（理论物理专业论文）hene激光对dna固体纤维诱变的拉曼光谱分析.pdf

h e - n e 激光对d n a 固体纤维 诱变的拉曼光谱分析 摘要 本文用拉曼光谱技术研究了不同功率密度的h e n e 激光照射小牛胸腺d n a 固 体纤维不同时间对其分子结构的影响。从d n a 的磷酸骨架基团和构象、脱氧核糖 和磷酸一脱氧核糖以及碱基三个方面分析了激光对d n a 损伤的效应。该研究有助于 进一步从分子水平上理解激光与d n a 相互作用的机理，在激光育种、激光医学和 激光生物基因方面具有一定的参考价值。通过反复实验，得到下面一些结论： 1 、低功率密度的h e n e 激光照射d n a 固体纤维后，构象仍为a 型，但随照射 时间延长，有轻微损伤。照射时间很短时，激光对磷酸骨架结构基本无影响，对 氢键和碱基有轻微损伤。随着照射时间延长，部分磷酸二酯键o p - o 和氢键断 裂，继续照射，激光先是对d n a 的损伤有所减少，然后又使d n a 的损伤加剧。但磷 酸骨架基团损伤程度减小的时间早于氢键损伤程度减小的时间。在较长时间照射 后激光对d n a 损伤程度反而降低的机制不清楚。激光对大部分碱基的影响是先破 坏与d n a 垂直的碱基碱基堆积相互作用，再使碱基之间氢键受损和断裂。 2 、高功率密度的h e n e 激光照射d n a 固体纤维后，对d n a 的损伤是严重的。 很短时间的照射就使d n a 各碱基的强度减小率在3 0 左右，随着照射时间的延 长，各碱基强度减小率在6 0 - - 8 0 之间。d n a 构象仍为a 型，但构象随照射时间 的延长受损程度加剧，最初有部分单、双链断裂，最后d n a 变为无序，使d n a 构 型也发生了变化。随激光照射时问的延长，脱氧核糖由轻微损伤到严重损伤。激 光对各碱基均造成一定程度损伤，损伤最严重的是鸟嘌呤和腺嘌呤，其次是胸腺 嘧啶和胞嘧啶。 3 、中功率密度h e - n e 激光照射d n a 固体纤维后，在很短的照射时间，激光对 d n a 磷酸骨架结构和氢键的损伤就达到了最大值，这时不仅有磷酸二酯键的断裂， 氢键也发生了断裂；随着照射时间的延长，激光对d n a 的损伤程度先是减小，然 后再加剧。激光对碱基的影响，先是使碱基谱线强烈减色，随着照射时间的延长， 3 减色效应逐渐减小，然后变为较强的增色效应，再变为减色效应，这也许是激光 在损伤碱基后又破坏碱基碱基间的垂直堆积状况，造成碱基谱线的拉曼增色效应。 本部分研究还尝试从价键水平分析激光对d n a 碱基的损伤效应。激光照射d n a 后，d n a 嘧啶组分中的胞嘧啶c 。原子处氨基有减少的可能，而c 5 c 。双键的减色可能 是由于c 。c 。电子云密度降低的原因，这也是导致c 。c 。单键键伸缩振动减弱的原因。 关键词：拉曼光谱；h e n e 激光；功率密度；小牛胸腺d n a ；脱氧核糖； 磷酸骨架结构；碱基 4 r a m a n s p e c t r o s c o p i ca n a l y s i so fs o l i dd n a f i b e r i n d u c e db yh e n el a s e ri r r a d i a t i o n a b s t r a c t i nt h i st h e s i s ，u s i n gr a m a ns p e c t r o s c o p e ，a f t e rh e n el a s e ri r r a d i a t i o no fd i f f e r e n t p o w e rd e n s i t yt r e a t e dc a l ft h y m u sd n a i ns o l i df i b e ra tv a r i o u st i m e ，t h ee f f e c to f h e n el a s e ro nc a l ft h y m u sd n am o l e c u l a rs t r u c t u r ew a ss t u d i e d t h ed n a d a m a g e e f f e c ti n d u c e db yh e - n el a s e rw a sa n a l y z e df r o md n ap h o s p h o r i ca c i d s k e l e t o n s t r u c t u r ea n dc o n f o r m a t i o n ，d e s o x y r i b o s ea n dp h o s p h o r i ca c i d - d e s o x y r i b o s ea sw e l la s b a s i cg r o u p t h er e s u l t so ft h i sr e s e a r c ha r eh e l p f u li nu n d e r s t a n d i n gt h ei n t e r a c t i o n s b e t w e e nh e n el a s e ra n dd n ai nm o l e c u l a rl e v e l ，a n dw i l lp r o v i d eac e r t a i nv a l u e r e f e r e n c ef o rb r e e d i n gi nt h el a s e r , l a s e rm e d i c i n ea n dl a s e rb i o l o g i c a lg e n e s a f t e r r e p e a t e de x p e r i m e n t s ，s o m er e s u l t sa st h ef o l l o w i n gw e r eo b t a i n e d 1 、t h ec o n f o r m a t i o no ft h ed n as o l i df i b e rs t i l li sa - t y p ea f t e ri tw a si r r a d i a t e db y l o w - p o w e rd e n s i t yh e - n el a s e r b u tt h ec o n f o r m a t i o nh a st h em i n o rd a m a g ew h e nt h e l a s e ri r r a d i a t i o nt i m el e n g t h e n e d a f t e rl a s e ri r r a d i a t i n go fas h o r tt i m e ，t h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t sp r o v e dt h a tt h el a s e ri r r a d i a t i o nh a dh a r d l ya n ye f f e c to np h o s p h o r i ca c i d s k e l e t o ns t r u c t u r ea n ds l i g h t l yd a m a g e dt h eh y d r o g e nb o n d sa n dt h eb a s e s w i t ht h e e x t e n d e dl a s e ri r r a d i a t i o nt i m e ，s o m eo ft h ed i - p h o s p h a t ee s t e rk e yo p oa n do ft h e h y d r o g e nb o n d sw e r eb r o k e n c o n t i n u e dl a s e ri r r a d i a t i o n ，t h ed n ad a m a g ei n d u c e db y l a s e rr e d u c e df i r s t l y , t h e ni t sd a m a g ew a sa g g r a v a t e d b u tt h et i m ew h e ne x t e n to f d a m a g eo fp h o s p h o r i ca c i ds k e l e t o ng r o u p sr e d u c e di st h ee a r l i e rt h a nt h et i m ew h e n e x t e n to fd a m a g eo fh y d r o g e nb o n dr e d u c e d t h em e c h a n i s mw h i c ht h ed n ad a m a g e r e d u c e di n s t e a di n c r e a s e dw i t hl a s e ri r r a d i a t i o nf o ral o n g e rt i m ei sn o tc l e a r f i r s tt h e l a s e rd e s t r o y e dt h ei n t e r a c t i o no fb a s e b a s ew h i c hp e r p e n d i c u l a rw i t hd n af o rt h e m a j o r i t yo fb a s i cg r o u p s ，t h e nm a d eh y d r o g e nb o n d so ft h eb a s ed a m a g e d a n dc u to f f 2 、t h ed a m a g et ot h ed n as t r u c t u r ew a sv e r ys e r i o u sa f t e ri tw a si r r a d i a t e db y h i g h - p o w e rd e n s i t yh e n el a s e r w i t hl a s e ri r r a d i a t i o nf o ras h o r tt i m e ，t h ei n t e n s i t y r e d u c e dr a t eo ft h eb a s e sw a sa b o u t3 0 w i t ht h ee x t e n d e di r r a d i a t i o nt i m e t h e 5 i n t e n s i t yr e d u c e dr a t eo ft h eb a s e sw a sa b o u t6 0 l o8 0 a f t e ral o n g e rp e r i o do f i r r a d i a t i o n ，i t sc o n f o r m a t i o ns t i l lw a sa t y p e ，b u tt h ec o n f o r m a t i o nd a m a g ew a s a g g r a v a t e dw i t ht h ee x t e n d e dl a s e ri r r a d i a t i o nt i m e a tf i r s tap a r to fs i n g l ea n dd o u b l e s t r a n db r o k e n ；t h e nd n ab e c o m ed i s o r d e r l y ；f i n a l l yi t sc o n f i g u r a t i o na l s oc h a n g e d l e n g t h e n e ra l o n gw i t ht h el a s e ri r r a d i a t i o nt i m e ，d e o x y r i b o s ew a sd a m a g e df r o mm i n o r t os e r i o u s l a s e rd a m a g e da l lb a s e si ns o m ee x t e n t t h ed a m a g ed e g r e e so ft h eb a s e p a i r si nt u r nw e r eg u a n i n e ，a d e n i n e ，t h y m i n ea n dc y t o s i n e 3 、w h e nt h ed n as o l i df i b e rw a si r r a d i a t e db ym i d d l e - p o w e rd e n s i t yh e n el a s e r , t h ed a m a g eo fp h o s p h o r i ca c i ds k e l e t o ns t r u c t u r ea n do fh y d r o g e nb o n d sh a sg o tt ot h e m a x i m u mi nt h ev e r ys h o r ti r r a d i a t i o nt i m e b yn o wn o to n l yh a dt h ed i p h o s p h a t ee s t e r k e yw a sb r o k e n , t h eh y d r o g e nb o n dh a sa l s ob e e nb r o k e n a l o n g w i t hi r r a d i a t i o nt i m e s e x t e n s i o n ，t h ed n ad a m a g ei n d u c e db yt h el a s e ri sf i r s tt or e d u c e ，t h e nt oa g g r a v a t e a g a i n f i r s t t h ee f f e c to fl a s e ri r r a d i a t i o no nt h eb a s e sw a si n t e n s er a m a n h y p o c h r o m i c i t yo ft h eb a s ep e a k s s e c o n dr a m a nh y p o c h r o m i c i t yo ，ft h eb a s ep e a k s w e 畦e n e dg r a d u a l l yw i t hl a s e ri r r a d i a t i o nt i m ee l o n g a t i o n lt h e nt h es t r o n g e rr a m a n h y p e r c h r o m i c i t yo ft h eb a s ep e a k se m e r g e d t h eb a s ep e a k sb e c a m ew e a ka g a i nw h e n t h el a s e ri r r a d i a t i o nc o n t i n u e d t h er e a s o n sf o rt h e s ep h e n o m e n am a yb et h a tl a s e r d e s t r o y e dt h es t a c k i n gs t r u c t u r eo fb a s e - b a s ew h i c hp e r p e n d i c u l a rw i t hd n a a f t e ri t d a m a g e db a s e s ，s or e s u l t e d i nb a s e p e a k sw e a k e n i n gf i r s t a n ds t r e n g t h e n i n g s u b s e q u e n t l y i nt h i ss t u d y , t h ed a m a g ee f f e c to ft h el a s e ro nt h ed n ab a s e sw a st r i e dt oa n a l y z e a tt h eb o n dl e v e l 。a f t e rt h el a s e ri r r a d i a t i o no nt h ed n a , t h ea n a l y t i cr e s u l t ss h o w e d t h a tt h eo u t r i n ga m i n og r o u pn u m e r a t i o no ft h ed n a p y r i d i n ec o m p o n e n t sc y t o s i n ec 4 s i t eh a v er e d u c i n gi nt h ef o r mo fr a m a nh y p o c h r o m i c i t y a n dr a m a nh y p o c h r o m i c i t y o ft h ed o u b l eb o n do fc 5 c 6m a y b er e s u l tf r o mc 5 c 6e l e c t r o n i cc l o u dd e n s i t yr e d u c i n g , w h i c ha l s ol e dt h es t r e t c h i n gv i b r a t i o n so f 岛c 4s i n g l eb o n dw e a k e n i n g k e y w o r d s ：r a m a ns p e c t r o s c o p e ；h e n el a s e r ；p o w e rd e n s i t y ：d e s o x y r i b o s e ； p h o s p h o r i ca c i ds k e l e t o ns t r u c t u r e ； b a s e ： c a l ft h y m u sd n a 6 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本 文的研究在做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：宝尘：望 日 期： 2q q 墨生旦 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他 复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：塞! ! ：婆导师签名：型盥日期：2q ! g 生旦 第一章前言 l 激光对d n a 作用的研究现状 1 1 激光对生物组织的影响 由于激光具有普通光所无法比拟的优异特性，如亮度极高，方向性最好、单 色性最纯、相干性极强等，当把激光照到生物样品并相互作用时，除可发生同波 段普通光引起的生物效应外，还可引起许多特别的生物效应，如共振效应、非线 性吸收效应、异构化作用、光化作用、机械作用、电磁作用、热作用以及对生物 系统的刺激作用等。根据这些生物效应，激光在生物学中可用于刺激和诱变植物 体的生长、发育，在医学中可用于诊断和治疗。因此，激光与生物组织相互作用 的基本原理及应用研究就显得特别重要，并吸引了一大批相关领域专家的关注和 参与。从相关科学工作者探讨的议题及研究热点可以看出，激光与生物组织相互 作用的基本原理及应用研究仍是当前的研究重点。 激光与生物组织作用形式多样，作用机理也各不相同。根据构成生物组织的 分子和原子对激光能量的吸收和转化，可将激光与生物组织的作用分为光化作用、 光热作用、光蚀除作用、等离子体诱导蚀除作用和光致破裂作用等五类；根据激 光作用生物组织所产生的宏观效应，又可把激光与生物组织作用分为热作用、光 化作用、机械作用、电磁场作用、生物刺激作用。根据研究报道，激光对生物体 的作用主要表现为光作用、电磁作用、热作用和机械作用。但是低功率的激光特 别是可见光范围内的激光产生的热和机械作用很少，因此，低功率激光对生物体 的作用主要是光作用和电磁作用这两种作用( 向洋等，1 9 9 7 ) 。韩榕等研究证明， 与激光相同波长的红光对生物体的作用很小，起作用的是电磁效应( 韩榕等， 2 0 0 2 ) 。 所谓光化作用是指，当一个处于基态的分子吸收了能量足够大的光子以后， 受激跃迁到激发态，在它从激发态返回到基态，但又不返回其原来分子能量状态 的弛豫过程中，多出来的能量消耗在它自身的化学键断裂或形成新键上，其发生 的化学反应即为原初光化学反应。在原初光化学反应过程中形成的产物，大多数 极不稳定，它们继续进行化学反应直至形成稳定的产物，这种光化反应称为继发 7 光化反应，前后两种反应组成了一个完整豹光化反应过程。光化学过程可导致酶、 氨基酸、蛋白质和核酸等变性失活，分子结构也会有不同程度的变化，从而产生 相应的生物效应根据光化学反应的过程不同可将光化作用分为共振作用、非线 性吸收、异构化作用、激发电子和光解离作用。( 1 ) 共振作用：激光辐射生物分 子时，当激光频率与生物分子或分子某些键的振动频率相同或栩近时会产生同共 振，使这些分子键振动加剧，从而可能导致这些键的断裂。d n a 是生物体的遗传 物质它由戊糖、磷酸和碱基组成，三者之闻以e 弋键、p - q 键、c - n 键相连，并 以氢键等维持结构。这些键的共振波长分别是3 4 9 n m ，3 5 7 n m ，5 3 4 n m 和1 4 8 0 n m ， 而碱基的共扼双键的共振波长为2 6 0 n m 。因此：紫外激光、可见及红外激光都能 引起d n a 分子特定键的共振吸收，从而影响生物遗传的稳定性，产生生物学效应 和遗传诱变作用。( 2 ) 非线性吸收：激光与生物大分子作用时的双光子或多光予 吸收现象。两个相同的光子参与同一个光吸收过程的现象称为双光子吸收，类似 地有二光子、多光子吸收，统称为非线性吸收。由于激光具有光子简并度高的特 点，因此容易发生多光子的吸收。( 3 ) 异构化作用：光能使生物大分子发生变化， 引起核酸与蛋白质的变性，以及酶的激活或失活的现象，其影响方式主要有异构 化、激发媳子和光鳃离。光导致异构化在高等植物中典型的例予是植物光敏色素 两种形式的转变。用波长为3 3 7 1 、6 3 2 8 和1 0 6 0 n m 的激光，以不同剂量照射水 稻的于胚，在萌动生长7 h 后分析胚芽中可溶性蛋白、酯酶同工酶和过氧化物同工 酶，结果发现激光辐照的种胚分子结构发生变化。( 4 ) 激发电予：在光合作用过 程中，天线色素分予捕获光子后处于激发态，激发的天线色素分子把能量传递绘 反应中心的叶绿素，同时产生电荷分离，抛出一个高能量电子。电子沿着电子传 递链一直传到原初反应，参与一系列生理过程。c y t c 在氧化还原反应制造生物能 a t p 的整个过程中起着重要的电子传递作用。这样的作用对生物分子结构的稳定 将产生很大的影响。( 5 ) 光解离作用：当激发的分子将激发能转到一个特定的键 上，这时振动加强，若没有其它消耗，结果将产生一个键的断裂。光解离的结果 能产生自豳基等活性物质，有时也产生稳定的分子。在激光光解离方瑟研究得最 多的是碳氧血红蛋白( c o h b ) 衍生物的光解( 陈怡平，2 0 0 4 ) 。 所谓毫磁场效应是指，从电磁学费度看，激光也是一静电磁波，其电场强度 e 和入射激光功率密度i 的关系为：e 。2 7 4 l 。在般的激光作用下，电磁场效 8 应不明显，只有当激光强度极大时，才出现明显的电磁场效应。当聚集q 开关或锁 膜脉冲激光器的功率密度为1 0 9 1 0 1 5 w c m 2 ，其电场强度可高达1 0 6 。1 0 1 5 v c m ( 李忠明等，2 0 0 2 ) 。所以，当激光照射生物组织时，相当于将生物体置于强大的电 场中。而生物体似于电介质电容器，电介质中整个分子呈中性，但中性分子的电 荷分布不均衡，在电场作用下，分子的正负电荷分别朝相反方向运动，使分子发生 极化，被极化的分子在电场作用下将重新排列，在重排过程中与周围分子( 粒子) 发生碰撞摩擦而产生大量的热，这种电磁场效应引起或改变生物组织分子及原子 的量子化运动，引起生物组织发生一系列的变化。电磁场可以通过许多方式影响 蛋白质、酶及生物分子的结构，从而导致生物活性的变化。酶结构中金属原子的 顺磁性、酶蛋白的半导体性以及外磁场影响酶反应中的离子传输等各种情况都是 外磁场使酶活性改变的原因。如经外磁场处理后小麦过氧化酶的活性发生了改变； 适当剂量的磁场处理香菇、小麦，可使t a m p 、a t p 、d n a 等含量增加，并且能 活化许多酶，这也直接关系到基因调控因子的变化( 陈怡平，2 0 0 4 ) 。 激光对生物组织的影响可以分为多种作用，但每种作用的分类并没有严格的 界限，如在光化作用中光热作用也起了很大的作用，电磁作用也产生热作用和机械 作用等，激光热作用、光化作用和机械作用通常是同时发生的。所以激光对生物 组织作用的分类并不是绝对的，但各种作用之间也确存在着一些差别，每种作用 都具有典型的激光及典型现象等。 激光对生物组织的作用是一个多种因素决定的复杂过程，激光的参数( 如波 长、功率、能量、激光模式等) 、生物组织的性质( 如密度、弹性、热导率、比 热、热扩散率、反射率、吸收率、色素、含水量、不均匀性和层次结构) 以及生 物体状态等对激光的生物效应都有影响。激光波长的不同对细胞的致伤作用也不 同。例如用红宝石激光和钕激光的倍频光照射新鲜的人周围血细胞，照射后用细 胞光度计检查受照射的样品，测量其光学密度来判断受损伤的情况。这两种激光 都是可见光，其脉冲时程和光束直径基本近似，但钕激光的倍频绿光照射红细胞 在0 4 z m - - 0 6 z m 波段内吸收光能的本领明显减弱，而红宝石激光照射的红细胞的 吸收本领几乎没有影响。生物大分子有确定的选择吸收带。如d n a 的吸收峰是 2 6 6 n m 。因此，利用高单色性、高功率密度、低能量的超短脉冲激光，可实现对 活细胞进行分子水平的选择性激发，使被激活的分子引发定向光化学反应，而不 9 损伤活体细胞。激光照射剂量是影响激光细胞生物效应另一个重要因素。对细胞 生长而言，照射能量小时，有促进作用，能量大时，有抑制作用。如用红宝石激 光照射白细胞群，当强度为0 0 5 j c m 2 时，可使白细胞噬菌功能加强。但强度大到 几个j c m 2 时，其噬菌作用却减弱了。激光照射剂量与激光器的输出功率、照射时 间( 或脉冲宽度) 的长短和受照射面积的大小有关，它对细胞效应影响很大。一般 地说，连续输出激光或长脉冲激光照射是以热效应为主，短脉冲激光或超短脉冲 激光照射是以光化学反应为主。q 开关脉冲激光的脉宽参数为纳秒量级，它与生 物相互作用时光效应与热效应同时存在。光效应可实现选择性光化反应进行定向 催化，而热效应可影响大分子内及大分子间的弱键，从而改变其生化活性。当用 氩离子激光( o 5 1 4 5 , u r n ，功率1 8 0 m w - 4 4 5 m w ) 聚焦照射染色体时，对有丝分裂前 期的染色体会造成染色体区段明显可见的损伤光斑，但无其他异常，细胞能继续 分裂；对有丝分裂后期的染色体却被打断，造成染色体向两极移动，断片移动缓 慢，但受照射细胞仍能完成有丝分裂。用未聚焦的红宝石激光照射培养细胞实验， 发现受照射细胞比对照组细胞周期的s 期部分受到抑制。这说明激光照射对d n a 的 合成是有影响，且激光照射参数是重要的影响因素。 由于激光对生物组织的作用具有有利和不利两个方面，要想利用激光对生物 的有利方面，最首要的任务是认识并理解激光对生物组织的作用机理，然后才能加 以应用。 1 2 激光对d n a 作用的研究现状 脱氧核糖核酸( d n a ) 携带着大量遗传信息，在维持生命活动过程中具有十分重 要的作用因此激光对d n a 作用的研究已成为分子激光生物学的重要内容。研究 d n a 生物功能的丧失与物理化学变化之间的关系有助于阐明激光育种、激光医学， 激光生物基因诱变的分子机制，对发展新的光疗技术，育种方法也具重要意义。 1 2 1d n a 的激光生物物理学研究 激光也是光，它具有光的性质，但与普通光比较又具有一定的特点。普通光 源是自发辐射过程，每个原子自发地独立地发射光子，初始相位不一致，是非相 干光。激光器的发光是受激辐射过程，其光束平行度很高，发射角很小，它是由 1 0 原子体系实现粒子数反转，以受激辐射占优势，在频率、振幅、初始相位、发射 方向上均是一致的。因此激光具有相干性。 核酸的光生物物理学研究初期主要用2 5 4 n m 紫外光对d n a 进行研究，观察d n a 的氢键断裂、交联及其碱基变化。6 0 年代激光光源的应用使传统的光生物学研究 产生变革与飞跃。首先，由于激光具有高度的单色性，可选用特定波长的激光如 1 9 3 n m 、2 6 6 n m 等观察各种波长的光所产生的不同效应。研究单光子过程和双光子 的非线性生物学效应。其次，激光的良好方向性，可通过光学系统将亮度很强的 激光束聚焦很小的一点，实现微束照射。在一定条件下用来切割染色体，进行激 光基因转移。此外，激光具有高亮度特性，其脉冲输出峰值可高达百兆瓦量级， 使研究d n a 的非线性生物学效应成为可能。激光除作为辐射光源外，亦可作为分 析光源，利用激光超短脉冲技术制成高时间分辨光谱分析仪器，研究体内、体外 d n a 构象变化快过程和超快过程。一些以激光为光源的大型现代化仪器如激光检 受谱仪，流式细胞光度计等已用于细胞d n a 含量与分布及d n a 精细结构变化，大 大地推动了核酸激光生物物理研究。所有这些都县传统的光牛物学所不能实现的 ( 曹恩华，1 9 9 3 ) 。 1 2 2d n a 的激光诱变效应 激光辐照可以诱导d n a 损伤。损伤的类型包括d n a 碱基损伤( 碱基丢失与改 变) 、键或链断裂、交联及各种光产物的生成。当它们再结合时，有时可能发生错 位，而造成基因突变( r o m ak o h l i 等，2 0 0 1 ) 。许多激光生物学效应，现在都可 以用d n a 中的特殊的化学和物理变化来解释，但对不同的研究对象，在各种不同 的实验条件下，d n a 不可能对激光具有同一敏感性，其损伤类型及产率都可能有 所差别。通常情况下，低剂量的辐射主要表现为刺激效应，无损伤作用。随着剂 量的增加，从刺激效应向抑制效应转化，并且增强生物诱变效应，同时会产生一 定损伤作用。 激光对d n a 的作用包括紫外光、可见光及红光波段。有下列两种途径导致d n a 损伤。第一种途径是d n a 直接吸收紫外激光辐射。目前研究最多的是u v c ( 1 9 0 - 2 8 0 n m ) 波段，因为d n a 的最大吸收波长在2 6 0 n m 左右。一般来说，光生物学 涉及的是低能辐射对d n a 的作用。主要引起物质的激发，但高能量紫外激光亦能 引起物质的电离。另一种途径是光动力学作用。光动力学作用是指在激光和敏化 剂的参与下，通过能量转移( i i 型反应) 或电荷转移( ( i 型反应) 产生的活性氧和自 由基进一步作用于d n a ，导致d n a 结构损伤。因此光动力学作用所引起d n a 损伤， 不是激光的直接作用的结果。它可以是可见激光，波长的选择与光敏剂特性有关。 在研究激光对d n a 的作用中，不可忽视细胞及细胞提取液中存在色素的重要性( 曹 恩华，1 9 9 3 ；曹恩华，1 9 9 4 ) 。 引发d n a 损伤的机制有直接作用和间接作用两种。直接作用即是糖一磷酸键 通过失去质子而发生电离，导致链断；间接作用机制，主要是o h 从d n a 分子糖 环上夺氢导致链断裂的产生( g u r z a d y a ngg 等，1 9 9 2 ；r a s m u s s e nre 等，1 9 8 9 ) 。 紫外激光对碱基的作用，嘧啶碱基要比嘌呤敏感1 0 倍，在d n a 分子中胸腺嘧 啶碱基最敏感，所以紫外激光破坏嘌呤的量子效率不可能很高。光动力学作用主 要是破坏鸟嘌呤碱基，在血卟琳衍生物( h p d ) 存在下，用6 3 2 n m 激光照射d n a ，观 察到鸟嘌呤的损伤是腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的5 - 1 2 倍，其拉曼光谱也表明嘌 呤损伤较嘧啶碱基严重( e n h u ac a oe ta 1 ，1 9 9 2 ) 。 d n a 特别是碱基受紫外激光照射后可以形成多种形式的光产物如光水合物、 二氢胸腺嘧啶与嘧啶二聚体等。研究最多的是胸腺嘧啶环丁烷二聚体，其次是6 、 4 嘧啶一嘧啶酮光加成物。光产物的生成会干扰d n a 产生局部变性。当d n a 复制转 录时，生成的光产物对形成突变就很重要。两个嘧啶碱基在c 5 - c 。双键相加可形成 环丁烷二聚体，在水溶液中再用短波长光照射可单体化。6 、4 光加成物可以是相 同碱基，也可以是不同碱基，与二聚体不同，它不能用光酶反应使之分裂，它的 吸收峰在3 1 5 n m ，允许光破坏作用。上述两种产物量子产率均很低，它们都是由于 直接吸收u v - c 而产生。环丁烷二聚体是由三重态形成的，而非环丁烷二聚体是由 激发单线态形成的。一般来说，前者的产率是后者的3 5 倍。最近也有报导用3 8 5 n m 或4 0 5 n m 激光照射人上皮细胞观察有胸腺嘧啶二聚体的形成，其机理不清楚 ( h a c h a mhe ta 1 ，1 9 9 0 ) 。照射不同的细胞和微生物来源的d n a ，t t 的形成量一 般都比c t 多，而c c 形成量最少。然而不同的波长照射其产率也有差别。如 u v b ( 2 8 0 3 2 0 n m ) 诱导嘧啶二聚体的生成( t t ：c t ：t c ：c c = 5 2 ：1 9 ：1 2 ：7 ) 的比例不同 于u v c t t ：c t ：t c ：c c = 6 8 ：1 3 ：1 6 ：3 ) 。嘧啶二聚体的生成具有序列的特异性，如胸 腺嘧啶二聚体在核昔酸链的5 端易于形成，其序列为5 a t t a 比5 a t t c g 更加 1 2 有效( s a g ee ，1 9 9 3 ) 。激光辐照下，d n a 分子除了发生碱基损伤，形成嘧啶二聚体 外，还可以产生蛋白质一核酸、核酸一核酸交联以至主链断裂等不同类型的结构损 伤，其中主链断裂特别是双链断裂是辐照后些双链d n a 噬菌体功能钝化失活的 主要原因，在d n a 主链断裂的修复，重接或错误修复时，导致染色体畸变与细胞 突变( f r e i f e l d e rd ，1 9 6 5 ) 。 不仅紫外激光可以诱变d n a 发生损伤，其它波长的激光直接辐照d n a 也可以使 d n a 产生损伤。有研究显示，用准分子激光和a y g 激光分别照射d n a 饱和溶液，在一 定的激光功率密度作用下，可观察到激光引起d n a 链的明显损伤，且在强激光照射 下，d n a 裂解成不同层次的结构单元，产生d n a 光解物( 谭石慈等，1 9 9 7 ；宗仁鹤 等，1 9 9 5 ) 。用5 3 2 n m 强激光照射d n a 产生了相当于紫外吸收的光化学反应，表明在 高强度纳秒激光照射下，d n a 分子同时吸收了两个5 3 2 n m 光子，产生了非线性的生 物学效应( 曹恩华等，1 9 9 2 ) 。用扫描电镜和透射电镜观察波长为3 0 8 n m 的低功率 x e c l 激光直接辐照小牛胸腺d n a 固体纤维后对其纤维状束的微细形态和结构的影 响，发现3 0 8 r i m 紫外激光能使受照样品d n a 中的氢键、磷酸二酯键受照断裂，破 坏d n a 主链使其断裂，影响其初级结构。但主链上的磷酸二酯键断裂似不是主要 的，而氢键受影响断裂又重新键合，在d n a 分子中的扭曲、交联、松散中起主导 作用，影响着受辐射的d n a 分子的高级结构，空间构象( 黄汝多等，2 0 0 2 ) 。 h e - n e 激光具有明显的生物学效应，可诱变细胞遗传物质。量子生物学计算， 遗传物质d n a 的碱基基态与第一激发态之间的能量差在2 e v 左右，例如对于腺嘌 呤( a ) 为1 8 0 e v ，鸟嘌呤( g ) 为1 1 6 e v ，胸腺嘧啶( t ) 为2 0 5 e v ，胞嘧啶( c ) 为 2 0 0 e v 。h e - n e 激光光子能量约2 e v ，虽不足以打断d n a 分子中磷酸二脂键或核昔 键，但有可能使d n a 分子中的碱基受到激发，碱基对之间氢键质子能量改变，隧 道效应提高，发生互变异构，导致基因突变( 邵耀春等，1 9 9 2 ) 。低功率h e - n e 激光 对白细胞d n a 诱变的拉曼光谱研究发现，h e - n e 激光照射前，白细胞d n a 主链振 动区域出现二条强的a ，c 构型特征线8 1 2 c m - 1 和8 7 2 c m 1 ，以及弱的b 型谱线 1 0 9 2 c m 。辐射后，a 型特征线8 1 2 c m 叫消失，代之是与b 型结构有关的二条强的谱 线：8 0 0 c f f l 和1 0 9 0 c f f l 。说明h e - n e 激光可诱变d n a 构型的转变( a b 型) 。在碱基 振动区域，辐射前其强而宽的c = o 伸缩振动谱线1 6 8 0 c f f l ，辐射后强度大大减小， 揭示h e n e 激光有可能使碱基发生互变异构( 张淑辉等，1 9 9 6 ) 。朱苏文等利用 1 3 3 2 r o w 低功率的l i e - n e 激光辐照离体质粒d n a ，发现h e - n e 激光辐照可诱发质粒 d n a 的单链断裂及明显影响质粒的转化频率，且断裂频率随辐照时间增大而提高， h e - n e 激光主要是诱发d n a 的单链断裂。短时间辐照可提品质粒转化活性，随着 辐照时间的进一步增加，转化率逐渐降低，质粒损伤加重。当辐照时间达3 0 分钟 时，转化率仅为对照的5 0 6 ，即接近半致死剂量( 朱苏文等，1 9 9 9 ；朱苏文等， 1 9 9 9 ) 。 可见激光对d n a 的作用除了损伤效应以外，还有促进细胞内d n a 的合成及对紫 外光造成的d n a 损伤的修复作用。k o n s t a n t i n o v 等用低剂量的红色激光照射植物种 子芽细胞，发现激光能促进细胞内d n a 的合成。t c r e m e r 等用5 3 2 n m 的脉冲激光照 射v 7 9 中国仓鼠细胞染色质，c c r e m e r 等用紫外激光照射中国仓鼠成纤维细胞的 细胞核也得出了相同的结论。后者发现，对g 1 分裂期的细胞核进行全面照射或局 部照射，结果都使细胞核内非常规d n a 合成( 梁宏，1 9 8 0 ) 。因此，激光辐射不但 能促使染色体之间的交换，形成多桥结构，还能促使其中的双链d n a 氢键断裂( 严 国忠，1 9 8 4 ：j o h n s o ntme ta 1 ，1 9 8 4 ) ，或通过激活d n a 合成体系中的酶的活性， 从而解开d n a 双链，诱发非按期d n a 合成( 朱九明，1 9 8 8 ) 。用h e n e 激光处理经增 强的u v - b 辐射损伤的蚕豆幼苗的实验发现，激光不但对u v - b 损伤幼苗具有防护作 用，而且对u v - b 损伤d n a 具修复作用( 齐智等，2 0 0 0 ) 。用h e - n e 激光处理冬小麦， 发现激光可以促进种子萌发，提高发芽势，且对u v - b 损伤d n a 具切除修复功能( 韩 榕等，2 0 0 1 ；韩榕等，2 0 0 1 ) 。李方民在c o ：和h e - n e 激光辐照对增强u v - b 辐射损伤 绿豆幼苗的修复效应的研究中，发现增强u v b 辐射引起绿豆d n a 损伤后产生的主要 光产物为环丁烷嘧啶二聚体，以及少量的6 - 4 光产物，表现在胞嘧啶( c ) 和胸腺嘧 啶( t ) 的表征谱带产生较大位移，且峰的强度下降，同时胸腺嘧啶的氢键配对能力 显著下降，c 。c 。双键强的拉曼减色现象，以及c 6 h 的拉曼增色现象。经适宜剂量的 c o 。和h e - n e 激光辐照后，胞嘧啶( c ) 和胸腺嘧啶( t ) 的表征谱带基本恢复原位，且 峰的强度增加，而胸腺嘧啶的氢键配对能力，c 。c 。双键强的拉曼减色现象，以及c 6 h 的拉曼增色现象都在一定程度上得到恢复。说明增强u v b 辐射后形成的环丁烷嘧 啶二聚体，再经过c 0 2 和h e n e 激光辐照后，能直接打断嘧啶二聚体之间的共价键， 使二聚体单体化，从而形成一种断键修复方式。但是红光则不具备h e - n e 激光对增 强u v - b 辐射引起绿旦d n a 损伤的修复效应( 李方民，2 0 0 6 ) 。 1 4 对于激光诱导d n a 空间结构发生变化的机制，许多学者进行了研究。李宝键 等( 1 9 7 9 ) 认为激光照射产生染色体畸变的可能原因是激光的发射光谱与d n a 吸收 光谱相接近时为d n a 分子所吸收，这种光化反应过程造成细胞遗传损伤，另外，激 光电磁波的直接作用或间接作用同样可以引起d n a 分子中氢键的断裂以致在细胞 分裂时产生染色体畸变。激光辐照造成的断裂发生在染色体的一个臂或不同臂上 时，就有可能导致同臂内染色单体间的卜型互换或不同臂的染色单体间和染色单 体内的各种非对称性互