（茶学专业论文）藤茶中二氢杨梅素的纯化及金属配合物的初步研究.pdf

华中农业人学2 0 0 8 届硕上学位论文 藤茶中二氢杨梅素的纯化及金属配合物的初步研究 摘要 藤茶( a m p e l o p s i sg r o s s e d e n t a t aw t w a n g ) 是葡萄科蛇葡萄属的一种藤本植物， 广泛分布于我国长江流域以南等省区，是我国民间一茶用、药用植物，富含二氢杨 梅素( d i h y d r o m y r i c e t i n , 简写为d m y ) 等黄酮类物质。我国壮族和瑶族人民将其幼 嫩茎叶制成保健茶，用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、黄疸型肝炎等症。有关藤茶的 研究主要集中在藤茶活性成分的分离鉴定及黄酮的功能活性等方面。本文先探讨了 藤茶中d m y 的纯化，然后对金属配合物进行了初步研究。 1 二氢杨梅素纯化工艺的优化 采用水重结晶法可以得到高纯度的d m y 产品，3 次重结晶后结晶产率为 3 4 5 9 ，产品纯度亦可达到9 0 以上。选用1 1 种大孔树脂对藤茶d m y 行了静态吸 附与解吸附试验。结果表明，1 号大孔树脂适宜于藤茶d m y 的分离纯化，对d m y 的吸附量为3 6 0 6 m g g ，解吸率为8 6 1 7 。通过动态吸附试验对l 号有关参数进行 了优化。结果表明，利用1 号树脂分离藤茶d m y 的适宜参数为：上样浓度6 - - 7 m g m l ， 上样量为柱体积的1 3 ，8 0 的乙醇洗脱液，流速1 8 m l m i n ，d m y 的洗脱率可达8 0 左右，纯度达6 5 左右。利用聚酰胺树脂柱层析法，上样前对粗黄酮进行预处理， 可以较好精制藤茶d m y ，适宜参数为：6 0 的乙醇洗脱液，流速0 6 m l m i n ，上样 量0 5 9 。d m y 的洗脱率可达8 6 左右，纯度达8 5 左右。 2 二氢杨梅素金属配合物的初步研究 以重结晶的d m y 产品为原料，与锌离子、钙离子和铁离子在碱性条件下以不 同的摩尔比例分别反应而形成配合物。对配合物进行紫外扫描和红外检测，确定 d m y 与金属离子发生了配合反应。抗氧化活性方面，锌配合物和钙配合物都有较理 想的o h 自由基清除效果，清除率在8 0 以上；铁配合物的清除率很低，不到达2 0 。 关键词：藤茶；二氢杨梅素；纯化；重结晶；大孔树脂：聚酰胺；金属配合物 藤茶中二氢杨梅素的纯化及金属配合物的初步研究 p u r i f i c a t i o no fd i h y d r o m y r i c e t i nf r o mt e n g c h aa n d p r e l i m i n a r y s t u d yo i li t sm e t a l l i cco m p l e x e s a b s t r a c t t e n g c h a ( a m p e l o p s i sg r o s s e d e n t a t aw t w a n g ) ，b e l o n g st oa m p e l o p s i sm i c h xo f v i t a c e a e i ti sg r o w na b r o a di nt h es o u t ho ft h ey a n g t z er i v e r i t su s e df o rd r i n k i n ga n dd r u g a m o n gt h ep e o p l e ，w h i c hc o n t a i n sr i c hf l a v o n e s ，s u c ha sd i h y d r o m y r i c e t i n ( d m yf o r s h o a ) t h et e n d e rs t e m sa n dl e a v e so ft e n g c h ah a v eb e e nm a d ei n t oah e a l t h yd r i n k w h i c hi sc a l l e d 。m y s t i ct e a ”f o rt r e a t i n gr h e u m ，f e v e r , g a l lo ff a u c e s ，h e p a t i t i sa n ds oo n , 、i n lal o n gh i s t o r yo fs e v e r a lh u n d r e dy e a r sa m o n gy a oa n dz h u a n gn a t i o n a l i t yi nc h i n a t h es t u d i e so nt c n g c h aw e r em a i n l yi ni s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fa c t i v ec o m p o n e n t a n df u n c t i o n a la c t i v i t yo ff l a v o n o i d s p u r i f i c a t i o no fd i h y d r o m y c e t i nf r o mt e n g c h aa n da p r e l i m i n a r ys t u d yo fm e t a l l i cc o m p l e x e sw e r es t u d i e di nt h i sp a p e r 1o p t i m a lp u r i f i c a t i o np r o c e s so fd i h y d r o m y r i c e t i nf r o mt e n g c h a h i 曲p u r i t yd i h y d r o m y r i c e t i nw a so b t a i n e d 埘t i lw a t e rr e c r y s t a l l i z a t i o n , t h ey i e l d w a s 3 4 5 9 a f t e rt h et m r dr e p e t i t i o na n dt h ep u r i t yw a sa b o v e9 0 e x p e r i m e n t so f11 k i n d so fm a c r o p o r o u sa d s o r b i n gr e s i n sa d s o r b i n ga n dd e s o r b i n gd i h y d r o m y r i c e t i n i n d i c a t e dt h a tn o 1w a so n eo ft h em o s ta p p r o p r i a t er e s i n si na l lf o rp r e l i m i n a r y p u r i f i c a t i o no ff l a v o n e s i t sa d s o r b i n gc a p a c i t i e sw e r e3 6 0 6 m g g ，d e s o r b i n gr a t ew e r e 8 6 17 i nc o l u m no fn o 1 ，t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r et h a tt h ec o n c e n t r a t i o no fc r u d e f l a v o n e sw a s6 - 7 m g m l ，t h ev o l u m eo fs a m p l ew a s1 3t h a to fe o l m m a , f l o w i n gv e l o c i t y w a s1 8 m l m i n , e l u t i n gs o l u t i o nw a s8 0 e t h a n o l ，w h i c hl e dt o6 5 p u r i t yo ft h e d i h y d r o m y r i c e t i na n d8 0 d e s o r b i n gr a t eo fd i h y d r o m y r i c e t i n i t sab e t t e rw a y t op u r i f y d i h y d r o m y r i e e t i nt h r o u g hp o l y a m i d ec o l u m nw i t l lc r u d ef l a v o n o i dp o w d e rp r e t r e a t m e n t t h es u i t a b l ep a r a m e t e r sw e r e ：e l u t i n gs o l u t i o n6 0 e t h a n o l ，f l o w nr a t e0 6 m l m i n , t h e w e i g h to fs a m p l e0 5 9 t h ed e s o r b i n gr a t ew a s8 6 a n dt h ep u r i t yr e a c h e d8 5 2p r e l i m i n a r ys t u d yo nm e t a l l i cc o m p l e x e so fd i h y d r o m y r i c e t i n t h ec o o r d i n a t i o nr e a c t i o n sb e t w e e nt h ep r o d u c to fw a t e rr e p e t i t i o na n dc a l c i u mi o n , z i n ci o n , f e r r o u si o nw e r er e s e a r c h e dw i t hd i f f e r e n tm o l a rr a t i ou n d e rt h ea l k a l i n e c o n d i t i o n t h r o u g ht h eu v r s p e c t r u ma n di rs p e c t r u m , i tw a sc o n f m n e dt h a t t h e c o o r d i n a t i o nr e a c t i o n sh a dh a p p e n e d a sf a ra sa n t i o x i d a n ta c t i v i t y , t h e s c a v e n g i n g c a p a b i l i t yt oh y d r o x y lr a d i c a lo fz i n cc o m p l e xa n dc a l c i u mc o m p l e xw e r es i g n i f i c a n t ，t h e c l e a r a n c er a t eo v e r8 0 t h ec l e a r a n c er a t eo ff e r r o u sc o m p l e xw a sl o w , l e s st h a n2 0 k e yw o r d s ：t e n g c h a ；d i h y d r o m y r i c e t i n ；p u r i f i c a t i o n ；w a t e rr e c r y s t a l l i z a t i o n ； m a c r o p o r o u s ；p o l y a m i d c ；m e t a l l i cc o m p l e x i t 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 如需保密，解密时 是否保密 圣 间 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢 意。 研究生签名：蓝基 时间：瑚年勿月加日 学位论文使用授权书 本人完全了解。华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生 必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文 的印刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：盖垄 导师签名：p 锄旗 签名日期：砷8 年月加日 签名日期：立以年f 月少日 华中农业人学2 0 0 8 届硕士学位论文 第一章文献综述 藤茶( a m p e l o p s i s g r o s s e d e n t a t aw t w a n g ) ，又名显齿蛇葡萄，是葡萄科蛇葡萄 属的一种野生藤本植物，又称茅岩莓茶、甘露茶等( 王文采，1 9 7 9 ；中国科学院植 物研究所，1 9 8 3 ) ，湖南、广西等省区壮族和瑶族民间常用其幼嫩茎叶入茶，用于 治疗感冒发热、咽喉肿痛、黄疸型肝炎、痈疥、高血压等症( 广西植物研究所，1 9 9 4 ； 王文采，1 9 7 9 ；钟正贤，2 0 0 2 ；中国科学院植物研究所，1 9 8 3 ；中草药汇编，1 9 9 7 ) ， 已有数百年的使用历史。尽管人们对显齿蛇葡萄植物的利用历史悠久，但由于对其 缺乏全面系统的研究，目前仍处于民间饮用和一般性开发。 1 藤茶的应用 1 1 显齿蛇葡萄利用的现状 1 1 1 作茶饮 这一用途十分普遍，当地群众借“藤”称茶，名之“藤茶”，“藤婆茶”或“甜婆茶”、 “甜树茶”、“白茶”等，都是以“藤”为茶，而且都有一套简易的加工技术( 宋纬文， 1 9 9 6 ) ，同时每年均有一定的产品投入市场。目前，将显齿蛇葡萄幼嫩茎叶开发为袋 泡茶，产品有湖南张家界的“茅岩莓茶”，福建宁远的“宁远藤茶，广东的“广东白茶” 等( 杨英雄等，2 0 0 5 ) 。 1 1 2 作中草药防病治病 在瑶族同胞集中居住的地区，每年都要自采自制一些藤茶，除作家庭经常性饮 用外，还作中草药，主要用作治感冒、清热解毒、助消化、治腹胀，喉炎肿痛等( 广 西植物研究所，1 9 9 4 ) 。近年，福建宁远将显齿蛇葡萄粗提物制成主治咽喉发炎的“含 化片”( 张雁，2 0 0 2 ) 已经上市；广东省农业科学院农业生物技术研究所，用藤茶 提取液研制出藤茶保健果冻( 张雁，2 0 0 4 ) 等，但大都处在初步开发阶段。 1 2 蛇葡萄属植物药理作用研究近展 从蛇葡萄属植物的长期应用和药理研究中发现，该属一些植物的具有显著抗炎、 保肝、抗高血压等多方面的作用，但主要药效学物质基础不是很清楚，作用机理还 不十分明确。 1 2 1 抗炎镇痛 研究证实( 张汉萍等，1 9 9 8 ) 藤茶水提取液对小鼠巴豆油性耳廓水肿、大鼠角叉 菜胶性、甲醛性足趾肿胀及腹腔毛细血管通透性均有抑制作用；对小鼠醋酸性扭体 反应和热水反应有一定的镇痛作用，能提高小鼠的痛阈水平。湖北麻城地区用蛇葡 藤茶中二氢杨梅素的纯化及金属配合物的初步研究 萄彳s i n c i a ( m i q ) w t w a n g 、光叶蛇葡萄、异叶蛇葡萄、三裂蛇葡萄治疗慢性骨髓 炎，长期临床研究表明具有肯定的疗效。 1 。2 2 抑菌、祛痰止咳 研究表明( 熊大胜等，2 0 0 0 ) ，藤茶提取物对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌有很强 的抑制作用：对黑曲霉、黄曲霉、青霉、交链霉等均有不同程度的抑制效果，抑制 浓度为0 0 7 0 o - 1 o 不等。钟正贤等( 钟正贤等，1 9 9 8 ) 把二氢杨梅素( d i h y d r o m y r i c e t i n ， 简写d m y ) 以1 o g k g 剂量给小鼠灌服，能显著增强呼吸道酚红排出量和减少氢氧 化胺实验性咳嗽次数，提示具有祛痰、止咳作用。粤蛇葡萄临床用于葡萄球菌绿脓 杆菌等感染性疾病4 0 0 0 余例，治愈率达7 0 ，无不良反应。 1 2 3 降血脂、降血糖、抗高血压 文献报道( 陈晓军等，2 0 0 1 ) ，藤茶总黄酮能明显抑制大鼠体外血小板聚集合体 内血栓的形成：降低高血脂症模型小鼠血脂和血糖水平，明显减少主动脉及肝脏t c 含量，抑制动脉粥样硬化及肝脏脂肪化病变。d m y 对四氧嘧啶致糖尿病小鼠有明显 的治疗作用，对葡萄糖、肾上腺素引起的高血糖模型小鼠也有明显的降血糖效果， 但对正常小鼠无明显影响；d m y 能拮抗由肾上腺素( n a ) 和高k + 所致的兔胸主动脉 条收缩；对肠平滑肌和主动脉条的受体具有阻断作用( 周雪仙和周天达，1 9 9 7 ) 。张 汉萍( 张汉萍等，1 9 9 8 ) 从大叶蛇葡萄a m e g a l o p h y l l ad i e l se tg t g 中分离出蛇葡萄素， 并进行了初步药效学研究，结果表明其对脱氧皮质酮盐性等高血压模型大鼠有降压 作用。 1 2 4 抗肿瘤、增强免疫的作用 周宁宁报道( 周宁宁等，2 0 0 0 ) 从无刺根植物a c 册0 刀把凇捃( h 0 0 ke ta m ) p l a n c h 中提取的蛇葡萄素对b 1 6 黑色素瘤具有较好的抑制效果，体外对h k 1 ，m c f 7 ， h l 6 0 ，k 5 6 2 和肝癌b e l 一7 4 0 2 的细胞生长以及体内小鼠移植性黑色素瘤的生长均有 明显的抑制作用。台湾l e eh u e i 等( l e eh u e i ，e ta l ，1 9 9 8 ) 发现，东北蛇葡萄彳 b r e v i p e d u n c u l a t a ( m a x i m ) t r a n t v 根的沸水提取物具有中等程度的抗苦酮酸和苯并花 所致诱变的活性。 1 2 5 减轻乙醇中毒 h a s e k 等人在进行解除酒精中毒剂实验中发现( h a s ek e ta l ，1 9 9 7 ) ，从h d u l c i s 中提出的d m y 作为解除酒精中毒剂效果最佳；之后，在进行机理研究时发现，d m y 减轻乙醇中毒的原理主要是保护肝，减轻乙醇对肝的损伤。刘建新等( 刘建新等， 1 9 9 8 ) 用显齿蛇葡萄植物水煎剂进行了解酒实验，结果显示随其水煎剂浓度的加大， 跌倒反应百分率和步态不稳百分率下降，证实其具缓解酒醉反应，促进醒酒的作用， 尽管刘建新用的不是d m y 单体，但显齿蛇葡萄植物水煎剂的主要成分为d m y ，从 中也可发现d m y 的减轻乙醇中毒的作用。 2 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 2 二氢杨梅素的研究现状 二氢杨梅素( 3 ，5 ，7 ，37 ，4 ，5 一六羟基2 ，3 双氢黄酮醇) 又名双氢杨梅树皮素、福建 茶素、蛇葡萄素等，是黄酮类化合物的重要一员( 孙文基和绳金房，1 9 9 3 ) 。该化合 物首次由k o t a k e 和k u b o t a 于1 9 4 0 从葡萄科蛇葡萄属植物福建茶即楝叶玉葡萄4 m e l i a e f o l i a 的叶中分离到，命名为蛇葡萄素( 周天达和周雪仙，1 9 9 6 ) 。 d m y 广泛存在于松柏类植物和木材中，如松属( p i n u s ) 和雪松属( c e d r u s ) 树皮中， 也存在于木本被子植物，如杜娟花科植物饼砂杜娟( r h o d e n d r o nc i n n n b a r i u u n m ) 叶、 连香树科植物连香树( c e r c i d i p h y l l u mj a p o n i c u s ) 木材中，是一种抗氧化剂( 孙文基和 绳金房，1 9 9 3 ) 。据植物成分手册介绍( 国家医药管理局中草药情报中心站编，1 9 8 6 ) ， 该植物存在于杨梅科、杜娟科、藤黄科、大戟科等植物中，有抗癌、利胆和抗炎作 用。近十年来，随着黄酮类化合物成为天然植物活性成分的研究热点后，d m y 也受 到人们的重视和关注，但由于在以上植物中存在含量不高的因素，一直无法进行大 规模的应用和实验，直到在蛇葡萄科中发现并提取之后才引起人们极大的关注和重 视。从目前研究情况表明，d m y 大量存在于葡萄科植物中，尤其是在蛇葡萄属植物 中更是大量存在。有研究表明，藤茶幼嫩茎叶中含量达2 7 2 8 ，最高部位可达4 0 以上( 张友胜等，2 0 0 1 ；何桂霞，2 0 0 0 ) ；粤蛇葡萄中幼嫩茎叶中含量可达2 5 以上( 陈 缵光和蔡沛祥，1 9 9 7 ) 。d m y 作为黄酮类成分中的重要一员，在天然植物中单体含 量如此之高，实属罕见。 2 1 二氢杨梅素的化学性质 为了更好地发挥d m y 的生理功效，使其在食品、医药领域得到广泛应用，人 们对d m y 的化学性质尤其是在作为食品抗氧化剂和防腐剂使用时的稳定性做了大 量研究。d m y 的分子中含有6 个酚羟基，具有弱酸性，等电点在p h = 5 左右，因此 其在酸性溶液中构型稳定，在中性和碱性溶液中酚羟基易发生解离。尤其是在强碱 性条件下由于酚羟基大量的解离，改变了分子上的电子云分布，从而使分子发生了 彻底的构型转换，在c 环的氧原子处发生解环，生成了a 环上的一个羟基，变成类 似于查尔酮的结构( 郭清泉等，2 0 0 6 ) 。 2 1 1 二氢杨梅素良好的热稳定性 林淑英等( 林淑英，2 0 0 3 ) 研究发现，d m y 在水相中的热稳定性与时间关系密切， 1 0 0 c 下加热3 0r a i nd m y 在水中仍能保持稳定的构型，加热时间更长以后d m y 发 生氧化，变成亚醌式结构，c 环发生断裂。d m y 的d s c 稳定性分析发现其熔点为 2 4 5 左右。 藤茶中二氢杨梅素的纯化及金属配合物的初步研究 2 1 2 二氢杨梅素与金属离子的络合性质 d m y 分子中的酸性酚羟基和成络基团羰基都很容易和金属离子发生反应，所以 加工或提取等工艺过程中引入到食品体系中的金属离子或食品原辅料中固有的金属 离子对d m y 稳定性的影响不容忽视。研究发现c a 2 + ，m 9 2 + ，n a + ，n h 4 + 和b a 2 + 对于 d m y 的稳定性均无明显作用( 林淑英，2 0 0 3 ) ；a 1 ”易与d m y 生成络合物，非共 有电子增多，i h 兀共轭加强，使紫外一可见吸收光谱出现红移效应；过渡态的高价 金属离子f e 3 + 和c u 2 + 易与d m y 发生鳌合，使其氧化。而f e 3 + 和c u 2 + 是许多自由基 产生过程的催化剂，所以这也是d m y 具有抗氧化作用的作用机制之一。 2 1 3 二氢杨梅素的合成反应 分子中的酚羟基还能和一些酸、脂肪酰卤、糖等反应生成新的化合物，这些性 质为d m y 提供了更广阔的应用潜力。如李卫等( 李卫，2 0 0 5 ) 用月桂酰氯对d m y 的羟基进行酯化，合成了d m y 月桂酸酯。通过对d m y 及d m y 月桂酸酯在猪油中 抗氧化性能的比较试验，证实d m y 月桂酸酯能够持久、稳定地在猪油中发挥抗氧 化作用，而且抗氧化能力比d m y 还要强。m a t s u m o 等( m a t s u m oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 在实 验中发现，从& l i xs a c h a l i n e n s i s 提取的d m y 对c l a d o s p o r i u mh e r b a r u m 真菌具极强 的抑制作用，但d m y 甲酯的抑菌能力为d m y 的4 倍。宁正祥( 宁正祥，2 0 0 5 ) 采用 黄酮糖苷酶催化合成了d m y 葡萄糖苷。通过对1 5 8 例糖尿病患者为期9 个月的治 疗发现，d m y 葡萄糖苷能使其血糖代谢基本回归到正常水平。 2 2 二氢杨梅素的检测方法 实验室多采用a 1 c 1 3 显色法( 钟萝，1 9 8 9 ) 来测定藤茶中的总黄酮含量。而d m y 的测定方法主要有薄层扫描法( 何桂霞等，2 0 0 1 ) 和高效逆流色谱法( 张友胜等，2 0 0 1 ； 田森林，2 0 0 2 ；何桂霞等，2 0 0 4 ) 。这两种方法是比较常用的微量分析法。 何桂霞等( 何桂霞等，2 0 0 0 ) 用薄层扫描法测定藤茶中d m y 的含量。用甲苯 一乙酸乙酯一甲酸( 1 0 ：8 ：5 ) 为展开剂所得薄层色谱图分离效果较好，结果测得 藤茶中d m y 的含量为3 8 1 7 一3 8 5 4 ，回收率为9 8 5 ，r s d 为1 6 ，快速，简 单。 田森林等采用反相高效液相色谱法测定显齿蛇葡萄植株中d m y 的含量，其最 佳检测条件为色谱柱为n o v a 2 p a c kc 1 8 不锈钢柱，检测波长为2 9 4n m ，用甲醇一 水( 体积比2 4 ：7 6 ) 为流动相。方法的变异系数为1 1 2 5 ，平均回收率为9 5 0 3 ， 最低检测量为1 0 n g ，湖南显齿蛇葡萄中不同部位的d m y 含量在1 1 8 7 - - 4 0 6 6 之间。( 田森林等，2 0 0 2 ) 。何桂霞等建立h p l c 法对不同产地不同采收期藤茶叶、 茎中的d m y 进行含量测定( 何桂霞等，2 0 0 4 ) 。另外，科研工作者也将h p l c 法应 用到藤茶深加工产品如藤茶含片中，来测定其中的d m y 含量( 王春娥等，2 0 0 6 ； 郑虹和叶秋焰，2 0 0 6 ) 。 4 华中农业大学2 0 0 8 届硕l 学位论文 高效液相色谱中反相液相色谱在测定黄酮含量中扮演着中心角色，它是基于溶 质在极性流动相和非极性固定相表面之间的疏水效应建立的一种色谱模式。黄酮类 化合物分析中c 1 8 柱用的最为普遍，过去主要分析极性较大的昔或苷元，现在可用 于分析低极性的苷元。应用反相h p l c 分析黄酮类化合物，一般优先选择甲醇水及 乙腈水体系为流动相。为了提高分离度常常需要梯度洗脱。正相系统中流动相一般 采用乙烷或异辛烷等体系，以极性较大的乙醇、丙醇、乙腈等有机溶剂调节。由于 黄酮类化合物常带有酚羟基，在水中会部分解离，而未解离的羟基与固定相作用较 强，从而导致拖尾。所以黄酮类化合物的反相i - i p l c 中需要加入酸，如乙酸、甲酸、 磷酸或高氯酸等调节p h 值，抑制解离，克服拖尾现象。但酸对仪器具有腐蚀性。 极性较大的苷元一般用c 1 8 或c 1 8 反相系统分离( gk i t ee ta l ，2 0 0 6 ) 。在色谱柱的 选用中，在相同流动相下c 1 8 柱对称性及拖尾情况比较好。在色谱柱均为c 1 8 柱 情况下，因乙腈价格较昂贵而选择甲醇水系统作为流动相。流动相中加入适量的磷 酸缓冲液，可使色谱峰对称，不拖尾。( 田森林等，2 0 0 2 ) 。 现在多采用反相高效液相色谱法来测定d m y 含量，操作简便，可靠。随着对 d m y 研究的不断深入，相信在不久的将来，人们将利用d m y 所具的还原性、弱酸 性和与金属离子的螯合性等方面的化学性质，探索出更多简便、快速、准确的测定 方法。 2 3 二氢杨梅素分离纯化方法 藤茶一直以粗植物的形式开发和销售，致使其不能更广泛的应用到制药、食品 添加剂等领域。获得高纯度的d m y 对扩大其应用范围，意义重大。 植物天然产物d m y 的纯化方法有： 2 3 1 吸附法 通常利用吸附法除去体系的杂质如色素等，也可以用吸附剂吸附有效成分。常 用的吸附剂有氧化铝、活性炭、多孔树脂，分子筛等。y o o 等( y o oe ta 1 ，2 0 0 6 ) 报道 了利用萃取吸附技术从h o v e n i ad u l c i s 中提取纯化d m y 的方法。将提取液经活性粘 土p 1 吸附过滤，再经硅藻土过滤吸附，甲醇洗提，洗液过硅胶柱后乙醚洗提，洗 液经浓缩蒸发可得到纯度达5 0 的d m y 粗品。 2 3 2 结晶法 结晶法是分离和纯化固体成分的重要方法之一，是利用混合物中各成分在溶剂 中的溶解度不同来达到分离的方法。结晶时应选择合适的溶剂、合适的温度和时间 等；结晶法手所用的度依样品必须是具有一定纯度的样品才能采用此法纯化，如果 粗液部分的纯度很差，则很难得到结晶，或者结晶后的纯然较低。对提取出的粗黄 酮进行预处理后再进行重结晶可得到较高纯度产品( 张友胜等，2 0 0 2 ) 。采用“增温 5 藤茶中二氢杨梅素的纯化及金属配合物的初步研究 溶解，保温过柱，温水解吸 法从显齿蛇葡萄中提纯d m y ，经此法后再重结晶的 d m y 可达到较高纯度要求。 高建华( 高建华，2 0 0 6 ) 对显齿蛇葡萄黄酮提取物d m y 的提纯及结晶态进行 了初步探讨。表明：以水作为结晶溶剂进行多次重结晶，可有效去除植物黄酮提取 物的杂质，总黄酮含量又原来的8 6 提高至9 6 5 。d m y 在水相中的结晶态多为针 状结晶，水相保温结晶呈放射性棒状结晶。在p h 4 5 的条件下，其溶解度最低可获 得较高的回收率。 2 3 3 色谱法 2 3 3 1 常规色谱法 色谱法包括离子交换色谱、分配色谱、吸附色谱等，其中吸附色谱主要是选用 硅胶、活性炭、聚酰胺和离子交换与吸附树脂等具有强选择吸附性质的吸附剂作为 柱填充料，吸附样品中的杂质或待提纯的物质。若吸附的为待提物的物质，则选用 适当溶剂系统洗脱被吸附物质，将洗脱液浓缩干燥即得较纯产品，该法工艺简单， 使用有机溶剂少，安全性强，树脂再生容易，重复利用率高，具有较好的发展前景。 2 3 3 1 1 大孔树脂吸附法 大孔树脂是2 0 世纪6 0 年代末在凝胶型树脂的基础上发展起来的一类有机高分 子聚合物吸附剂，吸附作用的本质是吸附剂与吸附树脂分子间的范德华力。它是一 种不溶于酸、碱及有机溶剂( 如乙醇、丙酮及烃类等) ，对氧、热、化学试剂稳定及 机械强度高的有机高分子聚合物，树脂内部具有三维空间立体孔结构，其孔隙度与 比表面积都比较大。大孔树脂分为大孔离子交换树脂和大孔吸附树脂。一般认为， 依靠物理界面力作用引起溶液中溶质的浓度减少称为吸附，因化学作用引起溶液中 溶质的变化称为离子交换( 汪茂田等主编，2 0 0 4 ) ，起离子交换与吸附作用的树脂分 别称为离子交换树脂和吸附树脂。 大孔吸附树脂具有物化稳定性高、比表面积大、吸附选择性好、不受无机物存 在的影响、再生处理方便、吸附解吸条件温和、使用周期长、节省费用等优点，广 泛应用于物质的分离纯化。 由于吸附树脂理化性质不同，不同型号的树脂对黄酮的精制效果有较大的差异。 陆志科等选用6 种不同型号的树脂对竹叶黄酮的吸附特性进行比较研究，结果表明， 弱极性的a b 一8 树脂适宜竹叶黄酮的提取( 陆志科、谢碧霞，2 0 0 3 ) 。分离纯化枸 杞叶总黄酮时用h p d l 0 0 型大孔树脂效果较好( 雍晓静，2 0 0 5 ) 。银杏叶黄酮的分 离纯化采用d m 一1 3 0 型树脂具有较好的效果( 卢锦花等，2 0 0 2 ) 。 除树脂的类型外，溶剂的种类及浓度对纯化的效果也具有很大的影响，有研究 表明( 李昀，2 0 0 0 ) ，d 2 0 4 、x d a 2 树脂吸附银杏叶黄酮后，用8 0 7 , 醇洗脱效 果最好，而d 一2 5 4 、d 1 1 3 则以9 5 乙醇洗脱效果最好。 6 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 洗脱速度也是影响树脂吸附分离特性的一个重要因素。安彩贤等用d 1 0 1 树脂 分离纯化葛根与山楂叶中的总黄酮时，选取2 、3 、4 m l m i n3 个不同的洗脱速度对洗 脱率进行考察，结果表明，葛根黄酮洗脱率在洗脱速度为2 m l m i n 时最高( 安彩贤、 李冶姗，2 0 0 4 ) 。 吸附量与被吸附物浓度的关系符合f r e n d i c h 和a n g m u r 经典吸附式，即被吸附 物浓度增加，吸附量也随之增加，但被吸附物浓度增加有一定的限度，不能超过其 吸附容量。在吸附容量不是很大的情况下，一般低浓度下进行吸附比较有利( 郭永 学等，2 0 0 4 ) 。任顺成等用a b 一8 树脂对玉米须总黄酮进行吸附和解吸效果的研究， 确定上样液浓度控制在0 5 - - 0 8 m g m l 范围内较好( 任顺成、丁霄霖，2 0 0 3 ) 。 当然影响大孔吸附树脂洗脱效果的因素还有很多，如p h 值，柱温，被吸附化 合物结构的影响、无机盐浓度的影响、树脂柱径高比的影响等。 张友胜等( 张友胜等，2 0 0 2 ) 建立了大孔树脂柱色谱分离方法。采用“增温溶 解，保温过柱，温水解吸 法从显齿蛇葡萄中提纯d m y ，分析了温度、料液浓度、 过柱速度，解吸柱水流速度等影响因素。 2 3 3 1 2 聚酰胺柱层析法 对分离黄酮类化合物来说，聚酰胺是较理想的吸附剂。其吸附强度主要取决于 黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成 氢键缔合能力的大小。柱层析分离黄酮类物质样品容量大、可逆、分离效果好，可 使性质极相似的类似物得到分离。苷元相同，洗脱先后顺序一般是三糖苷、双糖苷、 糖苷、苷元。大多数黄酮苷在1 0 一4 0 的乙醇液中就可以洗脱下来，而苷元在5 0 9 5 的乙醇液中才能洗脱下来。东南大学王怡红等人( 王怡红等，1 9 9 9 ) 用改性 的聚酰胺层析柱从银杏中分离黄酮类化合物。由于纯聚酰胺用于柱层析固定相存在 滤水性差、单位质量吸附量小、有小分子夹带的问题。王怡红等对聚酰胺柱进行了 改进，将聚酰胺涂装在硅藻土上，制成的改性聚酰胺柱，改善了滤水性，提高了单 位质量聚酰胺的吸附量，消除y d , 分子夹带问题。此外，王怡红等通过实验还得出 聚酰胺在该层析柱上的吸附为单分子层吸附的结论。郑国华等( 郑国华等，2 0 0 6 ) 用聚酰胺柱层析法从藤茶的乙酸乙酯萃取部位分离得到3 个化合物等。经过理化常 数测定和光谱分析，确定为蛇葡萄素，杨梅素和杨梅苷。其中杨梅素和杨梅苷是首 次从该植物中分得。 由于使用范围广泛，使用寿命长，分离效果好，柱层析分离实验操作简单，聚 酰胺层析法将会得到更多关注。其层析作用机理，虽目前讨论较少，但随着研究的 进一步深入，也必定会有很大的突破。 7 蘼茶中二氢杨梅素的纯化及金属配合物的初步研究 2 3 3 2 其他色谱法 真空液相色谱( v a c u u ml i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , v l c ) 是近年来在国外化学实验 室中迅速发展起来的一种新的色谱技术，它是利用柱后减压，使洗脱液迅速通过固 定相，从而很好地分离样品。真空液相色谱具有快速、简易、高效、价廉等优点， 目前已成功地用于萜类、木质素、生物碱等生物活性植物天然产物的分离。 张友胜等( 张友胜等，2 0 0 3 ) 采用高速逆流色谱法( h s c c c ) 从原料中提制的粗 品进行纯化得到9 9 0 6 以上的纯品。选用溶剂系统为石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水( 1 ： 3 ：2 ：2 ) ，在转速为8 0 0 r m i n ， 进样量为2 0 0 m g 、进样速度为1 5 m l m i n 的条件下， 能很好地将8 0 左右的粗d m y 提纯到9 0 以上，进样速度、进样量对d m y 的分 离有一定影响。h s c c c 是一种不用固态支撑体或载体的液一液分配色谱和能实现连 续有效的分配功能的分离技术。这种方法的关键之处在于合适的溶剂系统的选择和 配比。 d u ( d ue ta 1 ，2 0 0 2 ) 采用制备型三柱高效逆流色谱法，由显齿蛇葡萄叶片提取 物中纯化d m y ，溶剂系统为正已烷：乙酸乙酯：甲醇：水( 1 ：3 ：2 ：4 ，v v ) ，检 测波长为2 5 4 n m ，经9 个小时获得纯度为9 9 以上的d m y 产品。 2 4 黄酮类金属配合物研究 有机金属配位化合物是指独立存在的稳定化合物进一步结合金属离子而成的复 杂化合物。从组成上看，配合物是由可以给出孤对电子或多个不定域电子的离子或 分子( 称为配体) 和具有接受这些电子的空位的离子或原子( 称为中心原子) 按一 定的组成和空间构型所形成的化合物。配合物形成后往往表现出不同于配体和中心 原子原有性质的特殊性能。 目前，在天然药物有效成分金属配合物的研究中，多集中于黄酮类化合物，如 黄芩苷、槲皮素、芦丁、桑色素等，这与黄酮类化合物的母核结构有关。黄酮类化 合物的母核是由3 个环组成，两个苯环，一个吡喃环。黄酮类化合物具有超离域度， 整个分了形成一个大兀键共轭体系，黄酮分子中的氧原子具有强配位能力，黄酮母 核的空间结构有利于配合物的形成。 周晶等( 周晶等，2 0 0 1 ) 合成了槲皮素与金属c d ( i i ) 、s c ( r i ) 配合物。以1 ：2 的物质的量比将金属醋酸盐加入到槲皮素和醋酸钠的无水乙醇溶液中，经回流、过 滤、洗涤、干燥得到黄色粉末状固体。由元素分析和热分析结果得知，配合物的化 学组成分别为c d l 2 3 h 2 0 ，s c l 3 6 h 2 0 。从红外光谱数据可知，槲皮素中羰基振动频 率位于1 6 4 4 c m 一，形成c d ( i i ) 、s c ( 1 1 1 ) 配合物后，向低波数分别位移了3 5 和2 6 c m ， 而“c - o c ”的振动频率基本保持不变，由此可知，配体的羰基氧参与了配位。比较配 体h l 2 h 2 0 ( 槲皮素) 与c d ( i i ) 、s e ( m ) 配合物的1n m r 谱，配体于9 5 8 ( 1 h ，3 o h ) 8 华中农业大学2 0 0 8 届硕十学位论文 的吸收峰在配合物中消失，表明配位时3 - o h 失去质子并通过氧原子与金属离子配 位。 曹风歧等( 曹风歧岐等，1 9 9 3 ) 合成了刺槐甙p r ( i i i ) 、s m ( i i i ) 的稀土配合物。 将刺槐甙和氯化稀土以3 ：1 的物质的量比在吡啶溶液中回流1 0 h ，产生的沉淀经无 水乙醇洗涤、干燥，得到粉末状配合物。从元素分析结果推知配合物的组成为 p r a c l 2 4 h 2 0 和s m a c l 2 4 h 2 0 ( a 为失去一个羟基质子的刺槐甙阴离子) 。在d m s o 中测得配合物的摩尔电导率在2 0 - 2 5 s c m 2 m o l j 之间，说明配合物在d m s o 中以非 电解质形式存在。比较配体和配合物的红外光谱发现，配体在1 6 5 5 c m j 处出现的羰 基伸缩振动吸收峰在配合物中红移至1 6 2 0 c m j 处，表明羰基参加了配位。配体在 1 2 4 5 c m 1 处的芳醚c - o c 键伸缩振动吸收峰在配合物中向高波数区稍有位移，说明 芳醚氧原子没有形成配位键。配体在1 3 0 0 c m d 处由o h 键面内变形振动偶合所致的 吸收峰在配合物中消失，说明酚羟基参与了配位成键，并且配合物在6 1 5 c m 1 处出 现r e o 键的伸缩振动吸收峰，表明形成了金属氧键。 d m y 分子中的酸性酚羟基和成络基团羰基都很容易和金属离子发生反应。研究 发现( 林淑英，2 0 0 4 ) ：c a 2 + 、m 9 2 + 、n a + 、n h 4 + 和b a 2 + 对于d m y 的稳定性均无明 显作用；a l ”易与d m y 生成络合物，非共有电子增多，n 叫【共轭加强，使其紫外 可见吸收光谱出现红移效应；过渡态的高价金属离子f e 3 + 和c u 2 + 易与d m y 发生鳌 合，使其氧化。郭清泉等( 郭清泉等，2 0 0 6 ) 。利用d m y 螯合金属离子的特性，制 备铁一d m y 螯合物，作为铁强化食品的主要功效成分，起到补充和强化人体铁元素 含量的目的。d m y 容易与铁发生螯合作用，铁的螯合率较高，有实际应用价值。 桑色素锰、钴、镍、铜和锌配合物对超氧自由基( 0 2 ) 的清除作用均明显高于配 体( 张歧等，2 0 0 2 ) ，其中桑色素铜、锰配合物显示出更强的清除超氧自由基活性。 在抗脂质过氧化活性方面，桑色素锰、钴、镍、铜和锌配合物对脂质过氧化具有抑 制作用，其中桑色素钻、镍、锌配合物抗脂质过氧化活性强于桑色素。黄芩甙铜、 锌配合物对超氧自由基( 0 2 。) 具有明显的清除作用( 房喻等，1 9 9 1 ) ，并呈量效关系， 其中以铜配合物活性最高。黄芩甙锌可减轻0 2 。对红细胞及红细胞膜的破坏作用， 其作用强于黄芩甙，表现为黄芩甙与锌的协同作用。黄芩甙锌配合物对0 2 。导致的 h b 氧化失活及红细胞膜脂质过氧化有显著的抑制活性，但对0 2 。致细胞溶血及膜脂 流动性降低没有抑制活性。黄芩甙铜虽然有很高的清除0 2 。活性，但仍表现出一定 的细胞毒性，即促进膜脂流动性进一步降低、诱发细胞溶血。d m y 与铁发生螯合作 用后，螯合物的抗氧化活性与d m y 的相差不大( 郭清泉等，2 0 0 6 ) 。 9 藤茶中二氢杨梅素的纯化及金属配合物的初步研究 3 课题研究的目的和意义 进入2 l 世纪，人们对生活质量的要求越来越高，日益严重的化学合成物质对环 境的污染和毒性问题，使得人们对植物天然产物的需求也越来越迫切。天然植物中 的活性成分已成为人们研究的主要对象之一。藤茶为我国特有茶用、药用植物，具 有具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、消炎抑菌、降血压、降血脂等多种 药理功能( 何桂霞等，1 9 9 9 b ；钟正贤等，1 9 9 8 ；杨书珍等，2 0 0 3 ：钟正贤，2 0 0 2 ： 覃洁萍等，2 0 0 1 ：何桂霞等，2 0 0 3 ) 。其主