（应用化学专业论文）新型固相萃取剂的合成及表征.pdf

摘要 目前不论是生命领域还是药学界的发展都离不开分析技术这一助跑器。在众多分析 手段中，色谱技术一直受到人们的青睐。而固相萃取( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，简称s p e ) 是一种用途广泛而且越来越受欢迎的样品前处理技术。本文研究合成了两种用于生物大 分子分离纯化的新型无孔固相萃取剂。 本小组合成了3 z m 无孔脲醛树脂一二氧化锆复合微球，并用扫描电子显微镜对其 进行表征。利用基体表面上的酰胺键与丙烯酸甲酯和乙二胺进行三次马氏加成反应和胺 化反应，形成末端为胺基的聚胺基酰胺星型树状间隔臂。再用咪唑法将牛血清白蛋白对 其表面进行修饰，制成b s a u f - z r 0 2 固相萃取剂。考察了磷酸缓冲溶液含有不同浓度 盐溶液时，溶菌酶和卵清蛋白两种蛋白在b s a - u f z r 0 2 固相萃取剂上的吸附量和洗脱 率的变化。结果表明，b s a u f z r 0 2 固相萃取剂对溶菌酶的最佳吸附时间是4 h ，最佳介 质( 缓冲溶液) 的p h 值是6 0 ，吸附量最高达5 3 1 4m g g ，最佳洗脱试剂是0 5m o f l 的n a c i ，洗脱率达7 3 2 6 ，0 1 2 5m o l l 的k s c n 洗脱率达7 6 6 8 ；对卵清蛋白的最 佳吸附时间是6h ，体系溶液的p h 值是6 0 ，吸附量最高达3 5 3 8m g g ，最佳洗脱试剂 是0 5m o l l 的n a c i ，洗脱率达7 8 0 5 ，o 2 5m o l l 的k s c n 洗脱率达8 3 0 7 。 本小组还制备了l - p h e n y l a t a n i n e u f - z r 0 2 固相萃取剂。以溶茵酶和卵清蛋白作为测 试蛋白，分别考察了时间、p h 值、洗脱试剂及其浓度对吸附量和洗脱率的变化。结果 表明，l - p h e n y l a t a n i n e u f z r 0 2 固相萃取剂对溶菌酶的最佳吸附时间是6h ，最佳介质( 缓 冲溶液) 的p h 值是6 o ，吸附量最大达5 2 9 4m g g ，最佳洗脱试剂是0 2 5m o l l 的n a a ， 洗脱率达7 1 6 2 ，o 2 5m o l l 的k s c n 洗脱率达7 6 3 9 ；对卵清蛋白的最佳吸附时间 是6h ，体系溶液的p h 值是6 0 ，吸附量最大达3 6 1 7m g g ，最佳洗脱试剂是o 2 5m o l l 的n a o ，洗脱率达7 6 6 3 ，0 1 2 5m o l l 的k s c n 洗脱率达9 0 5 2 。 关键词：脲醛树脂一二氧化锆复合微球；固相萃取剂；牛血清白蛋白；溶菌酶 a b s t r a c t a t p r e s e n t ，a n a l y s i st e c h n o l o g y l i k em o t o rt ol i f ea n dm e d i c i n e t e r r i t o r y a n d c h r o m a t o g r a p h i ct e c h n i q u ei sp o p u l a ra n a s i sm e t h o d w h e r e a s ，s o i l d p h a s ee x t r a c t i o n a p p l i e dt op r e - p r o c e s s i n gf o rs a m p l e si sm o r ea n dm o r ep o p u l a r t h i sp a p e rs t u d i e dt w on o v e l k i n do fs p eu s e dt os e p a r a t eb i o m a c r o m o l e c u l e i ti se s s e n t i a lt or e s e a r c han o v a ls t a t i o n a r ye x t r a c t i o na g e n t ，a n dt h ew o r ko u rt e a mw o r k e d a sf o l l o w s ：3 0 z mn o n p o r o u su r e a - - f o r m a l d e h y d er e s i n z i r c o n i ac o m p o s i t em i c r o s p h e r e s ( u f - z r 0 2 ) a st h em a t r i xo fh i g hl i q u i da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y , w h i c hw a sc h a r a c t e r i z e d b ys c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) a m i d ob o n do nt h es u r f a c eo f t h em a t r i xa c t i v a t e d b ym i c h a e la d d i t i o nr e a c t i o nw i t hm e t h y la c r y l a t e ，a n ds u b s e q u e n t l yw i t hd i a m i n o e t h a n e ， t h e nr e p e a t e dt h r e et i m e s a tl a s t ，p a m a mw i t ha r b o r e s c e n c es t y l ew a s p r e p a r e d t h e n ，t h e s u r f a c eo fp a m a mw e r em o d i f i e db yn ，n - c a r b o n y l d i i m i d a z o l e ( c d i ) ，t h e nc h e l a t e db y b s a , s u c c e s s f u l l y f i n a l l y , b s a - u f - z r 0 2s t a t i o n a r ye x t r a c t i o nr e a g e n tw a sp r e p a r e d i t s l i g a n dh o l d i n gc a p a c i t yw a st e s t e du s i n gu l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o d t a k i n g a l b u m i ne g ga n d l y s o z y m ea st e s t i n gs a m p l e s ，t h ea b s o r p t i v ec a p a c i t yo fb s a - u f - z r 0 2 w e r e s t u d i e df r o ma b s o r p t i v et i m e ，p hv a l u e ，e l u e n tr e a g e n ta n dc o n c e n t r a t i o no fs o l v e n t t h e r e s e a r c hs h o w e dt h a tt h eb e s tf a c t o r sa sf o l l o w s ：4ha n dp h 6 0f o ra d s o r p t i o no f l y s o z y r a e ，6 ha n dp h 6 0f o ra d s o r p t i o no fa l b u m i ne g g t h em a xa d s o r p t i o nc a l lr e a c h5 3 6 1m g gf o r l y s o z y m e ，3 6 0 1m g gf o ra l b u m i ne g g t h em a xe l u t i n gr a t ef o rl y s o z y m ec a nr e a c h7 3 2 6 w i t h0 5m o l ln a c l ，7 6 6 8 w i t ho 1 2 5m o l l 的k s c n a n dt h ee l u t i n gr a t ef o ra l b u m i n e g gc a nr e a c h7 8 0 5 w i t h0 5m o l ln a c i ，8 3 0 7 u n d e r0 2 5m o l lk s c n o nt h eo t h e rh a n d ，l - p h e n y l a t a n i n e - u f - z r 0 2w a sp r o d u c e df o rf u r h e rr e s e a r c h b o v i n e s e r u ma l b u m i n ( b s a ) ，l y s o z y m ea n da l b u m i ne g gw e r eu s e da st h et e s ts a m p l e w ea l s o i n v e s t i g a t e t h e p e r f o r m a n c eo fl - p h e n y l a t a n i n e u f - 2 1 0 2c o m p o s i t em i c r o s p h e r e s v i a c h a n g i n gt h ep hv a l u e s ，p r o t e i nt e s t e d ，e l u e n tr e a g e n ta n dc o n c e n t r a t i o no fs o l v e n t t h e r e s e a r c hs h o w e dt h a tt h eb e s tf a c t o r sa sf o l l o w s ：6ha n dp h 6 0f o ra d s o r p t i o no fl y s o z y m e ，6 ha n dp h 6 0f o ra d s o r p t i o no fa l b u m i ne g g a d s o r p t i o no fa l b u m i ne g gc a nr e a c h3 6 1 7m g g ， 5 2 9 4m g gf o rl y s o z y m e t h ee l u t i n gr a t ec a nr e a c h7 1 6 2 f o rl y s o z y m ew i t h0 2 5m o l l n a c i ，7 6 3 9 w i t h0 2 5m o l lk s c n ，a n d7 6 6 3 f o ra l b u m i ne g gw i t h0 2 5m o l ln a c i ， 9 0 5 2 f o rt h a tw i t h0 12 5m o i lk s c n k e yw o r d s ；u r e a f o r m a l d e h y d er e s i n - z i r c o n i a f - z r 0 2 ) c o m p o s i t em i c r o s p h e r e s ， s t a t i o n a r ye x t r a c t i o nr e a g e n t ，b o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) ，l y s o z y m e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取 得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨盗墨墨太至或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：去盼珐 签字日期：洲年互月房日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 墨盗堡墨太鲎有关保留、使用学位论文 的规定。特授权墨盗墨三盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编， 以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复本和电子 文件。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 乌落穆 导师签名： 参乃易 签字日期：乏男年f 月 i2 日 签字日期：2 卅盼f 月z 日 第一章前言 第一章前言 随着科学技术的飞速发展，特别是生命科学也已进入崭新的时代。众所周知，生物 大分子是一类复杂的化合物，它的纯化分离对我们研究生命科学具有举足轻重的作用。 色谱法是一种高效的分离技术，其原理是利用欲分离的众多组分在两相间的分配有 差异，当两相做相对运动时，这些组分在两相中的分配反复进行，即使组分的分配系数 只有微小差异，随着流动相移动却可以有明显差距，最终达到分离的目的。 随着色谱技术的不断发展，人们对色谱技术的应用提出了各种新的要求。其中，色 谱分析技术的快速化是一个研究热点。要实现快速分析，应当从发展快速，高效的样品 前处理技术和研制适合快速分离、检测的便捷式分析仪器这两方面入手。从样品前处理 技术来看，色谱分析通常使用的样品前处理方法包括液相萃取和固相萃取这两大类。液 相萃取是传统的样品前处理方法，而固相萃取是目前研究样品前处理方法的热点。本文 将从高效液相色谱，固相萃取技术加以阐述。 1 1 高效液相色谱 1 1 1 高效液相色谱 高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h a ，h p l c ) 是2 0 世纪7 0 年代 初由法国的g a b o u i n 和美国的s c o t t 等人创立的一种新型的分析分离技术。它是将现代 的高压技术与传统液相法相结合，其特点有以下几点：1 ) 色谱柱采用均匀度很好、粒度 很细的填料，并通过高压填装，显著地减少了样品在柱内由于分子纵向扩散、涡流扩散以 及传质阻力所造成的峰扩展，柱效较传统液相色谱有大大提高；2 ) 配有高灵敏度的紫外 或荧光检测器，在进样器、梯度混合器、输液管道、比色池等的设计中死体积极少，使 色谱峰在柱外造成的扩散因素大为减少，检测灵敏度极大的提耐。 1 1 2h p l c 的应用 这种分析分离技术具有快速、高效和高选择性的特点，在化工、轻工、医药、生物 及食品分析等领域具有广泛的应用，尤其在某些重要医药、生物产品的生产中具有不可 替代的作用i 引。 1 ) 作为人工合成药物的精制手段，用于除去少量杂质，特别是那些异构体的分离。 2 1 中草药有效成分的制备和分析。 3 1 环境监测和污染物的分析。这在环境污染日益严重的今天是非常重要的。 4 1 食品中营养成分和物质的分析。 第一章前言 1 1 3h p l c 的分离原理 h p l c 的分离原理是：混合组分中不同待分离组分在固定相表面和流动相两相中吸 附、分配、离子交换、亲和力或分子尺寸的微小差异，经过连续多次在两相间的质量交 换，这种性质微小差别被叠加、放大，最终得到分离。h p l c 的最大特点可以分离不可 挥发而具有一定溶解性的物质或受热不稳定的物质。 1 2 亲和色谱 1 2 1 亲和色谱的分离原理及其分类 亲和色谱法作为液相色谱法的一个分支，在2 0 世纪6 0 年代以后获得了迅速发展， 它可在实验室和工业制备规模上，用于分离、纯化具有不同分子量的生物活性物质。亲 和色谱的突出优点是可对天然生物活性物质进行高特效性的分离和纯化。它利用目标蛋 白和配体之间的亲和吸附作用，而其他蛋白没有这种结合力，故达到分离效果。再通过 调整流动相的各个参数，如，p h 值、离子强度和温度等方式使该固定相得到重生，目 标蛋白质得到洗脱。这种特效性产生的原因在于亲和色谱固定相基体被键合了具有锚式 结构特征的配位体1 3 j 。 此配位体的官能团与被分离的、结构相似的生物分子之间，存在特殊的、可逆的分 子间相互作用，可表示成锁匙结构络合物。 1 基体；2 一间隔臂；3 一配位体；4 一被分离的生物活性分子；5 一锁匙络合物； a 一吸附；b 一洗涤；c 一洗脱；d 一再生 图1 - 1 锁匙结构络合物形成过程 f i g 1 - 1t h ef o r mp r o g r e s so fk e y - l o c kc o m p o u n d 依据生成锁匙结构、可逆络合物机理的不同，可以将亲和色谱分成以下几类详细见下表： 第一章前言 表1 - 1 常用亲和色谱体系 t a b l e l 1c o m m o na t f i n i t yc h r o m a t o g r a p h as y s t e m 方法名称分离机理应用对象 生物特效亲和色谱法利用可形成锁匙结构的不同 生物分子间的特效识别功能 染料配位亲和色谱法利用生物分子与三嗪和三苯 甲烷染料间的特效性相互作用 定位金属离子亲和色谱利用生物分子与金属离子一有 生物活性物质，包括 抗体、抗原、病毒、 细胞碎片 核酸、核苷、核苷酸、 核酸 键合的蛋白质、生物 酶 肽、蛋白质、核酸、 生物酶 机试剂螯合物之间的特效性作用 包合配合物亲和色谱法利用生物分子与环糊精( 或冠醚 手性氨基酸、多肽、 生物酶、凝固因子 、杯芳烃) 及其衍生物之间的特 效性包合作用 电荷转移亲和色谱法利用生物分子与卟啉衍生物之间 共价亲和色谱法 的电子给予和电子接受基团问的 特殊静电吸引亲和作用 利用含巯基的生物分子与含二硫 桥键配位体的生物分子间存在的 特效亲和作用 氨基酸、蛋白质、 核酸、核 苷酸 含硫多肽和蛋白 质、含汞 多聚核苷酸 1 2 2 亲和色谱的填料 1 2 2 1 小粒径全多孔硅基质填料 h p l c 是一种具有准确、灵敏、可以定量等特点的分离技术，适合于分析有机物、 无机离子、聚合物以及生物大分子等各种物质。常规色谱柱填充5y m 大小的硅胶基质 填料，柱长在1 0 2 5c m 之间，色谱仪器的耐受压力在4 0 0m p a 以内，完成一次分析约 需要1 5 2 0r a i n 或更长。但是，这一速度已经在一定程度上阻挡碍了生物工程领域和药 学领域等重要领域中的重要研究。 到二十世纪8 0 年代中期，开始有填充3 # m 固定相的商品短柱提供，但直到近两年 才逐渐得到应用。在过去的几年里，因为制药工业对快速高效液相色谱分析的迫切需求， 第章前言 重新激发了人们使用3 z m 左右粒径填料进行快速色谱分析的兴趣，有关应用研究日益 增多l 知1 0 1 。 科学实验得出粒径越小，最佳流速越大，更适合快速分离，但是分离对象的组成成 分复杂，同时含有酸性、中性、碱性物质。因此，对于依次完成高质量的分析往往需要 梯度洗脱，流动相的p h 变化范围也要更宽，这必然要求固定相具有更好的耐受性能。 虽然，有前人通过对传统硅胶进行衍生，但由于空间位阻作用，表面硅羟基没有被充分 衍生。而，酸性的硅羟基由于离子交换作用导致碱性化合物拖尾。此外，未衍生的表面 在p h 流动相下也很可能发生硅胶溶解现象。 1 2 2 2 整体柱色谱基质 整体色谱柱的类型主要有有机聚合物整体色谱柱、无机氧化物整体色谱柱和有机无 机溶胶一凝胶整体色谱柱三类。 2 0 世纪8 0 年代末，h j e r t e n l l l - 1 2 】及其同事发展了整体柱填料合成技术。通过在空管 柱中加入单体，引发剂和制孔剂的混合溶液“原位”聚合后得到丙烯酸凝胶，在将其高压 压入以空色谱柱制得软质基质“连续床”色谱柱，成功的用于蛋白质和多肽的分离。但这 种填料仅仅在溶涨情况下才存在大孔结构，所以不能用于流动相极性变化太大的分离过 程。 1 有机聚合物整体柱 根据所用单体不同，有机聚合物整体柱可分为：聚丙烯酰胺类、聚丙烯酯类和聚苯 乙烯类三种。 丙稀酰胺是一个亲水性很强的单体，通常被用于水相聚合制备凝胶。h j e r t e n 小组 1 3 - 1 4 】用丙烯酰胺与甲基丙烯酸丁酯共聚合成了聚丙烯酰胺一甲基丙烯酸丁酯疏水整体 柱，并成功的用于蛋白质的分离。这种聚合物的疏水性可通过改变反应液中甲基丙烯酸 丁酯的含量加以控制。z e n g 等【1 5 j 用哌嗪二丙烯酸、甲基丙烯酸酰胺单体进一步聚合得 到疏水整体柱。x i e l l 6 l 制备的交联聚丙烯酰胺一甲基丙烯酸丁酯整体柱同样也被用于蛋 白质的疏水色谱分离，且蛋白质的回收率达到9 0 以上。 聚甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a c o e d m a ) 是应用最广泛的聚丙烯酸酯类整体柱。 由于它本身具有的环氧火星官能团具有易于改性的特点，因此可被用于制备多种色谱填 料。s v e n 等【1 7 。1 8 】人用二乙胺与聚丙烯酸缩水甘油之整体柱反应只得弱阳离子交换柱。 v i k l u n d l l 9 j 用聚2 甲基丙磺酸( p o l y ( 2 a c r y l a m i d o 2 m e t h y l 1 p r o p a n e s u l f o n i c ) ) 在经过水 解的聚甲基丙烯酸缩水甘油之整体柱上接枝，得到强阳离子交换柱。p e t e r s 掣驯通过逐 步加入单体混合液降低聚合速度以消除由于聚合放热而导致温度升高的影响。他们采用 这种方法制备了在结构和性能上比较好的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯整体柱。s e c 等1 2 l j 以 交联聚甲基丙烯酸缩水甘油酯整体材料为基质，经过与二乙胺反应制备出离子交换色谱 柱，并实现对某些蛋白基线分离。 基于聚苯乙烯是强疏水性的材料，f r e c h e t 等【2 2 j 为了保证蛋白质在分离过程中的构 象稳定需要对其表面进行两次修饰。首先，用乙二胺与氯甲基反应，再与3 ，- g l u c o n o l a c t o n e 第一章前言 反应，从而使氯甲基苯乙烯表面的亲水性大大增强。将聚氯甲基苯乙烯整体柱与乙二胺 反应后，再与氯乙酸或溴乙酸反应即可得到弱阳离子交换柱。w a n g l 2 3 j 和x i e l 2 4 】等制备的 交联聚苯乙烯整体柱被成功地用于苯的同系物、多肽及蛋白质的反相色谱分离。w h l f ! f 【2 5 l 提出用模板化合物制备分子印迹聚合物色谱固定相，但这种固定相使用过程中柱效很 低。此后，m a t s u i 研究小组1 2 x , - 3 1 j 对此进行了改进，并取得了一些成果。研究发现，用原 位聚合方法制备的整体色谱柱要比常规装填的色谱柱具有更好的多孔性和渗透性，具有 灌注色谱的特点，即色谱柱中有流动相的流通孔又有便于溶质进行传质的中孔，因而可 以对生物大分子进行快速分离，而且色谱柱的稳定性很好。整体柱对流动相的通透性与 它的孔结构密切相关，整体柱中的大孔越多，流动相流过时的柱压就越低，但是，大孔 对基质材料的表面积贡献小。实际应用中，我们要兼顾低柱压和大表面积两方面要求。 传统大孔微球表面孔内停滞流动相的传质阻力是影响柱效，导致峰变宽的主要因素。特 别对于生物大分子，缓慢的扩散传质过程是分离速度难以提高的主要原因。由于整体柱 中存在着特有的大孔通道允许流动相直接流过，对流传质取代了缓慢的扩散传质，使得 样品的传质阻力大大减小。 2 无机基质整体柱 在这里我们重点指硅胶整体柱。和硅胶色谱柱相比，有机聚合物整体柱可以在p h 宽范围内使用，具有很强得生物兼容性，但在有机溶剂中收缩和溶涨现象难免。机械强 度低，柱效低是其致命的缺点。相比较而言，多孔无机硅整体材料更合适。p r e t o r i u s 等 旧开发了原位聚合制备泡沫状多孔硅的技术。之后，又有研究者制备了具有两种孔结构 的硅胶的整体材料技术。有关硅胶整体材料的基本物理性质以及色谱材料的分离理论都 有过大量的报道。硅胶基质整体柱具有和灌注色谱基质类似的特点，在较低的柱压和不 影响柱效和和分离效率的前提下，可以显著提高分析速度。 硅胶整体柱色谱具有快速高效分离的特点，在分离分析领域展现了自己的一大优势 和广阔前景。s c h u l t c 掣3 3 。3 5 j 使用硅胶整体柱，用模拟流动床色谱研究药物非对映异构体、 手性物质等的制备分离。其后，有研究者将其与质谱( m s ) 或核磁共振( n m r ) 连用 研究生物体液药物充分分离，色谱过程显示出良好的重现性，硅胶在此领域提供了一个 优良的平台。硅胶整体柱以其优越的色谱性能出现，得到了广泛的关注，也引起了科学 家更多的兴趣。 1 2 2 3 灌注色谱基质 多糖凝胶虽然具有得天独厚的价格便宜、容易衍生、高活性优势，但是，机械强度 差，只能适用于低压；无机基质适用于蛋白质分析，机械强度好，但，与蛋白质问存在 特异性作用，也不适宜在高碱性介质下使用。有机树脂存在孔内停滞流动相传质问题， 分离度低问题。 1 9 8 9 年，a f e y a n 等【3 6 】通过悬浮聚合、乳液聚合等方法，制备出一类新型的多孔型 高分子微球色谱填料，并将这种填料进行色谱分离的过程称为灌注色谱填料( p e r f u s i o n c h r o m a t o g r a p h yf i l l i n g ) 。美国的p e r s e p t i v eb i o s y s t e m s 公司根据该专利，由苯乙烯和 第一章前言 二乙烯酸苯( d v b ) 通过悬浮聚合、乳液聚合等方法开发出商品名为p o r o s 的多孔型 高分子微球系列灌注色谱填料。粒径规格为1 0 a m ( h 型) 和2 0 a m ( m 型) 两种。根据 化学修饰连接的官能团不同，又分为反相( r 型) 、强阴离子交换型和强阳离子交换型。 灌注色谱填料的特点是它可同时存在两种结构，一种是孔径在6 0 0 - - 8 0 0 r i m 范围内贯穿 这个颗粒的特大孔，称为特大孔( t h r o u g hp o r e ) ；另一种是孔径在8 0 1 5 0 r i m 范围内的 连接这些特大孔的较小孔，称为扩散孔( d i f f u s i v ep o r e ) ，孔深不超过1 “m 。灌注色谱填 料独特结构性的色谱过程中孔内“停滞流动相传质阻力”大大减小。从结构上看，灌注 色谱填料上的贯穿孔把一个大颗粒分割成聚集在以其的若干较小的颗粒，颗粒内的传质 过程主要靠贯穿孔内的对流传递。生物大分子溶质能随流动相的液体迅速达到孔内的活 性表面；对于每个较小颗粒而言，又都是对流传质的，这样就明显缩短了生物大分子的 分离时间，分离出的蛋白质质量、产量和产率都有所提高。灌注色谱在生物大分子物质 的快速分析，在线检测、规模放大试验和样品浓缩等方面有着主要的意义。近几年，科 学家们又相继研制出了适用于反相( r e v e r s e d p h a s e ) 、离子交换( i o n e x c h a n g e ) 、疏水 相互作用( h y d r o p h o b i ci t e r a c t i o n ) 和亲和( a f f i n i t y ) 等多种模式。 灌注亲和色谱广泛应用于蛋白质、抗体和基因的分离。灌注定位金属离子亲和色谱 固定相是将i d a 键合到p o r o s m 上制得的，其特点是速度快，柱容量可达到2 0 m g m l 柱 体积。细胞色素c 、溶菌酶和肌红蛋白的混合物在p o r o s m 螯合铜柱上6 r a i n 即可得到 分离1 3 7 1 。h i z e l 删等人利用亲和灌注色谱从肿瘤细胞中分离纯化b r c a i 蛋白。 1 2 2 4 表层多孔填料( s u p e r f i c a l l yp o r o u sp a r t i c l e s ) 表层多孔填料是无核结构，外面是厚度小于1 , m 的多孔层。早期的薄壳填料和表 层多孔填料，粒径在3 0 5 0 , m 之间。新型表层多孔填料的特殊结构有效地解决了停滞 流动相传质问题，降低扩散路径提高传质速度，提高柱效。目前报导不多。虽然薄壳 型填料和表层多孔填料能快速分析蛋白质，负载量也大大得到提高，但是它仍然有不足 之处： 1 ) 表面积低，样品负载量小。 2 ) 产生很小的尖锐色普峰，这需要特殊的具有小死体积的仪器。 3 1 色谱柱易出现堵塞现象。 4 ) 生物大分子受到小粒子作用，会变性甚至失去活性。 5 ) 孑l 径太小，生物大分子进不去，达不到分离的目的。 6 ) 一旦进入孔内，分子很难迅速扩散出来回到流动相中，从而增大了分子的扩散分 布，引起谱带扩张，增加了分析时间，存在所谓“停滞流动相传质”问题。 因此，研究无孔载体、双孔型载体和连续床等载体日益受到人们的重视。 1 2 2 5 无孔色谱基质 传统多孔基质停滞流动相传质问题困扰着很多研究者，也激励了他们开发研究无孔 色谱基质。无孔色谱基质可以有效地避免溶质在固定相颗粒内部的吸附与扩散，克服停 第一章前言 滞流动相传质所带来的峰加宽、柱效低、分离效果不好等缺点，同时由于传质速度加快， 两次操作之间平衡时间也大为减小，对于快速分离十分有效。自从u n g e r 等【3 9 加j 报导 了无孔小颗粒载体( 直径1 3 m ) 可快速分离蛋白质。这类载体在生物大分子分离方面 引起人们的关注。除硅胶以外，各种无孔载体，钛和锆的氧化物、有机聚合物如，合成 亲水树脂、交联聚苯乙烯、琼脂糖等相继被合成出来1 4 。由于这些填料的粒径均匀，表 面修饰后，球形微粒在柱管内呈现整齐紧密的排列，溶质的分离就在这些微粒的外表面 和空隙内进行。并在分离生物大分子方面取得了很好的效果。 典型的有无孔硅胶载体，无孔琼脂糖载体和无孔聚合物三种。无孔硅胶作为载体多 用于反相柱，硅胶表面的硅醇基是对其进行表面改性的基础。l s s a e v a l 4 2 j 利用无孔硅胶在 6 s 内实现细胞色素c 等六种蛋白的快速分离；l ( a l 曲a 百i 等【4 3 j 制备t i e 辛基二甲基氯硅 烷包覆的无孔硅胶，可在2 0s 内分离核糖核酸酶等5 种蛋白质。随后他们将非极性微 薄层的无孔硅胶用于多肽分析l 4 4 j ，2 0m i n 内完成t 组织血浆酶原活化因子的胰蛋白酶 水解液的分离，与传统技术相比，在灵敏度及效率不下降的情况下，分析时间可减少1 0 倍；0 k e e f e 等1 4 5 】利用无孔粒子表面键合c 1 8 的微薄壳固定相，在1 3m i n 内将重组 p a l 1 ( p l a s m i n o g e na c t i v a t o r i n h i b i t o rt y p e l ) 从大肠杆菌培养液中选择性地分离出来； a n s p a c h 等【删在无孔硅胶表面键合三嗪类染料并将其作为亲和吸附剂，从粗提取物中快 速制备酶。m a a 【4 7 】等人研究了反相无孔聚苯乙烯载体的性能，结果表明该载体可在较高 温度下( 8 0 0 c ) 使用，因而洗脱液粘度低，分析时间短；b u r k e l 4 8 - 5 0 等人将无孔的表面偶 联有聚乙烯基亚胺的聚甲基丙烯酸酯作为阳离子交换剂，色谱峰非常尖锐，柱平衡时间 短，载体p h 稳定范围宽，且蛋白质回收率很高；k a t o | 5 1 j 用阴离子交换型无孔亲水性 树脂在2 0m i n 内完成聚腺苷酸水解产物的分离；r o u n d s l 5 2 】等人将无孔聚苯乙烯以聚乙 烯亚胺包覆、二环氧化物交联、季胺化反应后，制得强碱性阴离子交换树脂，可用于联 机监测大批量蛋白质的纯化；s i n i b a l d i l 5 3 j 合成2 - 4 z m 单分散无孔脲醛树脂微球，基体 偶联l - 2 氨基5 脲基戊酸配位后，制成配体交换色谱固定相，用于苯丙氨酸对映体的分 离。 h j e r t e n l 5 8 】等利用大孔琼脂糖颗粒在有机溶剂中的收缩和交联制备无孔琼脂糖，将 其用于疏水作用色谱和阳离子交换色谱中分离蛋白质。由于交联剂含有疏水基，因而产 物不需要非极性配位衍生化即可用于疏水作用中。具有阳离子交换性质的无孔琼脂糖是 以1 ，4 丁二醇缩水甘油醚活化，再与二甲胺偶联制得的。其在分离蛋白质时，分离效率 高，分离速度快且回收率高。 1 2 3 新型间隔臂 亲和色谱中，在大多数情况下，载体和配位体之间需有问隔臂相连。在h p l c 中广 泛使用的是具有双官能团的直链有机化合物( 如乙二胺、丁二酸、乙二醇等) 构成与载 体相连的间隔臂。间隔臂的作用为： 1 ) 它可以使活化基团在空间上充分伸展，以便同配位体相连； 2 ) 连接上配位体后，可使配位体更容易发生变形，同时使其运动性增强； 第一章前言 3 ) 可使配位体远离载体表面，避免配位体和载体的非特效作用； 间隔臂太长或太短，都不利与配位体和溶解分子的特异性吸附作用。间隔臂相隔 2 1 2 个原子，一般认为配位体与载体之间插入4 6 个亚甲基，可以获得最佳效果。所以 一个理想的间隔臂，应该长度合适，对分离物不进行特异的吸附( 既不能带太多的电荷 也不能有太强的疏水性) ，无外加的活性吸附点，由连接配位体和载体的双功能反应基 副5 9 l 。传统色谱中使用的间隔臂为线形间隔臂，此类间隔臂在分离生物大分子时会与生 物大分子发生缠绕，从而导致低柱效。本实验采用树状间隔臂以克服上述线形间隔臂的 缺点并可增大无孔载体对配位体的负载量。 树状大分子是由逐步重复的反应在每个单体产生分支而形成的高度支化的三维大 分子。典型的这种大分子是由若干树枝子单元组成的球状体，从外层到内层所有的键都 收敛到分子中心。这种树状大分子以集合级数增加支化度，分子量可迅速达到数万、甚 至上百万。分子直径可达到1 0 一5 0 0 埃。它具有相对稳定的构象，球体状使得分子间相 互接触面有限而呈现出各自相互独立性，而线性大分子可任意缠绕，大面积接触，构象 受环境影响较大。树状大分子具有的显著优点就是它具有大量的端基。这样易于配位体 的键合，大大增加配体的密度。其特殊的机构会阻止柔韧结构的生物大分子的链接进入 星射状间隔臂的内部。也就是说，配位体与具有柔韧结构的生物大分子发生构成琐匙结 构的分子间的相互作用仅在固定相外表面发生，从而大大缩短了生物大分子的质量扩散 路程，有利于快速分离。 1 2 4 生物配体 在亲和色谱同定相上键联的配位体，可分为染料配位体、定位金属配位体、包和配 合物配位体、生物特效配位体、电荷转移配位体和共价配位体。本文所用的配位体为生 物特效配位体类型1 6 0 - 6 2 1 。人们主要以h p a c 分离纯化蛋白质来取决配位体的选择，它要 求所选择的配位体与被分离的蛋白质之间有一种特定的生物亲和作用。常用配位体有： 抗原( a n t i g e n s ) 底物( s u b s t r a t e s ) 核苷( n u c l e o s i d e s ) 、核苷酸( n u c l e o t i d e s ) 激素 ( h o r m o n e s ) ，酶( e n z y m e s ) 、糖( s u g a r s ) 等。我们将配位体分为两类： ( 1 ) 特异性的配位体。这种配位体只针对单一物质进行特异结合与其他物质不作用； ( 2 ) 通用性配位体。这种配位体一般为简单小分子，在这一条件下可与一类或几 类生物大分子作用。 一般情况下，是从生物来源的物质中选择那些与互补溶质有天然配对倾向的物质作 配位体。生物分子与用于固定的有效配位体数大分子之间可逆、特效的亲和能力，是由 于它们在形成亲和作用区间内基团的化学结构、立体排布，而表现出具有轮廓分明的镶 嵌结构特征，从而呈现出在一部分分子之间或分子中某个部分的生物识别能力。 现今用作配位体的生物活性物质越来越多，因此我们在键合配位体之前，需对 配位体进行选择1 6 3 彤】。一般来讲，选择配位体时应考虑以下几种因素：配位体大分子 相互作用的性质、大分子与配位体的亲和力、配位体和基质的连接方式和配位体的浓度。 最近在选择性键合分子识别领域中的新方法是采用核酸配位体以及能够与选择的 第一章前言 目标分子显示高亲和特效键的寡聚核苷酸。这些配位体长度在8 1 2 0 核苷酸长度，相应 的分子量范围位3 0 0 0 4 0 0 0 0 。核苷酸配位体应用到化学分析上是一个很新的领域。至今 的例子也很少，且主要在临床诊断上，但是其独特构造产生稳定结构的可能性为化学传 感器和分析应用提供巨大潜力。核苷酸相对传统配位体试剂有几处潜在优势。因为他们 不是从活有机体中能得到的，因此可以被复制，且在短时间内用固相合成的自动程序来 精确合成。又因为核苷酸配位体比较小，他们的三维结构相对简单一些，因此减少了立 体阻力，增加表面覆盖率。他们构造的稳定性将有助于保持在靠近固定相表面部分的选 择性和活性。而且，各种以键合为基础的连接方式提供了在色谱固定相表面取代和更新 配位体的更大可能性。核苷酸配位体的稳定性是他们作为分析试剂使用中的一种很重要 的考虑因素，这对于r n a 尤其重要。r n a 在生物原料样品中易被核糖核酸酶降解。d n a 可在大多数实验中进行处理而无需特殊的留心，但是，r n a 在处理中应防止被皮肤上 的酶污染，因此应使用无酶试剂。为了提高核苷酸配位体的稳定性，它们应被键合成与 d n a 或者r n a 结构相似的化学改良衍生物i 睢7 0 j 。 1 3 固相萃取 色谱分析的全过程主要包括样品的收集处理、样品中各组分的分离测定和样品测定 后数据处理与结果的表达3 个步骤。其中样品的收集处理步骤通常包括样品的选择和收 集、样品的贮存和运输、样品的分离、浓缩和纯化等内容。h p l c 已经成为分析生物大 分子化合物的重要手段。但由于生物活性样品组成复杂，样品未经处理直接进行h p l c 分析测定时，要么被测组分含量太低达不到检测下限，要么共存杂质在色谱柱内发生强 保留、甚至不可逆保留而污染固定相。所以采用h p l c 法分析生物样品前，必需对原始 样品中被测组分浓缩富集或分离除去干扰组分，制备成适合于h p l c 分析的样品。目前 样品处理最常用的方法是固相萃取法。因此，研究制备适于处理不同样品的新型固相萃 取剂是h p l c 领域中重要的研究课题。 1 3 1 固相萃取原理 固相萃取( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) 是利用选择性吸附与选择性洗脱的色谱分离原 理，使液体样品通过吸附剂，保留其中某一组分，再选用适当溶剂除去杂质，然后用少 量溶剂迅速洗脱，从而达到分离、净化与浓缩的目的。s p e 的基本原理是样品在两相之 间的分配，即在固相( 吸附剂) 和液相( 溶剂) 之间的分配。其保留或洗脱的机制取决于被 分析物与吸附剂表面的活性基团，以及被分析物与液相之间的分子间作用力。有两种洗 脱模式，一是被分析物比所存在的生物介质与固相之间的亲和力更强，因而被保留，然 后用一种对被分析物亲和力更强的溶剂洗脱；另一是存在的生物介质较被分析物与固相 之间亲和力更强，则被分析物被直接洗脱l 7 1 7 引。通常用前者。s p e 的操作步骤固相萃取 一般有4 个步骤：活化、上样、淋洗、洗脱。 第一章前言 1 3 2 固相萃取技术的进展 近2 0 年来，固相萃取技术发展迅速，各种性能优越的新型吸附剂层出不穷，自动 化程度迅速提高，使得该技术在体内药物分析中呈现出广阔的应用前景【7 4 1 。但，大量 s p e 的自动重复操作仍是相当耗时的。目前的自动化仪器可分为半自动和全自动两种， 半自动s p e 是指萃取过程机械化，但将洗脱液转移到进样阀则需手工完成，该类型的商 品化仪器较多，如g i l s o n 公司的“a s p e c x l ，h a m i l t o n 公司的“m i c r o l a hs p e ”和 h e w l e t t p a c k a r d 公司的“h p 7 6 8 6p r e p s t a t i o n ”等；而全自动s p e 则是真正的在线操作，整 个的萃取和分析过程都是由机器控制完成，如荷兰s p a r k 公司的“p r o s p e c t ”及m e r c k 公司 的“o s 2 ”系统。 1 3 3 固相萃取剂 原则上，用于h p l c 的固定相均可以做为固相萃取剂。现已开发的产品有v a r i a l l 的 b o n d - - e l u t c e r t i f yi ，i i ，i s t 公司的i s o l u t e c o n f i r mh a x h c x ，j b a k e r 的n a r c - 2 等。混合型吸附剂能综合运用氢键、极性、非极性以及离子间相互作用等多种作用力， 使各种吸附剂在性能上相互补充，因此使用范围更广，可用于各种化合物的萃取浓缩。 固相萃取存在一个瓶颈问题，即使用前需要活化，活化期间和上样前柱内要保持湿润， 否则就难以保证萃取效率和重现性，这在一定程度上限制了固相萃取的应用。新一代的 聚合物吸附剂，如w a t e r s 的o a s i sh l b ，不需活化，也不怕溶剂流干，简化了样品制备 过程，而且具有很宽的p h ( 1 - - 1 2 ) 范围，能萃取亲水、疏水、酸性、碱性或中性组分， 特别适用于血浆、尿液等生物样品的制备。开发建立在分子识别基础上的具有高度特 异性的选择型吸附剂，如免疫吸附剂和分子印记吸附剂是当前萃取剂开发的另一重要方 向。免疫萃取吸附剂利用抗体一抗原的相互作用，特异性识别