（分析化学专业论文）离子液体的固定化及其在蛋白质分离中的应用.pdf

t0 ：s f 芰 at h e s i si na n a l y t i c a lc h e m i s t r y 俐删 i m m o b i l i z a t i o no fi o n i cl i q u i da n di t s 一 一一一o 一 一 一 a p p i l c a n o nl np r o t e i ni s o l a t i o n b yl i u y u j i a s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rw a n gj i a n h u a n o r t h e a s t e r nu n i v e r s i t y j u n e2 0 0 9 独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下完成的。论文中取得 的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含本人为获得其他学位而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢 = e 己 思。 学位论文作者签名：主，1 孚他 日期： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者和指导教师完全了解东北大学有关保留、使用学位论 文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人同意东北大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索、交流。 作者和导师同意网上交流的时间为作者获得学位后： 半年母一年口一年半口两年口 学位论文作者签名：三- j 7 导师签名： 签字日期：签字日期： 东北大学硕士学位论文摘要 离子液体的固定化及其在蛋白质分离中的应用 摘要 离子液体优良的物理和化学性质使其成为潜力巨大的功能性材料。近年来，离子液 体作为有效的载体在分离富集中的应用受到了广泛的关注，但在常规的液液萃取分离 中，离子液体消耗量大，且分离效率较低，另外由于离子液体的黏度较大，使得萃取体 系的相分离较为困难。离子液体的固定化能将离子液体的特性转移到固相载体上，利用 固定化的离子液体作为分离富集的媒介则可以使操作大大简化，同时显著提高分离富集 的效率。 本文采用n 甲基咪唑和聚氯乙烯( p v c ) 树脂为原料，通过简单的化学反应，将n 甲基咪唑固载到p v c 表面，制备固定化离子液体1 乙烯基3 甲基咪唑氯代盐 ( p v c m i m c l ) ，采用红外光谱、核磁共振光谱、z e t a 电位分析等手段对所制备的固体材 料进行结构表征。 采用该固定化离子液体p v c m i m c l 作为固相吸附材料，考察其对蛋白质的吸附性 能，结果表明在酸性条件下该固定化离子液体对血红蛋白具有吸附选择性，据此建立了 以p v c 固定化离子液体为分离介质固相萃取分离血红蛋白的新方法。实验中考察了吸 附时间、离子强度、洗脱剂及其浓度等分离参数对分离纯化效率的影响。在最优实验条 件下，1 5m g 该固定化离子液体对3 0 嵋m l 以血红蛋白的吸附效率为9 1 ，采用浓度为 1 o 的s d s 溶液为洗脱剂，洗脱效率为7 5 ，吸附容量为2 2 7g gm g 1 。将该方法应用 于人全血样品中血红蛋白的分离并对分离后的血红蛋白进行s d s p a g e 凝胶电泳测定， 结果表明该方法可有效地实现对人全血样品中血红蛋白的分离，且分离出的血红蛋白纯 度较高。 关键词：离子液体固定化；血红蛋白；固相萃取；选择性分离 i i i 东北大学硕士学位论文a b s t r a c t 一 ，一 j l m m ob l l l z a t i o no t1 0 n 1 cl i q u i da n di t sa p p l i c a t i o n i np r o t e i ni s o l a t i o n a bs t r a c t a t t r i b u t e dt ot h ee x c e l l e n tp h y s i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，i o n i cl i q u i d ( i l ) h a s b e c o m eak i n do fp o t e n t i a lf u n c t i o n a lm a t e r i a la n db e e ne x p l o i t e dw i d e l ya sa ne f f i c i e n t m e d i ai nt h es e p a r a t i o n e x t r a c t i o n w h i l ei nt h ec o n v e n t i o n a ll i q u i d l i q u i de x t r a c t i o np r o t o c o l ， l a r g ea m o u n to fi li sc o n s u m e da l o n gw i t hl o we x t r a c t i o ne f f i c i e n c y a tt h es a m et i m e ，i ti s d i f f i c u l tt og e ts a t i s f a c t o r yr e c o v e r yd u et ot h eh i g hv i s c o s i t yo fi l t h ei m m o b l i z a t i o no fi l o f f e ras o l u t i o nt ot h ea b o v em e n t i o n e dq u e s t i o n s b ya d o p t i n gt h ei m m o b i l i z e di l ，w h i c hh a s t h es a m ec h a r a c t e r i s t i c sa si l ，a st h ee x t r a c t i o nm e d i a ，as i m p l em a n i p u l a t i o nf o r t h e e x t r a c t i o na n dh i g h e re x t r a c t i o ne f f i c i e n c yc o u l db ee a s i l ya c h i e v e d i nt h i sw o r k ，a ni m m o b i l i z e di l ，1 - v i n y l 一3 - m e t h y l i m i d a z o l i u mc h l o r i d e ( p v c - m i m c l ) ， w a sp r e p a r e db yg r a f t i n gn m e t h y l i m i d a z o l i u mf n m i m ) o n t ot h ep o l y v i n y lc h l o r i d e ( p v c ) c h a i n s ，a n di tw a sc h a r a c t e r i z e db yf t - i r ，1hn m ra n ds u r f a c ec h a r g ea n a l y s i s t h ea d s o r p t i o np e r f o r m a n c e so ft h i si m m o b i l i z e di lt od i f f e r e n tp r o t e i nw e r ea l s o i n v e s t i g a t e d e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tp v c - m i m c lo w n sa d s o r p t i o ns e l e c t i v i t yt ot h e h e m o g l o b i ni na c i d i cc i r c u m s t a n c e s ，t h e r e f o r ean o v e ls o l i dp h a s ee x t r a c t i o np r o c e d u r ef o r t h ei s o l a t i o no fh e m o g l o b i nw a sp r o p o s e db ye x p l o r i n gp v c - m i m c la ss o r b e n t at h o r o u g h s c r u t i n yh a sb e e nm a d et oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so fas e r i e so fe x p e r i m e n t a lp a r a m e t e r so nt h e s e p a r a t i o ne f f i c i e n c y , i n c l u d i n ga d s o r p t i o nt i m e ，i o n i cs t r e n g t h ，s t r i p p i n gr e a g e n ta n di t s c o n c e n t r a t i o n as o r p t i o ne f f i c i e n c yo f91 w a sa c h i e v e df o rah e m o g l o b i ns o l u t i o no f 3 0 0 i l gm l - 1b y15 0m go ft h i si m m o b i l i z e di l ，a n d7 5 o ft h er e t a i n e dh e m o g l o b i nc o u l d b e r e a d i l yr e c o v e r e db ye l u t i o n w i t ha1 o s d ss o l u t i o n t h e s o r p t i o nc a p a c i t yf o r h e m o g l o b i nw a sd e r i v e dt ob e2 2 7g gm g - 1 t h ep r e s e n tp r o c e d u r ew a sa p p l i e df o ri s o l a t i o n o fh e m o g l o b i nf r o mh u m a nw h o l eb l o o da n d s a t i s f a c t o r yr e s u l t sw e r eo b t a i n e db y s d s p a g ea s s a y k e y w o r d s ：i o n i cl i q u i di m m o b i l i z a t i o n ；h e m o g l o b i n ；s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ；s e l e c t i v e s e p a r a t i o n v 东北大学硕士学位论文 目 录 目录 独创性声明i 摘要iii a b s t r a c t v 第1 章绪论1 1 1 蛋白质分离纯化概述。1 1 1 1 蛋白质分离纯化的意义1 1 1 2 蛋白质分离纯化的常用方法1 1 2 离子液体4 1 2 1 离子液体的种类及性质- 4 1 2 2 离子液体的制备4 1 2 3 离子液体在蛋白质分离中的应用5 1 3 离子液体的固定化7 1 3 1 离子液体的固定化方法7 1 3 2 固定化离子液体的应用1 3 第2 章咪唑类离子液体在聚氯乙烯上的固定化与表征1 7 2 1 引言17 2 2 实验部分18 2 2 1 实验原理1 8 2 2 2 实验仪器及试剂18 2 2 3 实验方法19 2 2 4 固定化离子液体的表征1 9 2 3 结果与讨论1 9 2 3 1 红外光谱分析2 0 2 3 2 核磁共振谱图分析2 1 2 3 3z e t a 电位分析2 2 2 4 小结2 2 v i i 东北大学硕士学位论文 目录 第3 章固定化离子液体p v c m i m c l 萃取分离血红蛋白的研究2 5 。 3 1 引言“2 5 3 2 实验部分2 5 3 2 1 实验仪器、试剂及溶液配制2 5 3 2 2 实验操作2 6 3 3 结果与讨论2 7 3 3 1p v c - m i m c l 对血红蛋白的选择性吸附2 7 3 3 2 血红蛋白吸附条件的选择3 1 3 3 3 血红蛋白洗脱条件的选择3 4 3 4 全血样品中血红蛋白的萃取分离3 7 3 4 1s d s p a g e 凝胶电泳操作3 7 3 4 2s d s p a g e 凝胶电泳结果3 9 3 5 小结4 0 第4 章结论一4 3 参考文献4 5 致谢5 5 攻读学位期间发表的论文5 7 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 蛋白质分离纯化概述 蛋白质是生物机体的重要组成部分，在人体中约占人体重量的1 6 3 。它是生物体 生命活动的物质基础，与各种生命活动密切相关，机体内的许多生理活性物质，包括酶、 抗体、一些重要的激素如胰岛素、胸腺激素等都是蛋白质，它们对调节生理功能、维持 新陈代谢起着极其重要的作用，可以说没有蛋白质就没有生命。蛋白质的基本组成单位 是氨基酸，氨基酸通过脱水缩合形成肽链。蛋白质一般由一条或多条肽链组成，每一条 多肽链含有二十到数百不等的氨基酸残基，各种氨基酸残基按一定的顺序排列。 1 1 1 蛋白质分离纯化的意义 随着人类基因组计划的完成，生命科学研究已进入了后基因组时代。功能基因组学 包括基因组和蛋白组研究，已成为生命科学的重要研究对象。从目前的研究水平来看， 仅依靠基因组的序列分析来阐明生命活动的现象和本质是远远不够的。尽管已有多个物 种的基因组序列已经破解，但这些基因组中通常有一半以上的基因的功能是未知的。目 前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析等，都是从细胞中m r n a 的角度来考虑的，其前提是细胞中m r n a 的水平真实反映了蛋白质表达的水平。但事 实m r n a 的表达并不能全面代表蛋白质的表达水平。研究实验表明，组织中m r n a 丰。 度与蛋白质丰度的相关性并不理想，尤其对于低丰度蛋白质，其相关性较差【l 】。更为重 要的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质与蛋白质之间 的相互作用等则几乎无法从m r n a 水平来判断。因此只有从蛋白质组学的角度对所有 蛋白质本身进行研究，才能更科学地掌握生命现象和活动规律，更完善地揭示生命的本 质。然而，蛋白质的多样性和可变性使得蛋白质研究技术远比核酸技术要复杂和困难得 多，蛋白质研究的首要前提是将目标蛋白从复杂的大分子混合物中分离纯化出来，得到 纯度较高且具有生物活性的蛋白质。只有获得较高纯度的目标蛋白，才能进一步进行其 结构、性质、功能的研究，从而大规模应用于生产，造福人类。因此，高效的分离纯化 技术和手段无论是在蛋白质的基础理论研究、揭示生命现象本质方面，还是在蛋白质工 程、基因工程和细胞工程等产品的工业化生产方面，都是非常重要的基础和关键【2 1 。 1 1 2 蛋白质分离纯化的常用方法 蛋白质的分离纯化是一项复杂困难的工作，纯化方法的选择和确定要根据不同蛋白 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 质样品的性质和具体的研究目的来决定。一般蛋白质的分离纯化主要根据以下五种原理 来进行，即蛋白质的分子大小、溶解度、电荷、疏水性质和对特异性配体的亲和力，相 对应地也形成了一些常用的分离方法，如表1 1 所示。其中较为经典的方法有凝胶过滤 色谱、电泳法、离子交换色谱、亲和色谱等。 表1 1 蛋白质分离纯化的常用方法 t a b l e1 1m e t h o d o l o g i e sa d o p t e df o rt h es e p a r a t i o n p u r i f i c a t i o no f p r o t e i n 原理 方法 分子大小 溶解度 电荷 疏水性质 特异性亲和力 离心，透析，超滤f 3 】，分子筛，凝胶过滤色谱4 】 沉淀法【5 1 ，萃取、法【6 】，结斟7 1 电泳法【8 】离子交换色谱【9 】，羟磷灰石色谱 疏水作用色谱 亲和色谱【1 2 】 凝胶过滤色谱是2 0 世纪5 0 年代前后发展起来的一种利用凝胶的网状结构根据分子 大小和形状进行分离纯化的手段，是发展最早的蛋白质纯化技术之一，也称为凝胶层析、 排阻色谱、体积排阻色谱等。常用的用于分离蛋白质的凝胶过滤介质按组成可以分为葡 萄糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、乙烯共聚物凝胶、硅凝胶和混合凝胶等。但 无论何种类型的介质，都是多聚物通过交联形成具有三维网状结构的颗粒，填充成色谱 柱时，在颗粒间存在大量的间隙，当蛋白质混合物通过色谱柱时，尺寸小于网孔孔径的 蛋白质能够进入凝胶颗粒内部，尺寸大的蛋白质则从间隙中快速流出，这样不同分子大 小的蛋白质因在柱中的保留时间不同而达到分离的目的。 蛋白质的荷电性也是常被用来对其进行分离纯化的有效手段，电泳就是依此来分离 蛋白质和鉴定蛋白质纯度的重要方法。由于不同的蛋白质分子所带的净电荷及分子大小 和形状不同，因而在电场下泳动的速度不同，移动距离不同，从而得到分离。相对于其 它蛋白质分离纯化手段，电泳具有操作温和、特异性高、分辨率高等优点。现在广泛使 用的电泳都是以凝胶作为支持介质的，按凝胶介质来分类常用的有聚丙烯酰胺凝胶电 泳、琼脂糖电泳等，根据分离原理可分为等电聚焦【13 1 、双向电泳【1 4 1 、毛细管电泳15 1 、 免疫电泳【1 6 1 等。 离子交换色谱是另一种利用蛋白质的电荷性质对其进行分离纯化的技术。目前，它 已成为蛋白质分离纯化中最常用的手段，占蛋白质纯化使用方案的7 5 。离子交换色谱 是利用固相离子交换剂的活性基团的可交换离子，与带相同电荷的蛋白质分子发生交 2 - 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 换，从而将蛋白质吸附于固相上，再换以不同p h 值、离子强度的缓冲溶液进行洗脱。 通过选择不同的离子交换剂，控制缓冲溶液的组成和p h 、离子强度等条件可实现不同 蛋白质的分离纯化。离子交换色谱方法具有分辨率高、交换容量大、操作简单等优点。 常用来分离蛋白质的交换剂是离子交换纤维素【l7 1 。在纤维素上通过化学方法引上不同的 活性官能团，就得到了不同类型的离子交换剂。常用的阳离子型交换剂为羧甲基纤维素， 阴离子型交换剂有二乙氨基乙基纤维素。离子交换纤维素对蛋白质的吸附力较弱，在较 温和条件下即可将蛋白质洗脱，不影响蛋白质的活性，且能够获得较好的分离效果和较 高的回收率。 亲和色谱的分离依据较为特殊，不是依据蛋白质的物理性质而是依据蛋白质分子的 生物活性，利用蛋白质分子与其配体之间的特异性亲和力对蛋白样品进行分离。通过合 适的化学偶联方法，将配体固定在固相载体上作为固相亲和剂，当含有亲和蛋白分子的 样品液流过时，与此配体具有亲和性的特定蛋白质分子就从样品中被吸附，从而与其它 组分分离。根据配体与目标蛋白之间的亲和作用的差异，亲和色谱可进一步分为免疫亲 和色群18 1 、金属亲和色谱【19 1 、拟生物亲和色谱( 染料亲和色谱【2 0 】、多肽亲和色谱等) 和共 价亲和色谱。尽管亲和色谱中蛋白质与配体之间的结合类型有很多，并且不同蛋白质与 配体之间结合的特异性存在着高低差异，如表1 2 所示。 表1 2 亲和色谱中蛋白质和对应配体 t a b l e1 2p r o t e i n sa n dt h e i rc o r r e s p o n d i n gl i g a n d si na f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y 由于蛋白质与配体之间的结合和解离都是可逆的，因此可以进行蛋白质的分离和纯 - 3 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 化，而且正是由于蛋白质与配体之间亲和的特异性，使得亲和色谱具有良好的选择性。 1 2 离子液体 一 离子液体是由有机阳离子和无机阴离子构成，室温或室温附近温度下呈液体状态的 盐类【2 6 1 。离子液体与传统溶剂相比具有许多独特的物理化学性质，如室温条件下蒸汽压 低、不挥发、不易燃、稳定性好、热容量大、导电性好、电化学窗口宽、溶解能力强等。 此外，离子液体的结构具有更大的可设计性，即可以通过修饰或改变阴阳离子的结构或 种类来调控离子液体的物理化学性质，以满足特定的应用需求。离子液体这些优良的性 能为化学研究开辟了一个崭新的领域，近几年来，离子液体越来越多的受到人们的关注， 有关离子液体的报道日益增多，可以说，目前离子液体的研究已经成为化学界的热点课 题之一。 1 2 1 离子液体的种类及性质 离子液体的分类是根据组成离子液体的阴阳离子的种类进行的，阳离子主要有四 类：咪唑离子、吡啶离子、季铵离子和季膦离子，其中较为常见的是前两种。阴离子可 以是a 1 c 1 4 。、b f 4 。、b f 6 、c f 3 c o o 。、c f 3 s 0 3 。、( c f 3 s 0 2 ) 2 n 、s b f 6 - 等有机离子和配合物 离子，也可以是c 1 、b r 、i 。、n 0 3 。、c 1 0 4 等简单无机离子。选择不同的阳离子和阴离 子可以组合得到不同的离子液体，据估算，离子液体的种类可以达到1 0 1 8 种【2 刀，但是目 前已经合成出来的离子液体仅有几百种。 离子液体的性质与其阴阳离子的结构有关，结构不同的离子液体，所表现出的熔点、 密度、粘度、导电性、热稳定性等性质也有所不同。例如1 9 9 2 年w i k e s 领导的研究小 组首次合成出的以b f 4 - 为阴离子的咪唑类离子液体1 乙基一3 一甲基咪唑四氟硼酸盐离子 液体( e m i m b f 4 ) ，具有熔点低、抗水解、稳定性强等性质，至此离子液体才得以迅猛发 展【2 8 1 。而1 9 9 6 年( c f 3 s 0 2 ) 2 n 。首次作为阴离子的出现，对于电化学领域的研究则具有里 程碑式的意义，这种含有( c f 3 s 0 2 ) 2 n 。阴离子的眯唑类离子液体不仅对水稳定、不溶于水， 还兼具低粘度、低熔点、高导电性的优点，为研究者提供了新的优良的电化学体系。随 着研究的深入，通过设计离子液体结构改变离子液体的性质，得到性能更理想、功能化 更强、更有实用价值的离子液体已成为了离子液体发展的一个新方 2 9 , 3 0 】。 1 2 2 离子液体的制备 离子液体的制备通常采用一步 3 1 , 3 2 1 或两步合成法 3 3 , 3 4 】。一步合成法是通过酸碱中和 反应或季铵化反应一步合成离子液体。一步合成法操作简单，没有副产物，但仅适合于 4 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 结构简单的离子液体。两步合成法是较为常用的方法，一般首先在c h 3 c c l 3 、c h 3 c n 等适当的有机溶剂中加热回流，通过季铵化反应制各出含有目标阳离子的卤负离子一x 型离子液体，然后再以目标阴离子y 。的盐通过置换反应置换x 。由于采用银盐时，存 在着银盐种类有限，价格较贵，产物卤化银难以去除等缺点，因此常采用碱金属盐或铵 盐，铵盐置换后产生的n h 3 易于除去。 为缩短合成时间，提高离子液体的产率，还可以采用微波或超声波【3 6 】等辅助方法 制备离子液体。另外，随着功能化离子液体近年来越来越受到人们的重视，更多的含有 不同官能团的功能化离子液体被制备出来以满足各种不同应用的需求，含质子酸的离子 液体【3 7 1 、手性离子液体【3 8 1 、具有配体性质的离子液体3 9 1 都已有报道。这些功能化离子 液体的合成方法都相差不大，基本上都是选用带有特定官能团的原料，再经由相似的反 应过程制备。 1 2 3 离子液体在蛋白质分离中的应用 嚣 根据离子液体的特性，目前针对离子液体的应用研究主要集中在合成反应 4 0 舶】、电。 化学4 4 4 8 1 、生物催化【4 9 】、纳米材料的制型5 们、天然高分子加工等领域【5 l 】。作为一种相 对环境友好的绿色溶剂，离子液体还被广泛地应用于萃取分离领域，应用模式有液液萃 取【5 2 1 、液固萃取、双水相萃取【5 3 】、超临界c 0 2 萃取剐等，可实现金属离子f 5 5 5 7 1 、有机 物【5 8 , 5 9 】等的分离。近年来，离子液体在氨基酸【6 0 】、激素等生物活性物质萃取分离中的成 功应用使得离子液体的应用范围扩展到了生物活性物质的分离科学领域。作为新型绿色 溶剂的离子液体是否能够替代传统的有机溶剂，进一步应用到蛋白质等重要生物大分子 的萃取分离中，引起了研究者们的广泛兴趣并开展了一系列的研究工作。 g o t o 等【6 1 】以冠醚( d c h l 8 c 6 ) # j 萃取剂，将含有丰富赖氨酸的细胞色素c 萃取到了离 子液体l 一羟乙基3 甲基咪唑双( - - 氟甲基磺酸) 酰亚胺盐( c 2 0 h m i m t f e n ) q b 。实验中细胞 色素c 首先与d c h l 8 c 6 发生了配位作用，生成的配合物再被萃取到离子液体中。之后， g o t o 等【6 2 】又采用d c h l 8 c 6 为配体的离子液体作为萃取剂将细胞色素c 萃取到离子液体 c 2 0 h m i m t n 和c 2 m i n t f 2 n 中，与采用d c h l 8 c 6 作为萃取剂相比，细胞色素c 更容易 被反萃出来。 邓凡政等【6 3 】建立了一种由亲水性离子液体四氟硼酸1 甲基3 丁基咪唑( b m i m b f 4 ) 和k h 2 p 0 4 形成的双水相体系萃取分离牛血清白蛋白( b s a ) 的新方法。研究了不同盐及 其浓度、离子液体浓度以及蛋白质用量、溶液酸度、其它共存物质对双水相成相及b s a 萃取效率的影响，结果表明溶液酸度在p h4 8 范围内，磷酸二氢钾盐浓度为8 0g l 一， 离子液体浓度在1 6 0 2 4 0m ll - 1 时，此离子液体双水相体系对浓度为3 0 5 0m gl - 1 内的 s 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 b s a 有较高的萃取效率。 d u 等【删则采用离子液体1 丁基3 甲基咪唑盐酸盐( b m i m c l ) 与磷酸氢二钾( k 2 h p 0 4 ) 组成的双水相体系对牛血清白蛋i 刍( b s a ) 进行了萃取研究，结果表明白蛋白的萃取主要 是由于盐析作用，而白蛋白与离子液体之间并没有发生化学作用。该体系可以应用于人 体尿液中的白蛋白的萃取分离，电泳结果说明该方法对蛋白质的分离效果良好。采用离 子液体参与的双水相体系萃取分离蛋白质具有萃取效率高、分相速度快等优点，但由于 从离子液体相中反萃蛋白还存在一定难度，因此蛋白质的回收问题有待进一步解决。 c h e n g 6 5 瑚】等首次在不加入任何辅助萃取剂的情况下，直接应用离子液体为萃取剂， 将蛋白质成功地萃取到了离子液体中，并且选择合适的洗脱剂将蛋白质反萃，实现了蛋 白质的分离。他们以带有不同烷基侧链的咪唑类疏水性离子液体为萃取剂，对多种蛋白 质的萃取进行了研究，结果表明无需添加其他任何辅助萃取剂，血红蛋白可以从水溶液 中被萃取到离子液体1 丁基3 三甲基硅基咪唑六氟磷酸盐( b t m s i m p f 6 ) 中，基于此建立 了离子液体萃取分离血红蛋白的方法，并将该方法应用于全血中的血红蛋白的分离。紫 外、荧光、圆二色、穆斯堡尔等光谱性质的研究表明在萃取过程中，血红蛋白中血红素 分子的铁原子与离子液体中的咪唑阳离子发生轨道杂化，咪唑阳离子垂直于血红素分子 平面与铁原子发生配位是致使血红蛋白被萃取到离子液体中的主要原因。随后他们又对 同为血红素蛋白的细胞色素c 的萃取进行了研究，发现在酸性条件下细胞色素c 能部 分的从水溶液中被萃取到离子液体b t m s i m p f 6 中。通过紫外、园二色光谱的测定发现在 酸性条件下，细胞色素c 的构型发生了转变，疏水性基团暴露出来，当溶液p h 值小于 2 时，细胞色素c 中血红素基团的铁原子与甲硫氨酸的第6 个配位键断裂，提供一个空 的配位位置，与离子液体的咪唑阳离子发生配位作用，从而促使细胞色素c 进入离子液 体中。 s h u l 6 7 】等在c h e n g 的基础上将表面活性剂2 乙基己基琥珀酸酯磺酸钠( a o t ) 与1 丁基3 甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体( b m i m p f 6 ) 和水混合，制成了一种离子液体包水型 的反向微孚l ( w a t e r a o t b m i m p f 6 ) ，并用形成的微乳体系对血红蛋白进行了萃取分离实 验，研究了不同水、a o t 、离子液体比例与不同酸度条件下微乳对不同浓度的血红蛋白 的萃取效率，结果表明离子液体微乳体系可选择性地萃取血红蛋白，且不会引起蛋白质 的变性。当h 2 0 ：a o t ：b m i m p f 6 的比例为6 ：5 0 ：5 ，p h 为6 3 时，血红蛋白的萃取效率可 达到9 6 ，这一结果优于应用离子液体直接萃取血红蛋白，且因为将离子液体形成微乳 后萃取蛋白增加了离子液体与蛋白质之间的接触面积，所以很大程度上提高了离子液体 的利用率。 6 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 离子液体应用于蛋白质的分离还处于起步阶段，相关研究不是很多，但已有的研究 表明生物分子在离子液体中的活性、稳定性都有所提高，且离子液体的应用从源头消除 了使用传统有机溶剂挥发性强、毒性大、对环境危害严重等问题，把整个分离过程变成 了绿色环保的工艺。 1 3 离子液体的固定化 离子液体的特性使得其在各种领域中都取得了广泛的应用，但也存在着些许不足之 处值得进一步研究。例如在催化分离方面，由于离子液体的成本高、黏度大、使用时易 在水中流失，因而限制了其在工业上的大规模应用；在电化学应用中，液态的离子液体 作为电解质使用在电池中存在着泄露的危险，并且对于小型的电化学装置更多需要的则 是不易流动的固体电解质。因此，离子液体的固定化可能为解决上述问题提供一个可行 的思路。 离子液体的固定化是指将离子液体固定在某种固体载体上，得到负载型离子液体或 表面具有离子液体结构的固体物质【6 8 】。将离子液体固定到固体载体的表面，可提高离子 液体的利用率和节约离子液体用量；此外与自由态离子液体相比，固定化的离子液体更 加稳定。常用来作为固定离子液体的无机材料有多孔硅胶、活性炭、分子筛【6 9 ，删等；有 机材料主要是高聚物，包括聚苯乙烯、聚偏氟乙烯等。 1 3 1 离子液体的固定化方法 将离子液体与固体材料以一定的物理的或化学的方式相结合，形成固定化离子液体 的新材料，新材料一定程度上保留了原有固体载体的性质，又能很好的发挥离子液体的 特性，给应用上带来方便。离子液体的固定化方法通常根据应用而异，目前主要包括以 下几种： 1 3 1 1 耦合成膜法 耦合成膜法是将离子液体与有机聚合物或无机多孔膜等材料通过物理或化学作用 力复合形成膜状物从而将离子液体固定化的方法，常用的膜材料主要有聚偏二氯乙烯、 聚丙烯、聚醚砜等有机聚合物以及氧化铝等无机多孔膜材料。 f u l l e r t 7 1 】等将离子液体b m i m b f 4 、b m i m t f 和b m i m p f 6 在一定的溶剂条件下与聚偏氟 乙烯六氟丙烯共聚物( p v d f h f p ) 混合，得到一种胶状膜，这种自立的弹性膜具有耐高 温、电导率高等特点。i z a k 等【7 2 】分别将离子液体1 乙烯基3 乙基咪唑六氟磷酸盐 ( p y e i m p f 6 ) 和四丙基胺四氰基硼酸盐( ( c 3 h 7 ) 4 n b ( c n ) 4 ) 与聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 均匀混 合，制得两种固定化离子液体的支撑滤膜，并将其应用于水中丙酮的回收，呈现出了很 7 - 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 好的回收效果。b r a n c o 等【7 3 1 分别将b m i m p f 6 、b m i m b f 4 、c 8 m i m p f 6 、c 1 0 m i m p f 6 等几种 离子液体通过减压渗透的方法使其与聚偏二氯乙烯、聚丙烯、聚醚砜等高分子聚合物膜 进行复合，制得了固定化离子液体的支撑液膜，他们用此液膜对胺的同分异构体进行了 萃取分离研究，发现该膜对二级胺( - - 异丙胺) 的传输能力高于一级胺( 己胺) 和三级胺( - - 乙胺) 。 如上所述这种将离子液体与膜耦合，使得离子液体限制在一定的固体形态内活动， 降低了离子液体的流动性，使得离子液体可以更方便地应用于电化学传感和作为固体支 撑液膜用于物质的分离。此外，膜固定化离子液体还被应用于有机反应中，如将离子液 体、高聚物与负载有p d 的活性炭混合并制成膜，可应用于丙烯的催化加氢反应【7 4 1 。将氯 铝酸盐离子液体与多孔聚醚砜复合制成的膜，对乙烯的齐聚反应有很高的催化活性，而 向其中添加有催化活性的镍催化剂的膜对丁烯的选择性更高r 7 5 】。 1 3 1 2 浸渍法 与耦合成膜法相似，浸渍法也是一种相对简便的制备固定化离子液体的方法，浸渍 法是将离子液体滴加到固体载体上至载体完全湿润，或将载体浸润到过量的离子液体 中，浸渍后再以索氏抽提法除去多余的离子液体，最后将固定化的离子液体进行干燥处 理。浸渍法的固体材料与离子液体之间的作用可以是简单的物理吸附，也可以是固体载 体材料与离子液体的阴离子或阳离子之间形成特定的的共价键。 h 6 1 d c f i c h 研究小组对路易斯酸型咪唑类离子液体的固定化进行了一系列研究【7 6 ，7 7 1 。 他们采用浸渍法将离子液体a 1 i l 缓慢滴加到干燥的固体载体颗粒上，待固体材料浸湿 后，多余的离子液体用索氏抽提法除去。经过比较n b 2 0 5 、t i 0 2 、n a _ y 、s i 0 2 、a 1 2 0 3 等载体，发现采用s i 0 2 为固相载体时，离子液体的固定量最大。将离子液体固定到硅胶 中后，利用2 9 s in m r 对固定化的离子液体进行表征，结果表明，硅原子上的o h 在9 1 和1 0 l p p m 处的吸收峰消失，并且在滴加离子液体到载体上的过程中有h c l 生成，这说明 离子液体的阴离子与硅胶表面的硅烷醇发生了反应，其作用机理如图1 1 所示。 b 攥一；一。秽队h ， 图1 1 离子液体通过浸渍法固定到硅胶表面7 7 】 f i g 1 1i m m o b i l i z a t i o no fi o n i cl i q u i dv i ai m p r e g n a t i o n 7 7 】 但是以这种通过阴离子固定化离子液体的方法还存在着一些缺陷，如制备过程中硅 8 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 胶、分子筛等载体的结构容易被破坏、酸度降低等。为了避免这一缺点可以采用分步浸 渍固定的方法，即先将阴离子固定化，然后通过离子交换反应的形式在载体中加入阳离 子，或先将阳离子固定化，然后再通过离子交换在载体中加入阴离子。如先用a 1 c 1 3 水 溶液浸泡载体，然后再用弱酸性的氯铝酸盐型离子液体i l a i c l 3 浸渍，a 1 c 1 3 可以和 i l a 1 c l s 形成强酸性的i l ( a l c l 3 ) x ，x 射线衍射分析表明，采用该种固载化方法，不会 破坏载体结构。 以上浸渍法仅适合于a 1 c 1 3 型的咪唑类离子液体的固定化，而其它类型的离子液体往 往因为无法与载体间形成特定的共价键，所以只能通过离子液体在载体上简单的物理吸 附作用固定化。 1 3 1 3 接枝法 因为绝大多数的离子液体不具备与硅胶表面硅羟基缩合的性质，如果需要将离子液 体固定到该类载体上，一般采用接枝的方法，即先在固相载体上或是离子液体的阳离子 上接枝上可与离子液体或载体反应的功能性官能团，再在一定条件下反应形成共价键将囊 离子液体固定在固相载体上。 当以硅胶为载体时，在键合前需对离子液体的n 侧链进行修饰，通常是修饰上三 乙氧基硅烷的结构，然后与硅胶发生缩合反应，脱去乙醇分子，形成新的s i o s i 键， 使离子液体固定到硅胶表面，其过程如图1 2 所示。 h 6 1 d e r i e h 等先将硅胶活化，再加入甲苯，搅拌分散后，加入1 乙基( - - - 7 , 氧基硅番 基) 3 甲基咪唑的卤盐，9 0 搅拌1 0h 以上，甲苯和生成的乙醇用蒸馏的方法除去，再 加入二氯甲烷后用真空蒸馏的方法除去过量的1 乙基( 三乙氧基硅基) 3 甲基咪唑，最后 加入金属卤化物a 1 c 1 3 、f e c l 3 搅拌，过量卤化物用索氏抽提法除去，得到阳离子键和固 定离子液体的硅胶。 瓢旦秘心 图1 2 阳离子接枝法固定离子液体7 8 1 f i g 1 2i m m o b i l i z a t i o no fi o n i cl i q u i db yc a t i o n i cg r a r i n g 7 8 】 m e h n e r t 等【7 9 】合成了阳离子为1 乙基( 三乙氧基硅基) 3 甲基咪唑的卤盐离子液体， 并且进一步经过阴离子交换和与硅胶缩合脱醇的过程，制备出了阴离子为b f 4 - p f 6 、对 9 一 凰 吣爹 。 h l l 钳 伽 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 水比较稳定的的固定化离子液体。 另一种接枝固定的方法是先在载体材料上接枝上反应性基团，再与带侧链的咪唑反 应，形成离子液体。通常适用于这种固定化方式的载体材料多为有机高聚物。 x i a o 等【8 0 】将一种带有氯甲基的聚苯乙烯树脂与1 甲基咪唑混合，在甲苯溶剂中加 热回流、冷却后再过滤，先后以甲苯、h c i 、水、甲醇等洗涤固体，减压干燥后得到固 定化的离子液体。如图1 3 所示。制得的产物经过n 元素分析得到离子液体的固定量为 3 6m m o lg - l 。 争o 、夸寸赢t o l u 丽e n e o c k - 咧 图1 3 苯乙烯树脂固定化离子液体的制备过程8 0 】 f i g 1 3p r e p a r a t i o no fs t y r e n er e s i n i m m o b i l i z e di o n i cl i q u i d 8 0 】 s h i 等 s u 将介孔硅胶与浓盐酸在室温下搅拌4h ，然后在甲苯中加热回流1 0h ，过滤 得到的混合物，以去离子水和丙酮洗涤，1 4 0 下真空干燥，除去硅胶表面的金属氧化 物和含氮的杂质得到含有丰富硅醇基的硅胶。再将5g 活化的硅胶与1 8m m o l 的y 氯丙 基三乙氧基硅烷混合，n 2 保护下在甲苯中回流2 4h ，得到烷基化的硅胶s i 0 2 1 ，再将功 能化硅胶与甲基咪唑或吡啶在无水c h 3 c n 中搅拌回流2 4h ，将得到的产物以丙酮抽提 洗涤，再于c h 3