（药物分析学专业论文）四种药物的毛细管电泳电化学发光法分析.pdf

原创性声明 删舢1 1 + 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 y1 8 , , , l , 3 l lu i | 3 | f l l l l 3 i i i i i116l l l l 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者： 张长 日期：上oi d 年万月2 d 日 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门 或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学 可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文 或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者：张祆日期：2 0 l o + 岁月3 0 日 、 中文摘要 中文摘要 毛细管电泳( c e ) 是一种高效的分离分析工具，具有进样量少，分辨率高， 灵敏度高，选择性好，操作成本低等优点。电化学发光( e c l ) 具有操作简单，背 景噪音低，线性范围宽等优点。近年来，c e e c l 联用技术倍受关注，越来越 多的应用于痕量、复杂样品的分离分析。 本论文利用c e e c l 联用技术，建立了四种药物盐酸托莫西汀、盐酸 林可霉素、甲硝唑和盐酸麻黄碱测定的分析方法体系；研究了盐酸托莫西汀、 盐酸麻黄碱与细胞色素c 、肌红蛋白及牛血清白蛋白三种蛋白的相互作用。本 研究所获得的结果为上述四种药物的快速测定及实验研究提供了新的方法参考 和依据。具体内容如下： 1 通过实验条件的优化，首次建立了测定盐酸托莫西汀的毛细管电泳电致 化学发光分析体系。通过对盐酸托莫西汀胶囊、大鼠口服给药血浆浓度的测定， 考察了方法的可行性。结果表明，在最佳的实验条件下：检测电位为1 1 5 v ； 检测池中联吡啶钌的浓度为5m m o l l ，磷酸盐缓冲液浓度为7 0m m o l l ( ph 8 o ) ； 电动进样条件为1 2k v x1 0s ；分离电压为1 2 5k v ；分离缓冲液为3 0m m o l f l ( p h 7 5 ) 的磷酸盐缓冲液。所建立的方法体系可用于盐酸托莫西汀胶囊及血浆样品中 盐酸托莫西汀的测定，为盐酸托莫西汀实际样品的分析提供了新的方法。 2 由于毛细管电泳电致化学发光分析体系能够满足对盐酸托莫西汀的分 析测定，据此首次利用本体系研究了盐酸托莫西汀与三种蛋白牛血清白蛋 i 兰i ( b s a ) 、细胞色素c ( c y t c ) 和肌红蛋白( m b ) 的相互作用，并且计算了它们之 间的结合常数分别为9 5 1 1 0 3 l m o l 、1 1 5 x 1 0 4 l m o l 和7 3 8 x 1 0 l m o l ，结合 位点分别为1 5 2 3 、1 0 1 9 和1 7 1 5 。 3 建立了毛细管电泳电化学发光( c e e c l ) 法测定盐酸林可霉素注射液中 盐酸林可霉素含量的新方法。研究了检测电位、磷酸盐缓冲液浓度和p h 值、 分离高压、进样电压和进样时间、分离缓冲液的浓度和p h 值等实验条件对盐 酸林可霉素分离检测条件的影响，得到了优化的实验条件。盐酸林可霉素在 5 x 1 0 墙 - - - 9 x 1 0 6g m l 范围内呈良好线性，检出限为1 5 5 x 1 0 一g m l ，回收率为 9 6 1 4 1 0 0 2 9 。 4 建立了毛细管电泳电化学发光( c e e c l ) 法测定甲硝唑注射液中甲硝唑 中文摘要 含量的快速、灵敏的新方法。实验得到测定甲硝唑的最优条件：检测电位1 2 0 v 、 5m m o l l 的联吡啶钌、磷酸盐缓冲液浓度为6 0m m o l l ( p h7 o ) 、分离高压为 1 5 k v 、进样高压为1 0k v 、进样时间为1 4s 、分离缓冲液的浓度为1 5m m o l l ( p h 7 o ) 。在此条件下，甲硝唑在8 x1 0 8 2 1 0 。6 9 m l 范围内呈良好线性( r 2 = o 9 9 7 ) ， 检出限为9 7 x1 0 。9 9 m l ，并成功的应用于两个不同厂家的甲硝唑注射液和一个 厂家的甲硝唑葡萄糖注射液中的甲硝唑含量的检测，回收率为9 9 0 1 1 0 0 7 5 。 5 将毛细管电泳与r u ( b p y ) 3 2 + 电化学发光检测技术相结合，应用于对盐酸 麻黄碱的检测。在优化的实验条件下，其浓度线性范围为6 x 1 0 8 一- 6 x 1 0 击g m l ； 检出限( s n = 3 ) 为4 5 1 x 1 0 9g m l 。本方法快速准确，成功应用于呋麻滴鼻液中 盐酸麻黄碱含量的测定，回收率为9 6 1 4 1 0 0 2 9 。 6 本论文利用c e e c l 检测方法，首次建立了盐酸麻黄碱与牛血清白蛋白 ( b s a ) 、细胞色素c ( c y t c ) 和肌红蛋白( m b ) 这三种蛋白相互作用的新方法，并 且计算了它们之间的结合常数分别为1 5 5 x 1 0 4l m o l 、6 5 8 x 1 0 3l m o l 和 1 5 9 x 1 0 4l m o l ，结合位点分别为8 5 2 、1 2 6 0 和l o 6 6 。 关键词：毛细管电泳电化学发光蛋白相互作用 i i a b s t r a c t a b s t r a c t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i si sa ni m p o r t a n ta n dp o w e r f u la n a l y t i c a ls e p a r t i o nt 0 0 1 t h ea d v a n t a g e so fc ei n c l u d i n gs m a l ls a m p l es i z e ，h i g hr e s o l u t i o na n ds e n s i t i v i t y , n i c es e l e c t i v i t y , r e d u c e dc o s ta n ds oo n i th a sb e e nd e v e l o p e dw i d e l yi nr e c e n ty e a r s e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ( e c l ) h a sm a n ya d v a n t a g e si n c l u d i n g i t s s i m p l e i n s t r u m e n t s ，l o wb a c k g r o u n dn o i s e ，w i d el i n e a rr a n g ea n ds oo n n o w a d a y s ，t h e t e c h n o l o g yo fc ec o u p l e d 、析me c l ( c e e c l ) h a sb e e np a i dc o n s i d e r a b l ea t t e n t i o n c e - e c li sw i d e l yu s e di nt h es e p a r a t i o na n da n a l y s i so ft r a c ec o m p o n e n t sa n d c o m p l e xs a m p l e s i nt h i ss t u d y , t h ec e - e c lm e t h o dw a sa p p l i e dt oa n a l y z ef o u rm e d i c a m e n t s ， w h i c hw e r ea t o m o x e t i n eh y d r o c h l o r i d e ，l i n c o m y c i nh y d r o c h l o r i d e ，m e t r o n i d a z o l e a n de p h e d d n eh y d r o c h l o r i d e t h e s t u d y o fa t o m o x e t i n eh y d r o c h l o r i d ea n d e p h e d r i n eh y d r o c h l o f i d e 、) r i t l lt h r e ep r o t e i n sw a si n v e s t i g a t e d t h et h r e ep r o t e i n s w e r eb s a ，c y t o c h r o m ec ( c y t - c ) a n dm y o g l o b i n ( m b ) t h em a i nc o n t e n t sa r e d e s c r i b e db l e w ： 1 t h r o u g ht h eo p t i m i z a t i o no fe x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ，t h ec e - e c la n a l y s i s s y s t e mh a sb e e na p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no ft h ea t o m o x e t i n eh y d r o c h l o r i d e t h e o p t i m a lc o n d i t i o n sa l ea sf o l l o w s ：t h ed e t e c t i o np o t e n t i a l a t1 15v ；5m m o l l r u ( b p y ) 3 2 + d i s s o l v e di n7 0 m m o l lo fp h 8 0i n d e t e c t i o nc e l l ；t h ee l e c t r o k i n e t i c i n j e c t i o na t 12k vf o r l0s ；12 5k vs e p a r a t i o nv o l t a g e ；t h er u n n i n gb u f f e rw a s3 0 m m o l ls o d i u mp h o s p h a t eo fp h7 5 i tw a ss u c c e s s f u l l yu s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o n o ft h ec o n c e n t r a t i o no fa t o m o x e t i n eh y d r o c h l o r i d ei na t o m o x e t i n eh y d r o c h l o r i d e c a p s u l e sa n dr a tp l a s m a i tc o u l dp r o v i d ean e wm e t h o do fr e a ls a m p l e sd e t e c t i n gf o r a t o m o x e t i n eh y d r o c h l o r i d e 2 i tw a sf o u n dt h a t ，t h ec e - e c la n a l y s i ss y s t e mc a l lm e e tt h en e e df o rt h e a n a l y s i so fa t o m o x e t i n eh y d r o c h l o r i d e b a s e d o nt h i so b s e r v a t i o n ，c e - e c lw a s a p p i l e dt ot h es t u d yt h ei n t e r a c t i o no f a t o m o x e t i n eh y d r o c h l o r i d ew i t ht h r e ep r o t e i n ， w h i c hw e r eb s a ，c y t o c h r o m ec ( c y t - c ) a n dm y o g l o b i n ( m b ) a n dt h eb i n d i n g i i i a b s t r a c t c o n s t a n t sw e r e9 5 1 x 1 0 3 l m o l 、1 1 5 x 1 0 4 l m o l a n d7 3 8 x 1 0 3 l m o l ，r e s p e c t i v e l y a n dt h eb i n d i n gs i t e sw e r e15 2 3 、10 19a n d17 15 ，r e s p e c t i v e l y 3 am e t h o do f c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) 、) v i t l lt r i s ( 2 ，2 - b i p y r i d y l ) r u t h e n i u m ( i i ) e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ( e c l ) d e t e c t i o n h a sb e e n a p p l i e d t ot h e d e t e r m i n a t i o no f l i n c o m y c i nh y d r o c h l o r i d e i n l i n c o m y c i nh y d r o c h l o r i d e i n j e c t i o n t h ee f f e c t so fd e t e c t i o np o t e n t i a l ，c o n c e n t r a t i o na n da c i d i t yo fp h o s p h a t e b u f f e r , s e p a r a t i o nv o l t a g e ，i n j e c t i o nv o l t a g ea n dt i m e ，c o n c e n t r a t i o na n da c i d i t yo f s e p e r a t i o nb u f f e rw e r ei n v e s t i g a t e d u n d e ro p t m i m z e dc o n d i t i o n s ，t h el i n e a rr a n g e w a $ 5 x10 s - 9 xl0 巧g m l ，t h ed e t e c t i o nl i m i t sw a s1 5 5x10 一g m l ，t h er e c o v e r i e s w e r e b e t w e e n9 9 6 2 a n d10 0 31 4 af a s ta n ds e n s i t i v ea p p p r a c ho f c a p i l l a r ye c l c t r o p h o r e s i s ( c e ) w i t h t r i s ( 2 ，2 - b i p y r i d y l ) r u t h e n i u m ( i i ) e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ( e c l ) d e t e c t i o nh a s b e e na p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fm e t r o n i d a z o l ei nm e t r o n i d a z o l ei n j e c t i o n t h e e f f e c t so fo p t m i m z e dc o n d i t i o n sw e r et h a td e t e c t i o np o t e n t i a la t1 2 0v ，5m m o l l r u ( b p y ) 3 扩a n d6 0m m o l lp h o s p h a t eb u f f e rw i t hp h7 0i nt h ee c lc e l l ，s e p a r a t i o n v o l t a g ea t 15k v , e l e c t r o k i m e t i ci n j e c t i o nv o l t a g ea t10k va n dt i m ef o r10s ，t h e s e p e r a t i o nb u f f e rw a s15m m o l l ( p h7 0 ) s o d i u mp h o s p h a t e u n d e ro p t m i m z e d c o n d i t i o n s ，t h el i n e a rr a n g ew a s8 x 1 0 。8 2 x 1 0 石g m l ( r 2 = 0 9 9 7 ) ，t h ed e t e c t i o nl i m i t s w a s9 7 x10 一g m l t h em e t h o dw a ss u c c e s s f u l l yu s e df o rt h ea n a l y s i so ft h ec o n t e n t o fm e t r o n i d a z o l ei nm e t r o n i d a z o l e i n j e c t i o ns a m p l e s i n t h et w od i f f e r e n t m a n u f a c t u r e r sa n di n i n j e c t i om e t r o n i d a z o l i e tg l u c o s ii no n em a n u f a c t u r e r t h e r e c o v e r i e sw e r eb e t w e e n9 9 01 a n dl0 0 7 5 5 c e e c ld e t e c t i o no fe p h e d r i n eh y d r o c h l o r i d eb a s e do nr u ( b p y ) 3 计w a s p r e s c e n t e d t h ee c li n t e n s i t yw a sl i n e a rw i t ht h ee p h e d r i n eh y d r o c h l o r i d e c o n c e n t r a t i o nr a n g e df r o m6 x10 。3t o6 x10 由g m lu n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s t h e l i m i td e t e c t i o nw a s4 51x10 一g m l ( s n = 3 ) t h i sm e t h o dw a ss u c c e s s f u l l yu t i l i z e d t o e p h e d r i n eh y d r o c h l o r i d et h ed e t e r m i n a t i o ni ne p h e d r i n eh y d r o c h l o r i d ea n d n i t r o f u r a z o n en a s a ld r o p s ，t h er e c o v e r i e sw e r er a n g e df r o m9 6 14 t o10 0 2 9 6 an e wm e t h o df o rt h es t u d yt h ei n t e r a c t i o no fe p h e d r i n eh y d r o c h l o r i d ew i t h t h r e ep r o t e i n ，w h i c hw e r eb s a ，c y t o c h r o m ec ( c y t c ) a n dm y o g l o b i n ( m b ) w a s e s t a b l i s h e db yc e e c l t h eb i n d i n gc o n s t a n tw e r e1 5 5 1 x 1 0 4l m o l 、6 5 8 x 1 0 3 i v a b s t r a c t l t o o la n d1 5 9 x 1 0 4l m o l ，r e s p e c t i v e l y a n dt h eb i n d i n gs i t e sw e r e8 5 2 、1 2 6 0a n d 10 6 6r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ；p r o t e i n s ； i n t e r a c t i o n v 目录 目录 中文摘要i a b s t r a c t 。i i i 第一章绪论1 1 1 毛细管电泳技术l 1 2 电致化学发光技术2 1 3 毛细管电泳一电致化学发光( c e e c l ) 联用技术。3 1 4 药物与蛋白的相互作用8 1 5 本实验所研究药物的药理作用9 1 6 本研究的研究目的及内容1 0 第二章毛细管电泳一电化学发光法测定盐酸托莫西汀11 2 1引言1 1 2 2 实验部分12 2 3 结果与讨论13 2 4 应用分析。2 0 2 5小结2 3 第三章毛细管电泳电化学发光法检测盐酸托莫西汀与三种蛋白 的相互作用2 4 3 1 引言2 4 3 2 实验部分2 4 3 3 结果与讨论2 6 3 4 小结3 0 第四章毛细管电泳电化学发光法测定盐酸林可霉素3 1 v i 目录 4 1 引言31 4 2 实验部分3 2 4 3 结果与讨论3 3 4 4结论4 1 第五章毛细管电泳电化学发光法测定甲硝唑4 2 5 1 引言。4 2 5 2实验部分。4 3 5 3 结果与讨论4 4 5 4 反应机理5 3 5 5结论。5 3 第六章毛细管电泳电化学发光法测定盐酸麻黄碱5 4 6 1 引言5 4 6 2 实验部分5 4 6 3 结果与讨论。5 5 6 4结j 沧。6 3 第七章毛细管电泳电化学发光法检测盐酸麻黄碱与三种蛋白的 相互作用6 5 7 1 引言6 5 7 2 实验部分6 5 7 3 结果与讨论6 6 7 4小结7 0 参考文献71 第八章结语7 3 个人简历8 6 v l l 目录 致谢8 7 v i i i 第一章绪论 第一章绪论 1 1 毛细管电泳技术 1 1 1 毛细管电泳的定义 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 又称高效毛细管电泳( h p c e ) 或毛 细管电分离法( c e s m ) ，是经典的电泳和现代微柱分离技术相结合的产物，包含 了电泳与色谱及其相互交叉的内容，是继高效液相色谱之后分析科学的又一重 大进展。毛细管电泳具有高灵敏度、高效率、高速度、易实现高自动化、所需 进样量少、运行成本低、应用范围广等特点。电泳是电解质中带电粒子在电场 作用下，以不同的速度向电荷相反方向迁移的现象。毛细管电泳是一类以毛细 管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术1 1 1 ，在空芯 的、散热效率很高的、内径( 1 0 - - 2 0 0 | l m ) 微小的毛细管内进行的大、小分子 高效分离技术。因此消除了传统电泳会在电解质离子流中产生自热，引起径向 粘度与速度梯度的弊端，从而避免由于区带展宽而造成的效率减低，使分离分 析科学的检测水平从微升级升级到纳升级，是分离科学领域中最活跃的研究方 向之一。 1 1 2 毛细管电泳的发展历史 毛细管电泳( c e ) 的发展有悠久的历史。1 9 3 7 年瑞典科学家a m et i s e l i u s 【2 1 等首次用电泳法分离人血清中的蛋白。1 9 6 7 年瑞典科学家h j e r t e n l 3 】首先用直径 3 m m 的毛细管在高场强下进行了电泳分离，首次提出毛细管区带电泳( c a p i l l a r y z o n e e l e e t r o p h o r e s i s ，c z e ) 的概念。1 9 7 4 年，v i r t a n e n 【4 i 提出使用细孔毛细管提高 分离效率。1 9 7 9 年，m i k k e r s 5 】等使用直径为2 0 0 岬的聚四氟乙烯管获得了高 效的分离结果。1 9 8 1 年，j o r g e n s o n 和l u k a c s 6 , 7 , s l 使用更细的7 5 微米熔融石英 毛细管，以电迁移的方法进样，使用荧光检测方法，产生了4 x 1 0 5 理论塔板数 的高效率分离，同时探讨了分离机理、高场强和小内径等因素对与分离效率的 影响。n j e r t e n 于1 9 8 3 年后提出了毛细管凝胶电涮9 i 和毛细管等电聚焦法【l o 】， 使之更易于自动化操作，并且提高了电泳分离效率。t e r a b e 等【l l l 于1 9 8 4 年建 立了胶束电动毛细管色谱法( m i c e l l a re l e e t r o k i n e t i c c a p i l l a r y c h r o m a t o g r a p h y , m e k c 或m e c c ) ，使电泳和色谱完美结合，扩大了毛细管电泳 第一章绪论 的应用范围。1 9 8 7 年，c o h e n 和k a r g e r l l 2 】提出了毛细管凝胶电泳。由于c e 的 分离范围较宽，从离子到中性分子、从小分子到生物大分子等，从多肽、蛋白 质、d n a 的分离分析到环境实际样品分析等，因此近几年来在研究的广度和深 度上得到了迅猛的发展，逐步成为各相关学科实验室中一种有力的分析分离手 段【1 3 】。 1 2 电致化学发光技术 1 2 1 电化学发光概述 电化学发光，又称为电致化学发光( e l e c t r o g e n e r a t e dc h e m i l u m i n e s c e n c e 或 e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ，e c l ) ，是由电化学反应引起的化学发光，是化学发 光方法与电化学方法相互结合的产物1 1 4 1 。其过程是在电极上施加一定的电压进 行电化学反应，使电极反应产物之间或电极反应产物与体系中其它组分进行进 一步化学反应，通过发光光谱和强度的测量而对被测物质进行定量的一种分析 方法。它不需要外加激发光源，并且具有化学发光方法的优点，如：灵敏度高、 线性范围宽、背景信号低、观察方便和仪器简单等，同时保留了电化学分析的 优势，如重现性好、控制容易、试剂稳定和化学试剂可以重复使用等。e c l 是 一种痕量分析技术，具有时控性好、线性范围宽、灵敏度高、分析范围广、仪 器操作简单等优点。因此在草酸、葡萄糖、蛋白质、有机胺、药物、核酸、d n a 和其它物质的测定方面都有应用 t 5 , 1 6 j 。 1 2 2 r u ( b p y ) 3 2 + 电致化学发光体系的概述 按照发光试剂的种类，电化学发光体系可以分为以下几类：酰肼类化合 物电致化学发光体系。其代表性化合物是鲁米诺，因体系发光量子产率高、激 发电位低和抗溶液中溶解氧等杂质干扰能力强等，自身特有的优点而倍受到人 们的关注 1 7 , 1 8 j 。吖啶类化合物电致化学发光体系。典型的化合物是吖啶酯体 系( a c r i d i n i u m ，a e ) 和光泽精( 1 u c i g e i n ) 体系。这类发光剂在过氧化氢的稀碱 溶液中即能发光而不需催化剂的存在。过氧化草酸酯电致化学发光体系。此 类化合物有化学发光效率很高，工作p h 范围宽的优点，但缺点是试剂稳定性 和溶解性不理想，受试剂纯度、溶剂的组成、温度等条件的影响较大，因此应 用较少。多环芳香烃类电致化学发光体系。其体系的反应因为大部分要求非 2 第一章绪论 水介质、除杂除氧等条件从而在分析方面的应用受到限制。金属配合物电致 化学发光体系。目前对m o 1 9 1 、r u 2 0 川、r e t 2 2 1 、t b t 2 3 1 、c u 2 4 1 、e u 2 5 1 、c d 2 6 1 和 i r 【z 7 】等金属络合物的电致化学发光进行了研究。 分析化学中研究和应用最为广泛的是钌配合物，尤其是电致化学发光特点 最突出的联钌吡啶r u ( b p y ) 3 2 + 及其衍生物。r u ( b p y ) 3 2 + 电化学发光现象的首次发 现是在19 7 2 年，t o k e l 和b a r d 等【2 8 l 用电化学方法产生了r u ( b p y ) 3 2 + 的激发态。 一般认为r u ( b p y ) 3 2 + 的e c l 是激发态的r u ( b p y ) 3 2 + 产生所致，发光波长大概在 6 1 0n m 左右【2 9 l 。d a n i e l s o n 等【3 0 1 于1 9 8 7 年首先报道了r u ( b p y ) 3 2 + 烷基胺的e c l ， 并指出e c l 强度与胺自身的结构有关。对伯仲叔胺而言，因为它们氨基的第一 级电离化所需能量为伯 仲 叔胺，所以e c l 强度为伯 仲 第三章毛细管电泳一电化学发光法检测盐酸托莫西汀与三种蛋白的相互作用 透析率结果如表3 1 所示。由此结果可以看出，本方法处理样品的透析率 较高，实验提出的处理样品的方法适合于盐酸托莫西汀与蛋白相互作用的样品 处理。 表3 1 盐酸托莫西汀的透析率测定结果( n = 5 ) 3 4 小结 本实验应用毛细管电泳一电致化学发光法研究了盐酸托莫西汀与b s a ， c 弦c 和m b 这三种蛋白的相互作用，建立了一种研究盐酸托莫西汀与蛋白相互 作用的新方法。计算了盐酸托莫西汀与这三种蛋白的结合位点和结合常数，并 且考察了盐酸托莫西汀用微渗透法处理时的透析率，透析率较高，结果真实可 靠。对于临床和代谢动力学方面提供一定的参考意义。 3 0 第四章 盐酸林可 所示，为白色 红霉素相似，对革兰阳性球菌有较高的抗菌活性，特别对厌气菌、金葡菌及肺 炎球菌有高效。其作用机制和红霉素相似，属抑菌剂。主要抑制细菌细胞蛋白 质的合成，临床主要用于敏感菌引起的各种感染，如肺炎、脑膜炎、心内膜炎、 蜂窝织炎、扁桃体炎、丹毒、疖及泌尿系统感染等。由于本药可进入骨组织中， 和骨有特殊亲和力，故特别适用于厌气菌引起的感染及金葡菌性骨髓炎，本品 口服后在胃肠道迅速吸收，不被胃酸破坏；其制剂盐酸林可霉素注射液适应于 敏感葡萄球菌属、链球菌属、肺炎链球菌及厌氧菌所致的呼吸道感染、皮肤软 组织感染、女性生殖道感染和盆腔感染及腹腔感染等，如患者对青霉素过敏或 不宜用青霉素者，本药可用作替代药物。因而，盐酸林可霉素在临床上应用广 泛。 图4 1 盐酸林可霉素的结构 分子式：c i s h 3 4 n 2 0 6 s h c i h 2 0 分子量：4 6 1 0 2 到目前为止，关于盐酸林可霉素的分析检测已经有多种方法，如紫外分光 光度法【1 5 5 】、流动注射化学发光法【1 5 们、微生物测定法1 1 5 7 1 、高效液相色谱法 1 5 8 - 1 6 0 1 等。但是还没有报道用c e e c l 体系测定盐酸林可霉素的分析方法。本 实验的目的就是要建立用c e e c l 体系测定盐酸林可霉素。 毛细管电泳与传统的分离方法比较，显著特点是高效、快速、简单、微量。 与其它检测方法相比，电化学发光检测是一种灵敏的检测方法，具有质量检测 第四章毛细管电泳一电化学发光法测定盐酸林可霉素 限低，仪器简单、选择性好、体积小、价格低廉、操作方便等优点。r u ( p b y ) 3 2 + 具有较好的稳定性，其电化学发光检测模式与毛细管电泳联用是应用较广的一 种检测技术。 本实验开展的目的：把毛细管电泳与r u ( p b y ) 3 2 + 电化学发光检测技术相结 合，建立检测盐酸林可霉素的c e e c l 方法体系，着重提高检测的灵敏度和选 择性，努力应用于实际样品的分离分析检测，并考察该方法的精密度、专属性 及重现性。 4 2 实验部分 4 2 1 仪器与试剂 m p i a 型毛细管电泳电化学发光分析检测系统( 西安瑞迈电子科技有限公 司1 ；x k 9 6 a 快速混匀器( 姜堰市新康医疗器械有限公司) ；雷磁p h 计( 上海 精科) ；k q 1 0 0 e 型超声波清洗仪( 昆山市超声仪器有限公司) ；a l 1 0 4 电子天 平( 梅特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司) ；石英毛细管( 2 5i t mi d 、3 6 5i t m o d 、4 0c m ) ( 河北永年光导纤维厂) 。 盐酸林可霉素原料药( 河南天方药业股份有限公司) ；盐酸林可霉素注射液 ( 上海某制药公司) ；联吡啶钌纯品( 美国a l f aa e s a r 公司) ；磷酸二氢钠( 天 津市化学试剂六厂，分析纯) ；磷酸氢二钠( 中国上海新华化工厂，分析纯) ， n a o h ( 天津市化学试剂三厂，分析纯) ；水森活饮用纯净水( 可口可乐公司) 。 n a o h 用水森活纯净水配置成o 1m m o l l 的溶液，磷酸氢二钠和磷酸二氢钠分 别用水森活纯净水溶解配成1 0 0m m o l l 的储备液，然后根据实验需要依次稀 释。溶液用0 2 2g m 微孔滤膜过滤，于4 储存备用。 4 2 2 仪器操作与毛细管预处理 同第二章。 4 2 3 溶液配置及样品处理 在暗室里称取盐酸林可霉素标准品0 0 1 0 0 0g 于1 0 0 0m l 棕色容量瓶中溶 解后用水森活纯净水定容，溶液用0 2 2g m 微孔滤膜过滤，于4 储存备用。 3 2 第四章毛细管电泳一电化学发光法测定盐酸林可霉素 使用时逐级稀释配制一系列不同浓度的盐酸林可霉素溶液。 随机抽取不同批号的盐酸林可霉素注射液，取标示量为o 3g m l 的盐酸林 可霉素注射液到容量瓶中配成1 5 1 0 # m e ，进一步稀释到1 5 x 1 0 g m l ，并制 备其加标回收：向1 5 x 1 0 。7 咖l 样品中分别加入盐酸林可霉素标准溶液1 2 1 0 刁 g m e 、1 s x l 0 - 7g m l 、1 8 x 1 0 g m l 。 4 2 4 实验方法 光电倍增管的电压设置为+ 8 0 0v 。检测电位为1 1 5v ，采用1 4k v x1 0s 电 驱动进样，分离电压1 2 5k v ，电泳缓冲溶液为1 5m m o l l ( p h6 5 ) 磷酸盐缓冲液， 溶液进入毛细管前需用o 2 2g m 微孔滤膜过滤。反应在体积约为4 0 0i l l 的检测 池中进行，实验前检测池中充满5m m o l l 联吡啶钌溶液和6 0m m o l l 磷酸盐缓 冲液( p h7 0 ) 3 5 0 “l ，3h 后更换新鲜的联吡啶钌和磷酸盐缓冲溶液，以保证实 验的重现性。在样品进入检测池检测后，记录其毛细管电泳谱图。 4 3 结果与讨论 4 3 1 盐酸林可霉素与r u ( b p y ) 3 2 + 的循环伏安特性 分别对3 0m m o l l 、p h 为8 o 的磷酸盐运行缓冲液；检测池中含有5 m m o l lr u ( b p y ) 3 2 + 、7 0m m o l l ( p h7 5 ) 的磷酸盐缓冲液，运行缓冲液3 0m m o l l 、 p h 为8 0 的磷酸盐运行缓冲液；检测池中含有5m m o l lr u ( b p y ) 3 计、7 0 m m o l l ( p h7 5 ) 的磷酸盐缓冲液，运行缓冲液3 0m m o l l 、p h 为8 0 的磷酸盐运 行缓冲液，盐酸林可霉素浓度为9 1 0 击m l 进行循环伏安扫描，记录这三个条 件下的电极电流和e c l 曲线，结果如图4 2 所示。由图中可以看出，曲线2 为 在曲线1 的条件下加入5m m o l lr u ( b p y ) 3 2 + 、7 0m m o l l ( p h7 5 ) 的磷酸盐缓冲 液，电极电流和e c l 强度增加，曲线3 在2 的基础上又加入了9 1 0 击g m l 的盐 酸林可霉素，电极电流和e c l 强度又增高明显，说明是盐酸林可霉素催化 r u ( b p y ) 3 2 + 的电化学发光行为的结果，因此可建立使用c e e c l 法检测盐酸林可 霉素的新方法。 第四章毛细管电泳一电化学发光法测定盐酸林可霉素 o 1o 30 5o to 9l 1l 3 p o t m t i d t t i m ，s 图4 2 循环伏安图( a ) 和e c l 发光曲线图( b ) 检测条件：1 3 0m m ，p h 为8 0 的分离缓冲液；2 条件1 中加入5m m o l lr u ( b p y ) 3 2 + 、7 0 m m o l l ( p h7 5 ) 的磷酸盐缓冲液；3 条件2 中加入9 x1 0 巧g m l 的盐酸林可霉素。扫瞄速率 均为1 0 0 m v s 。 4 3 2 优化检测电位 在c e e c l 体系中，检测电位对盐酸林可霉素e c l 强度影响很大。实验表 明，检测电位在1 0 0 - 1 3 5v 范围