（微生物学专业论文）盐生杜氏藻cbr基因的克隆及其在烟草中的鉴定.pdf

盐生杜氏藻c b r 基因的克隆 及其在烟草中的鉴定 微生物专业 研究生郑鸣指导老师乔代蓉 杜氏藻是一种真核单细胞绿藻，可以在0 1 5 5m o l 几的n a c l 溶液中 生存。杜氏藻之所以能耐受盐逆境与其细胞内具有一套独特的渗透压调节机 制和b 一胡罗卜素合成途径有关。为了从基因水平上研究其耐盐机制，本实 验室利用传统的同源克隆的方法成功克隆到盐生杜氏藻c b r 基因并将其转入 模式植物烟草中为下一步功能研究打下了实验基础。本实验研究的主要内 容包括：1 利用同源克隆的方法从盐生杜氏藻中顺利克隆到一条2 5 0 b p 的 c d n a 片段，测序分析发现其同nb a r d w a i 的c b r 基因有6 7 0 9 6 的同源性， 然后以该片段为基础，利用r a c e 技术构建了其全长序列；2 对盐生杜氏藻 进行渗透震扰3 h 、6 h 、1 2 h 、2 4 h 、4 8 h ，然后利用半定量r t p c r 技术分析了 渗透震扰对c b r 基因表达的影响，结果发现高渗和低渗震扰对c b r 基因表达 的影响明显不同：3 构建中间载体p c a m b i a 2 3 0 i g ，再用它和c b r 构建了可在 植物中高效表达c b r 的载体p c a m b i a 2 3 0 i g c b r ，并将该质粒导入根癌农杆菌 ( a g r 0 6 a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) e l l a l 0 5 中；4 叶盘法转化烟草 ( 肘c o t i a n a t a b a c u m ) 。烟草叶盘经农杆菌浸染后，在含卡那霉素的惦。诱 导培养基上生长，4 周左右再生大量丛生芽，6 周左右丛生芽在m s 。培养基中 生根，生根率达到7 0 左右，最后将p c r 检测的阳性苗成功移栽到蛭石：沙 ( i ：1 ) 的培养介质中培养；5 对转基因苗进行分子生物学检测，包括p c r 、 s o u t h e r n 杂交和r t p c r ，结果显示有2 7 的再生苗为p c r 阳性，对p c r 检测 阳性苗进行s o u t h e r n 杂交分析，发现c b r 基因已整合入烟草的基因基因组 中，部分p c r 阳性苗s o u t h e r n 杂交结果却是阴性。随后的r t p c r 分析结果 显示，所选的三棵阳性苗均能扩增出相应条带说明c b r 基因已经转录生成 m r n a 。 关键词：同源克隆 g 6 ，r a c e转基因烟草 叶盘转化s o u t h e r n 杂交 r t p c r c l o n i n ga n dt r a n s g e n i ct o b a c c oi d e n t i f i c a t i o n o fc b rf r o md u n a l i e l l as a l i n a m a j o rm i c r o b i o l o g y g r a d u a t es t u d e n tz h e n gm i n g t u t o r q i a od a i _ r o n g d u n a l f e l l a 8 a l i n a e n k a r y o t i cu n i c e l l u l a rg r e e na l g a e ，a b l et o p r o l i f e r a t eu n d e rs a l i n ec o n d i t i o n sr a n g i n g f r o m0 1t o5 5m o l ln a c i t h er e a s o no ft h es a l tt o l e r a n c ew a s t h a tt h e r ew a sad o v e l o s m o r e g u l a t i o nm e c h a n i s ma nan o v e lc a r o t e n o i db i o s y n t h e t i cp a t h w a y i n 口s a l i n ai no r d e rt os t u d yt h es a l tt o l e r a n c em e c h a n is ma tt h e g e n el e v e l ，o u rl a b o r a t o r ys u c c e s s f u l l y c l o n e dt h eg e n ec b r ( 一c a r o t e n e b i o s y n t h e s i sr _ e l a t e d ) f r o mn s a i i n ab yt h et r a d i t i o n a l h o m o g e n e c l o n i n gm e t h o d t h e n ，t h eo r fo ft h ec b r w a so b t a i n e db yr t p c ra n d w a si n t r o d u c e di n t ot o b a c c of o rs t u d y i n gt h eg e n ef u n c t i o n b yt h e r a c e t e c h n i q u e ，t h ef u l l i e n g t h c d n a o fc b rw a ss u c c e s s f u 儿y c o n s t r u c t e di nd s a l i n a w ea n a l y z e dt h ee f f e c t so fo s m o t i cs h o c ko n c h e g e n ee x p r e s s i o n o fc b rb y u s i n g s e n s i t i r e s e m i q u a n t i t a t i v e r t - p c r 1 u s i n gt h et r a d i t i o n a lh o m o g e n ee i o n i n gm e t h o d ，w ee l o n e dac d n a f r a g m e n to ft h ec s rf r o md s a n n a t h er e s u l to fd n as e q u e n c i n g i n d i c a t e dt h a t6 7 0 9 6o ft h e s e q u e n c eo ft h ef r a g m e n t w a s h o m o l o g o u st ot h ec b ri nn b a r d w a i 7 t h e n ，t h ef u l l l e n g t hc d n a o fc b rw a sc o n s t r u c t e db yt h er a c e t e c h n i q u eb a s e do n t h i s s e q u e n c e 2 口s a l i n aw a st r e a t e dw i t hh y p o o s m o t i cs h o c k ( n a c i1 5 m o l l 3 - - 0 5 m o l l ) a n dh y p e r o s m o t i cs h o c k ( n a c l1 5 m o l l - - 3 m o l l ) f o r 3 h ，6 h ，1 2 h ，2 4 h ，4 8 h i no r d e rt oa n a l y z et h ee f f e c t so fv a r i o u s o s m o t i cs h o c k so nt h eg e n ee x p r e s s i o no fc b r , s e m i - q u a n t i t a t i v e r t p c rw a sp e r f o r m e dw i t ha ni n n e rs t a n d a r do f2 3 sr n af r o m ns a l i n a t h er e s u l ts h o w e dt h a t h y p o o s m o t i cs h o c k a n d h y p e r o s m o t i es h o c kh a do b v i o u s l yd i f f e r e n te f f e c t so nt h eg e n e e x p r e s s i o no fc b r , r e s p e c t i v e l y 3 f i r s t l y ，t h ev e c t o rp c a m b i a 2 3 0 i gw i t ht w og u sr e p o r t e rg e n e sw a s c o n s t r u c t e d t h e no n e g u sw a s s u b s t i t u t e dw i t ht h e c o d i n g s e q u e n c eo fc b ro b t a i n e db yr t p c r ，a n dp c a m b i a 2 3 0 i g - c b rw a s c o n s t r u c t e d f i n a l l yt h ep i a 2 3 0 i g c b rw a si n t r o d u c e di n t o a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n su s i n gt h ef r e e z e t h a wm e t h o d 4 a f t e ri n f e c t e db ya t u m e 角c i e n st h el e a fd i s c so ft o b a c c ow e r e s e l e c t e do np l a t e sc o n t a i n i n g si n d u c e m e n tm e d i u ms u p p i e m e n t e d w i t h7 5 m g lk a n a m y c i n r e g e n e r a t e dp l a n t sw e r e t r a n s p l a n t e d i n t ov e r m i c u l i t e ：s a n d ( 1 ：1 ) m e d i u m 5 t h e r e g e n e r a t e dp l a n t s w e r ei d e n t i f i e d b yp c r s o u t h e r nb l o t a n a l y s i sa n dr t - p c r p c ra n a l y s i ss h o w e dt h a ta p p r o x i m a t e2 7 t e s t e dp l a n t sp r o d u c e dt h et a r g e tb a n d af e wo ft h ep l a n t s p r o d u c e dt h eb a n di n t h es o u t h e r nb l o ta n a l y s i s t h r e ep l a n t s w e r es e l e c t e dr a n d o m l yf o rr t p c ra n a l y s i s t h et a r g e tb a n dw a s a m p l i f i e di na l l t h et h r e ep l a n t s k e y w o r d ：h o m o g e n ec l o n i n gc b r ( t a r o t e n eb i o s y n t h e s i sr e l a t e d ) r a c e ( _ r a p i d 纳p l i f i c a t i o no f c d n a e n d ) t r a n s g e n i ct o b a c c o l e a fd i s c st r a n s f o r m a t i o ns o u t h e r nb l o tr t - p c r t 盐生杜氏藻c 打基因的克隆 及其在烟草中的鉴定 月i j吾 土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的一个非常重要的非生物胁迫 因素。如何利用太面积的盐碱地提高作物的耐盐性是生物科学的一个重要 研究课题。随着分子生物学技术的发展，一些先进的研究手段，如d n a 微点 阵分析，定点克隆，m r n a 差异显示、s a g e 等，用于克隆植物耐盐相关基因， 研究植物耐盐机制。目前，该领域的研究热点主要是利用模式生物酵母和拟 南芥进行耐盐的遗传突变分析，进而分离、克隆耐盐基因，而自然界中存在 的盐生生物，如杜氏藻等，可以在高盐环境下正常生长，许多学者相信这些 盐生生物中蕴含有可用于基因工程改良农作物的耐盐基因。 杜氏藻( z l a n a l i e l l a ) 是一种单细胞真核绿藻，属于真绿藻纲、团藻 目、杜氏藻科。它广泛分布于世界各地的盐湖和海洋可在0 1 j 5m o l 几 的n a c i 溶液中生存并能适应外界盐浓度的剧烈变化“。3 ，除了对高盐浓度的 适应外，杜氏藻属的所有种还能适应许多其它方面的逆境，如大范围的温度 变化，高静水压，高强光照射，某些杀虫剂及重金属铜、汞、铅、镉等o ”。 这在植物中是绝无仅有的它是目前发现的唯一能进行渗透压调节的真核光 合生物，其简单的结构和独特的耐盐机制引起人们极大的关注，它已成为植 物抗逆基因组学研究的模式生物”1 。 在盐胁迫和其他一些逆境下光合生物会产生大量的活性氧( 包括过氧 化物自由基、羟基自由基、过氧化氢) ，它们就会靠近蛋白质、脂质和核酸 等组成细胞的重要组份，并对他们进行强烈的破坏，特别是对叶绿体具有较 大的损伤作用，这对于光合生物来说是致命的，因此，能否有效清除体内的 活性氧自由基成为决定植物能否在逆境条件下生存的一个重要因素。杜氏藻 5 属的各个种均能适应许多逆境，主要是其细胞体内有一套独特的渗透压调节 机制和b 一胡罗h 素合成途径“。同其他光台生物一样，杜氏藻有个大的叶 绿体，并能合成类胡萝 素，有些杜氏藻，如丑b a r d w a i l ，能积累相当于 细胞干重1 0 的b 一类胡萝p 素，在强光、高盐、营养饥饿等环境下还能超表 达b 一类胡萝h 素。1 ”，作为光合色素的辅助色素类胡萝h 素在生物体内担 当重要角色，他们能同相关蛋白质结合成复合物，淬灭机体内反应活性很高 的自由基，保护光系统使光合作用得以顺利进行，这是杜氏藻能耐受许多 逆境的先决条件。 近年来，借助于生化分析、经典遗传学和近年来分子生物学的研究，目 前已经基本搞清楚高等植物类胡萝h 素生物合成的主要途径，并陆续分离鉴 定了一系列关键酶的基因，但对杜氏藻类胡萝h 素的生成机制则研究较少。 1 9 9 0 年，l e r s 等人”成功地从口b a r d w a i l 中克隆一条类胡萝h 素合成相关 基因，即c b r ( _ c a r o t e n e b i o s y n t h e s i s t e a t e d ) 基因，该基因的丰度同0 一类胡萝h 素的表达量成正相关性，进一步的研究显示c b r 与高等植物的早 期光诱导蛋白( e l i p s ，_ e a r l y 国 删p d b r o t e i n ) 高度同源，而且与 叶绿素a 、b 结合蛋白( c a b s 。助 o r o p h y l l a b - b i n d i n g 量r o t e i n s ) 结构 相似”，同属于c a b 蛋白家族“。e 1 i p s 是由核基因编码的叶绿体蛋白， 1 9 8 4 年，m e y e r 和k l o p p s t e c h 等人首次从绿化处理2 4 小时后的黄化苗中 分离到p 扫基因“”，随后g r i 珊n 及其同事亦从绿化处理的黄化苗中分离到 该基因“。过去很长一段时间，研究者认为e j 咖基因仅在植物叶绿体发育 早期瞬时表达，保护叶绿体免受光的损伤，促使其正常发育。但髓着已经的 逐步深入，研究者发现不仅仅在叶绿体发育早期，而且在强光等逆境条件下， 成熟的绿色组织中亦表达产生e l i p s “、”1 ，同时还发现在植物叶片发育阶 段e 如基因的表达受昼夜节律的调控“”。这些研究结果的取得以及 口b a r d w a i lc b r 基因的表达同类胡萝h 素生成之间协同激活关系的发现，无 疑为阐明e l i p 基因的功能提供了重要线索：c b r e 1 i p s 作为一种色素载体在 叶绿体发育早期或在各种胁迫条件下，同叶绿素a 或叶黄素结合成复合物， 有效清除光合系统的活性氧自由基，保护光合系统免受损伤。目前，对于c b r 基因表达同类胡萝卜素形成之间的协同激活、类胡萝卜素的形成同叶绿体发 6 育之间共调节的机制以及c b r 基因同叶绿体发育之间的关系等问题尚须深入 研究。 本实验室多年来一直从事植物抗逆方面的研究工作，盐生杜氏藻以其独 特的抗逆机制吸引着全世界众多学者的目光。为了从分子水平上研究其耐盐 机制以及盐胁迫条件下叶绿体的发育，本实验室根据口b a r d w a i tc b r 基因 及其同源基因e j 功设计简并引物，利用传统的同源克隆技术成功地克隆到 口s a l i n a 的c b r 基因。为进一步研究该基因的功能，以p c a 尬i a 2 3 0 1 为骨架 构建植物表达载体，以根癌农杆菌为介导，利用叶盘转化法成功地将c b r 基 因转入模式植物烟草中转基因烟草的再生为下一步功能研究提供了材料。 论文 第一章、盐生杜氏藻c b r 基因的克隆 首先对其他物种c b r e 印基因的同源序列进行相似性分析，设计一对 简并引物，利用t r - p c r 技术获得一2 5 0 b p 的片段，经克隆测序分析发现其 同口b a r d w a i 的c b r 基因有6 7 0 的同源性，然后再以此片段为模板设计引 物，通过r a c e 技术构建盐生杜氏藻c b r 基因的全长序列。 1 材料与方法 1 1 材料 11 1 实验用藻种、工程菌和克隆载体 杜氏盐藻由本实验室保存的盐生杜氏藻( 口s a l i n a ) ，克隆用宿主菌为 大肠杆菌j m l 0 9 克隆载体为t a 克隆载体( 购自t a k a r a 公司) 。 1 1 2 实验用试剂盒、工具酶和其它试剂 5 一r a c e 试剂盒和反转录酶购自c l o n t e c h 公司，3 一r a c e 试剂盒、a q 酶和d n am a r k e r 购自t a k a r a 公司，胶回收试剂盒购自华舜公司，t r i z o l 试剂购自i n v i t r o g e n 公司，其他试剂均为分析纯试剂。 1 1 3 引物和测序 实验中所用的引物( 见表1 ) 的合成以及克隆的测序均由上海生物工程 公司完成。 1 2 方法 1 2 1 盐生杜氏藻培养 1 0 接种量在2 8 c 士l c 和1 6 8 光照黑暗的环境中培养培养液成 分参照文“6 ”3 的方法略作修改 1 2 2 盐生杜氏藻总r m 的提取 离心收集培养至生长期的盐生杜氏藻细胞1 1 0 7 个，加入i m l t r i z o l 试 剂，按照使用说明操作来分离总r n a ，并增加用乙酸铵乙醇来沉淀总r n a 。 提取的总r n a 经1 非变性琼脂耱凝胶电泳和2 6 0 n m 2 8 0 n m 的紫外波长范围 内的扫描来分析其质量。 1 2 3 盐生杜氏藻甜厂基因部分c d n a 片段的克隆 取盐生杜氏藻总r n a 进行反转录，反转录体系各组分按反转录酶的使 用说明添加，反轷录条件为7 2 水浴2 m i n ，冰上急冷2 m i n ，4 2 反应1 2 h r 。 反转录后对其进行p c r 分析，p c r 引物为兼并引物，p c r 体系各组分按“t a q 酶的使用说明添加，p c r 条件为9 4 预变性i m i n ，9 4 变性3 0 s e c ，5 5 。c 退 火5 0 s e c ，7 2 延伸2 m i n ，3 5 个循环。p c r 反应液经1 琼脂糖( 0 5 t b e ) 凝胶电泳分离，用胶回收试剂盒回收目的片段，回收的目的片段用t a 克隆 载体进行连接转化大肠杆菌j m l 0 9 ，挑选阳性克隆子测序。 12 4 盐生杜氏藻曲r 基因全长c d n a 的构建 1 ) 3 末端的克隆 3 r a c e 反应按t a k a r a3 r a c e 试剂盒的说明进行，完成后用1 琼脂 糖( o 5 x t b e ) 凝胶电泳分离，回收目的片段，克隆、测序。 2 ) 5 末端的克隆 5 r a c e 反应参照c l o n t e c h5 f a c e 试剂盒的说明并略作改进，完成 后用1 琼脂糖( 0 5 x t b e ) 凝胶电泳分离，回收目的片段，克隆、测序。 3 ) c b r 基因全长o d n a 的构建及开放读框的获得 利用v e c t n t i 软件包对c b r 基因的3 末端和5 末端序列结果进行拼 接，获得全长c d n a ，对其进行o r f 分析，并在o f r 的两端设计对引物进行 r t p c r ，从而获得c b r 基因的o r f 。 2 结果 2 1 盐生杜氏藻总r n a 的质量分析 由图1 i 可以看出，t r i z o l 试剂提出的盐生杜氏藻总r n a 在电泳条件下 看不见有基因组d n a 和蛋白质的污染，2 3 s 核糖体f l n a 与1 8 s 核糖体r n a 的 带型比较清晰，无拖尾现象两条带的亮度比基本上呈2 ：1 的关系，由此 g 表1 1 实验用引物序列 引物 序列 上游引物 5 一a a ( t c ) g g n c g n c t n g c n a t g 一3 i 简并引物 下游引物 5 一n c c ( a g t ) a t c a t n g c ( g a ) a a n c t 一3 3 r a c e 引物5 一c t a t g c t g g g a t 丁t g t g g c 卜3 r a c e 引物 5 r a c e 引物 5 一c c a g g g a t g c t a g g g t g a a t 一3 s e n s ep r l m e r5 一c g g g a t c c a c a a g t t t c t c t a g t t t g c a c a a g g 一3 o r f 引物 a n t i s e n s ep r i m e r 5 一c g a g c t c c a g g a a c a a a t c a a a t g g c t t g c 一3 ( 注：n 代表a t i g c ) 表1 2 总r n a 的紫外分析结果 图i 1 总r n a 电泳结果 m ：n a r k e r 1 ：盐藻总r n a 1 0 圉1 2 盐藻c 6 ，基因的r t - p c r 结果 ：m a r k e r 1 ：目的片断 图13 盐藻曲，基因3 r a c e 图1 4 盐藻曲，基因5 r a c e 图1 5 盐藻c b r 基因的o r f 说明此r n a 完整性比较好。为了进一步确定此r n a 的质量，还对其进行了 2 2 0 n m 3 2 0 n m 的紫外波长范围内进行扫描( 表1 2 ) ，2 6 0 2 3 0 2 0 0 ，2 6 0 2 8 0 在l _ 9 0 2 0 0 之间，表明r n a 的纯度很高，不存在蛋白质、多糖和酚类的 污染。 2 2 盐生杜氏藻曲厂基因部分c d n a 片段的克隆 利用r t p c r 技术，成功地获得一条约2 5 0 b p 的片段，如图1 2 测序分 析显示其同nb a r d w a i l 的c b r 基因有6 7 o 的相似性。 2 3 盐生杜氏藻c 6 厂基因全长c d n a 的构建 通过3 、 5 r a c e 技术分别克隆了盐生杜氏藻c b r 基因的3 、 5 末端片段，如图1 3 和图1 4 测序后利用v e c t n t i 软件包对c b r 基因的3 末端和5 末端序列进行拼接获得一条1 0 2 6 b p ，并成功利用r t p c r 技术获得 c b r 的o r f ，如图1 5 。 3 讨论 3 1 盐生杜氏藻总r n a 的提取 高质量的r n a 既要求尽可能保持r n a 的完整性，同时又要求诸如e d t a 、 s d s 等反转录酶抑制剂的含量尽可能的少，因此，如何获得高质量的r n a 是 分子生物学研究的关键。t r i z o l 试剂是目前应用最广的总r n a 抽提试剂，能 够应用于各种生物总r n a 的提取，但本实验室利用t r i z o l 提取盐生杜氏藻 总r n a 时却遇到麻烦，出现很严重的基因组d n a 和蛋白质的污染，而且酚类 污染也很严重。针对以上问题，本实验室特增加了乙酸铵乙醇来沉淀总r n a ， 并取得了良好的效果，完全可以运用于r t p c r 、r a c e 等实验，如图1 1 和 表1 2 。 3 2 盐生杜氏藻c o t 基因部分c o n a 片段的克隆 在强光照、高盐、营养饥饿等逆境条件下，光和生物会产生大量自由基， 从而损伤光合系统，这对于光和生物来说是致命的。c b r e l i p 则在光合单位 的天线系统与玉米黄素结合成光保护复合物，能有效的抑制自由基的产生， 因而c b r e l i p 对于光合生物来说具有重要意义，同时也是一种进化相对缓 慢的蛋白质。分析口b a r d a w i 的c b r 及拟南芥、大麦、豌豆等高等植物的 e li p s 发现，c b r e l i p s 同c a b s 在结构上具有高度的相似性，都有一个结合 叶绿素a 、b 的保守结构域，这就为盐生杜氏藻c 打基因的同源克隆创造的 条件。根据保守结构域内的两段氨基酸序列( n g r l a m 和r f a m i g ) ，设计了 一简并引物，长度均为1 8 b p 。经r t p c r 扩增，得到一条约2 5 0 b p 的特异扩 增带，与所设计的两条引物间的距离相吻合，克隆测序分析发现其同 z 2 b a r d a w f 7 的c 打基因具有6 7 0 9 b 的同源性，结果表明这样一条克隆路线是 可行的。 3 3 盐生杜氏藻c b r 基因全长e d n a 的构建 筛选文库和r a c e ( _ r a p i da m p l i f i c a t i o no fc _ _ d n ae n d ) 是两种常用的获 得全长c d n a 的方法，但相对于筛选文库，r a c e 具有简便、快捷、廉价等优 点，是目前普遍采用的克隆全长c d n a 的技术。c l o n t e c h 公司发明的 s m a r t r a c e 专利技术借助于其公司独特的s m a r t 寡核苷酸引物和逆转录 酶反转录后获得完整的5 和3 末端的c d n a ，然后再利用合成的第一链 e d n a 为模板直接进行r a c e 反应，这样 末端，同时又避免了连接接头的问题， 段。为了增加r a c e 的特异性，根据1 不仅能方便快捷克隆基因的5 和3 现已成为克隆全长基因的一项有效手 2 3 步克隆的c d n a 片段又从新设计了 一对特异引物，利用r a c e 试剂盒分别进行5 和3 r a c e 反应，在进行 5 r a c e 时，考虑到引物t m 值的大小，故相应的降低了p c r 的退火温度。两 次r a c e 结果经克隆测序后，利用v e c t n t i 软件包对其进行拼接，从而成功 地构建盐生杜氏藻c 打基因全长c d n a 。序列分析发现，这一全长c d n a 包含 一个长为5 7 3 b p 的o r f ，翻译产生一条1 9 0 个氨基酸的蛋白质，与口施，幽j 的c b r 具有4 5 7 的相似性。为了方便以后的功能鉴定及转基因表达研究， 在o r f 两端设计一对引物并在引物的两端加上限制性酶切位点，利用 r t p c r 技术，获得了包含盐生杜氏藻c 打基因编码区的一段序列。 杜氏藻是一种极端耐盐的真核绿藻，是较好的研究耐盐机制的模型，而 口s a j i n a0 6 ，基因的克隆，为研究盐胁迫条件下杜氏藻叶绿体的发育及光合 作用的特性提供了条件，同时也为耐盐机制的研究打下了坚实的基础。 第二章 渗透震扰对盐生杜氏藻c b r 基因表达的影响 低渗、高渗震扰对盐生杜氏藻对c b r 基因的表达有一定程度的影响，本 文采用2 3 s 核糖体r n a 基因作为内标，利用半定量r t p c r 的方法研究了低 渗、高渗震扰对盐生杜氏藻对c 打基因的表达丰度变化。 1 材料和方法 1 1 材料 、 1 1 1 实验用藻种 杜氏盐藻由本实验室保存的盐生杜氏藻( 口s a j i n a ) 。 1 1 2 实验用试剂盒、工具酶和其它试剂 总r n a 提取试剂盒购自华舜公司；p o w e r s c r i p tr e v e r s et r a n s c r i p t a s e 购自c l o n t e c h 公司：r n a s ei n h i b i t a r 购自a m b i o n 公司；“t a q 酶和d n a m a r k e r 购自t a k a r a 公司，其他试剂均为分析纯试剂， 1 1 3 引物合成 实验中所用的引物( 见表2 1 ) 均由上海生物工程公司合成。 表2 1 实验用引物 引物序列 上游引物 5 - c c c g t g t c a g t t g c c g a a g c - 3 目的片段 下游引物 5 一t 0 盯c 下r r g a a c a g a g c a g t c e c 一3 上游引物5 一怵a g t 黜a c g g 丸 a t c a 一3 内标片段 下游引物 5 - c a c t t t 从t g g g c g a a c a g c 一3 1 2 方法 1 4 1 2 1 盐生杜氏藻的低渗、高渗震扰培养 低渗培养基：n a c l0 5 m o l l 正常培养基：n a c ll _ 5 m o l l 高渗培养基：n a c i3 o m o l l 其余成分均相同。 培养条件均为2 8 。c 士l 和1 6 8 光照黑暗的环境中培养，低渗、高 渗震扰时间分别为3 h 、6 h 、1 2 h 、2 4 h 、4 8 h 。 1 2 2 盐生杜氏藻总r n a 的提取 分别离一e l 收集震扰培养后的盐生杜氏藻细胞1 1 0 7 个，然后按r n a 提取 试剂盒的操作说明来提取总r n a ，之后，再进行非变性凝胶电泳和紫外扫描 检测总r n a 的质量。 1 2 3e d n a 的台成 1 ) 、取2 9 9 总r n a ，加入i g lr a n d o mp r i m e r s ( 1 6 0 州) 并用水补足4 肛l ， 混匀后简单离心收集至管底： 2 ) 、7 0 水浴5 分钟后立即置于冰上冷却2 分钟以使r n a 充分变性： 3 ) 、依次加入下列试剂： 0 5 me n a s ei n h i b i t o r 2 o m5 xf i r s t - s t a n db u f f e r 1 5 md d t ( 2 0 r a m ) l _ o nd n t pn i x ( 1 0 l l l m ) 1 o g l p o w e r s c r i p tr e v e r s et r a n s c r i d t a s e 1 0 扯lt o t a lv o l u m e 混匀后简单离心收集液体至管底； 4 ) 、在p c r 仪中4 2 反应1 5 h ，合成c d n a 第一链； 5 ) 、加入1 0 0 斗i 的t eb u f f e r ( p h 8 0 ) ，并于7 2 温浴7 分钟； 6 ) 、加入0 5 p i r n a s e ( 1 0 m g l ) 3 7 温浴3 0 分钟： 7 ) 、合成好的e d n a 第一链保存于一2 0 ，以备之后的p c r 用。 1 2 4 半定量r t p o r 以正常条件下盐生杜氏藻的e d n a 进行2 倍系列稀释后作为模板，特异扩 增内标片段：以正常条件下盐生杜氏藻的c d n a 作为模板扩增目的片段和内 标片段，进行循环数梯度变化：以各种条件下盐生杜氏藻的c d n a 作为模扳 分别扩增目的片段和内标片段，p c r 完成后取等量的目的片段和内标片段扩 增液经1 琼脂糖( o 5 t b e ) 凝胶电泳分离，e b 染色后置于紫外下观察。 2 结果 2 1 总r n a 的提取 提取的盐生杜氏藻总r n a 在非变性凝胶电泳条件下能观察到很清晰的两 条带，无拖尾，亦看不见明显的基因组和蛋白质污染，如图2 1 ，其2 2 0 n m 3 2 0 n m 的紫外波长范围内进行扫描结果显示，2 6 0 2 3 0 2 0 0 2 6 0 2 8 0 = 1 8 5 2 0 5 之间，表明此总r n a 基本上没有蛋白质、多糖和酚类的 污染，而且完整性很好，可以用作反转录的模板。 2 2 半定量r t p b r 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，清晰可见相应的c b r3 2 4 b p 和2 3 s 核 糖体r n a 基因2 7 6 b p 的片段，如图2 5 。 3 讨论 3 1 内标的选择 目前，有多种方法可以定量检测基因的差异表达，传统方法如r n a s e 保 护试验、s l 核酸酶处理试验、n o r t h e r n 狭线印迹等，虽然技术比较成熟， 但由于操作复杂，需要的起始样本多，且敏感度低而受到一些研究者的冷落， 近年来发展起来的d n a 微阵列等新技术则受到一些研究者们的亲睐，但因价 格昂贵和技术的不完善限制了其广泛应用。相比于以上技术，半定量r t p c r 技术敏感性高操作简单而得到许多研究者们的好感。报道较多的半定量 r t p c r 研究结果一般采用g a p d h 或b a c t i n 基因作内标o “”1 ，这一实验设 计的基础在于g a p d h 或b a c t i n 基因在生理或病理条件下组成型表达，因此 计的基础在于g a p d h 或b - a c t i n 基因在生理或病理条件下组成型表达，因此 可用其他基因相对于g a p d h 或b a c t i n 基因表达水平的改变来反应生理或 病理条件对该基因表达水平的影响。但考虑到盐生杜氏藻g a p d h 或b a c t i n 基因的表达受外界环境的影响，不能作为内标使用，故选择了盐生杜氏藻 2 3 s r i n a 基因作为本实验的内标。为了避免因c 打基因m r n a 的丰度与2 3 s r r n a 基因m r n a 的丰度相差太大而导致共扩增时c b r 基因扩增产物太少，电泳后 看不到特异条带的现象，本文采用分别进行扩增，然后取等量扩增液混合后 电泳的方法。 图2 1 盐藻总r n a 电泳图2 2p c i i 循环数梯度对目的片段扩增的影响 m ：m a r k e r ，1 ，2 3 ：盐藻总r n am ：m a r k e r ，i - 4 ：p c r 循环数1 5 、2 0 、2 5 、3 0 图2 3p o r 循环数梯度对内标片段扩增的影响图2 4 稀释模板对内标片段扩增的影响 m ：m a r k e r ，1 - 4 ：循环数1 0 、1 5 、2 0 、2 5m ：m a r k e r ，1 - 7 ：模板稀释1 6 、3 2 、6 4 、 1 2 8 、2 5 6 、5 1 2 、1 0 2 4 倍 3 2 循环数的确定 从理论上讲，p c r 反应每个循环的产物均成为下个循环的底物，扩增产 物早期呈指数增长形式，产物的多少与初始模板的浓度成正比，这是半定量 r t p c r 的理论基础。为了说明这个问题，我们以正常条件下盐生杜氏藻的 c d n a 进行2 倍系列稀释后作为模板特异扩增内标片段，如图2 4 所示随 着模板浓度的降低，扩增产物的量越来越少。由此可以看出初始模板的浓度 对p c r 终产物的影响。但在p c r 反应的后期随引物、底物的消耗，酶活力 的下降等p c r 扩增逐渐进入平台期此时，扩增产物的量不再随循环数的 增加而增加。为了准确反映低渗、高渗震扰对盐生杜氏藻c b r 基因表达的影 响，我们以正常条件下盐生杜氏藻的c d n a 作为模扳扩增目的片段和内标片 段，进行循环数梯度变化，以确定目的片段和内标片段p c r 扩增的指数期， 如图2 ，2 和2 3 所示，目的片段的p c r 扩增在3 0 个循环时还没有达到平台 期而内标片段在2 5 个循环时就基本上达到了平台期。参照这结果，我们 在进行半定量r t p c r 时，扩增目的片段和内标片段的循环数分别采用2 5 和 2 0 个循环。 圈2 5 渗透震扰对盐生杜氏藻曲r 基因的影响 m a r k e r ，1 ；1 , q l o l ln a c i 2 - 6 ：0 5 - 儿n a c l 分别培养3 、6 、1 2 、2 4 、4 8 小时，7 - i l ：3 0 l c 1 分别培养3 、6 、1 2 、2 4 、柏小时 3 3 低渗、高渗震扰对盐生杜氏藻c b r 基因的影响 盐胁迫条件下，光合生物如何适应环境的变化顺利进行光合作用为机体 提供能量是耐盐机制研究的一部分利用半定量r t p c r 监测c b r 基因在低 渗、高渗震扰下表达差异将为盐生杜氏藻耐盐机制的研究提供实验基础。从 实验结果可以看出，低渗、高渗震扰对盐生杜氏藻c b r 基因表达的影响明显 不同。相对于正常条件而言，高渗震扰对c h r 基囡表达起正调控作用，而低 渗震扰则在前1 2 小时有轻微的负调控，1 2 小时后基本上趋同于正常条件下 c b r 基因的表达。文献报道，杜氏藻属具有一条独特的类胡萝p 素生物合成 途径，这是其耐受许多逆境的基础。l e t s 等人发现口b a r d w a i ic b r 基因的 表达丰度同b 一类胡萝p 素合成成正相关性，d s a l i l - 1 8 虽然不象口b a r d w a i l 那样超表达类胡萝h 素，但高渗震扰对光合系统的损伤必然伴随着类胡萝h 素合成量的适当增加，这可能是高渗震扰正调控c b r 基因表达的内在原因。 低渗震扰对盐生杜氏藻光合系统的损伤显然不如高渗震扰大，但由于外界环 境的突然改变，细胞重建离子平衡需要一段时间，这导致c b r 基因表达短暂 下调。1 2 小时后细胞生长趋于正常，c b r 基因的表达也恢复到正常水平。 这一实验结果同l e r s 等人的研究结果相吻合。 第三章 盐生杜氏藻c b r 基因农杆菌表达载体的构建 在植物基因转化方法的选择上，本文采用农杆菌转化系统，在表达载体 构建中，以载体p c a m b i a 2 3 0 1 为骨架引入p b i l 2 1 中的g u s 基因，构建了简 便、实用的中间载体p c a m b i a 2 3 0 1 g 。并将其中的一个g u s 基因用目的片段 c b r 替换，构建了可以在植物中高效表达的载体p c a m b i a 2 3 0 i g - c b r , 成功地 将其转入根癌农杆菌e i i a l 0 5 中，为下一步进行转基因植物的研究作准备。 1 材料和方法 1 1 材料 1 1 1 菌株和质粒 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 脚卯、根癌农杆菌( a g r o b a c t e m u m t u m e f a c i e n s ) e l l a l 0 5 和植物表达载体p b l l 2 1 、p c a m b i a 2 3 0 1 均由本实验室 保存。 1 1 2 酶与试剂盒 各种限制酶、t 4 d n a 连接酶、叮a qd n a 聚合酶均购自b i o l a b 、r o c h e 和 t a k a r a 公司；质粒抽提和胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。 1 1 3 引物及测序 引物合成及测序工作由上海生工生物工程公司完成。 1 1 4 试剂 细菌培养基、质粒抽提的各种试剂及各种抗生素贮存液均按分子克隆 实验指南上的方法配制。 1 2 方法 1 2 1 载体p c a m b i a