（应用化学专业论文）微生物降解法处理工业含油废水的研究.pdf

硕士学位论文摘要 摘要 本文针对钢铁冷轧厂含油废水的生物降解效益难于提高的难题， 进行了优势降解菌株的筛选、纯化、驯化以及含油废水降解等系列实 验。 经过培养、筛选及驯化等步骤，从含油废水的活性污泥中得到6 株以石油烃为唯一碳源的菌株。通过对这六株菌株进行初步的降解试 验，进一步筛选出h 1 菌株，经鉴定确定为假单胞菌属。 通过生长特性研究表明，h 。的最适生长环境为：温度4 0 、p h 9 、 无机盐体积浓度2 。而且对菌株生长的影响程度依次减小。 通过含油废水的生物降解条件实验表明，h 。降解的最适条件为： p h 7 ，温度为3 0 4 0 ，培养时间为4 0 h ，菌体接种量为每l o o m l 废水中投加2 o m l 菌液，c n 比值为3 ：1 ，摇床转速为1 6 0 r m i n 。h ， 对含油废水的降解率比市混合菌高出2 0 ，由此证明h 。菌株为高效降 解菌株。 通过降解动力学的研究表明，h ，对含油废水的降解遵循m o n o d 动力学方程，其降解动力学方程式为y = o 1 3 3 6 s 0 8 8 3 + 8 ) 。 该研究对含油废水生物降解性价比的提高，提供了重要的技术参 数和有效的研究方法。 关键词含油废水，生物降解，细菌，除油率 硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t i no r d e rt or a i s et h ee f f i c i e n c yo fb i o d e g r a d a t i o no fo i l i n e s sw a s t e w a t e ri nt h es t e e la n di r o nc o l d - r o l l i n gm i l l ，s e r i e se x p e r i m e n t sa b o u t s c r e e n , p u r i f i c a t i o n , d o m e s t i c a t i o no fs u p e r i o r i t yd e g r a d a t i o nb a c t e r i u m w e r ec a r r i e do n s i xb a c t e r i a ls t r a i n sw e r eo b t a i n e df r o ma c t i v a t e ds l u d g eo fo i l n e s s w a s t ew a t e ra f t e rs e r i e s e x p e r i m e n t s a b o u ts c r e e n ，p u r i f i c a t i o na n d d o m e s t i c a t i o n t h e s es i xb a c t e r i a ls t r a i n st a k et h ep e t r o l e u mh y d r o c a r b o n a st h eo n l yc a r b o ns o u r c e b a c t e r i a ls t r a i nh i ，w h i c hw a sa p p r a i s a l e da s p s e u d o m o n a ss p ，w a sf u r t h e rs c r e e n e da f t e rd e g r a d a t i o ne x p e r i m e n t so n t h e s es i xb a c t e r i a ls t r a i n s t h eg r o w t hc h a r a c t e r i s t i cr e s e a r c hi n d i c a t et h a t t h em o s ts u i t a b l eh a b i t a to fh ii s ：t e m p e r a t u r e4 0 ，p h 9 ，i n o r g a n i cs a l t v o l u m ec o n c e n t r a t i o n2 m o r e o v e rt h ei n f l u e n c eo nt h es t r a i n sr e d u c e s i n t u m 1 1 1 eb i o d e g r a d a t i o nc o n d i t i o ne x p e r i m e n t so fo i lw a s t ew a t e rw e r e t o o ko n r e s u l t so ft e s t ss h o wt h a tu n d e rt h eo p e r a t i n gc o n d i t i o n so f p h = 7 , t e m p e m t u r e = 3 0 * c 4 0 。c ，i n c u b a t i n gt i m e = 4 0 h ，q u a n t i t y o f i n o c u l a t i o n = 2 0 m lb a c t e r i u mi ne v e r ylo o m lw a s t ew a t e r , s p r o u t i n g f a c t o ri sn e c e s s a r y , a n dt h er a t i oo fc a r b o nt on i t r o g e ni s3 ：1 ，t h et a b l e r o t a t i o n a l s p e e d i s1 6 0 r m i n t h e e f f i c i e n c y o fo i l d e g r a d a t i n go f b a c t e r i u mh ti sp r i o r i t yt h a nt h a to fo ns a l e t h i sp r o v e st h a tb a c t e r i u mh i i st h eh i g h - e f f i c i e n c yo i l d e g r a d a t i n gb a c t e r i u m t h er e s u l t so fd y n a m i cr e s e a r c hs h o wt h a th 1f c i l l o wt h em o n o d d y n a m i ce q u a t i o n t h ed y n a m i c se q u a t i o n o f d e g r a d a t i o n i s ，= 0 1 3 3 6 s 0 8 8 3 + s ) t l l i sr e s e a r c hh a sp r o v i d e dt h ei m p o r t a n tt e c h n i c a lp a r a m e t e ra n dt h e e f f e c t i v er e s e a r c ht e c h n i q u e st ot h es t u d yo fo i lw a s t ew a t e r k e yw o r d so i lw a s t ew a t e r ，b i o d e g r a d a t i o n ，b a c t e r i u m ，o i l e d d e g r a d a t i o nr a t e i i 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名：! 五星琴日期：三生l 年月堕日 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位 论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论 文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 日期：且4 ej - , 目堕日 硕士学位论文第一章绪论 第一章绪论 1 1 含油废水的来源及危害 1 1 1 含油废水的来源 含油废水的来源广泛，主要是石油工业的采油、炼油、贮油及运输石油化工 部门排出的大量含油废水“1 。此外，交通运输在洗涮油罐和油舱过程中，也产生 相当数量的含油废水，机械工业、食品工业、纺织与轻工业等的废水中，皆含有 大量的油类污染物。卅。随着工农业、服务业的发展，油及其制品在工业、农业、 城市、农村的广泛使用，对环境的污染范围也越来越广。目前，我国七大水系中 珠江、海河、松花江的主要污染物都包括油类“1 。水体中石油烃不但可来自石油 开采、运输、炼制和使用等过程中的人为污染，还可来自水体中较高级生物的分 解，栖息在海洋中的植物生产出多种多样的烃。由于生物活动每年进入海洋的烃 类估计有3 0 0 万吨，与直接进入海洋环境的石油烃大致相当。大气中的烃也可随 降雨进入水体。我国每年有6 0 多万吨原油进入环境，污土壤、地下水、河流和海 洋，已成为海洋污染的第二大污染源”。 1 1 2 含油废水的危害 油类污染对人类、动物和植物乃至整个生态系统都产生不良的影响“”。油 污染被公认为是继农药污染之后，人类所面临的又一大公害。例如，漂浮于水体 表面的油影响空气一水体界面上氧的交换。据调查，一滴油流入水面后可形成 0 2 5 m 2 的油膜。2 0 0 0 l 油在1 0 d , 时左右即可在水面扩展成2 0 0 0 m z ，0 2 n m 厚的油膜。 形成的油膜隔绝空气，阻碍水体的复氧，阻隔了水体中氧的来源。 宾馆、酒店等餐饮业的含油脂废水若未经处理直接排入城市生活污水处理装 置。其中的油类物质包裹在填料外层使氧的传递受阻，导致好氧微生物代谢紊乱， 影响处理效果，有可能使处理系统崩溃”1 。有时油脂会在管道中凝聚，有可能就 会发生堵塞。从而在厌氧的环境下厌氧菌分解产生气体，严重的就会发生爆炸。 在美国就曾经发生过由于油脂堵塞生活污水管网而引起的爆炸事件。事实上油类 物质对环境的影响是多方面的：对江河湖泊地表水的污染、对土壤及地下水的污 染等。在受污染地区，大批的鱼类和珍稀的动物因窒息或皮肤受油类污染而死亡。 对生活在江河湖泊附近的居民来说，油对地表水的污染触目惊心。油污染不仅影 响水体的水质，而且对工农业生产及日常生活用水都会造成影响，极少量的油就 硕士学位论文 第一章绪论 会使水不适于灌溉和牧畜饮用；在油污水体中所有的水生生物都会受影响：油类 污染还降低水体的自净能力，影响水源沿岸的环境卫生；油类在土壤中向下迁移， 就可能造成严重的地下水污染，使本来己经短缺的水资源雪上加霜，从而严重影 响人类的生存环境。 含漓废水中的油类主要就是成分复杂的烃，园而石油烃的危害，更加剧了含 油废水的危害。 石油烃中含有多种有毒的物质，其毒性按烷烃、烯烃和芳香烃的顺序逐渐增 加，现已确定，具有致癌、致畸、致突变潜在性的化学物质中，有许多就是石油 开采，石油制品中所含有的物质。石油烃进入环境后，将对动植物、水生生物、 人类及生态环境产生直接的严重危害。石浊烃使水体中植物体内的叶绿素及其他 脂溶性色素在植物体外或细胞外溶解析出，使之无法进行光合作用而大量死亡， 破坏水体生态系统的平衡。当水中石油烃浓度为0 o l m g l 时，鱼类会在一天内 出现油臭而降低食用价值；浓度为2 0 0 m g l 时，鱼类不能生存。石油烃对强碱， 强酸和氧化剂都有很强的稳定性，可以在水体中残存较长时间并被水生生物吸 收，富集而进入食物链。石油烃进入人体，能溶解细胞膜，干扰酶系统。引起肝， 肾等内脏发生病变，危害人体健康。石油烃不但对环境造成直接危害，而且还具 有破坏生物的正常生活环境的作用。漂浮于水体表面的油影响空气一水体界面上 氧的交换。同时，水体中的溶解油和浮化油在被水中好氧微生物氧化分解的过程 中，也消耗了水中的溶解氧。上述两种因素的共同作用会使水体中的c 0 2 浓度增 加，p h 值下降，致使鸟类和水生生物丧失生存条件。另一方面，微生物在分解 油类过程中形成多种有毒物质，这些物质危害水生生物，使水生生物发生畸变并 通过食物链进入人体。因石油污染而死亡的大量生物，经厌氧分解所形成的未求 知物及石油烃中的多环芳烃有可能诱发赤潮。据报道，1 9 8 7 年我国南海曾因此 发生两次赤潮现象。 在进入环境的石油污染物中，由于突发事件引起的污染往往引起公众的严重 关注，如1 9 8 9 年美国阿拉斯加海岸遭受5 0 0 0 吨原油泄漏的污染，影响j i u l 6 6 8 公里 的海岸环境“”；1 9 9 1 年海湾战争期间，大量的原油泄漏，对波斯湾沿岸海域造 成严重污染“”。综上，石油污染对生态系统可能造成毁灭性的破坏，对人体健康 也造成潜在的危害。 1 2 含油废水的治理技术 在废水治理中所涉及的含油废水，其中的油主要是指液态或低熔点的石油制 品，它是一种成分复杂的烃类混合物。含油废水的处理需要根据其物理的及化学 的性质决定其处理方法“，常用的方法有： 2 硕士学位论文第一章绪论 ( 1 ) 物理处理法 ( 1 ) 重力分离法 依靠油水比重差进行重力分离是含油废水治理的关键，主要用来去除水中悬 浮态的油。重力分离的常用设备是隔油池。在平流式隔油池的基础上，发展了斜 板、波纹等除油装置。国内外学者就用“浅池原理”与“聚结技术”成功研制了 高效油水分离器和高效过滤器，填补了该领域的空白。 ( 2 ) 粗粒化法 利用油水两相对聚结材料的亲和力不同将油水分离，主要用于去除水中的分 散油和乳化油。其原理是使含油废水通过粗粒化材料，使其中的细小油粒聚结成 较大的油滴，从而加大上浮速度。从材料的性质来看，许多研究者认为材质表面 的亲油疏水性是主要的，而且亲油材料与油的接触角就小于7 0 。“”。 ( 3 ) 过滤法 过滤是将废水通过设有孔眼的装置或流过由某种介质组成的滤层，使废水中 的油得以去除。这种方法需要在一定的工作时间后进行反冲洗，以避免凝结油穿 透滤层而影响除油效果。在低渗透油藏水处理技术研究中，国外目前采用常规采 油污水处理流程辅以精细过滤技术，使处理后的采出水达到低渗透油藏要求。目 前国外使用较好的预滤器有美国p w t 公司和h y d r o m a t i o n 公司生产的核桃过滤器； 美国c - e n a t c o 公司设计制造的双向高速过滤器。 ( 4 ) 离心分离法 离心分离是使装有废水的容器高速旋转，形成离心力场，因污染物和污水的 质量不同，受到的离心力也不同。含油废水经离心分离后，油集中在中心部位， 而废水则集中在靠外侧的器壁上，这样就达到了油水分离的目的口水力旋流技术 在近几年也开始兴起。我国胜利油田、塔里木油田和南海流花油田都有水力旋流 器在运转。美国开发的k a e m e r 和v o r t o i l 含油废水处理系统，也以旋流器为主体 设备“”1 。 ( 5 ) 吸附法 吸附法处理含油废水是利用吸附剂的多孔性及巨大的比表面积，将废水中的 微量油吸附在固体表面，使废水得到净化。活性炭、沸石、二氧化硅、硅藻土、 膨润土、煤粉、泥炭等可用作吸附剂去除乳化油和溶解油“。其中活性炭处理 含油废水的效果最好，它不仅对油有很好的吸附性能，而且能同时有效地吸附废 水中的其他有机物，但吸附容量有限，且成本高，再生困难，一般只用于含油废 水的深度处理。 ( 2 ) 化学处理法 含油废水的化学治理方法主要用于治理废水中不能单独用物理方法或生物 硕士学位论文第一章绪论 方法去除的一部分胶体和溶解性物质，特别是乳化油。化学破乳法破乳“”的方法 主要有盐析法、凝聚法、棍合法、p h 值调节法。马红竹等人研究采用实验室合成 的z - 1 0 多功能药剂及配套的方法，对含油污水进行综合治理，使絮凝、阻垢、防 腐和杀菌过程一步完成，简化了污水处理工艺，降低了处理费用。 ( 3 ) 生物化学法 生物法与物理或化学方法相比较具有成本低，投资小，效率高，无二次污染 等特点【1 9 - 2 2 1 。生物利用微生物使部分有机物作为营养物质被吸收转化成为微生物 体内的有机成分或增殖成新的微生物，其余部分被微生物氧化分解成简单的无机 或有机物。如c 0 2 ，h 2 0 ，c h 4 等，从而使废水得到净化。该法从微生物对氧的 需求上可分为厌氧生物处理和好氧生物处理，从过程形式上可分为活性污泥法、 氧化塘法和生物膜法。而且经过人们的不断努力，生物法在形式是己发展为多种 多样【z 3 2 9 j 。 厌氧生物处理技术是处理有机污染和废水的有效手段，以其投资少、能耗低、 可回收利用沼气能源、负荷高、产泥少、耐冲击负荷等诸多优点。2 0 世纪7 0 年 代以来。废水厌氧处理技术得到较快的发展，并出现了一批以升流式厌氧污泥床 反应器( u a s b ) 为代表的能滞留大量微生物固体的第二代厌氧反应器技术。国内 p l a t t i n g 肉类加工厂油脂废水采用l a r a n 工艺进行处理，在h r t 为3 8 d 时， c o d c ，去除率9 2 1 3 0 l ，。但这些技术在某些方面还存在一定的问题，而且人们对 参与这一过程的微生物的研究和认识不足，致使该技术与好氧生物处理技术相比 发展缓慢。 活性污泥法技术包括絮凝、连续循环的微生物生长以及在有氧条件下的微生 物与废水接触等过程，是依靠连续循环适应废水环境的微生物来实现的。通常起 作用的微生物是一些能降解有机物的好氧厌氧型细菌的混合菌群。这种技术在 2 0 世纪初的英国取得专利并得到不断发展和改进，其改进大多为在不同负荷下 保证好氧条件。为了提高传氧能力，人们发明了不同的曝气方式，有逐步曝气、 加速曝气、延时曝气、纯氧曝气、富氧曝气和深层曝气等。活住污泥工艺运用于 含油废水的处理已被许多国家的炼油厂做采用，处理效果一般比普通生物滤池 高，运行费用低，但管理水平要求高。 氧化塘法是能够提供有机物好氧分解和厌氧分解的大型浅池，塘内有大量好 氧、厌氧微生物和藻类。氧化塘一般采用水面自然复氧和藻类光合作用复氧，其 运行情况随温度和季节的变化丽变化。氧化塘要求污求能够静止停留几天到几个 月，占地较多。 生物膜法中，好氧微生物附着生长在固体载体( 或填料) 表面，形成胶质相 连的生物膜。在处理过程中，废水中的有机物和溶解氧为生物膜所吸附，有机物 4 硕士学位论文第一章绪论 不断分解除去，同时，生物膜本身也不断新陈代谢。生物膜法中的微生物是在载 体的表面或载体孔隙的内部，由于生物膜的吸附作用，在其表面上会附着一层薄 水层，水层内的有机物被生物膜中的微生物吸附，空气中的氧气也通过水层进入 生物膜。膜内的微生物在氧的参与下将有机物进一步分解，使得水层中的有机物 浓度大大低于流动水层，在传质推动力的作用下，流动层中的有机物不断向附着 水层转移，从而使流动水层在整体流动过程中，逐步得到净化。在反应过程中， 随着微生物不断增殖，生物膜的厚度不断增加，当水层中溶解氧被膜表层的微生 物所耗尽时，会在生物膜内层滋生出大量厌氧微生物，造成内层好氧微生物不断 死亡、解体，降低生物膜与载体表面的豁附力，同时厌氧微生物代谢产生的c 0 2 ， h 2 s , n h 3 , c 池等气体溢出时也会对生物膜在载体的表面的附着状况产生负面影 响，从而使过厚的生物膜在本身重力及废水流动力的作用下脱落下来，生物膜上 的线虫等的蠕动也会使生物膜松动、脱落。在膜脱落后的载体表面，又会开始新 的生物膜的形成过程，这就是生物膜的正常的更新过程。在生物膜法处理中，采 用的反应器可划分为固定床和流化床两类。自1 8 7 1 年英国伯明翰建起首座生物 滤池，生物膜本身得到长足的发展。常用的方法有生物滤池、生物转盘、生物接 触氧化和生物流化床等工艺。 一般含油( 脂) 的生物处理是在二级处理或三级处理阶段，但将含油( 脂) 废水直接生物处理也在进行研究，并引起了人们的重视。金梁【3 ”、谢思琴【3 2 】等 从含油污泥中，筛选出能以2 0 # 机械润滑油为唯一碳源的3 株石油降解菌株，经 鉴定分别为动胶菌属( z o o g l o e as p ) ，氮单胞菌属( ( a z o m o n a ss p ) 和假单胞菌属 ( p s c u d o m o n a s s p ) 。通过对其降解能力的测试，以动胶菌d 2 菌株对2 0 * 机油的降 解能力最强：在含油浓度为5 0 0 - b 0 0 m g l 的摇瓶实验中，其除油率为2 0 8 - 2 5 。 利用动胶菌d 2 菌株进行生物接触氧化法处理含油废水模拟实验，在实验室条件 下，废水中含油浓度4 2 4 1 4 3 2 m g l ，经过试验运行，出水中油浓度己降至o 2 0 m g l ，除油率达9 7 以上，水质达到国家二级排放标准。黄钧等u 川从油脂化工 废水处理装置中分离得到3 株分解脂肪酸和脂肪胺的功能菌，其中f a 一菌株对 c 1 8 烯酸和c 1 8 伯胺作用4 8 h 的降解率分别为8 0 8 、8 2 3 ，3 株细菌分别归类于 葡萄球菌属( s t a p h p l a c o c c u s ) 和棒状菌群。s h i r a ik a t s u h i s a 等 3 4 1 从m i z u s h i m a 海湾 被石油污染的海水中分离出一株除油能力较强的酵母菌( c a r a d i d as p m 2 3 - 2 ) 0 慎 义勇等t 3 5 1 从4 种活性污泥中驯化分离了1 2 种菌，考查了它们对含高浓度植物类 油脂污水的降解能力，各菌种7 2 h 内对l l 油脂配水的去除率都接近或超过8 0 ， 特别是编号为g s h - 1 ，g s h - 2 ，g s h - 3 的3 种菌的油脂去除率分别达到9 4 2 9 2 9 ，9 2 5 。并选用高效降解菌g s h 1 进行了相关影响条件试验，结果表明 在适宜条件下该菌在3 0 h 内对餐厅实际含油污水c 0 d 。的去除率达8 6 。黄志 硕士学位论文第一章绪论 立等 3 6 1 从某餐馆排污渠污泥中分离到1 0 株油脂降解菌，以植物油脂花生油为唯 一碳源，通过适应性培养驯化并检测细菌生长的o d 值筛选出1 株优势菌。在 确定其最佳生长环境条件的基础上，分别以花生油、餐斤污水和种含有油脂的 膜为对象污染物，进行了优势菌的降解试验。结果表明，该菌对花生油溶液中油 脂和c o d 。的去除率在2 4 h 以内分别达到9 8 9 l 和9 7 2 7 。另外，该优势菌对 油脂膜也有良好降解效果。试验证实了该菌对植物油脂、含油腊污水和固体油脂 废弃物有良好的净化效果。另外石油开采和炼制过程中产生的油泄漏，脂加工过 程中产生的含脂废物以及饮食业产生的废物，也可以用不同来源的脂酶进行有效 的处理。然而目前含油废水直接生物处理大多处于实验室研究阶段。 1 3 微生物降解技术 微生物降解技术是指用从自然界筛选出的菌属或通过基因组合诱变技术得 到的菌属来去除某种或某类有害物质的方法。 1 3 1 微生物降解技术的优点 微生物降解方法具有以下优点： ( 1 ) 处理费用低 微生物处理技术是所有处理技术中最便宜，其费用约为焚烧处理费用的 1 3 1 4 。8 0 年代以来，采用这一技术处理每立方码( 相当于0 ，7 6 5 立方米) 的 土壤需7 5 2 0 0 美元，而采焚烧或填埋处理需2 0 0 8 0 0 美元。 ( 2 ) 对环境影响小 生物处理只是一个自然过程的强化，其最终产物是c 0 2 、水和脂肪酸等，不 会形成二次污染或导致污染的转移。微生物降解或转化有机污染物的巨大潜能， 被b e i j e r i n k 概括为。微生物的绝对可靠性”和“微生物降解的必然性”理论。”。 ( 3 ) 应用范围广 首先它是治理大面积污染区域的一种廉价实用的方法，同时在其他技术难 以使用的场所，如受污染土壤位于建筑物或公路下面不能挖掘或搬出时，可以采 用就地生物处理技术。另外，这一技术还可以同时处理受污染的土壤和地下水， 因而其应用范围有其独到的优势。 1 3 2 微生物降解技术作用原理： 菌种与污染物间的作用有以下几点： 6 硕士学位论文 第一章绪论 ( 1 ) 直接作用 通过驯化、筛选、诱变、基因重组等技术得到以目标降解物为主要碳源和能 源的微生物。比如微生物降解油脂过程中，微生物先产生表面活性物质，将油乳 化分散，形成悬浮于水中的微小油滴，在表面活性物质的作用下，微生物细胞壁 与油滴的界面张力降低，菌株吸附在油滴表面，形成由微生物一油滴一水( 溶有表 面活性物质) 组成的稳定的系统，然后油滴中的油可能通过进入菌体被吸收或积 累。 ( 2 ) 共代谢作用 多酶或多种微生物参与的共代谢机制是指对化合物的生物降解通常是分多 步进行的，在这个过程中包括了多种酶和多种微生物，一种酶或微生物的产物可 以成为另一种酶或微生物的底物。如在甲烷、芳香烃、氨、异戊二烯和丙烷为主 要基质生长的一些菌可以产生一种氧和酶，这种酶可以共代谢三氯烯。 ( 3 ) 酶的诱导 难降解有机物的降解过程实际是一系列的酶催化反应，有许多种酶的参与。 其中许多酶属于诱导酶。研究人员通过对铜绿假单胞菌种烷烃代谢途径的研究， 已经确定短链烷烃的微生物氧化作用是可以诱导的，并且在烷烃上生长可以同时 诱导相应的酶、醛和脂肪酸的氧化降解活力。一种目标物的加入，微生物能够同 时或几乎同时诱导几种酶的合成。诱导酶的产生是有机污染物可以彻底降解的关 键。 ( 4 ) 遗传物质转移作用 同种或不同种微生物之间的遗传物质的转移，增加了微生物代谢的多样性， 也使一些新的性状能够在微生物群落之间转移。微生物对难降解有机物的降解能 力也可以随着微生物降解基因在环境中的扩散而逐渐增强。一些研究者认为遗传 物质在微生物种群间的转移使微和物对难降解有机物适应并利用( 微生物的驯化 过程) 的一种主机机制啪1 。 1 4 微生物降解技术在含油废水污染治理中的发展方向 为了将微生物治理含油废水技术发展成为可靠且成熟的技术，研究工作者正 在进行积极探索，目前这一领域的研究工作主要集中于以下几个方面： ( 1 ) 营养物质的添加 石油中的烃类是微生物可以利用的大量碳底物，但它只能提供碳源而不能提 供氮和其他无机营养物，有些研究者发现加入氮和磷酸盐能直接而明显地促进受 污染土壤中石油的生物降解作用。 ( 2 ) 氧和温度的控制 7 硕士学位论文第一章绪论 油类物质的主要降解途径都需要单( 双) 加氧酶和分子氧的参与。理论上，每 克石油烃的降解平均需3 2 克氧。虽然在厌氧条件下，部分石油烃也可发生加氢、 水合而降解，但其降解速率较低。因此，在缺氧条件下，氧可能成为严重抑制微 生物降解的主要因素。 温度可直接影响微生物的活性，一般烃降解菌都为中温菌，现在已从很宽的 温度范围( 7 0 ) 分离到烃利用微生物。此外，温度还影响到污染物的存 在状态，温度较低时，长链烷烃和多环芳烃均以固态存在，溶解度极小，乳化程 度低，限制了微生物的降解。 ( 3 ) 同生菌群的作用 研究发现，混合培养菌群的降解效果明显优于单株培养菌，这种具有协同降 解作用的微生物群体称为同生菌群( c o n s o r t i a ) 。但目前对于具有协同关系的 菌株的筛选和组合还是一个随机的过程，缺乏有效的理论指导，其协同作用机制 有待进一步研究。实际上已经有一些生物修复公司从污染的土壤和地下水或化工 厂处理的废水中筛选出同生菌群。例如i o t r o l 公司( c h a s k a ) 使用明尼苏达大 学的专利技术，用以黄杆菌( f l a v o b a c t e r i u m ) 为主的同生菌群作为强化菌剂， 成功地处理p c p 污染的土壤。另一方面，随着这一技术在生物降解中的应用研 究的深入，人们不再满足于传统的反应模式，开始引入一些新兴的生物工程技术， 使这一领域的研究更加活跃。 ( 4 ) 基因工程菌的开发 美国学者a m c h a r k r a b a r t y 率先利用基因工程技术。他在研究中发现细 菌的降解基因位于质粒上，基于这一发现，他开发一菌多基因，这一新型菌能同 时降解四种油组分，在几小时内能把原油中约2 3 的烃类消耗，其突出优点是比 自然菌降解速度快，效率高。2 0 世纪8 0 年代以来，越来越多的研究者在环保领 域展开基因工程菌的开发，同时关于这种基因工程菌的生态安全性的争议也随之 产生。 ( 5 ) 油类物质可降解性及降解途径的研究 一方面从有机化合物本身的化学组成和结构上研究其影响生物降解的内在 原因，另一方面研究有机物在各种微生物作用下的降解机理和途径，总结各种类 型有机物生物降解难易的规律性，预测有机物及其不完全降解产物在环境中的滞 留情况及其毒性，以便从政策上控制污染物的排放，同时开发更有效的生物降解 技术，把有害物质在环境中的滞留量减到最小。许多微生物具有不同的生长要求 和不同的生理特性。这一切仍未被充分认识，而降解途径的生化分析也仅仅是一 个开端。因此，目前人们对生物降解的认识还很肤浅。对于烃类的生物降解方面 已有研究结果表明，链烷烃、单环烷烃及苯能被有效地降解，而环烷烃和芳烃常 硕士学位论文第一章绪论 常滞留，对这类物质的强化降解目前仍在研究当中。 ( 6 ) 降解含油废水的微生物研究 有关石油污染物的微生物降解研究长期以来一直是环境微生物学的热点。许 多微生物都能降解石油污染物，已报道有7 0 多属，2 0 0 多种微生物。在水生生 态系统中，细菌和酵母是主要的石油烃降解菌。按照扶水中分离微生物出现的频 率多少，分别有假单胞菌、无色杆菌、节杆菌、微球菌，诺卡氏菌、弧菌、不动 杆菌、短杆菌、棒杆菌、黄杆菌、放线菌、芽抱杆菌、球衣菌、产碱菌、假丝酵 母、红酵母等口土壤中的烃氧化菌主要为真菌，包括青霉、小克银汉霉、轮枝抱 霉、白僵菌、假丝酵母、红冬抱酵母、红酵母、丝抱酵母等。土壤中的烃分解细 菌主要为节杆菌和假单胞菌。一些蓝细菌和藻类也有降解石油烃的能力。环境中 的自然微生物群落通常种群较多，数量较少，一旦受到石油污染物污染后，形成 的微生物群落是受石油污染物选择的群落，此时，能够以石油污染物为碳源和能 源快速生长的微生物种群得以大量繁殖，形成种群少，数量多的特点。 高效降解菌的获得主要有两个途径1 ： ( 1 ) 自然界筛选 对于自然界固有的化合物，一般都能找到相应的降解菌种。但对于人类工业 合成的一些化合物，它们的结构不易被自然界固有的微生物酶系识别，需要用目 标污染物来驯化、诱导产生相应的酶系，筛选得到高效菌种，这种方法耗时长。 硎。从自然界筛选菌种的过程多以目标物为单一及至来驯化而后分离得到的。一 般筛选的过程为： 选择环境一分离适应性菌株选择降解菌株选择高效菌株。 一 ( 2 ) 构造基因降解菌 当从自然界筛选的菌株对污染物的降解效果达不到要求时，可以借助现代分 子生物技术，将一些特性性基因转移以微生物体内，构造基因降解菌。降解质粒 的发现，特别是质粒转移和基因工程构建特殊细菌的成功，有有机化合物的生物 降解开拓了广阔的前景。c h a k r a b a y t y ”3 率先利用基因工程技术把降解萘、甲苯、 辛烷和樟脑的四种质粒组合在一起，构成新的细菌，具有降解脂肪烃、芳烃、萜 和多环芳烃的多种功能。这种超级细菌降解石油的速度快，在几小时内能降解掉 海上溢油的三分之二。 构造基因降解菌的方法有三个：降解性质粒d n a 的体外重组。它综合采 用了生物化学和微生物学的现代技术和手段，在细胞体外对生物大分子遗传物质 进行剪切和加工，将不同亲本的d n a 重新连接，转移到受体细胞中，使细胞获得 新的性状。质粒分子育种是在有选择压力的条件下，在恒化器内长期混合培 养改造菌株的过程。原生质体融合技术基于微生物间的共生和互生的关系发展 9 硕士学位论文第一章绪论 起来的。 1 5 本课题研究的来源、意义及内容 1 5 1 本课题研究的来源及意义 湖南华菱钢铁集团有限责任公司是1 9 9 7 年底由湖南三大钢铁企业一湘钢、 涟钢、衡钢联合组建的大型企业集团，作为省属国有企业，由省国资委授权经营。 集团下辖湘潭钢铁集团有限公司、涟源钢铁集团有限公司、湖南衡阳钢管( 集团) 有限公司等十余家直接或间接控股的子公司。公司钢的生产能力进入全国8 强行 列。资产总额、销售收入、利税总额三项主要经济指标连续多年进入全国重点工 业企业1 0 0 强。 涟钢冷轧车间生产各种冷轧产品过程中需要大量水冲洗钢材和设备，从而也 产生废水和废液。冷轧废水种类繁多，冷轧车间由于废水来源不同，按照其性质 以及处理方式，主要把它分为含油废水，含铬废水以及酸碱废水，不同类型的废 水需要分流处理并回收其中的有效成分。 其中冷轧含油废水主要来自轧机机组、磨辊间和带钢脱脂机组以及各机组的 油库排水，其成分复杂，一般以三种状态存在于水中：悬浮油、溶解油、乳化油。 现在工厂是采用破乳刮油、超滤、生物降解、絮凝沉淀、核桃壳过滤器过滤等系 统处理进行含油废水治理。其工艺流程复杂，设备庞大。含油废水处理工艺流程 图如下： h n 嘎蒸气 蒸气r 。； 谥骤蓝卜臣婴卜臣寸毋 陌丽两磊n 酉画而丽订dj h c l j!一 中间p h 调节池 营养盐 曝气生物菌种l 磊；卅t 生物t 降解池 特殊添加剂 h c l l 1 一 i 污泥浓缩池 纛蔷磊f h 两丽丽千巾嘲南 图卜1 含油废水处理系统工艺流程图 1 0 蠹 硕士学位论文 第一章绪论 图中生物降解池中所使用的生物菌种及其营养盐是向专门机构购买而来，花 费昂贵，但由于供方所售菌种不具明显的针对性等原因，处理效果并不尽人意。 车间的未达国家排放标准的含油废水如果直接排入水体，因其表层的油膜会阻碍 氧气溶入水中，从而致使水中缺氧、生物死亡、发出恶臭、严重污染环境。因此， 冷轧含油废水处理系统已成为该工厂效益的瓶颈，引起厂方的高度重视。猎获高 效环境污染物降解菌是研究开发生物技术处理污染物的基础，也是其产业化的核 心和关键。 从上面工艺流程图亦可以看出，生物法在处理油脂废水中只是作为二级或三 级处理工艺。但从长远、根本意义来看，应采用生物法进行彻底治理。可以说生 物法是解决环境污染问题的一种最有效、最安全和最合理的方法。因为只有微生 物才是地球生态系统最重要的分解者，也是开发潜力最大、人类最宝贵的资源库。 而虽然有报道了许多环境污染物的高效降解菌的基础研究，但无论是数量还是质 量，或是高效菌种的应用技术都远远跟不上实际的需要。目前市场上已有一些不 同来源的处理油脂废水的微生物产品，主要是美国和日本的产品，如美国 g r e e n ，i e l db i o t e c h 公司的6 r e a s e - k i l l 等。它们虽宣称功能强劲，但一方面 要对这些产品仔细考察，另一方面迫切需要加快我们自己的微生物的开发和产业 化。因此，得到以油及其降解物为碳源和能源，并且目标物分解过程时间短、 效率高的微生物菌株至关重要。鉴于此，本研究通过大量的实验研究工作，以期 得到较为理想的降解油脂类物质的微生物。 1 5 2 本课题研究内容 ( 1 ) 从钢铁冷轧厂含油活性污泥中筛选、驯化出能有效降解油类物质的菌株。 并以优势降解菌为研究对象。 ( 2 ) 通过菌落和菌体形态观察及生理生化试验，对优势降解菌株进行初步鉴 定。研究该菌株生长特性，掌握其适宜的生长条件。 ( 3 ) 对菌株进行降解性能研究，掌握其高效降解的外部条件。 ( 4 ) 探索了菌株降解动力学，并创建降解动力学的数学模型。 硕士学位论文第二章高效降解菌的选育 2 1 前言 第二章高效降解菌的选育 筛选出能高效降解油脂的微生物是本课题的目的之一，而微生物的生长过程 遵循一定的演变规律，所以选择微生物时，来源有两个途径：一是从大自然中筛 选分离而来，二是经过基因诱变重组而来。来源大自然的菌种可以从活性污泥或 土壤中分离纯化出来，来源于基因变化的菌种是借助高科技手段，如紫外灯照射 等等【。本课题的菌种来源于活性污泥。本章的主要工作是通过分离纯化及驯 化方式，从活性污泥中筛选出能够有效降解含油废水的微生物。实验流程如下所 示：采样一制备游离菌悬液斗平板稀释初步分离斗平板划线纯化哼纯化菌的驯 化从驯化所得菌中筛选优势降解菌专对优势降解菌进行鉴定到属。 2 2 降解菌的分离纯化 2 ，2 ，i 实验材料 ( 1 ) 实验器材 主要的实验仪器如表2 一l 所示 表2 - 1 主要仪器 t a b l e2 - it h em a i na p p a r a t u si nt h ee x p e r i m e n t 仪器名称及型号生产厂家 】( s d - 1 0 7 c c d 型生物显微镜 b s - 1 e 型恒温培养摇床 s p x 1 5 0 一z 型生化培养箱 y x q - s g 4 6 - 2 8 0 s 手提电热灭菌锅 u v - 9 2 0 0 型紫外可见分光光度计 v s 一8 4 0 - 2 型超净工作台 p h s 一3 c 型精密p h 计 宁波永新光学股份有限公司； 一常州国华电器有限公司； 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 北京瑞利分析仪器公司； 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 上海精密科学仪器有限公司。 ( 2 ) 实验试剂 主要的实验试剂如表2 2 所示： 1 2 硕士学位论文 第二章高效降解菌的选育 表2 - 2 主要试剂 t a b l e2 - 2 t h em a i nr e a g e n t si nt h ee x p e r i m e n t 培养基配制 琼脂基础培养基：葡萄糖3 9 ，蛋白胨1 5g ，酵母粉0 6 9 ，琼脂5 o g ，水1 0 0 0 m l ， p u t 无机盐培养基：k i - - 1 2 p 0 4 0 5 9 ，k 2 h p 0 4 0 5 9 ，m g s 0 4 0 ，2 9 ，n a c l 0 2 9 ， 砥h n 0 3 1 0 9 ，水1 0 0 m l 富营养培养基：葡萄糖3 9 ，蛋白胨1 5g ，酵母粉( 生长因子) 0 6 9 ，水 1 0 0 0 m l ，p h 7 菌种来源 本课题所用的菌种来源于湖南涟源钢铁冷轧厂废水站含油废水处理系统的 曝气池中活性污泥。 废水来源 取自湖南涟源钢铁冷轧厂的含油废水，并配成浓度为2 0 0 m g l 。 2 2 2 实验方法 ( 1 ) 灭菌方法 为了筛选出降解油脂微生物的纯菌，试验的工作都要求在无菌条件下进行， 试验中所用的材料、玻璃器皿、培养基等都要经过消毒灭菌才能使用。试验采用 加压蒸汽灭菌法，蒸汽压0 1 m p a ，锅内温度达1 2 1 ，此温度下灭菌2 5 m i n 左右 将所有微生物及芽孢杀灭。 ( 2 ) 菌种分离纯化方法 试验中采用平板稀释分离法和平板划线分离法进行菌种的分离纯化。 硕士学位论文 第二章高效降解菌的选育 2 2 3 分离纯化结果 本课题所用的菌种来源于湖南涟源钢铁冷轧厂废水站含油废水处理系统的 曝气池。在不同的采样点采回4 个样品，用无菌广口瓶采集曝气池中活性污泥， 所采污泥不超过广口瓶容积的2 3 ，盖好瓶盖，置于4 2 2 冰箱中保存。取采集的 泥样5 0 9 于已灭菌的装有l o o m l 无菌水的三角瓶中，向其内投入适量无机盐培养 液，置于3 0 c ，1 2 0 r m i n 摇床中培养7 2 h ，打散菌胶团，使细菌呈单细胞状态分散 于水中，即得游离菌悬液。 所采污泥中生长着混合菌，所以游离菌液为多种细菌的混合液。为了得到单 一的细菌，将混合菌分离纯化。本试验采取平板稀释分离和平板划线分离法联用。 实验前准备好灭菌的玻璃试管、平皿、移液管两根( 7 m l ，l o m l ) ，并配好培养基 和灭菌水以进行下面的实验。 ( 1 ) 平板稀释分离结果 各取9 m l 无菌水于1 2 根试管中，再用l m l 移液管取l m l 前面制备的菌悬液于 1 号试管中，得稀释度1 0 ，再从2 号试管中取l m l 菌液于3 号试管中。如此反 复一直到稀释度为1 0 - ”。向平皿中各倒入5 0 c 的琼脂培养基，待其凝固后，各 取0 2 m l l 0 4 1 0 1 2 个稀释度的菌悬液倒入各个平皿中，缓慢摇晃平皿使菌液涂 满整个培养基表面。将稀释度为1 0 1 1 0 1 2 的5 个平皿放入3 0 生化培养箱中培 养2 4 h 后，挑出典型菌落5 个，转接到试管富营养培养基斜面上培养2 4 h 。实验 结果见图2 - 1 。 图2 - 1 ( a ) 1 4 硕士学位论文 第二章高效降解菌的选育 图2 - 1 0 0 ) 图2 - 1 ( c ) 图2 - 3 平板培养基菌落特点 f i g 2 - 3c h a r a c t e r i s t i c so f b a c t e r i a o nb a c t e r i a lp l a t ec u l t u r em e d i u m 由菌落形状、色泽，表面光滑程度，直径大小等判断，初步挑出5 个典型菌 落中，其中2 1 ( a ) 图中3 个呈乳白色，表面粗糙程度不一，2 1 ( b ) 及2 一l ( c ) 图中2 个呈淡黄色，菌落直径大小不一。此图可见，此次分离并不完全，还要进 一步进行划线分离。 ( 2 ) 平板划线分离结果 将稀释分离后的5 个斜面培养菌苔，用平板划线法进一步纯化。从斜面上轻 轻挑取少量菌苔于平板培养基上划线，照前面培养方法培养2 4h 后，挑取不同 典型菌落8 个转入斜面中培养以进行再次分离。直到得到特征单一的菌落1 1 个， 分别命名为h l h l l ，转接于试管中，以命名标记，保存备用。此1 1 个菌落在 基础培养基上的培养特征见下表2 - 3 。 硕士学位论文第二章高效降解菌的选育 表2 3 细菌在基础培养基上的特征 t a b l