（应用化学专业论文）某些天然抗氧化剂在复杂体系中抗氧化作用的研究.pdf

摘要 用非离子表面活性剂t w e e n 2 0 稳定的葵花油水包油乳状液模拟非均相食品体系，大 豆磷脂脂质体模拟非均相生物体系，用水溶性的偶氮化合物a a p h 热分解生成的自由基 引发脂质氧化，通过硫氰酸铁法( f c d 和硫代巴比妥酸反应物法( t b a r s ) 检测脂质的氧 化进程，并研究p 谷甾醇( p s i t o s t e r 0 1 ) 、豆甾醇( s t i g m a s t e r 0 1 ) 、胆固醇( c h o l e s t e r 0 1 ) 和欧李 红色素( r e dp i g m e n to f c e r a s u sh u m i l i s ) 的抗氧化活性以及v c 和v e 对它们抗氧化活性的 影响。结果表明，不同浓度b 谷甾醇、豆甾醇、胆固醇和欧李红色素均具有抗氧化活性， 但不同体系中其抗氧化活性并不相同。b 谷甾醇和欧李红色素的抗氧化能力随浓度升高 逐渐降低，豆甾醇和胆固醇在葵花油乳状液中均具有最佳抗氧化浓度( o 0 2 m g m l ) 。豆 甾醇在反应的整个过程中，抑制乳化体系和磷脂脂质体氧化的能力均高于b 谷甾醇，豆 甾醇有比8 谷甾醇更强的抗氧化活性。在考察两种抗氧化剂的协同作用时发现：除了在 大豆磷脂脂质体中，用t b a r s 法测得的0 0 0 1 6 m g m l1 3 - 谷甾醇和o 0 0 8 m g m lv c 共同 作用时表现出较强的协同增效作用，用f t c 法测得的o 0 0 8 m g m lb - 谷甾醇和 0 0 0 1 6 m g m lv e 共同作用时显示抗氧化协同增效作用，以及用 b a r s 法测得三种不同 浓度胆固醇和o 0 0 1 6 m g m lv e 共同作用时显示了一定的协同抑制作用外，其余各种不 同浓度的b 谷甾醇、豆甾醇、胆固醇和欧李红色素与v c 、v e 共同作用时均不显示协同 增效作用。 关键词：脂质氧化；抗氧化活性；协同作用；生物抗氧化剂 a b s t r a c t a n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so fd i f f e r e n ta n t i o x i d a n t s ，i n c l u d i n g1 3 - s i t o s t e r o l ，s t i g m a s t e r o l ， c h o l e s t e r o la n dr e dp i g m e n to fc e r a s u sh u m i l i st o w a r d l i l ： i d o x i d a t i o ni ns u n f l o w e r o i l - i n - w a t e re m u l s i o n s ( f o o dm o d e ls y s t e m s ) s t a b i l i z e db yt w e e n2 0a n ds o y b e a n p h o s p h a t i d y l c h o l i n el i p o s o m e sr b i o l o g i c a lm e m b r a n em o d e ls y s t e m ) w a ss t u d i e di nt h i st h e s i s t h ee f f e c to fa s c o r b i ca c i da n dc t - t o c o p h e r o lo nt h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fi b - s i t o s t e r o l , s t i g m a s t e r o l ，c h o l e s t e r o la n dr e dp i g m e n to fc e r a s u sh u m i l i si nd i f f e r e n tm o d e ls y s t e m sw a s i n v e s t i g a t e d , r e s p e c t i v e l y t h ew a t e rs o l u b l ea z o - c o m p o u n d2 , 2 a z o b i s ( 2 - a m i d i n o p r o p a n e ) d i h y d r o c h l o r i d ef a a p h ) c o u l db eu s e dt og e n e r a t ec a r b o nc e n t e r e dr a d i c a l sb yt h e r m a l d e c o m p o s i t i o nf o ri n i t i a t i n gl i p i d so x i d a t i o n t o t a la n t i o x i d a n ta c t i v i t y ( t a a ) w a sm e a s u r e d b yf e r r i ct h i o c y a n a t ea s s a yf f t c ) a n dt h i o b a r b i t u r i ca c i d - r e a c t i v es u b s t a n c e s ( t s a r s ) t e s t t h er e s u l t ss h o w e dt h a td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so t p s i t o s t e r o l ，s t i g m a s t e r o l ，c h o l e s t e r o la n d r e dp i g m e n to fc e r a s u sh u m i l i sa l lh a da n t i o x i d a n ta c t i v i t i e si nd i f f e r e n ts y s t e m s b u tt h e a n t i o x i d a n ta c t i v i t yw a sd i f f e r e n ti nd i f f e r e n ts y s t e m s i tw a sc l e a rt h a ta n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so fi n d i v i d u a lp s i t o s t e r o la n di n d i v i d u a lr e d p i g m e n to fc e r a s u sh u m i l i si n c r e a s e dw i t ht h er i s eo ft h e i rc o n c e n t r a t i o n si nt r a d i t i o n a l s u n f l o w e ro i l - i n w a t e re m u l s i o na n di ns o y b e a np h o s p h a t i d y l c h o l i n el i p o s o m em e m b r a n e b o t hs t i g m a s t e r o la n dc h o l e s t e r o lh a dt h eb e s ta n t i o x i d a n tc o n c e n t r a t i o no f0 0 2 m g m l i t w a sa l s os h o w nt h a tt h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fi n d i v i d u a ls t i g m a s t e r o lw a sh i g h e r rt h a n 1 8 - s i t o s t e r 0 1 f u r t h e r m o r e ，s y n e r g i s t i ci n t e r a c t i o n sb e t w e e nt h e1 3 - s i t o s t e r o l ，s t i g m a s t e r o l ，c h o l e s t e r o l ， r e dp i g m e n to fc e r a s u sh u m i l i sa n da s c o r b i ca c i d a t o e o p h e r o la g a i n s tl i p i dp e r o x i d a t i o n w e r ea l s oi n v e s t i g a t e d i tc a l lb es e e nt h a tt h ec o m b i n a t i o no fo 0 0 1 6 m g m lp s i t o s t e r o la n d 0 0 0 8 m g m lv ci ns o y b e a np cl i p o s o m er e s u l t di nap r o u n c e ds y n e r g i s t i ci n t e r a c t i o n sb y u s i n gt b a r st e s t ，t h ec o m b i n a t i o no f o 0 0 8 m g m li b - s i t o s t e r o la n do 0 0 1 6 m g m lv eo w n e d s l i 曲t l ys y n e r g i s t i ci n t e r a c t i o n sb yu s i n gf t ca s s a y , a n dt h ec o m b i n a t i o no ft h r e ed i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n sc h o l e s t e r o la n do 0 0 1 6 m g m lv eh a dc e r t a i ns y n e r g i s t i ci n t e r a c t i o n s t h e o t h e rc o m b i n a t i o no f - s i t o s t e r o l ，s t i g m a s t e r o l ，c h o l e s t e r o l ，r e dp i g m e n to fc e r a s u sh u m i l i sa n d a s c o r b i ca c i d a - t o e o p h e r o ld i dn o tl e a dt os y n e r g i s t i ci n t e r a c t i o n s n k e y w o r d s ：l i p i dp e r o x i d a t i o n ，a n t i o x i d a n ta c t i v i t y , s y n e r g i s t i ci n t e r a c t i o n s ，b i o l o g i c a l a n t i o x i d a n t i i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河南 工业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了 谢意。 论文作者签名：之兰塾：日期：丝2 丕垒：型 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；本人授权河南工业大 学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的论文在解密后应 遵守此规定) 论文作者签名：噍坠 日期： 丝至墨：兰2 导师签名：缉虹日期：! 翌! 二l 某些天然抗氧化剂在复杂体系中抗氧化作用的研究 1 1 脂质的氧化与抗氧化 第一章前言 1 1 1 膳庾氧化的反压羽【理 在空气存在情况下，脂质过氧化( l i p i dp e r o x i d a t i o n ，简称l p o ) 有如下三种类型：( 1 ) 自由基氧化；( 2 ) 酶氧化；( 3 ) 非自由基非酶促氧化【”。其中，最重要的是自由基引发的链 式反应，也称自动氧化。脂质过氧化的基本反应如图1 - 1 所示【2 】。 ，! 芝，! 塑，苌， 1 ： 弋八i 办厂 h o oo 0 h 仓 删3 卫弋八c y c l 疹i z e 厂 r h ob 0 c y c l i z e 0 2 r h t 弋 入尸 2 o o 缸o p r o 一 乒h 矿h 十 m d a 圈1 1瞻陪衬誊仆的后府加理 6 卜州 m 咖 河南工业大学硕士学位论文 脂质在均相体系中的氧化( 如油脂体系) 的研究工作较多，在非均相复杂体系中的氧 化研究尚不充分。脂质在非均相体系氧化行为与均相体系明显不刚0 4 】，乳化的脂质与均 相体系中的脂质的氧化机理也不同。特定食品中脂质氧化的机理取决于反应物的性质以 及它们的物理化学环境。水包油型乳状液和胶束体系中脂质氧化的研究表明，位于油滴 表面的脂质氢过氧化物和水相中的过渡金属的相互作用是引起脂质氧化最常见的原因 【5 闸。在生物体内，很多脂类含有高不饱和脂肪酸，特别在生物膜的磷脂中，高不饱和脂 肪酸含量高，化学性质不稳定，很容易受到过氧化作用的损伤。 i i 2 脂质氧化对食品体系的影响 脂质氧化既有优点又有缺点。在食品体系中，少量的脂质氧化产物是形成煎炸食品 香味川、炖肉【8 】和焙烤坚果t 9 1 等的特殊风味的主要原因。然而，在大多数食品中，脂质 氧化是引起含腊食品质量下降的一个主要原因。脂质氧化产生令人讨厌的气味并且产生 可能有毒性的反应产物，造成食品的味道、货架寿命、外观和营养等方面的改变。 i i 3 脂质氧化对生物体系的影响 近年来，脂质氧化对机体的生理过程和病理损伤在基础及临床医学上受到人们的广 泛关注。脂质氧化与某些疾病的病理过程，如肿瘤、化学中毒、感染、炎症反应、自身 免疫病及心血管疾病、衰老等生理过程均有密切联系( 1o j 。脂质氧化对机体的损伤主要表 现在o m 2 j ： ( 1 ) 脂质过氧化中间产物自由基( l 、l o 或l 0 0 ) 导致蛋白质分子聚合。 ( 2 ) 脂质过氧化终产物之一的丙二醛导致蛋白质分子的交联。 ( 3 ) 脂质过氧化对细胞的损伤主要表现在对生物膜的损伤，使细胞膜的流动性降低。 流动性是生物膜的主要特征之一，合适的流动性对生物膜表现其正常功能具有十分重要 的作用。 ( 4 ) 脂质过氧化可引起动动脉粥样硬化。脂质过氧化产生的醛类物质进攻蛋白质生 成的聚合物( 如低密度脂蛋白的脂质过氧化物) 对动脉粥样硬化的形成起重要的作用。 ( 5 ) 脂质过氧化可引起癌变。脂质过氧化产生的中等活性的自由基如过氧自由基 ( l 0 0 ) 、烷氧自由基( l o ) 等影响核酸的结构和功能，使正常的基因突变为癌基因。 ( 6 ) 脂质过氧化可引起衰老。老年斑是衰老的重要标志之一，脂质过氧化与老年斑 的形成有密切的关系。 脂质过氧化与某些疾病的病理过程，如肿瘤、化学中毒、感染、炎症反应、自身免 疫病、辐射损伤及心血管疾病等以及吞噬杀菌、衰老等生理过程均有密切联系。由脂质 2 某些天然抗氧化剂在复杂体系中抗氧化作用的研究 氧化所导致的部分疾病的关系，如下： 不饱和脂肪酸 j 氧化 毒素( 生成l o o h ) + 脱发，白发 与蛋白质的氨基酸结合，并变黄- 体内脂褐质色素形成+ 老年斑 氧化中性腊肪和胆固酵一沉积于血管内壁一 血管狭窄，血管壁变硬、发脆+ 脑梗死、脑血栓、脑内出血 1 1 4 脂质氧化的抑制 1 1 4 1 抗氧化剂 在脂肪、油脂或含脂肪和油脂的食物中加入抗氧化剂对延迟脂质氧化是有效的f 1 3 】。 生物体内存在着各种生物抗氧化剂，它们组成了一个有效的自由基防御系统来保护生物 膜免受氧化剂进攻。这些防御系统包括：( 1 ) 预防性抗氧化剂：清除活性氧，防止自由基 反应，如超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、谷胱甘肽过氧化氢酶( g s h - p x ) 和 细胞色素氧化酶【1 4 】等；( 2 ) 自由基链反应阻断剂：能阻断脂质过氧化链式反应，如胡萝h 素和维生素c 等；( 3 ) 具有氧化金属离子活性的蛋白抗氧化剂，如铜蓝蛋白、乳铁蛋白 等【1 5 】。其中，s o d 是人体内清除超氧化物自由基的一种金属酶，它可以结合不同的金 属，有c u z n - s o d 、m n s o d 和f e s o d 三种。这些s o d 都能催化活性氧0 2 一和h o o 发生歧化反应生成h 2 0 2 与0 2 ，从而成为活体内部氧化保护的一道防线。g s h 可减少脂 过氧化氢和h 2 0 2 旧。 抗氧化剂如维生素e 、维生素c 、胡萝 素和多酚类物质等能有效保护细胞膜免受 脂质过氧化损伤，合成抗氧化剂如b h a ( 丁基羟基茴香醚) 、b h t ( 二丁基羟基甲苯) 和 t b h q ( 叔丁基对苯二酚) 等在二十世纪初被应用到食品添加剂中，但研究表明，合成抗 氧化剂具有一定毒性和致癌作用。因此，许多国家开始禁止或限制使用这类合成抗氧化 剂。因而寻找天然、高效和低毒的抗氧化剂成为发展趋势。 1 1 4 2 抗氧化作用的机理 生物抗氧化剂的抗氧化机理大致分为以下三类：( 1 ) 抑制由过渡金属引发的自由基产 物产生；( 2 ) 捕获脂质过氧化链式反应中产生的自由基，减少脂质过氧化反应链长度；( 3 ) 以上两种机理的混合作用。能够提供氢原子的抗氧化剂( i n s ) 对自由基链式反应的抑制可 用以下各式表示： 河南工业大学硕士学位论文 ( i ) l o o + i n h l o o h + i n ( 3 ) i n + i n _ p r o d u c t s ( 5 ) i n h + l o o h 一p r o d u c t s ( 7 ) i n - c o l + i n o + l o 1 1 4 3 抗氧化剂的协同作用 ( 2 ) i n + l o o i n o o l ( 4 ) i n + l h + i n h + l ( 6 ) i n h + 0 2 。i n + h 0 2 。 ( 8 ) h l 。+ 0 2 - 呻i n o o 某些抗氧化剂在纯净状态下活性较弱，但在混合状态下表现出较强的抗氧化作用， 其原因为组分间存在协同作用。协同作用是抗氧化剂间的一种普遍现象，最典型的例子 是v e 与v c 的协同作用。1 9 6 2 年，t a p p e l 【1 7 】对v e 与v c 间协同作用进行了研究，提出 了v t 再生了v e 的观点，这个结论也被p a k e r 及n i k i 1 8 , 1 9 1 等证实。此外，其他抗氧化剂 问的协同作用也有文献报道。由于协同抗氧化过程比较复杂，目前人们对其机理的了解 还不十分透彻。总结已有研究工作，协同抗氧化方式主要有以下三种。 ( 1 ) 再生抗氧化剂 有些抗氧化剂如v c ，辅酶q 除了自身可直接作用于氧化过程外还可以与高效抗氧 化剂( 主要为v e ) 交换电子从而使v e 维持正常水平不断发挥抗氧化作用。v e 与v c ，在 抑制大豆磷脂的脂质体、鱼油、均相体系中亚油酸或亚油酸甲酯的脂质过氧化等实验中， 人们发现在反应初期v e 的浓度基本不变，而v c 的浓度有所下降，待v c 完全消耗后， v e 的浓度开始下降。由此人们推测v c 可将v e 自由基还原为v e ，从而提高溶液中v e 的有效浓度，增强抗氧化能力；同时v c 还可将脂质化合物的氢过氧化物分解成非自由 基产物，表现出协同作用。 p o o h 啼r 0 0 。v e 、，v c ) (x r o o h 、v e v c 另外，何东f 2 等用前线分子轨道理论对上述现象进行了理论解释。前线分子轨道反 应理论指出，对反应体系稳定性及新化学键生成起重要作用的是最高占据轨道( h o m o ) 一最低空轨道( l t r m o ) 间的相互作用。v c 的h o m o 轨道由碳和氧原子的p z 轨道组成， 而v r 自由基的l u m o 轨道也由p z 轨道组成，两者的能级差较小( 约为0 3 l h a r e t r e e ) ， 因此v e 自由基有可能同v c 反应而再生。 p a l o z z a 和k r i n s l o ：2 1 1 观察到6 胡萝h 素和v e 混合后比单一成分对于防止癌变及抑 制早期肿瘤更有效。李兆陇等发现d 一胡萝h 素在均相有机溶液中可以有效地抑制亚油 酸的过氧化，而且与v e 合用时具有显著的抗氧化协同作用和相互保护作用，他们将这 归因于阻胡萝h 素氧化产物视黄醇及p 胡萝卜素的降解醛( r c h o ) 可还原v e 自由基使 4 某些天然抗氧化剂在复杂体系中抗氧化作用的研究 | i v e + r c h o 。v e + r e 另据报道，茶多酚f r p ) 对v r 及v c 都有保护作用】。在由a a p h ( 2 , 2 偶氮- - - - ( 2 脒基丙烷) 二盐酸盐) 引发的亚油酸的自动氧化试验中，利用氧气吸收法研究t p 与v e 的 抗氧化活性，结果表明t p 可以保护、飞，抑制v e 消耗。 咖h 一：) ( ：) ( ：臻体 1 9 5 9 年，e r i f e e v a 和s h a m r a i 发现t p 可以显著增加动物组织中的v c 的含量。吴瑞 荣和s t a 9 9 1 2 4 0 5 1 研究证实了t p 能够促进人体内生v c 的贮存量。其原因为t p 再生了v c 。 呦一：) ( 薹) ( ：臻体 ( 2 ) 清除氧气 在菜油和猪油中，类胡萝h 素与v c 间存在协同抗氧化作用。在油脂中类胡萝卜 素通常存在以下反应。 c a r 十0 2 ；= = = c a r - 0 0 ( 1 2 ) c a r + r o o 非自由基产物 ( 1 3 ) c a r ：类胡萝h 素自由基 v c 具有强还原性，可与油脂中的氧反应，使氧浓度降低。当胡萝h 素与v c 组合时， 由于v c 的作用，反应( 1 - 2 ) 被抑制，c a r - 0 0 的生成速率远远小于c a r - ，从而有效降低了 体系中过氧化自由基的浓度，表现出抗氧化协同作用。 ( 3 ) 螯合金属离子 1 9 3 6 年，o l c o t t 与m 毗i l 嘲发现酚型抗氧化剂与酸性物质( 如柠檬酸、磷酸等) 混合 使用时，具有显著的抗氧化效果，其原因为这些酸性物质可螯合金属离子，抑制金属离 子对过氧化物的催化分解，进而表现出抗氧化协同作用。 抗氧化剂的的协同作用除了能提高每种化合物的抗氧化效果外，还能降低每一种抗 氧化剂浓度，减少抗氧化剂用量。然而大多数化合物的抗氧化协同作用的机理仍不十分 5 河南工业大学硕士学位论文 1 2 非均相食品体系及非均相生物体系中脂质氧化的抑制 1 2 1 非均相食品体系一食品乳状液中脂质氧化的抑制 在实际生产中，大量食品是由乳状液或部分乳状液组成，或在生产加工过程的某些 时候以乳化形式存在，如牛奶、乳酪、蛋黄酱、人造奶油、冰淇淋、酱油、婴儿食品和 饮料等。乳状液是由两种互不相溶的液体( 通常是油和水) 组成的非均相体系，一种液体 以球形小液滴的形式分散到另一种液体中。根据油相和水相在体系中的相对位置不同， 乳状液可分为两类：油滴分散到水相的体系称为水包油型乳状液( o w ) ，例如蛋黄酱和 牛奶；水滴分散到油相的体系称为油包水型乳状液( w o ) ，例如人造奶油和黄油。油包 水型乳状液中脂质氧化的速度与均相体系中油脂的氧化速度相似，因为油包水型乳状液 的油相表面直接暴露在空气中。 乳状液是热力学不稳定体系。为了形成在一定时间内稳定的乳状液，须添加一些乳 化剂。乳化剂是表面活性分子，均质时吸附到油滴表面形成一层膜，阻止油滴聚集。食 品工业中最常使用的乳化剂是两性蛋白质( 酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白或鸡蛋蛋白等) 、 磷脂( 鸡蛋磷脂或大豆磷脂) 和小分子表面活性剂( s p a n ，t w e e n 或甘一酯) ，这些乳化剂形 成的界面膜对乳状液中脂质的氧化有较大的影响。 乳状液中脂质氧化受多种因素影响，如抗氧化剂、界面层特性、脂质结构、氧浓度、 水相中的各种成分、溶液的p h 值、生产乳状液所使用的原料的质量等。 通过大量研究，可以找出延缓食品乳状液中脂质氧化的办法，主要有以下几种：( 1 ) 通过除去体系中的氧可以提高乳状液的氧化稳定性，例如采用真空或充氮包装技术。( 2 ) 使生产食品乳状液所用的原料中氢过氧化物、过渡金属或其他促氧化剂的含量低，也能 提高乳状液的氧化稳定性，一般可采用纯度高杂质少的原料或在使用前将原料纯化。但 从实际来看，使用高纯度的原料或在使用前将其进一步纯化的方法不十分可行。( 3 ) 通过 阻止氢过氧化物靠近促氧化剂或使促氧化剂失活，能有效延缓脂质氧化。可采用以下方 法：向乳状液水相中添加e d t a 、肌醇六磷酸、蛋白质或多糖等能螯合过渡金属的成 分，使过渡金属失活；使用能让油滴带正电的乳化剂，通过静电排斥，阻止过渡金属 与界面上的氢过氧化物接触；避免将过渡金属还原成其最高活性形式( 如将f 矿+ 还原成 f e 2 + ) ；使用能形成厚界面层的乳化剂，使氢过氧化物与促氧化剂隔开：通过加热、 添加变性剂或调整p h 使促氧化酶失活。( 4 ) 使用链断裂型抗氧化剂保护脂质免于氧化， 尤其是使用位于油水界面附近的抗氧化剂最有效，因为脂质氢过氧化物位于油水界面。 实际上，延缓脂质氧化最有效的办法是将上述方法结合使用。由于每种食品乳状液 6 某些天然抗氧化剂在复杂体系中抗氧化作用的研究 都有其独特的组成和结构，因此对于不同的食品乳状液应采取不同的抗氧化措施。 1 2 2 非均相生物体系一脂质体中脂质氧化的抑制【1 2 1 生物的基本结构和功能单位是细胞，任何细胞都以一层薄膜将其内含物与环境分 开，这层膜称细胞膜或外周膜。此外，真核细胞中还有许多内膜系统，组成具有各种特 定功能的亚细胞结构和细胞器，例如，细胞核、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基体和 过氧化物酶体。此外，在植物细胞中还有叶绿体等。细胞的外周膜和内膜系统称为“生 物膜”。生物膜结构是细胞结构的基本形式，它对细胞内很多生物大分子的有序反应和 整个细胞的区域化都提供了必需的结构基础，从而使各个细胞器和亚细胞结构既各自有 恒定、动态的内环境，又相互联系，相互制约，从而使整个细胞活动有条不紊、协调一 致地进行。 生物膜主要由蛋白质( 包括酶) 、脂质( 主要是磷脂) 和糖类组成，脂质以磷脂为主， 分布很广泛。 囊泡是两个双亲分子定向单层尾对尾结合成的封闭双层外壳和壳内包藏的微水相 而构成，由磷脂分子形成的囊泡又叫脂质体。脂质体是2 0 世纪6 0 年代由b a n g h 锄博士首 次发现并命名的【翊。 在生物体内存在有活性很高的清除自由基的两大系统维持体内活性氧的产生和清 除。一类为抗氧化酶防御系统，另一类为非酶( 小分子抗氧化剂) 防御系统。在正常情况 下，由于体内抗氧化防御体系存在，机体内自由基的生成与清除处于动态平衡。当体内 自由基的生成过多或清除自由基系统出现故障，均可导致自由基在体内的堆积，或称氧 化应激态。高水平的自由基会对机体产生损伤作用，其中对脂质的损伤表现为脂类的过 氧化反应，生成脂质过氧化物( 主要为脂质氢过氧化物) ，使组织及体液的脂质过氧化物 明显升高，从而导致疾病的产生。外加一些抗氧化剂协助体内维持氧代谢的平衡对防止 疾病的发生和保持机体的健康是十分有益的。抗氧化剂可消除体内过量的活性氧并提高 机体的免疫力，从而达到预防和治疗由活性氧引起的疾病的目的。 1 3 生物抗氧化剂 1 3 1 植物甾醇 甾醇( s t e r 0 1 ) 是甾类化合物中的一类仲醇，在自然界广泛分布，主要存在于动植物的 油类与脂肪中。甾醇又称固醇，是3 位碳孤子上连接有羟基的甾体化合物，属于四环三萜 7 河南工业大学硕士学位论文 类天然产物，它的主体是环戊烷并多氢菲的甾核【2 9 州。多数甾醇c 一5 位为双键，c 3 位羟基 是重要的活性基团之一，甾醇可以通过此基团形成各种衍生物。 自然界存在的甾醇可能有1 7 0 0 多种。甾醇的含量和组成因其种类、产地和来源的不 同而不同。根据来源不同，甾醇可分为动物甾醇、植物甾醇和菌类甾醇三类。动物甾醇 来自动物组织和动物细胞中，主要有胆甾醇、胆甾烷醇、粪甾烷醇等。植物甾醇是一种 类似于环状醇结构的物质，代表了植物代谢的一个终产物。菌类甾醇主要存在于霉菌和 蘑菇之中，有麦角甾醇等。其中，在已发现的4 0 种较为主要的植物甾醇中含量最大的是 谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇。 植物甾醇属于天然物质，本身无毒性，具有良好的乳化性和稳定性等特点，因此广 泛用于医药d l , 竭、食品 3 3 , 3 4 1 、日用化学品【明以及化工、纺织等各个领域的相关行业【3 6 1 。 研究表明，许多植物甾醇具有抗氧化能力，这起因于发现橄榄油、玉米胚芽油及小 麦胚芽油能使红花籽油在煎炸条件下保护其脂肪酸不发生氧化降解。特别是5 一燕麦 甾醇、7 一燕麦甾醇、甜谷甾醇和斑鸠甾醇被发现具有阻止不饱和脂肪酸在高温加热条 件下发生氧化降解的功能，在同等条件下，争谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇不具抗氧化活 性，或有轻微助氧化作用。1 9 9 9 年芬兰a n n a - m a i j al a m p i 和瑞典l e n ah d i m b e r g 等j k 【3 7 】 研究了豆甾醇、谷甾醇和岩藻甾醇在高温条件下对高油酸葵花籽油的抗氧化和抗聚合效 果。结果表明，植物甾醇的抗氧化效果不仅与自身分子结构有关，而且在很大程度上受 氧化产物影响。例如，5 的b 谷甾醇在葵花籽油和猪油中表现出抗氧化效果，但含亚乙 基侧链的岩藻甾醇在葵花籽油煎炸模型中却没有表现出抗氧化效果。 当热、光、金属污染物和氧存在时，形成的自由基极易攻击植物甾醇环上的双键， 开始自动催化自由基链式反应，就如同其他不饱和脂肪酸一样。活性氧化剂和氧化酶类 也可以引发植物甾醇的氧化反应，主要的产物可能是7 氢过氧化物【3 8 j 。 我国的中草药药理临床研究发现，中草药中所含甾醇具有清除自由基的作用。资源 丰富的海洋生物中含有与陆地生物不同的甾核，已鉴定的海洋甾醇达1 6 0 种，它们是否 也具有与陆地生物所含甾醇清除自由基效应，尚需进一步研究。此外，植物甾醇与其他 天然抗氧化剂的协同效应也值得关注和研究。 1 3 2 胆固醇 n 醇( c h o l e s t e r 0 1 ) 亦称胆甾醇，它以游离或酯( 软脂酸、硬脂酸、油酸) 的形式存在 于一切动物组织中，是构成动物细胞膜的必需成分，在人体中主要存在于血浆、肝和肾 上腺中，具有重要的生理作用，是人体必需的营养成分【3 9 1 。 胆固醇含有一个双键和一个羟基，易发生结构变化。胆固醇受光热氧等条件的影响 某些天然抗氧化剂在复杂体系中抗氧化作用的研究 容易形成胆固醇氧化物( c h o l e s t e r o lo x i d a t i o np r o d u c t s ，c o p s ) 。近年来生物医学研究表明 c o p s 具有很强的细胞毒害性【加】、致突变性和可能的致癌性h ”，可明显促进动脉粥样硬 化【4 2 1 ，导致固醇类化合物代谢紊乱 4 3 】，危害人体健康，从而引起人们对c o p s 的广泛关 注。据报道，胆固醇在空气中的氧化产物约有7 0 多种，其中有些氧化产物如2 ，5 二羟基 胆固醇、3 p ，5 c t ，6 p - 三醇胆烷对人体是有害的，而其它代谢产物如粪烯醇、粪甾烷酮有 致癌作用。 1 3 3 天然色素 天然食用色素是从天然原料( 主要是植物原料) 中提取并经过精制而得到的产品，广 泛应用于饮料、酒类、糕点、糖果、乳制品、罐头等食品中，以改善食品外观品质，可 广泛应用于医药、化妆品及日用品等行业中】。 现代科学研究表明，天然色素不但起着着色作用，而且具有营养、保健和药效等功 能，对人体健康有重要的保护作用。令人注意的是，天然色素具有一定的抗氧化和清除 自由基能力，具有抑制食品抗氧化的作用，下面以原花青素的抗氧化活性为例说明其抗 氧化作用。 原花色素的抗氧化特性是通过几种途径综合体现出来的。原花色素具有很强的自 由基清除能力，是一种强有力的自由基捕获剂嗍，它可以清除体内过多的自由基，恢复 代谢平衡。对一系列由自由基引起的疾病，如炎症疾病、心血管疾病、血循环障碍、关 节炎、神经疾病和许多与衰老有关的疾病等具有预防作用。原花色素在体内吸收快，能 通过血脑屏障，对自由基所导致的脑和脊髓神经的损伤起保护作用，避免因此引发的帕 金森氏综合症、早老性痴呆症等。 原花青素的抗氧化活性来源于多酚分子中大量的酚羟基，分子中所含的酚羟基越 多，分子量越大，其抗氧化性越强。酚羟基的还原性是酚类化合物的共性之一。原花色 素分子中的多个酚羟基可以作为氢供体，对多种活性氧均具有清除作用，可将单线态氧 还原成活性较低的三线态氧，减少氧自由基的产生。此外，原花青素也可清除各种自由 基，生成活性较低的原花色素自由基，打断自由基氧化的链反应【4 ”。连苯三酚或邻苯二 酚的结构进一步加强了其还原性，使原花色素在氯酸钾、双氧水和重铬酸钾等强氧化剂 作用下，不仅酚羟基受到氧化，而且糖环、杂环甚至苯环同时开裂，被氧化降解。另外， 原花色素很容易被空气中的氧所氧化，特别是在水溶液状态和有原花色素氧化酶存在 下，酚羟基通过离解，生成氧负离子，再进一步失去氢，生成具有颜色的邻醌，使多酚 的颜色加深，而醌很易被还原为酚。再者，对于有氧化酶存在的体系，原花色素对其有 显著的抑制能力。原花色素还能与v c 和v e 等抗氧化剂之间产生协同效应，具有增效剂 9 河南工业大学硕士学位论文 的作用。 原花青素作为一种抗氧化剂，在相对低的浓度下能推迟或抑制自由基介导的氧化损 伤。2 0 0 9 的典型水果中，总生物黄酮原花青素含量在5 0 5 0 0 m g 之间，其中苹果中的含 ：e 超过2 0 0 m g t 4 羽。为使血浆中原花青素含量保持稳定，可有规律的食用足够量的新鲜水 果及蔬菜或经常补充原花青素。原花青素的化学结构决定了其吸收、分布、代谢及排泄。 提取方法不同也会影响原花青素的吸收及生物活性【4 9 】。溶于水及乙醇的原花青素被人体 吸收后，广泛地分布于组织及血浆中。一般原花青素的二聚体、三聚体、四聚体容易提 取，具有极高的生物活性，有助于健康。这些低分子量的原花青素被人体吸收后，存在 于血浆及组织中达7 1 0 天，保持其抗氧化性。相反，高分子量的原花青素不易提取， 抗氧化性可能高于低分子量的原花青素，但不易吸收或根本没有生物活。i , 生t s o j 。因此低聚 原花青素仍然是人们研究的主要对象。 1 4 本课题的目的和意义 食品是由多种成分组成的多相体系，其中脂质的氧化是一个十分复杂的化学反应过 程，食品中脂质的氧化产生令人讨厌的气味，并能生成对人体有毒的化合物，严重影响 食品的质量。近年来，脂质氧化对机体的生理过程和病理损伤也受到人们的广泛关注。 在正常情况下，由于体内各个抗氧化体系的存在，体内氧自由基的产生和清除是平衡的。 一旦氧自由基产生过多或抗氧化体系出现故障，体内氧自由基代谢出现失衡，适当补充 外源性抗氧化剂可以改善这一状况。外加的抗氧化剂对防止疾病的发生和保持机体的健 康，以及对保持食品的色泽、滋味、风味和质量有重要作用。 天然抗氧化剂因其无毒无害无副作用等优点越来越受到青睐。除了作为食品添加剂 以延长食品保质期外，天然抗氧化剂因为能够清除人体内自由基而具有延缓衰老预防癌 症、冠心病和心血管等各种疾病的作用。过去研究的焦点主要集中在一些具有抗氧化性 的维生素，如维生素e 、c 、a 和b 胡萝p 素等。近十年来随着回归自然的风潮，人们逐 渐关注一些植物来源的物质，如黄酮、萜类、多酚类、烯酸、多糖和多肽等。 目前，对抗氧化活性成分及其效果的研究也存在许多问题，单一活性成分的抗氧化 效果往往弱于混合物，而且某一成分的抗氧化活性的评价因实验方法的不同差异较大， 应重视对抗氧化活性成分之间抗氧化协同作用的研究，注意到天然抗氧化成分在生物体 中和食品中抗氧化作用的差异。各种抗氧化剂的抗氧化活性除了与它本身的结构性质有 关外，还决定于它使用的底物、温度、溶解分散能力以及增效效应等因素。 过去，对抗氧化剂的抗氧化活性的评价主要集中在均相体系，这就产生了两个问题。 第一，如前所述，真正食品体系是复杂体系( 如乳化体系) ，均相体系下得到抗氧化作用 1 0 某些天然抗氧化剂在复杂体系中抗氧化作用的研究 规律可能不适用或不完全适用于食品体系。第二，天然抗氧化剂具有对生命体免受氧化 损伤的保护作用，氧化损伤主要是针对生物膜，生物膜中不饱和脂肪酸是以磷脂脂质体 形式存在，不同于均相体系中的脂质形式，需要评价在该体系下抗氧化剂的抗氧化行为。 此外，食品及生命体中有多种抗氧化剂并存，研究其协同作用有助于深入了解各种抗氧 化剂的作用。 因此，研究在以表面活性剂t w e e n 2 0 稳定的葵花油水包油乳状液模拟食品体系、大 豆磷脂脂质体模拟生物体系，用水溶性偶氮化合物a a p h 引发脂质氧化，研究植物甾醇 ( p 谷甾醇和豆甾醇) 、动物甾醇( 胆固醇) 和天然色素( 欧李红色素) 在非均相食品体系和非 均相生物体系中对脂质氧化的影响，以及在该体系下它们与维生素c ( v c ) 和维生素e ( v o 之间的协同作用，以期为天然抗氧化活性的评价和抗氧化剂的大量筛选以及保健型功能 食品的研发提供理论依据和实验基础，同时为寻找安全、高效低毒的天然抗氧化剂奠定 基础。实验结果表明，p 一谷甾醇、豆甾醇、胆固醇和欧李红色素在试验条件下均具有抗 氧化活性，与v c 或v e 共同作用时部分浓度的复合抗氧化剂显示了协同增效作用。 河南工业大学硕士学位论文 第二章实验材料与方法 2 1 实验材料和试剂 9 - 谷甾醇( b e t a - s i t o s t e r o l ，w i t hc a 1 0 c a m p e s t e r 0 1 c a 7 5 b e t a - s i t o s t e r 0 1 ) 豆甾醇( s t i g m a s t e r o l ，9 5 ) 胆固醇( c h o l e s t e r o l ，s t a b i l i z e d , 9 5 ) 欧李红色素 抗坏血酸( v c ) 小生育酚( v e ) 葵花籽油 大豆磷脂 t w e e n 2 0 a a p h ( 2 ，2 一偶氮( 2 一脒基丙烷) 盐酸) 磷酸氢二钠 磷酸二氢钠 氯化钠 f e c l 2 4h e o 浓盐酸 硫氰酸铵 无水乙醇 2 一硫代巴比妥酸( w a a ) 三氯乙酸( t c a ) 叔丁基对苯二酚( t b h q ) 三氯甲烷 二次蒸馏水 2 2 主要仪器 k q - 1 0 0 超声波清洗仪 8 0 一1 型离心沉淀机 北京百灵威化学技术有限公司 北京百灵威化学技术有限公司 北京百灵威化学技术有限公司 卢奎老师馈赠 a r 级，洛阳化学试剂厂 s i g m a 公司 天津嘉里粮油工业有限公司 黑龙江前进油厂 上海三浦化学试剂公司 a l d r j c h 化学试剂公司 洛阳化学试剂厂 洛阳化学试剂厂 洛阳化学试剂厂 含量 9 9 7 ，天津双船化学试剂厂 含量3 6 3 8 ，洛阳吴华化学试剂厂 含量 9 8 5 洛阳化学试剂厂 洛阳吴华化学试剂厂 生化试剂，中国医药( 集团) 上海化学试剂公i a r 级，上海化学试剂采购供应站 纯度 9 7 ，s i g m a 公司 洛阳化学试剂厂 蒸馏水中加入高锰酸钾放置2 4 h 后蒸馏得到 巩义市英裕予华仪器厂 江苏姜堰市天力医疗器械有限公司 某些天然抗氧化剂在复杂体系中抗氧化作用的研究 t l 8 0 - 2 型医用离心机 s h z - - d a ( i i i ) 循环水式真空泵 旋转蒸发器i 江一5 2 c 7 2 2 s 型分光光度计 s h z c 水浴恒温振荡器 1 0 1 2 s 型电热恒温鼓风干燥箱 b s 2 2 4 s 万分之一电子天平 微量加样器( 1 0 1 0 0 u l ) 微量加样器0 0 0 一5 0 0 u l ) 2 3 主要试剂的配制方法 江苏姜堰市天力医疗器械有限公司 巩义市英裕予华仪器厂 巩义市英裕予华仪器厂 巩义市英裕予华仪器厂 江苏省金坛市华锋仪器有限公司 上海路达实验仪器厂 北京赛多利斯仪器系统有限公司 上海青花仪器厂 上海求精生化试剂仪器有限公司 2 3 1 磷酸盐缓冲液( p h o s p h a t eb u 仃e r ) 的配制 称取n a 2 h p 0 44 7 9 9 1 9 ，n a h 2 p 0 41 0 2 9 7 9 ，n a c l8 5 0 0 9 加二次蒸馏水溶解定容至 1 0 0 0 m l ( o 0 2 m 、，p h 7 4 ( 2 r c ) 。 2 3 2a a p h 溶液的配制 称取0 5 0 0 0 9