压榨法4,5、Solexol工艺611、Emersol工艺1215、Armour-Texaco工艺16,17和Henkel工艺1822。经典的分盘压榨法根据熔点的不同来分离软脂和硬脂组分。Lanza、Henkel、或Lipofrac工艺是利用熔点不同而研发出来的自动分离工艺。Solexol和Emersol工艺利用液液逆流萃取与熔点差异相结合的方法来分离脂肪酸，从而得到较高纯度的脂肪酸产品。Armour-Texaco工艺与Emersol工艺相似，但用丙酮代替甲醇做溶剂。这些方法的焦点都集中在硬脂酸和油酸的提取上。但这些方法不适合分离高价值的脂肪酸。目前对各种脂肪酸的需求，包括长链多不饱和脂肪酸（PUFA），可能需要结合不同工艺来进一步分离脂肪酸。2.1 经典方法及其进展分离脂肪酸的原理是基于每种酸或酸基团的特性。在分离技术的发展过程中，主要用到两种性质（蒸气压和熔点的差异）。脂肪酸混合物的蒸汽压随脂肪酸链长的变化而发生大幅度变化，这一点可用作分馏分离长链脂肪酸和短链脂肪酸的方法。但蒸气压不随不饱和度的改变而有很大变化不大。脂肪酸的熔点随其不饱和度而变化很大，因此可以用另一种方法将混合脂肪酸分离成饱和组分与不饱和组分。通过改变混合物的温度，脂肪酸就可以在其各自结晶温度时，依据其不同的不饱和度而分离。2.1.1 普通色谱法 Smith23和Elsden24报道了短链脂肪酸色谱分离的经典方法。据报道利用氧化铝吸附层析柱25可以纯化花生四烯酸甲酯，利用硅胶柱26可纯化不饱和脂肪酸。以乳胶为固定相，可以用分配色谱27,28来分离脂肪酸。用含水丙酮和甲醇作为流动相可分离长链多不饱和脂肪酸与甘油酯，用硅油或合成的聚合物浸渍滤纸。Boldingh28报道了使用花生油饱和的乳胶粉末为固定相，甲醇/丙酮或甲醇/水为流动相的反相柱层析法分离脂肪酸。脂肪酸气-液相色谱分离方法首次在1952年发表29，描述了1到12个碳的脂肪酸的分离方法。同一研究小组接着又发现脂肪酸的预甲酯化可以提高它在高温下的挥发性和分离度。所用的固定相是硅油与硅藻土Celite 545掺合的固体粉末担体，将其填充于玻璃柱中。Orr和Catten30描述了一种以液体聚酯为固定相来分离饱和与不饱和脂肪酸的方法。后来，引入了具有各种极性相薄膜的毛细管柱，根据脂肪酸的碳原子数、不饱和度、异构化等来提高脂肪酸的分离效果。 色谱分离广泛应用于高纯度脂肪酸的提取。脂肪酸分离用的数种专利已经获得了授权，这些专利采用不同类型的吸附剂和技术。固定床色谱系统可以使用非极性固定相（如反相色谱系统）或极性固定性（正相色谱系统）。在多种油脂化工产品（脂肪醇、烷醇酰胺、-磺酸甲酯、蔗糖酯和其它酯）的生产中，脂肪酸甲酯可以作为脂肪酸的替代品。甲酯比脂肪酸更好，因为它们产品纯度更高，合成的条件更温和。甲酯通过油脂在碱性催化剂作用下醇解获得，通常是甲醇钠存在下与甲醇反应获得；或通过Colgate-Emery工艺（该工艺需大量资金且耗能）水解脂肪，接着加入甲醇与水解的脂肪酸酯化31。 分子筛吸附技术已得到广泛研究，并已应用于从混合脂肪酸中分离或浓缩分离饱和、单不饱和、二不饱和脂肪酸中分离或浓缩。Logan和Underwood32发明了一种专利方法，即根据不饱和度，用沸石作为吸附剂来分离脂肪酸酯。非离子的、疏水交联的聚合物也成功应用在脂肪酸的选择性分离上33。脂肪酸首先被吸附在含特定吸附剂的固体床上，然后用一个合适的洗脱剂来洗脱吸附的脂肪酸。 尽管气相色谱分离法用于分析目的是可行的，而液相色谱方法更适用于制备和工业规模化分离脂肪酸或脂肪酸酯。脂肪酸的液相色谱分离方法也用在从食品或药品的混合物中得到特定脂肪酸或脂肪酸酯的浓缩物。为了得到高纯度的长链多不饱和脂肪酸（PUFA）单体，已对液相色谱方法进行了很详尽研究。Nakahara等34报道了以丙酮/乙腈为流动相、十八烷基硅烷键(ODS)为固定相，从海洋微藻中（例如裂壶藻）分离含二十二碳六烯酸(DAH)和二十二碳五烯酸(DPA)甘油三酯（TAG）的反相液相色谱法。这种固定相分离甘油三酯（TAG）的原理是基于固定相与甘油三酯（TAG）中脂肪酸残基之间的范德华力强度的差异。根据脂肪酸中双键的数目和双键的构型（顺式或反式），用硝酸银硅胶来分离脂肪酸甲酯单体，在脂肪酸分离工艺中是一个大进步。此分离技术的原理就是金属离子(例如：银离子)与不饱和脂肪酸残基中碳原子中的一个碳碳双键轨道中的电子可逆相配，形成一个金属络合物。络合物的范德华力大小取决于脂肪酸的链长，碳碳双键的数目，双键的位置和构型（顺或反）。银（银离子）色谱和高效液相色谱（HPLC）也一起用来分离脂肪酸。反相和银离子高效液相色谱两个分离原理都是依据多不饱和脂肪酸（FUFAs）的不饱和度来分离甘油三酯的35。使用毛细管超临界液体色谱（25%丙基氰酯、75%聚甲基硅烷为固定相），使分离含相同酰基碳数和不饱和度的甘油三酯成为可能36。 Teshima等37利用硝酸银浸泡过的硅胶柱分离鱿鱼肝脏油脂肪酸甲酯中的二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），EPA纯度为85%-96%，DHA纯度95%-98%，产量分别为39%和48%。Corley等38利用由硅胶和银离子或镁离子组成的高效液相色谱（HPLC）柱从海藻油分离富含DHA的甘油三酯（TAG）。Hayashi和kishimura39使用硅胶酸柱，用正己烷、乙醚/正己烷、乙醚进行分步洗脱从金枪鱼眼窝油中分离出纯度达63%-74%的DHA。Adlof 和Emiken40利用银树脂柱通过等度洗脱从-3FUFA（多不饱和脂肪酸）浓缩物中将3脂肪酸的含量从76.5%提高至99.8%。在另一项研究中，同一批研究者通过在甲醇中增加乙腈的含量（0-30%，v/v），将100mg含29.1%EPA、20.5% DHA的鱼油甲酯浓缩物分离成含87.7%EPA和95.4%DHA的组分。他们通过用含40%（v/v）乙腈的丙酮等度洗脱，分离了约含12.5%EPA和11.1% DHA的非浓缩鲱鱼油甲酯和脂肪酸，得到一种EPA和DHA总含量约为69%的洗脱组分。 色谱分离脂肪酸酯所用溶剂的选择，取决于洗脱组分期望得到的纯度、生产要求以及产品最终用途。已经用四氢呋喃/甲醇/水（25：55：20，v/v/v）41和甲醇/水(90:10,v/v)42从鱼油脂肪酸乙酯中分离得到高纯度（75%-96%）的EPA和DHA。利用Tokiwa等41的四氢呋喃体系，Krzynowek等43得到更高纯度的EPA和DHA组分。但四氢呋喃具有氧化性很容易产生过氧化物，使多不饱和脂肪酸（PUFA）开始氧化分解，同时THF有潜在爆炸性。如果最终产品是人直接消费的，那么应该选择乙醇和水作溶剂。2.1.2逆流色谱法 最近几年，逆流色谱（CCC）和离心分配色谱（CPC）在多不饱和脂肪酸的分离中得到更多的关注。这种新的色谱技术采用液液分离，溶质混合物在两种液相中进行逆流分配，在没有固体物支撑的情况下进行复杂化学物质的混合物分离44,45。 Ito在1964年最先使用离心分配色谱（CPC），它是一个没有吸附剂的液液色谱，需有两种不互溶的溶剂相，该法基本上是逆流分配派生出来的，由Craig进一步开发46。在最典型的CPC方法中，当第二种溶剂相通过固定相溶剂时，一种液相保持固定。分离原理是溶质在两种互不相容的溶剂之间分配。溶质进入两种溶剂相中的相对比例由各自的离心分配系数决定。CPC是一个可用于大规模生产的分离技术，与传统的液固分离方法例如普通的柱层析色谱和高效液相色谱法相比，它在分离和纯化天然产品方面具有明显优势。CPC不需要用固体担体作为固定相。因此，消除了样品中高吸附力成分的不可逆吸附的可能性。事实上由于这个原因，这种色谱法实际上可以确保几乎100%回收化合物。任何两相溶剂系统都可用，很多分配体系可用那些无毒的易得的溶剂来构建。离心分配色谱中，固定相的体积占柱总体积（转子）的比例比传统液相色谱大。因此固定相保留样品物料的量很大。在传统填充色谱柱中，昂贵样品组分通常发生分解和变性，而CPC操作条件温和，不存在这种现象。CPC在任何pH条件下都可以使用。不需考虑CPC中固体担体（如二氧化硅、氧化铝等）对pH值会造成影响。CPC的另一个优点是溶剂消耗量较低，正相和反相洗脱都可以用相同的一对溶剂。CPC很容易进行大规模连续分离。其全部过程在一个液相密闭系统中进行。所以环保问题降到了最低，而且溶剂可以全部回收循环利用45。CPC仪器有两种基本类型：一种是日本京都Sanki工程公司制造的离心分配色谱，另一种是由Ito设计，马里兰州巴尔的摩制药技术研究公司制造的多盘管逆流系统。与大多数色谱系统相似， CPC有基本的部件，例如输送溶剂的泵、控制溶剂输送和样品注射的阀门、检测器和记录器。这种仪器的主要部件是转子。转子是由叠放的有刻纹的聚亚苯基硫化物（PPS）或聚氯三氟乙烯（DAIFLON）圆盘组成的，这些圆盘由聚四氟乙的密封垫和不锈钢板分开。圆盘由每一边的渠道和管道组成。液体固定相保持在这些渠道中，转动的动子产生的离心场可将固定相牢牢控住，足以让流动相泵送通过。Wansunsudara和Fedec45的综述描述了这种仪器的细节和功能。最近，法国昂热Kromaton公司制造出另一种型号的离心分配色谱（CPC）仪器，现在这种型号的设备已商品化。另一种商品化的旋转盘管式的仪器是由马里兰州巴尔的摩制药技术研究公司发明的多盘管逆流色谱。多盘管色谱是由两到三个相同的多层盘管对称安装在离心分离机的转子框架上，因此不需要用反向重量平衡。每个盘管柱都围绕离心机的中心轴做同步圆周运动，同时以相同的角速度沿自己的轴线旋转47,48。每个柱子都装有导流管，导流管的排布方式使它们不会扭曲，这样仪器可以在无密封下操作。这种三盘管仪器各种控制模块具有不同柱容量（型号有TCC-1000、CCC-3000和CCC-1000；各自对应的柱容量是4ml、40ml和800ml）。因为没有固体担体，所以注入样品的保持力仅取决于混合液各组分在互不相溶的两相溶剂之间的分配系数。通过增加盘管的数量或长度，减少盘管内径，或减少螺旋直径，都可以改善柱子的理论塔板数49。正确选择溶剂系统对于CPC成功分离是最为重要的。为CPC选择一种两相溶剂系统，类似于其他色谱方法（如普通柱或HPLC）选择一种溶剂50。样品成分的极性、溶解度、电荷状态和形成化合物的能力等都是重要的标准。CPC选择溶剂系统有两个关键点：第一是样品的溶解度，第二是所分离分子种的分配系数差异。色谱文献中有许多在各种逆流色谱分离中使用不同溶剂系统的例子51,52，这些参考文献提示某些分离过程可采用哪种溶剂体系。通常，经典的氯仿/甲醇/水（极性体系）或正己烷/乙酸乙酯/甲醇（非极性体系）溶剂系统可以作为起始体系，改变每种溶剂的比例，直到样品在两相中达到所要求的分配为止53。基于氯仿的溶剂系统在两种溶剂相之间的密度差较大且表面张力相对较高，因此，经常在CPC中用这种体系来分离天然产物。由于分配时间较短，通常氯仿/甲醇/水系统的相保留时间令人满意。但氯仿系统的一个缺点是很易导致Sanki型设备超压，另一方缺点是氯仿对健康的严重危害性。图1 三元相图另一个为CPC选择合适溶剂系统的途径就是使用溶剂相图。很多溶剂系统的三元相图都是由Serensen和Arlt54编制的，图1给出了其中的两个相图。很多溶剂系统通常是由两种互不相溶的溶剂加上第三种可以溶解在这两种溶剂中的溶剂组成的。很多体系与类型A相同，一种溶剂与其他两种不相溶溶剂相混杂（图1A）。类型A三元体系一个典型的例子就是氯仿/甲醇/水。很少有体系像类型B，它由三种全都两两互溶的溶剂组成，但这个三元相图中存在这样一个区域，当溶剂以合适的比例混合时，这个区域就会产生两相系统（图1B）。类型B体系的一个较好的例子就是水/二甲基亚砜/四氢呋喃系统。Foucault50建议当用三元相图来选择溶剂时，要考虑以下三个标准。（1）样品必须完全溶于所选择的溶剂。由于CPC可以用于制备目的，所以最后的混合液必须能溶解大量的样品，因此它应该包含至少一种“最佳的”溶剂使样品能完全溶解。（2）根据溶剂极性（许多极性范围在文献中都可以找到），在已选的“最佳”溶剂的两边各选择一种溶剂，一种是非极性的，一种是极性的。为了获得两相体系，最佳溶剂将在其它两种溶剂中分配。（3）调整最佳溶剂的比例将样品分散在两相中；也就是说，样品的非极性组分将优先进入非极性相而极性组分优先进入极性相。所以平均分配系数会在1左右。（4）常用用于分离天然产物的两相溶剂体系在表1中列出。表1 用CPC分离天然产物中常用的两相溶剂体系a化合物溶剂体系水溶性蛋白质，核酸糖乙醇/含水盐乙腈/含水盐肽，糖丁醇/乙酸/水丁醇/甲醇/水非离子物质（多酚，皂苷）丁醇/乙酸/水丁醇/甲醇/水丁醇/乙酸乙酯/水水不溶性高极性（多酚，丹宁酸）丁醇/乙酸/水丁醇/甲醇/水丁醇/乙酸乙酯/水中极性（多酚，萜类化合物）氯仿/甲醇/水甲基-t-丁基醚/乙腈/水庚烷/乙酸乙酯/水低极性（脂肪酸，生育酚，植物甾醇）正己烷/乙腈正己烷/甲醇/水正己烷/乙醇/水a数据来自于Wanasundara等45。Bousquet等55,56研究采用CPC从微藻油中分离DHA和EPA，可从这种油中分离出纯的EPA和DHA且得率很高。第一次分离用庚烷做固定相，乙腈/水（3%，v/v）为流动相，可除去次要的脂肪酸，留下四种主要的多不饱和脂肪酸混合物。从2.4g粗酸混合物中得到1g脂肪酸混合物，C18:3、C18:4、EPA、DHA含量分别为43%、7.5%、45%、4.5%。该脂肪酸混合物以庚烷为固定相甲醇-水为流动相的再经一次分离，在这样条件下，可以达到很好的分离效果，分离得到纯的EPA和DHA且得率很高。Murayama等57还成功分离了C18：0、C18：1、C18：2和 C18：3脂肪酸乙酯的混合物，因为在正己烷/乙腈（1:1，v/v）的两相溶剂中，它们的分配系数范围很广。C18：2和C18：3在第一次正相上行洗脱时分离出来，而C18：1可以通过改变洗脱模式来回收。CPC也可以用一种由正己烷/二氯甲/乙腈（5：1：4，v/v）组成的溶剂体系来分离EPA和DHA乙酯。用CPC已从含39.7%DHA和15.2%EPA的海藻油中纯化出DHA和EPA。用CPC的正相上行模式，用正己烷/甲醇/水（100：95：5，v/v）两相体系洗脱，可从海藻油中得到游离脂肪酸混合物。在这种条件下，DHA可纯化到84.6%，DPA可以到84.9%；但C14：0脂肪酸和DHA在这种条件下会发生共洗脱。为了得到DHA纯品（99%，高纯化学级），用尿素络合作为海藻油-FFA的预纯化方法来除去共洗脱的C14：0脂肪酸45。由于-亚麻酸（GLA）的不稳定性，利用经典的色谱方法纯化是很困难的；但在上述溶剂体系和条件下，利用CPC从琉璃苣油-FFA（油中含21.8%GLA）中分离的-亚麻酸（GLA）纯度可达98%以上的-亚麻酸（GLA）。CPC可以从蛋黄中分离和纯化出高纯度的磷脂。通过CPC的一次处理58，就能得到磷脂酰胆碱（PC，卵磷脂）纯度达98.3%的蛋黄乙醇提取物。这种纯化过程的副产品有相当高纯度的磷脂酰乙醇胺（PE）、溶血磷脂（LPC）、(神经)鞘磷脂（SPM）、甘油三脂（TAG）等。Boudimant等58还用CPC技术从鱿鱼提取粗磷脂中提纯获得纯的磷脂酰胆碱（PC）。起始的提取物含磷脂酰乙醇胺（PE）(24.1%)、磷脂酰肌糖（PI，17.5%）、磷脂酰丝氨酸（PS，4.9%）、磷脂酰胆碱（PC）48.3%）和(神经)鞘磷脂（SPM）（5.1%）。这个粗提取物第一次先用正己烷/乙酸乙酯/乙腈（1：0.6：1，v/v）溶剂体系分离。第一次洗脱采用正相上行模式，除去PC以外的成分，然后应用反相下行模式，将极性最大的磷脂酰胆碱（PC）从转子上洗脱下来。用CPC也可以分离和纯化生育酚异构体45。在上行洗脱模式下，用正己烷/乙腈/乙醇（40:25:10，v/v/v）溶剂体系，利用Sanki仪器可以使含70%总生育酚的混合物分离成-、-生育酚（纯度为97%）和-生育酚（纯度为99%），并且回收率较高。 CPC是一种高效的加工规模的分离技术，与其他方法相比，在分离和纯化脂肪酸上有明显的优势。它也是对HPLC的补充。尽管CPC的投资比HPLC更贵，但通常运行成本与规模相关，它比正传统液相色谱或制备HPLC进行相同分离规模时要低。由于在这种体系中没有固定相，在CPC中不需要考虑像HPLC放大时由于柱填充化学性能、表面形态和结构的改变而产生的问题。它的另一个优点是：当处理容易氧化的物质，尤其是高不饱和脂肪酸时，可以选择在氮气流或其它惰性气体下进行分离。目前已经证明它具有分离几克级脂质上的潜力，有希望进一步发展到千克水平的加工能力45。2.1.3 结晶 众所周知，高饱和酸的溶解度比相应的不饱和酸要小，据此可从混合物中将高饱和酸部分地分离出来。因此，在常温、零度、零度以下结晶，已成为纯化脂肪酸及其衍生物的一种有用方法。在20世纪30年代，Brown和Stoner59以及Brown和Shinowara60证实了利用低温结晶可以从棉籽油中部分分离脂肪酸，以及由橄榄油制备油酸。低温结晶最初是开发用于分离那些在0以上在有机溶剂中有很高溶解度，但在较低温度直至-80下溶解度较小的物质，如某些TAG、脂肪酸、酯和其它脂质61。1950年，Bailey和他的同事强调，任何一种酸的溶解度都与其熔点紧密相关，而在某种程度上取决于溶剂特性。 根据脂肪酸或甘油三酯熔点的不同进行结晶分提有两种方法。干法分提即低温结晶是在低温下除去高熔点的饱和成分，从而浓缩得到含更多不饱和甘油三酯成分的油。另一种方法就是溶剂分提（结晶），用有机溶剂如丙酮或正己烷来提高各组分的得率。2.1.3.1 低温结晶这种分离脂肪酸的方法不使用有机溶剂，因此，它的分提是没有溶剂的，或者称低温结晶。脂肪在有机溶剂中的溶解度随着平均分子量的增加而减少，随不饱和度的增加而增加62。一般来说，偶数碳的饱和与不饱和酸的溶解度随着分子量增加而减少，对不饱和脂肪酸来说，溶解度随双键数目的增加而增加。Singleton63和Stout64等测定了大量脂肪酸和酯在多种溶剂中的溶解度，得到以下规则：如果是饱和脂肪酸，长链酸的溶解度比短链酸要小；饱和脂肪酸的溶解度比相等链长的单烯酸和二烯酸要低；反式异构体的溶解度比顺式异构体要低；普通直链脂肪酸酸的溶解度比支链脂肪酸低。脂肪酸的熔点随着其类型与不饱和度变化而变化很大，因此分离饱和与不饱和脂肪酸混合物是可能的。反式脂肪酸（高熔点）的溶解度比它对应的顺式脂肪酸（低熔点）要低。饱和脂肪酸通常在室温下凝固，在温度0下时结晶。晶体通过任何传统的过滤方法可以从母液中分离出来。在低温下，有较高熔点的长链饱和脂肪酸结晶出来，而多不饱和脂肪酸（PUFAs)则仍然保持液体形式。然而，有较低熔点和高溶解度的不饱和脂肪酸必须在低温下（0至-100）才能结晶，而且必须在恰当低温下完成过滤。应该缓慢降低溶液温度（1-6h）至结晶温度并保持4-24h。这样产生大量易过滤的结晶体。低温结晶是一个温和的过程，尤其适合在高温度下很易氧化的多烯酸。在20世纪40年代，饱和脂肪酸的低温结晶就已经用于实践，并已发展成为一种从天然甘油三酯资源中分离不饱和脂肪酸的商业技术。在低温下形成的脂肪酸晶体可通过过滤分离出来，现在已经研发出特定的设备，可以在低温下完成这个过程。 某种特定脂肪酸在混合物中的溶解度接近于其纯品的溶解度，但也可能会发生互溶现象，也会在某些温度下形成混合结晶物而使得特定的脂肪酸无法沉淀出来62。当不饱和组分大量存在时，分离除去高熔点饱和脂肪酸成分是相对容易的，但天然的脂肪酸混合物通常不是这样的情形。所分离的固体物质中含有液相（夹带）是结晶分提过程中的一个问题，当结晶颗粒或凝聚物内部包埋了不结晶的液体，或颗粒之间包含了液体时就产生了这个问题。 使用膜式压滤机使干法分提与溶剂分提的效率不相上下，尤其是在棕榈油中间组分分离中。分提组分中对称单不饱和甘油三酯的含量，以及对称与不对称的单不饱和甘油三酯的比率，构成了棕榈油中间组分的品质指标，这也是可可脂的特征指标。根据Diffense65的研究，两级溶剂（丙酮）分提到的棕榈油中间组分的对称甘油三酯浓缩物通常与三步干法分提是一样的。Willlner等66研究表明，两级溶剂分提（丙酮）得到的中间组分，与两步干法分提（采用第一步为膜式压滤机，第二步为用高压力的“水压机”相结合的方法）是一样的。膜式压滤机的引入，改善了干法分提在工业分离油脂组分的应用特性。 通过长时间结晶实现缓慢冷却，有助于产生稳定的甘油三酯结晶的同质多晶体。为了实现这一点，一种方式是用油温作为冷冻剂的控制参数（如比利时Tirtiaux分提）。在结晶过程中，控制搅拌对优化软脂产量和产品质量也很重要。另一种方法就是用水平真空履带式过滤机（比利时Tirtiaux分提），这种设备早在20世纪70年代就已经采用，它可以提高软脂的产量（从67%到72%）。但这两种工艺方法仍不能减少夹带的问题。在20世纪80年代早期采用的膜式压滤机可在压滤机腔内对滤饼施压，从而使得滤饼中的液体夹带量很少。这种压滤机进一步发展到可以在50bars压力下操作，但操作成本较高（德国克虏伯水压机）。利用逆流结晶（在多段结晶工艺的连续段中，进料与逐渐缺少固体的液体相接触）可以强化食用油脂67的结晶分提效率。 干法分提可利用结晶调节物质来加速、延缓或抑制甘油三酯的结晶68。这些结晶改良剂（或晶体习性改良剂）是蔗糖脂肪酸多元酯，尤其是棕榈酸和硬脂酸酯69-71或葡萄糖酯及其衍生物，例如糊精72。晶体习性改良剂通过改变甘油三酯结晶习性使得结晶的硬脂基料更有效地从液相的软脂中分离出来。棕榈酸或是硬脂酸可作为蔗糖的主要取代剂（4到8个平均取代度），其产物蔗糖酯是一种乳化剂，可在高温下（约50）添加到油脂中。一旦它们与脂肪混合，温度随之下降，细小、坚硬的特定组分脂肪晶体就开始形成。真空过滤可用于分离生成的结晶。分离效果取决于结晶、静置或搅拌的模式。2.1.3.2 溶剂结晶 低温结晶过程可以在无溶剂的纯液体中进行，或在选定的溶剂/溶剂混合物中进行。开发的液液逆流萃取已应用于油脂与脂肪酸的分提和精炼。从有机溶剂尤其是极性溶剂的脂肪酸混合物中结晶出饱和脂肪酸，这是一种有前景的分离方式。表2给出了不同有机溶剂中各种脂肪酸的溶解度随温度而变化的情况。对不饱和脂肪酸混合物而言，Hildith和 Riley73研究表明，将葵花油、芝麻油和花生油脂肪酸混合物在丙酮（5g/ml）中冷却到-30，分离晶体后留在溶液中的那部分主要是亚油酸。结晶固体的碘值较低，主要含饱和脂肪酸。后来，用该工艺分离各种天然资源中的不饱和脂肪酸61。通过结晶在低温（-20到-80）下分离不饱和脂肪酸甲酯是可行的，因为饱和脂肪酸、单烯酸的酯更容易结晶。通常使用甲醇或丙酮做溶剂来分离“硬脂”和“软油”组分。也尝试用过其它溶剂例如正己烷、甲酸甲酯74。Emersol工艺和Armour-Texaco工艺就是利用在低温下脂肪酸组分能部分从溶剂中结晶出来的原理。先将脂肪酸溶解在甲醇中，然后使其通过一系列的预冷器和能将温度保持在凝固点以下（正己烷(-20)丙酮(-4)石油醚(-20)。脂肪酸的溶剂结晶对制备纯脂肪酸来说是不可缺少的方法。这个方法所要求的单元操作数最少，且设备最简单77,78。简要地说，这个工艺包括以下步骤：将油或脂肪酸在溶剂中冷却，保持一定时间，然后用过滤除去结晶组分。海豹油（SBO）溶剂结晶PUFA的研究表明，不论是游离的还是甘油三酯（TAG）形式的脂肪酸，都能在非结晶组分中得到浓缩79。表3给出了用正己烷、丙酮作溶剂对SBO进行低温结晶时，以TAG形式富集的总-3PUFA的情况。非结晶组分（浓缩物）中的-3FUFA的含量随着结晶温度的降低而增加。在所有温度条件下，采用丙酮可得到最高浓度的总-3多不饱和脂肪酸79。表3 不同溶剂中海豹油（SBO）低温结晶的FUPA（%）结晶温度（）TAG游离脂肪酸正己烷丙酮正己烷丙酮-1023.223.523.824.3-2023.926.924.525.4-4026.236.431.040.6-6030.543.858.356.8-7035.147.966.746.8原SBO中总-3脂肪酸含量为20.1%。来源于79。 在-60和-70低温的正己烷体系中，如果SBO以游离脂肪酸的形式结晶，可得到-3FUFA总量分别为58.3%和66.7%，回收率分别为39.0%和24.8%的浓缩液。但采用丙酮的话，浓缩液中-3FUFA总量分别为56.7%和46.8%，回收率分别为15.9%和12.9%。2.1.4 蒸馏方法 Chevruel80描述了甘油三脂的水解和皂化。在乙醇介质中采用碱回流水解甘油酯的肥皂生产工艺已用于实践。1895和1896年，Henriques报道可以在室温下实现皂化过程。所记录的最古老蒸馏工序可追溯到大约公元前3600年。在Mesapotamia的Tape Gowra发现一种装置，由蒸馏必需部件所构成，可能是用来制造香水的81。Dalton（1766-1844）和Roult（1830-1901）的物理定律则是蒸馏科学发展的基础。Dittmar在1869年、Kekule在1872年提出了实验室真空蒸馏法。Kraft82和Kreiser83报道用分离出的纯棕榈酸和硬脂酸来合成甘油三酯。Haller84等报道椰子油甲酯的分馏。在同一年，Bull85报道了从鳕鱼肝油甲酯中分离9-二十碳烯酸。Elsdon86,87报道了椰子油和棕榈仁油馏分的定量分析方法。为了测定花生油、葵花油、橄榄油88-91以及大豆油92、鲱鱼油中的不饱和脂肪酸和牛脑总的脂质中的成分，实践中已分馏出分析级的脂肪酸甲酯93-94。1932-1935年期间报道了一种精密蒸馏装置的发明，但其发明者是谁并没有明确认定。Reily95在书中图示了用开口管和螺旋形柱子来分馏脂肪酸酯。这个蒸馏工艺旨在获得含“链长相差2个碳原子单位的不超过2个相邻同系饱和或不饱和成分”的组分。1935年，Podbielniak97描述由可旋转分馏部件构成的蒸馏柱，之后，Baker98通过增加理论板数来提高分离效率使之改进。Privett99等利用这个装置将猪肝脂甲酯分馏成从C14到C22链长不等的38个馏分。这种蒸馏方法技术改进后，发展成为分子蒸馏法，用来分离维生素D100、鱼油酯101,102、胆固醇、生育酚103以及从鱼油中得到高纯DHA104。蒸馏已经用于脂肪酸甲酯混合物的部分分离。这个方法利用脂肪酸存在的分子量差异及其在减压下沸点的差异61，要求大约250的高温105。短程蒸馏和分子蒸馏采用的温度更低，加热时间较短。但分馏富含PUFA的油（如海产油酯类）是很困难的，这是因为随着分子量的增加，分离效果很差106,107。在减压下（0.1到1 mmHg）分馏甲酯是目前应用最广的蒸馏操作。即使在这个条件下，仍需要中等的高温；脂肪酸不饱和度越大，尤其是-3PUFA，越容易氧化、聚合和双键异构化。通常，加热柱中填充的是玻璃螺旋环或某种形式的金属填料，但有通过柱子时阻碍很大以及压力降等缺点，旋带式柱（Spinning band columns）的设计避免了这些缺点。更低压力的蒸馏已经用于一些高不饱和脂肪酸的分离，在聚合反应研究（分离单体、二聚体和多聚物）中，在由甘油二酯和甘油三酯混合物分离甘油一酯中。都具有其特殊价值。-3PUFA长链在蒸馏期间暴露在高温下会诱导分解、热氧化、聚合和异构化。长链PUFA的降解产物可能是环状脂肪酸和高分子聚合物108,109。Privett等110、Privett和Nickell111发现当用旋带式蒸馏柱缓慢蒸馏时，花生四烯酸（C20：4 6）发生了显著分解。尽管用全玻璃的仪器可以消除金属部件的催化作用，但高温和暴露在氧气中仍然会导致-3PUFA大量损失112。因此，期望设计一种制备-3PUFA浓缩物的方法，要求加工温度低，时间尽可能短，使不稳定分子的热破坏作用最小。2.1.5 不同脂肪酸盐的溶解度 1828年，Gusserow介绍了一种依据溶解度不同分离醚中的铅盐或脂肪酸皂的方法。饱和、不饱和脂肪酸与金属离子形成的盐在水或有机溶剂中的溶解度随着金属离子的特性、链长、不饱和度和酸根等特性而改变。用乙醇代替乙醚113可得到更好分离效果。 当冷却皂化溶液时，饱和脂肪酸碱金属盐比那些含有四个或更多双键的PUFA更容易结晶。因此，根据盐之间溶解度的不同，用很少量乙醇可以从富PUFA油中浓缩出脂肪酸盐形式的3脂肪酸。为了得到较高的总3脂肪酸含量和较好回收率，介质中水的含量应保持在3%的水平。Han114等将沙丁鱼油中总3脂肪酸含量从33.2%提高到75.9%。2.2 新方法2.2.1 酶法 在学术界和工业上，用酶来生成脂肪酸和脂肪酸衍生物已经成为一个焦点。脂肪酶可以催化酯化、水解或酯的脂肪酸交换115。这些工艺可以通过选择恰当的底物和反应条件来设定。脂肪酶催化过程已经引起的人们的关注，是因为它的反应条件温和并且在此条件下催化剂显示出特异性。在这两个方面，它们与典型的化学反应不同。由于酶反应在温和的温度、pH值以及常压下进行，与其他化学工艺相比，它们一般需要很少的能源，可以在低投资成本的设备中实施反应。酶工艺的另一个优点与很多脂肪酶的选择性有关，它可以获得用许多传统化学反应很难生产的产品。2.2.1.1 脂肪酶催化水解 Bottino等阐明了海产油中长链-3PUFA对脂肪酶有抗性的机理。脂肪酸中顺式碳碳双键的存在导致链的弯曲。因此，脂肪酸的甲基端基团和酯键靠得很近，它会对脂肪酶产生位阻上的影响。由于EPA和DHA各自存在5和6个双键，造成其高度弯曲，强化了位阻效应；因此，脂肪酶不能达到这些脂肪酸与甘油分子之间的酯键连接处。但饱和与单不饱和脂肪酸对脂肪酶不存在任何障碍，所以很容易水解。因此， EPA和DHA的脂肪酶选择性使得它们可以与存在的海产油其他组分相分离并得到浓缩。另外，脂肪酶还常用来区分含这两种脂肪酸的浓缩物中的DHA与EPA，这为浓缩-3PUFA提供了可能性。从黑曲霉（AN）、柱状假丝酵母(CC）、假单胞杆菌（PS）、色素细菌viscosum（CV）、根霉（RD）和根霉属javanicus（RJ）获得的微生物脂肪酶已经广泛应用于富PUFA油脂的改性117。当考虑到用酶来改性富PUFA海产油时118-121，脂肪酶对脂肪酸的特异性（可区别PUFA和短链脂肪酸）是一个关键因素。众所周知，从根霉（RD）中获得的脂肪酶具有1，3-位特异性122。Wanasundara79、Wanasundara和Shahidi123,124对海豹油和鲱鱼油、Tanaka117等对金枪鱼油的研究表明，脂肪酶催化水解海产油时，可以在不水解甘油酯的情况下富集-3PUFA。表4表明，经RO脂肪酶、CC脂肪酶和GC脂肪酶水解75 h，MHO中总-3PUFA含量从原料油的30%分别增加到45.7%，45.8%和42.2%，这种油中DHA含量也由原料油的10.1%各自相应增加到25.6%，18.2%和15.5%。在相似的实验条件下SBO用CC脂肪酶处理可大幅度提高总-3PUFA含量，从20.2%增加到45