（果树学专业论文）EMS诱变及筛选草莓抗灰霉病突变体的研究.pdf

摘要 本试验以草莓( f 脚a ，j 88 f i s i t a s s ad u c h ) 幸香( s a c h i n o k a ) 试管苗为材料， 使用化学诱变剂甲基磺酸乙酯( e t h y lm e t h y ls u l f o n a t e ，e m s ) 对草莓叶片所产生的愈 伤组织进行处理，用草莓灰霉菌培养滤液进行离体筛选，期望获得抗灰霉病突变体材 料，从根本上解决幸香草莓生产中存在的灰霉病危害问题，为草莓抗病育种探索 一条简单可行的新途径。 为得到适宜诱变的愈伤组织材料，并保证筛选出的愈伤组织能分化出不定芽，首 先进行了幸香草莓叶片离体再生的研究，包括暗处理、叶龄、滤光膜覆盖、a g n o ，、 激素组合等对叶片再生的影响。结果表明：暗处理6 周的材料再生能力最高，超过6 周再生率下降：叶龄在3 5 d 以内的叶片，随叶龄的增加再生能力提高；用不同颜色的 滤光膜覆盖时，红膜处理因能滤去紫外光、蓝紫光、绿光而再生频率达最大，黄膜和 绿膜次之，蓝膜对再生无影响，而紫膜对再生起显著抑制作用；添加a g n 0 3 能提高 再生能力，浓度为4 0 m g l 时再生率最高，继续增加a r 浓度则使叶片再生率下降； t d z 浓度范围在2 0 6 0m g l 内时叶片再生频率差异不大，当t d z 浓度过低( 1 0 r a g l ) 和过高( 8 0m g l ) 时，再生能力显著降低；不同类型的生长素的再生效果有 很大差异，吲哚类生长素对再生均有较好效果，2 ，4 d 效果较差，n a a 各浓度处理 对再生能力影响差异较大。 在用e m s 对草莓愈伤组织进行诱变处理时设置了o 0 5 、0 1 、o 2 0 6 、0 4 、 o 8 5 个浓度处理和o 5 h 、1 o h 、2 o h3 个时间处理，实验结果表明，随着浓度的升 高和处理时间的延长，外植体褐变率和死亡率呈上升趋势，e m s 浓度小于0 4 ， 处理时间为1 h ，是较为适宜的剂量。为探明引起褐变的原因，控制诱变过程中的褐 变发生，对e m s 不同剂量处理后的愈伤组织进行了一些生理指标测定，包括p p o 活 性、总酚含量、保护酶( s o d 、c a t 、p o d ) 活性及m d a 和游离脯氨酸含量的测定， 结果表明，e m s 处理对愈伤组织细胞膜的损伤造成胞内活性氧浓度的升高及细胞清 除活性氧能力的失调是愈伤组织褐变死亡的原因，并进一步验证了e m s 对草莓愈伤 组织进行诱变采用o 4 左右浓度的处理1 h 是适宜的剂量，在处理完成后的前1 2 h 培 养中，应采取一些抗氧化反应的措施以利于愈伤组织的恢复和生长。 采用静置培养草莓灰霉菌2 0 d 的培养滤液分别对愈伤组织进行细胞染色和草莓 果实进行田间接种，结果表明培养滤液在细胞和植株水平上对幸香草莓均有毒害， 可作为突变体抗性筛选的选择剂。通过在愈伤组织继代培养中附加不同浓度毒素粗提 液，在培养过程中称量愈伤组织鲜重的方法确定在8 0 培养滤液的培养基培养1 0 d 作为抗性筛选的选择压。不同类型的愈伤组织经e m s 不同浓度和不同时间处理后经抗 性筛选所产生的抗灰霉病愈伤组织的频率不具备规律性。经诱变处理8 6 7 块愈伤组织 在经不连续二次筛选后有2 0 4 块存活，存活率为2 3 5 3 9 6 ，其中有8 2 块分化出了不定 芽。获得的抗性芽有待进步进行抗性鉴定。 关键词：草莓甲基磺酸乙酯诱变离体筛选抗灰霉病突变体 a b s t r a c t m u t a g e n i z e d ( e m st r e a t e d ) c a l l if r o ml e a v e so f s t r a w l s e r r y ( f r a g a r i aa n a n a s s ad u c h ) s a c h i n o k a w e r es c r e e n e df o rr e s i s t a n c et ot h ec u l t u r ef i l t r a t eo fg r e ym i l d e wp a t h o g e n b o t r y t i sc i n e m ap e r s t h ep u r p o s eo ft h es t u d yw a st os o l v et h ep r o b l e mc a u s e db yg r e y m i l d e wd i s e a s ei ns t r a w b e r r yi n d u s t r yb yo b t a i n i n gr e s i s t a n tc u l t i v a r sa n dp r i v i d ean e w a p p r o a c hf o rr e s i s t a n tb r e e d i n go f s t r a w b e r r y t oo b t a i nar e l i a b l e ，r a p i d ，a n da ne f f i c i e n tr e g e n e r a t i o ns y s t e mo fl e a fi n v i t r o ， v a r i o u sk i n d so ff a c t o r sa f f e c t i n gr e g e n e r a t i o ni n c l u d i n gd a r kt r e a t m e n t s ，l e a fa g e s ，c o l o r s o f p l a s t i cf i l m s ，s i l v e rn i t r a t ea n dh o r m o n e sw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc a l l i r e a c h e dt h e i rh i g h e s tr e g e n e r a t i o nw h e nt r e a t e di nd a r kf o r6w e e k s ；r e g e n e r a t i o na b i l i t i e s o f1 e a v e si n c r e a s e da l o n gw i t l lt h e i ra g ew i t h i n3 0 d s ；r e df i l m si n d u c e dt h em o s te f f e c i e n t s h o o tr e g e n e r a t i o n ，f o l l o w e db yy e l l o wa n dg r e e no n e s ，b u tp u r p l ef i l m sc o m p l e t e l y i n h i b i t e dr e g e n e r a t i o n a 矿e n h a n c e dt h er e g e n e r a t i o na b i l i t i e s ，a n dt h er e g e n e r m i o nr a t e r e a c h e dt h ep e a ka t4 o m g lt h e nd e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo fa 矿t d zc o n c e n t r a t i o n s f r o m2 0m g mt o6 0m g ld i dn o ta f f e c tr e g e n e r a t i o n ，b u tr e g e n e r a t i o nw a sd e p r e s s e d e x c e e d i n gt h er a n g e d i f f e r e n tk i n d so fa u x i nh a dd i f f e r e n te f f e c t so nr e g e n e r a t i o n a u x i n o fi n d o l ep r o m o t e dr e g e n e r a t i o n ，w h e r e a s ，2 , 4 dh a dn e g a t i v ee f f e c t so nr e g e n e r a t i o n d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f n a as h o w e dv a r i e de f f e c ti nt h er e g e n e r a t i o n e m sw a sp r e p a r e da tc o n c e n t r a t i o n so fo 0 5 ，0 1 ，o 2 ，0 4 a n d0 8 ，a n d c a l l u s e sw e r et r e a t e dw i t ht h e s es o l u t i o n sf o r0 5 h ，1 0 ho r2 0h t h er e s u l t si n d i c a t e dt l l a t b r o w n i n ga n dm o r t a l i t yo fe x p l a n t sr o s ea l o n gw i t ht h ei n c r e a s e so fe m sc o n c e n t r a t i o n a n dt r e a t m e n tt i m e t h ea c t i v i t i e so fp p 0 ，s o d ，c a t , p o da n dc o n t e n t so fm d a ，t o t a l h y d r o x y b e n z e n ea n df r e ep r o l i n ei ne x p l a n t st r e a t e dw i t he m sw e r em e a s u r e di no r d e rt o f i n dc a u s e sr e s u l t i n gi na n dc o n t r o l l i n gb r o w n i n gd u r i n gt h em u t a t i o np r o c e s s t h ep o i s o n o u se f f e c t so fc u l t u r ef i l t r a t eo fs t r a w b e r r yg r e ym i l d e ww e r ef o u n db o t h o nc e l la n do np l a n tl e v e l st h r o u g hi nv i t r oo b s e r v a t i o na n di n o c u l a t i o ni nf i e l d ，s ot h e c u l t u r ef i l t r a t ew a su s e da sc r u d et o x i ne x t r a c tf o rs e l e c t i o np r e s s u r eo fm u t a t i o n t o d e t e r m i n et h es e l e c t i o np r e s s u r e ，d i f f e r e n tc o n c t e n t r a t i o n so fc u l t u r ef i l t r a t ew e r ea d d e dt o s u b c u l t u r em e d i u ma n dt h ec a l l u sw e r em e a s u r e d a tl a s t ，m e d i u mc o n t a i n i n g8 0 o ft h e c u l t u r ef i l t r a t ea n dlo dc u l t u r ew e r es e l e c t e da ss e l e c t i o np r e s s u r e m u t a n tc a l l iw i t hr e s i s t a n c et og r e ym e l d e wt o x i nw e r eo b t a i n e da f t e rt w i c es e l e c t i o n s s o m eo ft h e mp r o d u c e ds h o o t sw h i c h w o u l db er o o t e da n dt h e nt r a n s f e r r e dt of i e l dt ot e s t t h er e s j s t a n c e k e yw o r d ：s t r a w b e r r y ；e t h y lm e t h y ls u l f o n a t e ( e m s ) ；m u t a t i o nr e s i s t a n tt og r e ym i l d e w 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 、 人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 字獠 如5 年6 月扣日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意四j 1 f 农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 研究生签名 导师签名 呵轮 细i 年6 月扣日 如6 年6 月湘 草莓( 怖r ，aa n a n a s s 8d u c h ) 属蔷薇科草莓属，是多年生草本植物，是2 0 世纪8 0 年代中期以来在我国发展较快的水果之一。据中国园艺学会草莓分会统计， 2 0 0 3 年全国草莓面积已达到约7 6 万h m 2 ，是1 9 8 5 年的2 3 倍，年产量约1 3 4 万t ， 是1 9 8 5 年的5 3 6 倍，总面积和总产量均居世界第一位。草莓具有植株矮小、生产 、 周期短、结果成熟早、适应性强、栽培管理容易、产量高、收益快和经济效益好等特 点。生产中既可大规模集约化生产，也可小面积庭院栽培，还能与其他作物问作、套 种和轮种。 然而草莓生产中病害发生严重，主要有灰霉病、白粉病、炭疽病等，其中灰霉病 是我国草莓产区发现最早、发生最普遍的一种病害，主要危害果实、花瓣、花萼，同 时也危害叶片、果梗、果柄。在保护地内由于湿度大，栽植密，植株生长旺，透风性 差，或连续阴雨，地膜上积水，园地排水不良等，更易发此病。在无公害果品生产愈 来愈成为果业发展趋势的今天，选育抗病品种具有重大意义。本研究以。幸香 ( s a c h i n o k a ) 草莓为试材，通过离体化学诱变处理，用灰霉病菌毒素作为选择压，以 期筛选出抗灰霉病的草莓品种。 1 文献综述 1 1 离体诱变在植物育种上的应用 1 1 1 植物诱变育种概况 诱变育种是人为地利用诱变因素诱发植物变异，在较短时间内获得有利用价值的 突变体，选育成新品种直接生产利用，或育成新种质作亲本在育种上利用( 即突变体 的间接利用) 的育种途径。诱导植物发生突变的各种物理因素、化学因素和生物因素 称为诱变剂( m u t a g e n ，m u t a g e n i ca g e n t ) 。常用的物理诱变剂主要是指不同种类的射 线，如x 射线、b 射线、y 射线、中子、激光、电子束、离子束、紫外线等；常用的 化学诱变剂主要包括烷化剂，如甲基磺酸乙酯( e t h y lm e t h y ls u l f o n a t e ，e m s ) 、乙烯亚 胺( e t h y l e n i m i n e q u i n o n e ，e i ) 、硫酸二乙酯( d i e t h y ls u l f a t e ，d e s ) 等，另外还有碱 基类似物、叠氮化钠( n a n 。) 、抗生素、芥子气、羟胺，以及诱发加倍的试剂如秋水 仙素等”1 。 据统计，1 9 8 5 年世界各国通过诱变己育成5 0 0 多个品种，1 9 9 1 年在1 4 3 种植物 上育成1 4 9 7 个品种，1 9 9 2 年增至1 4 9 种植物，育成的品种达1 5 5 7 个，1 9 9 5 年又增 至1 5 4 种植物，育成1 7 3 7 个品种。我国诱变育种始于5 0 年代后半期，育成的品种数 及其种植面积均居世界首位，在1 9 9 1 年不完全统计已在3 5 种植物上育成3 9 6 个品种， 1 9 9 4 年底已在4 0 多种植物上育成4 3 0 个品种”“1 。 诱变育种可以诱导产生自然界不存在的或极为罕见的新性状、新类型。另外有的 基因类型虽然存在，但由于基因高度连锁或涉及种间或属问杂交，利用杂交育种进行 基因转移不易成功，采用诱变育种往往能够奏效；或者某些基因类型常与有害性状相 联系或存在基因多效现象，在这些情况下，诱变育种被经常采用，有时甚至是唯一有 效的育种手段。 1 1 2 离体诱变的优点与缺点 、 随着植物细胞工程等生物技术的快速发展，把诱变和离体培养技术相结合已成为 重要的育种方法，它具有以下几个优势： ( 1 ) 植物组织培养中通过不定芽( 或器官) 发生和体细胞胚胎发生通常被认为 是少数细胞或单细胞起源的，而突变也是一种单细胞事件，采用悬浮细胞或原生质体 培养，或者对丛生芽或愈伤组织进行连续切割转接，可大大降低常规诱变技术中产生 嵌合体的比例。m a n d a l 等“1 通过直接不定芽发生，从经射线诱变后的菊花的小花分离 出纯花色突变体，这在常规诱变育种中几乎是不可能的，因为花色嵌合体不能象其他 类型时嵌合体如“芽变”那样容易分离到纯的突变体，实际上每年都有许多花色突变 体被丢失。 ( 2 ) 植物组织培养所采用的繁殖体小，可以在有限的空间内对大量诱变群体进 行选择，周年都可以进行分离繁殖，而且可以在培养基中加入特定的选择剂，或使用 病原菌的毒素或培养滤液选择抗病植株，或改变培养条件( 如增加温度选择耐高温突 变体) 0 1 以提高选择效率。另外植物组织培养技术可对突变材料在短期内进行扩大繁 殖，产生数量较多的突变群体。 ( 3 ) 诱变同单倍体育种或加倍体育种技术相结合，不仅可提高变异率，防止嵌 合体发生，更为重要的是可使隐性突变体较早地表现，加速纯合化过程棚1 。 此外，由于离体培养环境的特殊性，离体培养过程本身就是一个诱变过程，所以 经常会出现频率较高的体细胞无性系变异，如果在体外培养过程中施加一定剂量的诱 变剂，则可以进一步增加再生植株的变异频率，获得更多的变异材料。 但是离体诱变也存在一些缺点：诱变本身的局限性如偶然性和不确定性，以及需 要较大的群体才能保证获得有用的突变体等，另外，该法对于难以进行组织培养的植 物也不大适用。 1 1 3 离体诱变的研究进展 无性繁殖的植物，如香蕉、马铃薯等，利用诱变与茎尖培养相结合的技术应用较 为广泛。o m a r 等”研究了e m s 对香蕉两个无性系茎尖培养的作用方式，发现标记的 诱变剂在茎尖顶端分生组织和叶原基部位累积，并在球茎区域广泛存在，而这个区域 正是新的不定芽起源的部位。b h a g w a t 和d u n c a n 1 研究了n a n 3 、d e s 和e m s 作为诱变 剂结合香蕉茎尖培养选择镰刀菌萎蔫症( f u s a f f u # lo x y s p o r u nf s p c u b e n s e ) 突变 体，发现不同诱变剂之间及不同处理时间对诱导产生的变异数目影响不显著。d a s 等 研究了诱变结合茎尖培养获得耐高温的马铃薯突变体，在高温胁迫条件下，叶绿素 变异体产生的频率随辐射增加而提高，但其中接近4 0 的植株具有正常的叶组织，而 对照植株的叶片完全受损。 利用诱变与花药培养结合是离体诱变研究的一大热门领域，在禾谷类作物中已取 得了显著成效。n i t c h 等”用y 射线照射烟草花药小孢子获得变异植株，包括叶片变 化、白化现象、花色和花瓣形状等变异。周嘉平等利用y 射线对黑胫病( p h y t o p h t h o r a p a r a s i t i c av a r n i c o t i a n a e ) 高度感病的烟草品种的花药照射后结合或不结合病原 菌培养滤液离体选择，都可选出抗病再生植株，其中一部分可以稳定遗传“”。k h a n 等咖研究了诱变与加倍单倍体育种技术相结合进行耐涝性育种的潜力，采用低剂量的 y 射线对耐早小麦的种间杂交f l 代种子进行辐射处理，以提高其遗传变异能力和雄 核发育反应。 除茎尖和花粉外，其他再生能力较强的外植体如叶柄、叶片、花序、花瓣、果柄、 鳞茎片、球茎块等也可经诱变处理获得较高频率的突变体。如以马铃薯叶轴、叶柄和 小叶圆片作外植体，经x 射线处理后，体外培养产生的不定芽中，平均突变率达6 8 2 ， 其中小叶圆片作外植体产生的不定芽突变率最高，达8 5 9 ，而突变株中仅2 为嵌合 体。以愈伤组织作为诱变材料，也可获得较高频率的突变体，但不同剂量或浓度的诱 变剂对愈伤组织的诱导率、成活率、绿苗分化率及再生植株突变率有较大影响。 细胞悬浮培养和原生质体培养与诱变相结合也有一定的研究。l i n 等“”利用秋水 仙素作为诱变剂，对甘蔗细胞悬浮培养进行诱变处理，获得非整倍体细胞和植株。事 实上，细胞悬浮培养和原生质体培养不经诱变处理也可获得较高频率的体细胞无性系 变异m 1 。 离体诱变育种在果树上应用已相当广泛，v a r d i “”采用e m s 处理和x 射线照射， 成功地诱导甜橙原生质体产生胚状体并再生植株。王存喜“”用射线和e m s 做为诱变 剂，对中华猕猴桃试管苗叶片产生的愈伤组织进行抗盐筛选，建立了耐0 5 、0 7 、1 0 n a c l 的变异细胞系，并均再生出完整植株。o 1 e m s 处理生长的枝条获 得了早熟、果大、颜色好的苹果新品种b e l r e n e ；越南的2 个枣变异种d a o t i e n 和 m a h o n g 也是通过化学诱变剂处理其种子而得到的“。 目前诱变育种存在的主要问题是：( 1 ) 突变频率尚不够高：( 2 ) 很多化学诱变剂毒 性较大，具有残留效应；( 3 ) 突变方向难以掌握，突变结果难以预期。利用诱变进行 抗病育种时若未在培养中使用选择剂，则需要对产生的大量实验材料进行检测，这需 要大量的时间和精力。因此，把诱变和突变体选择结合起来，是植物育种的一条重要 途径。 1 1 - 4e m s 在植物诱变育种中的应用 化学诱变剂与电离辐射相比不论在作用方式上，还是生物学效应的特点上均有较 大差异，其优势主要有以下几个方面”3 ： 化学诱变剂是靠各自的活性基团，靠特有的化学特性直接与生物分子进行各种特 定的化学反应，从而引起生物分子化学性质的改变。与电离辐射相比，化学诱变剂对 生物分子的影响是个别的，局部的，不利作用少。陆瑞菊等在对青菜和甘蓝优良品种 的诱变及耐热变异体的筛选试验中，发现钴”和平阳霉素诱变能产生耐热变异，平阳 霉素8 0 m g 1 浸泡种子2 4 h 对种子的损伤比钴”1 2 0 0 g y 小“。 化学诱变剂引起的突变频率较高，尤其是产生非常高的叶绿素突变频率，例如毛 炎麟用l o 一3 m 的n a n 。处理大麦种子，其叶绿素突变频率高达4 8 1 。在大部分的情况 下，就突变的数量而言，化学诱变剂要比辐射有效得多。 化学诱变剂有特异性，变异定位的程度比辐射高，诱发的突变性状有明确的专一 性，所以诱变谱与辐射相比是不同的。 此外，化学诱变剂是很经济的，每次用量甚少，只需一般实验室的玻璃器皿和通 风柜即可进行处理，不象辐射源那样需要昂贵的投资。 本试验使用甲基磺酸乙酯( e t h y lm e t h a n es u l f o n a t e ，e m s ) 对草莓离体材料进行 诱变处理。e m s 是应用十分广泛的一种烷化剂，也是被证明最为有效而且负面影响小 的诱变剂。与其他烷化诱变剂类似，e m s 是通过与核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分 子直接反应来诱发突变。e m s 诱发的突变主要通过两个步骤来完成，首先鸟嘌呤的0 6 位置被烷基化，成为一个带正电荷的季铵基团，从而发生两种遗传效应：一是烷化的 鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，代替胞嘧啶，发生转换型的突变；二是由于鸟嘌呤的n 2 7 烷基活化，糖苷键断裂造成脱嘌而后在d n a 复制过程中，烷基化乌嘌呤与胸腺嘧啶配 对，导致碱基替换，即g ：c 变为a ：t 2 。 e m s 诱变技术在玉米育种上应用尤为成熟。1 9 8 6 年，美国i c l 种子公司用e m s 的 石蜡油溶液处理玉米自交系的成熟花粉，然后将花粉涂于柱头上，在m 2 代中用除草 剂进行筛选，获得了9 株抗除草剂的突变体。“；1 9 8 7 年，郭丽娟等人用e m s 处理玉 米单倍体胚性细胞，以玉米小斑病菌毒素为选择剂获得了抗玉米小斑病突变体o ”； 1 9 9 8 年，薛守旺用e m s 处理了6 个稳定玉米自交系的成熟花粉，得到了浅黄色突变 体、显性核不育突变体和甜玉米”“。1 9 9 9 年赵永亮等采用含有e m s 的石蜡油处理玉 米自交系黄早4 和7 8 2 2 的花粉，创造了迄今为止所积累的所有特用玉米类型，包括白 玉米、甜玉米、糯玉米、超甜玉米和高直链淀粉玉米”。1 9 9 0 年，杜连恩等人用e m s 处理小麦合子，进行小麦高蛋白突变体的筛选与鉴定，获得了比原品种蛋白含量高 3 4 的突变体；此外，e m s 在大豆”、花生啪1 、大麦1 、水稻“1 、长春花m 1 、 薏苡“”、埃塞俄比亚芥m 1 、山黧豆。”、海甘蓝。、菠萝。”、菊花、茄子1 、葡萄“0 1 、 魔芋“植物的育种中也得到了应用。 以上研究结果表明，e m s 是一种有效的化学诱变剂，已在多种植物中应用并获得 了一些突变体。但迄今为止，在草莓上还未见采用e m s 进行诱变育种的研究报道。 1 2 离体选择在植物抗病育种中的应用 由于对大量再生植株进行抗病检测需要较大空间，也需要大量的时间和精力，因 而采用离体选择可以提高选择效率。离体选择对抗性进行直接或间接的选择都相对简 单，不必象遗传转化那样对抗病基因进行详细了解，更不必对其克隆和转化：离体选 择所用的繁殖材料小，可以在有限的空间内和可控制的环境条件下对培养物进行大规 模检测和选择，是一种快速、高效的选择方法。离体选择容易施用选择剂，且直接暴 露于细胞，也容易在选择之前结合诱变处理。离体选择还可以产生出新的抗性，即自 然界不存在的抗性。 自从c a r l s o n “”首次报道可以利用病原毒素对植物细胞和原生质体进行离体选 择以来，许多研究者相继在烟草“3 “”、番茄“6 “、玉米咖“”、马铃薯”“、油菜”、 甘蔗、香蕉1 、桃呲1 、大豆m “、小麦汹“1 、茄子”。”、水稻m ”作物上对抗病离 体选择进行了研究。许多研究者对未选择培养和离体选择两种结果进行比较啪。”1 ， 发现在培养中未经选择也可再生出抗性植株，但利用离体选择可显著增加获得抗性植 株的频率，有时两者都可产生同样比例的抗性植株，这种情况可能是由于毒素化合物 在发病过程中不发挥重要作用或者选择不当造成。v 抗病离体选择通常采用抗性选择法( r e s i s t a n c es e l e c t i o n ) ，即在选择条件( 如 在培养基中加入某种选择剂，例如病原毒素) 下对不抗病的植物材料进行离体培养， 具有变异表型的抗性细胞便会成活下来，而并不具抗性的材料会停止生长或死亡。抗 病离体选择方法是以选择剂对选择材料的生长抑制为选择基础的。离体选择可以在选 择培养之前或选择培养过程中结合诱变处理。选择剂的浓度可以在继代培养过程中结 合驯化作用逐代增加( 逐步法，s t e p w i s es e l e c t i o n 或s t e p u pp r o c e d u r e ) ，也 可以一直维持在半致死浓度左右( 一步法，o n e s t e ps e l e c t i o n ) ，或采用不连续选 择方法，即在含选择剂的培养基上生长一段时间后置于不含选择剂的培养基上生长， 然后再在含选择剂的培养基上生长，这种方法可以使培养物保持较高的再生能力，也 可以检测这种抗性在继代培养中能否稳定延续。选择培养的继代次数通常在5 次以 内，t h a n u t o n g 等“”以烟草愈伤组织对p s e u d o m o n a s 和a lt e r n a r i a 毒素进行体外抗 性选择，至少选择两代才能得到抗性植株。通常逐步法较一步法需要在选择培养基上 继代较长时间，但继代时间太长不仅会增加不必要的变异如染色体数目畸异，也会使 培养物降低或丧失再生能力。经若干代选择培养后，在不含选择剂的再生培养基上进 行植株再生，之后对再生植株或移栽到温室或大田的植株进行抗病检测。 抗病离体选择中常用的选择剂( s e l e c t i n ga g e n t ) 或检测剂( s c r e e n i n ga g e n t ) 包括部分纯化或完全纯化的毒素、毒素类似物、粗培养滤液、病原提取液或病原物本 身。在选取选择剂之前，有必要对选择剂与培养物之间的相互作用，以及这种互作与 植物病害表现的相关关系加以研究和了解。 在微生物与植物组织共培养这种结合中，产生的非特异性毒害作用可能与完整檀 株中正常的病害进程完全无关，例如在一些真菌产生的病害中，病原对整株与对组织 培养的作用很少相关或没有相关”“”1 。但也有抗性在培养中表达的情况”“，而 h e g e s o n 等”及h a b e r l a c h 等”发现由肋y t o p h t h o r ap a r a s i t i c av a r n c o t i a n a p 引起的烟草黑杆病虽能在培养中表达，却严格依赖于诸如接种温度及激素组合等培养 条件。 由于以病原本身作为选择剂存在困难，所以绝大多数研究者采用纯化的毒素或粗 培养滤液作为选择剂，这样不仅可以克服以病原本身作为选择剂的某些缺点，还容易 掺入培养基，可均匀一致地暴露于植物组织。许多研究者利用此法成功选择出抗性材 料。3 “”1 ，在一些例子中，后来还从培养滤液中纯化并鉴定出毒素成分来4 ”1 。使用 培养滤液作为选择剂应注意是，尽可能选择较多的抗性系。因为其中有可能不少抗性 系是抗毒素以外的其他成分的，所以只要产生尽可能多的抗性系，其中就会有带有目 的抗性的植株m ，。 在离体选择时，需要确定最适选择剂剂量，因为无论选择剂性质如何，不同大小 的培养物( 或选择单位) 及不同的细胞系可能对某一特定水平的选择剂的反应不同。 不同剂量或浓度的选择剂对愈伤组织的诱导率、成活率及植株再生率有较大影响，所 以半致死剂量的浓度水平未必是最适选择条件。选择剂对培养材料的毒害，即使选择 后没有死亡也可能没有或只有极低频率的植株再生，所以既要考虑到选择的成活率， 也要考虑植株的再生频率。 如果不是以病原本身作为选择剂，就需要对再生植株或移栽苗进行病原接种检测 抗病性，看对选择剂的抗性是否与对病害的抗性一致。另外，需要确定抗性的性质， 因为这种抗性表型既可能是一种突变，也可能是一种生理适应现象或外遗传现象( 基 因表达引起的变异，不能通过有性世代传递) 。如果抗病性在营养繁殖植物上延续几 个世代，也可能不足以说明是遗传现象还是外遗传现象删。 1 3 草莓离体诱变育种进展 草莓诱变育种是随着草莓组织培养技术的发展而兴起的。草莓的组织培养开展较 早，近年来在突变育种上得到了突破性进展，已成为草莓品种改良的重要手段。日本 t o y o d a 研究小组利用草莓叶片再生植株技术，以草莓枯萎病病原真菌 ( f u s a r i u m o x g s p o r u mfs p t r a g a p i e ) 为选择压力，筛选抗性愈伤组织并诱导成株，从1 2 2 5 株再生植株中得到两个抗病体细胞无性系阳。郑永平。“用茎尖培养与”c oy 射线处 理相结合的方法得到了在株高、株径、单株果数和前三级果均重4 个主要农艺性状变 异中的“优变”突变体。段辛楣等用野生种森林草莓( e v e s c a l ) ( 2 n = 2 x = 1 4 ) 进行 离体分生组织培养，将0 0 1 和0 0 5 秋水仙素加入培养基，获得了多倍体植株。 雷家军等利用秋水仙素建立了草莓茎尖染色体加倍方法的体系，得到了草莓野生种、 种间杂种及品种共2 7 个加倍株系和一些混倍体株系。m a l o n e 和d i x 用除草剂西玛津 及绿黄隆对草莓愈伤组织及茎尖培养物进行定向筛选，获得可耐受浓度高达8 0m gl 1 西玛津除草剂的一个愈伤组织培养株系c l 一3 。“。李玉花等以高压静电场处理花药后 接种于培养基上，发现静电场处理后组培茎丛苗可使其超氧物歧化酶( s o d ) 活性升 6 高，丙二醛( m d a ) 含量降低，为抗性育种提供一定依据。 2 研究内容与技术路线 本研究以幸香草莓叶片愈伤组织作为诱变齐u e m s 处理的材料，着重于试管苗 叶片再生体系的建立、叶片愈伤组织经e m s 处理后发生的生理生化反应、用e m s 对叶 片愈伤组织进行诱变并离体筛选出抗灰霉菌毒素的突变体。技术路线如图1 所示。 图1草莓离体e m s 诱变和抗灰霉病突变体筛选技术路线 f i g 1t e c h n o l o g i c a lr o u t eo fi nv jf r om u t a t i o nw i t he m sa n ds e l e c t i o r ) v a r i a t i o nr e s i s t a n tt ob o t r y t sc i n e m a p e t s o ns g a w b a r r y 3 草莓叶片高频再生体系的建立 3 1 材料与方法 供试材料为幸香草莓试管苗，由郑州果树研究所草莓课题组提供。 叶片再生的各处理在未经特别说明的情况下，均以m s + t d z 4 o m g l + i a a o 1 m g l 作为诱导培养基，附加蔗糖3 0 9 l ，琼月b 7 9 l ，p h = 5 8 ，光照2 0 0 0 1 x ，1 6 h d ，温度2 5 2 ，以研究暗处理、叶龄、滤光膜、a g n 0 3 、不同激素对叶片再生能力的影响。 从试管苗上剪取叶片，弃叶缘、叶尖，剪成约2 m m 见方大小的叶盘，远轴面向上、近 轴面向下与培养基接触进行培养，经7 0 d 后统计不定芽诱导率。本实验采用单因素实 验设计，每个处理均设4 次重复，每个重复接种2 0 个外植体，结果使用d p s 数据处理 系统软件进行差异显著性分析。 3 2 结果与分析 3 2 1 暗处理对叶片再生植株的影响 暗处理能提高幸香草莓叶片的再生率( 表1 ) 。当一直进行光培养时，再生 频率仅为1 6 3 ，与进行了暗培养的处理再生频率差异极显著。暗处理6 周以内，随 暗处理时间的延长再生频率呈现逐渐增长的趋势，当暗处理时间为6 周时再生频率达 到最大值8 1 3 ，延长至7 周时再生能力有所下降。 表1暗处理对幸香革莓叶片不定芽形成的影响 t a b l e1e f f e c to f d a r kt r e a t m e n to ns h o o tr e g e n e r a t i o nf r o ml e a f d i s co 岱a c h m o k as t r a w b e r r y 注：表中a 、b 、c 表不1 水平上的差异显著性，a 、b 、c 表不5 水平上的差异显著性。fj 司。 3 2 2 叶龄对叶片再生植株的影响 将试管苗转接于继代培养基( m s + b a o 5 m g l + i b a o 1 m g l ) 中，取转接后新生成 的叶龄分别为2 、3 、4 、5 周的叶片作为材料进行再生，暗处理6 周后转入光下培养， 结果表明( 表2 ) ，叶龄在3 5 d 以内的叶片再生能力随叶龄的增大而提高，1 4 d 以内的幼 嫩叶片不利于叶片再生，每个处理之间的差异均达到极显著水平，因此幸香草莓叶片 再生选择5 周龄的叶片较为合适。 表2 不同叶龄的叶片不定芽再生能力 t a b l e2e f f e c to f1 e a fa g eo ns h o o tr e g e n e r a t i o nf r o ms a c h i n o k as t r a w b e r r y 1 e a fd i s c 3 2 3 光质对叶片再生植株的影响 将接种叶圆盘的培养皿覆盖于不同颜色( 红、绿、蓝、黄、紫) 的滤光膜中，以 不覆盖滤光膜的处理为对照，置于光下培养。 0 _ 兰 2 兰 享 砻 采 蝌 2 0 03 0 04 0 05 0 06 0 07 0 08 0 09 0 0 波长w a v el e n t h ( n m ) 图2 不同颜色滤光膜透射光光谱成分比较 f i g 2s p e c t r u mo f d i f f e r e n tc o l o rp l a s t i cf i l m s 测定了不同颜色滤光膜在2 0 0 n m 一9 0 0n i t l 的透光值( 见图2 ) 。在紫外光波段 如 加 0 ( 3 0 0 4 0 0 h m ) ，红膜透光值最低，峰值仅为2 3 ，其次是黄膜，透光值峰值为1 1 9 ， 绿膜、蓝膜、紫膜透光值峰值分别为4 3 1 、5 9 4 、5 6 4 。在可见光波段 ( 4 0 0 7 8 0 n m ) ，红膜透光值在6 1 0 n m 开始上升，6 7 0 n m 达到峰值，说明红膜能滤去 紫外光、蓝紫光( 4 0 0 - - 5 1 0 n m ) 、绿光( 5 1 0 6 1 0 n m ) ，而红橙光及远红光( 6 1 0 - 9 0 0 h m ) 则能较多地透过。黄膜在4 5 0 5 8 0 n m 透光值逐渐上升并维持在较高水平。绿膜在 5 8 0 n m 处有另一峰值而不同于其他色膜。蓝膜和紫膜的透光值变化趋势相似，对紫外 光和蓝紫光都有较大的透光值。 试验中使用的滤光膜处理中，红膜、黄膜、绿膜对叶片不定芽的分化起促进作用 ( 表3 ) ，以红膜效果最好，再生频率极显著高于其他处理，蓝膜处理的再生频率与 对照相比差异不显著，而紫膜处理的再生频率为0 。各膜色处理对再生能力的影响与 紫外光波段的透光值变化趋势相反，说明紫外光对叶片不定芽的分化起抑制作用。 表3 不同颜色滤光膜对幸香草莓叶片再生不定芽的影响 t l b l e3e f f e c t so f c o l o rp l a s t i cf i l m so ns h o o tr e g e n e r a t i o nf r o ml e a f d i s c so f s t r a w b e r r y s a c h i n o k a 3 2 4 a g n 0 3 对叶片再生植株的影响 叶片接种暗培养2 周后，转入含不同a g n 0 3 浓度( 1 0 、2 0 、4 0 、8 0 m g l ) 的培养基中培养，4 周后再转入光下培养。由表4 可以看出，当a g n 0 3 浓度范围在 1 0 - 4 0m g l 时，对再生能力有提高作用，并且随着浓度的增大效果越明显，以浓度 为4 o m g l 时效果最好，但当浓度增大到8 o m g l 时则抑制了再生，与其他处理差异 极显著。这说明适宜浓度的a g + 对幸香草莓叶片的再生是有促进作用的。 3 2 5 激素对叶片再生植株的影响 在m s + i a a o 1 m g l 的基础上附加1 o 8 o m g l6 个浓度处理的t d z ，暗处理6 周后 转入光下培养。另外在m s + t d z 4 o m g l 的基础上附j j i h a a 、i b a 、n a a 、2 ，4 一d ，均设4 个浓度水平，分别为0 1 、0 2 、0 4 、0 8 m g l ，暗处理6 周后转入光下培养。 表4a g n 0 3 对幸香草莓叶片不定芽形成的影响 t a b l e4e f f e c t o fa g + o ns h o o tr e g e n e r a t i o nf r o ml e a f d i s co f s a c h i n o k a s t r a w b e r r y m s 培养基中附加不同的浓度的t d z 、i a a 、i b a 、n a a 和2 ，4 一d ，当t d z 不同浓度附 加于0 1m g l i a a 时，t d z 浓度范围在2 0 6 0m g l 内叶片再生频率都较高，各浓度 间差异不显著，当t d z 浓度过低( 1 0m g l ) 和过高( 8 0m g l ) 时，再生能力均有 所降低，差异达到极显著水平( 表5 ) 。