（光学工程专业论文）悬浮式生物芯片中的多通道同步数据采集.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 生物芯片的出现是近年来高新技术领域中极具时代特征的重大进展，它是物理学、 微电子学与分子生物学综合交叉形成的新技术，目前已经成为人们高效、准确、大规模 地获取相关信息的重要手段之一。目前，生物芯片技术在生物基因测序、基因突变及基 因多态性分折、食品科学、医学诊断等领域已经得到了广泛应用。常见的生物芯片有两 种；固态生物芯片和悬浮式生物芯片。但由于固态生物芯片需要根据不同检测对象制作 各种芯片，成本昂贵，工艺复杂，大大限制了固态生物芯片的发展。悬浮式生物芯片以 其成本低廉、检测方便而有着广阔的应用前景。 在悬浮式生物芯片系统中，图像的采集是其重要组成部分。由于该系统需要同时对 多个光路信号进行图象采集，本文提出了一种采用c m o s 和多通道同步并行检测的生物 芯片检测方法。此方法需要多个c m o s 同步对通道中的荧光信号进行采集。因此本文先 从双通道开始，重点论述了基于c m 0 s 的两个通道同步图象数据的采集系统。 首先对图像采集系统的原理方案进行了分析和论证，然后确定了各个主要器件的型 号，接着设计了双通道图像采集系统的电路原理图，制作了p c b 板，完成了硬件电路的 调试和相应的软件编程，最后搭建了实验平台，进行了双通道的图象采集实验，最终的 实验结果表明：利用本系统可以实现悬浮式生物芯片的多通道同步图象数据采集功能。 论文的第一章介绍了生物芯片技术的发展和现状、研究背景和意义。第二章介绍了 悬浮式生物芯片的并行检测方案。第三章提出了悬浮式生物芯片的多通道图像采集系统 的原理设计方案。第四章简要介绍了系统相关的软硬件背景。第五章主要论述了系统具 体的软、硬件设计。第六、七章分析了实验结果，并对整个系统的性能做出了总结。 关键词：悬浮式生物芯片c m o s 图象采集 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h eb o r no f b i o c h i pi st h em o s ti m p o r t a n ts y m b o li nt h eh i g ht e c h n o l o g y ，i tc o m b i n e s k n o w l e d g e i nm a n yf i e l d s ，s u c ha sp h y s i c s 、p h o t o e l e c t r i c i t y 、g e n e t i c sa n d5 0o n , n o wi th a s a l r e a d yb e e nt h em o s ti m p o r t a n tm e t h o dt og e ti r r e l a t i v ei n f o r m a t i o n n o wb i o c h i ph a sb e e n w i d e l ya p p l i e dt og e n ei n s p e c t i o n 、a b e r r a n c e 、b r o m a t o l o g y 、d i s e a s ed i a g n o s e sa n ds o m e o t h e rf i e l d s g e n e r a l l y , t h e r ea r et w ok i n d so f b i o c h i p ：s o l i db i o c h i pa n ds u s p e n s i o nb i o c h i p s u s p e n s i o nb i o c h i pi sm o r ew i d e l yu s e db e c a u s ei tc o s t sl o w e ra n dc a nb eu s e dm o r e c o n v e n i e n t l y i nt h es y s t e mo f s u s p e n s i o nb i o c h i p ，t h ei m a g ea c q u i r i n ga n d p r o c e s s i n gp l a yav e r y i m p o r t a n tr o l e ，t h i sa r t i c l eo f f e r saw a y i nb i o c h i pt e s t i n gu s i n gc m o sa n dm u l t ic h a n n e l s s y n c h r o n i z a t i o n t h i sm e t h o dn e e d sm u l t i p l ec m o s s w o r ks y n c h r o n i z a t i o nt og e t i n f o r m a t i o n s ot h ei m p o r t a n c eo f w h a t1w i l ls a yi sh o wt h eb i o c h i pg e td a t as y n c h r o n i z a t i o n i nt w oc h a n n e l su s i n gc m o s a tf i r s t ，t h ea r t i c l ea n a l y z et h ep r i n c i p l eo ft h es y s t e m , t h e n , f i xo nt h et y p eo ft h ek e y d e v i c e s a n dd e s i g nt h ep c b 而t l lp r o l t e l 9 9 a f t e rf i n i s ht h ed e s i g no fh a r d w a r ea n d s o f t w a r e ，t h es y s t e mw o r k sw e l l a tl a s t ，w et e s tt h ew h o l es y s t e m ，t h er e s u l ti l l s t r a t et h a ti ti s p o s s i b l et od e t e c tf l u o r e s c e n c es y n c h r o n i z a t i o ni ns u s p e n s i o nb i o c h i pb yt h i si m a g ea c q u i r i n g w i t hm u l t i p l ec h a n n e l s a b r i e f d e s c r i p t i o na b o u tt h ec u r r e n ts i t u a t i o n 、b a c k g r o u n do f t h er e s e a r c h 、m e a n i n go f s u s p e n s i o nb i o c h i pi sg i v e ni nt h ef i r s tc h a p t e r s c o m p a r e dw i t ht h ee x i s t i n gd e t e c t i o np r o c e s s i ns u s p e n s i o nb i o c h i ps y s t e m , t h en o v e ld e s i g ni sp r e s e n t e di nt h es e c o n dc h a p t e r i ti sa b o u t t h ep r i n c i p l eo f t h es y s t e mo f a c q u i r i n gi m a g e sf r o mm u l t i p l ec h a n n e l ss y n c h r o n i z a t i o ni nt h e f o l l o w i n gc h a p t e r s t h eb a c k g r o u n do fh a r d w a r ed e s i g n a n ds o l , r a r ep r o g r a m m i n ga r e d i s c u s s e di nt h ef o u r t hc h a p t e r i ti sa b o u th o wt od e s i g nt h es y s t e ma n dm a k ei tw o r kw e l li t t h ef i f t hc h a p t e r a tl a s t ，t h ep e r f o r m a n c eo ft h i si m a g ea c q u i r i n gs y s t e mi sa n a l y z e di nt h e s e v e n t hc h a p t e r , h e r ew ea l s os u m m a r i z et h ew h o l es y s t e m k e y w o r d s ：b i o c h i p c m o s a c q u i r ei m a g e h 浙江大学硕士学位论文 1 1 生物芯片技术 1 1 1 生物芯片综述 第一章绪论 生物芯片技术是一种新型的生物检测技术，是继2 0 世纪5 0 年代半导体芯片后微芯 片技术的又一重大发展，也是2 0 世纪9 0 年代中期以来影响最深远的科技进展之- - 1 1 l 。 生物芯片技术是指将大量探针分子固定于载体( 如玻片、金属片、高分子材料制作的薄 膜等) 中，然后与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布而对样品 分子的序列和数量进行分析的一项技术【2 】。 随着生物芯片技术的迅速发展，各种功能的生物芯片相继问世，逐步实现对基因、 抗体、抗原等生物活性物质的快速高效的测试和分析，尤其最成熟的基因芯片技术已经 被成功地应用于分子生物学中基因结构与功能的研究( 基因测序、基因表达分析【3 】巾】、 基因突变和多态性检测) 、食品科学( 转基因食品的检测、食品中微生物的检测、食品 卫生检验) 、医学 s l - i t 】( 临床医学、疫苗研制、药物研究方面) 等领域【12 1 ，其他类型的 生物芯片也在军事、农业等领域发挥前所未有的巨大作用。生物芯片技术融合了微电子 学、生物学、物理学、化学、计算机科学等多个学科的先进技术，具有重大的研究价值 和良好的产业化前景。 生物芯片技术与传统的膜杂交技术相比，样品用量少，操作简单，自动化程度高， 检测靶分子种类多，检测效率高等优点，而微阵列分析方法的通量可达传统的膜杂交的 数千万倍，这是生物芯片分析显著的一个优势。 图i - i 是常见的生物芯片的微阵列图 生物芯片根据不同的分类标准，可以分成不同的类别。根据芯片上固定的物质的不 同，可以分成3 大类：基因芯片( d n a 芯片) 、蛋白质芯片、片上实验室( 也叫l o c l a b o nc h i p ) 。基因芯片又称为寡核苷酸探针微阵列，是基于核酸探针互补杂交技术原理 研制的。它是根据碱基互补的原则，利用基因探针在基因混和物中识别特定基因。蛋白 质芯片的芯片上固定的是蛋白质分子，他利用蛋白质分子和核酸、蛋白与其他分子反应 作用【l2 1 。 浙江大学硕士学位论文 图卜i 红绿彩色生物芯片阵列 芯片实验室是生物芯片发展的最终目标，它是将芯片的制备、生化反应、结果的检 测、处理、分析整合，得到的一个封闭式、全功能、微型化、便携式的微型分析系统。 是2 0 世纪9 0 年代瑞士c i b ag e i g y 分析实验室的w i d m e r 和l i a n z 等提出的一个全新概 念。这在美国叫做片上实验室( l a bo n a c h i p ) ，在欧洲称为m t a s ( m i c r ot o t a la n a l y s i s s y s t e m s ，微型综合分析系统) 。图卜2 显示的是一种l o c 的结构 图卜2l o c 的结构 生物芯片还可按标记种类来分成三类：荧光染料、化学发光、放射性标记。目前大 部分生物芯片采用荧光染料标记，其中大部分用c y 3 ，c y 5 两种染料来标记”“。图卜3 的是c y 3 ，c y 5 标记的c d n a 样品吸收光谱，光栅扫描仪显示c y 3 在5 5 0 n r a 为典型吸收峰 值，c y 3 在6 5 0 为典型吸收峰值。 2 浙江大学硕士学位论文 图卜3 分别标记c y 3 ，c y 5 的样品的吸收光谱 分子荧光是发生于从第一激发单线态的最低振动能级向基态跃迁而辐射光子的过 程，在理想情况下，分子荧光光谱是其吸收光谱的镜像，而荧光波长通常向长波长方向 移动，此规则称为斯托克斯规则，最大荧光波长与最大吸收波长之差称为斯托克斯位移 ( s t o c k ss h i f t ) 。斯托克斯位移越大，越易消除激发光带来的影响，实验效果越好【l 卦。 本实验中用到了的一个激光的是激发光为5 6 0 a m ，由于受s t o c k s 位移的影响，被激发的 荧光波长为5 9 0 h m 。 生物芯片的制备利用比较成熟的一些微细加工工艺，在硅片、玻璃、塑料等基质上 加工出用于生物样品分离、反应的微米尺寸的微结构，然后对芯片进行表面化学处理， 以减少生物样品非特异性吸附等，才能在芯片上进行所需的生物化学反应和分析。在微 细加工工艺上，目前比较成熟的有光学掩模光刻技术、激光切削、反应离子刻蚀、微注 入模塑和聚合膜浇注法等。 生物芯片依据制备时是否需要事先合成寡核苷酸从制作技术上基本可以分为两大 类：一类是机械点样法( p o s t s y n t h e t i ca t t a c h m a n t ) ；一是原位合成法( i ns i t u s y n t h e s i s ) 【1 4 1 。 机械点样法包括接触式打印法和非接触式喷印法。接触式打印是指点样器件与基片 间有接触的微阵列制备技术。在接触式点样技术中，运动控制系统上装有一根或者多根 微点样针，微点样针的头部有一个能够存放一定体积样品的通道，用样品通过虹吸作用 3 浙江大学硕士学位论文 载入加载器，然后通过直接物理接触传送至基片表面，逐点在基片上打点就可以制得生 物芯片微阵列。全部操作由自动控制系统和多道打印头完成。该技术需要预先合成寡核 苷酸及一系列纯化、储存等后续过程，密度低。为从事基础研究的实验室广泛采用。采用 非接触式点样法制备微阵列时不需要点样器件和基片直接接触，而是采用热喷印、压电 晶体喷印或者注射泵推进喷印等方法把样品“喷”到基体表面。另外，喷头还可以实现 一种或几种样品的快速喷射，适合制各样品种类不多的微阵列芯片。“喷印”方法优点 是允许几乎用任何感兴趣的样品做生物芯片，包括c d n a 、基因组d n a 、抗体和小分子物 质，理论上允许高速高密度制备，目前可以在1 c 舻面积上喷射1 0 0 0 0 个点，速度相对较 快、可以精确设计喷印液滴的体积。另外，由于喷印技术不需要点样器件和基片表面接 触，因而对表面无损伤。其中常用的压电喷印技术是使用压电晶体推进形式来喷出喷头 小孔中的液滴。 原位合成法是采用光导化学合成和照相平板印刷技术在载体表面合成寡核苷酸探 针的方法。它借鉴了半导体芯片加工制作中的光刻方法，利用较少的步骤就可以合成大 量产物并且具有并行性和高效性的特点。目前，原位合成法发展非常迅速，已经在生物 芯片的制备中得到了广泛的应用。 1 1 2 悬浮式生物芯片 所谓悬浮式生物芯片是相对于固态的平面生物芯片而言的，由于固态生物芯片采用 固态的平面微阵列，必须根据需要检测样品的不同种类设计不同阵列的片，成本比较昂 贵。再加上固态生物芯片要求的技工工艺比较复杂，面阵的均匀性比较差，杂交反应也 不理想，大大限制了它的发展。 为了克服固态生物芯片的缺点悬浮式生物芯片技术应运而生。该技术的检测载体 为不同规格的微球，检测的环境是在微通道的液相中。首先将探针分子固定在微球上， 此探针分子标记了分类荧光。然后将这些微球探针悬浮在用来检测的液相体系中。同时 将待测分子放在液相中，此待测分子固定了一定数量的标记荧光的报告分子。不同种类 的探针分子和对应的待测分子在液相中发生化学反应。用两束不同波长的激光同时对逐 通过检测流场的微球探针上的分类荧光和报告分子上的标记荧光进行照射，由于只有 反应后的荧光会被激光所激发，产生s t o c k ss h i f t 效应，在接受端就可以通过检测被 激发的分类荧光和报告分子荧光的强度的检测，以获得被固定的待测分子的种类和数量 4 浙江大学硕士学位论文 信息。其原理如图卜4 c _ 妒 分 一竺! 卜 二 色 计 系酐 算 机 统 怔五卜 图1 8 悬浮式生物芯片的并行检测原理 8 浙江大学硕士学位论文 该检测方法使用脉冲氙灯配合滤波片作为荧光激发照明光源，承载待测试液的微型 通道被设计成扁平状，其特殊的结构使之在液体流动时近似为一个二流场。光源对整个 区域同时照明，每次可以激发这一区域内的多个荧光小球发出荧光。荧光经物镜成像后， 通过分色系统( 分色镜组和前端滤波片) ，将荧光中含有的三个波段的光谱分别传到三 个高灵敏度面阵c c d 中，从而获得两副分类信息荧光图象和一副数量信息荧光图象。荧 光图像通过高速图像采集卡传输至计算机中进行处理，就可以得到待测试液中蕴含的全 部生物反应信息。由于该系统能一次对氙灯照射区域内的全部微球进并行检测，而面阵 c c d 同时以一定的速度拍摄，这样每秒钟检测的微球数将达数千个。可见这种方法大 大提高了悬浮式生物芯片的检测速度。 1 3 本论文主要研究内容 本文在悬浮式生物芯片的并行检测原理的基础上，将详细介绍悬浮式生物芯片的同 步图象采集系统。该系统提出了利用c m o s 作为图象采集器件来达到悬浮式生物芯片原 理中同步获得两种分类信息和一种数量信息的要求，文章将详细介绍系统的设计过程和 最终实验结果，论文的主要内容包括： 1 介绍了生物芯片技术的发展现状和应用前景，比较了固态生物芯片和悬浮式生 物芯片各自的优缺点。同时，对于生物芯片的分类、制备方法和荧光信号的检测作了较 为详尽地分析。 2 重点分析悬浮式生物芯片的并行检测方案。在悬浮式生物芯片的并行检测技术 基础上，提出了一种采用c m o s 和图象采卡实现对三种荧光信号的同步图象采集。介 绍系统方案的确定、主要器件的选型、硬件电路原理图设计、p c b 制作和硬件电路调试 的整个过程，并且从介绍c m o s 、图象采集卡中更好的了解该方案提出的基础。同时， 针对硬件调试过程中遇到的问题提出相应的解决办法。 3 介绍系统开发过程中用到的软件开发平台k c i lc 、l a b v i c w 、v b 和图像采集软 件v i s i o n a s s i s t a n t ，在此基础上，介绍了软件部分的开发流程。 4 搭建实验平台，并且进行荧光的同步图像采集实验，对实验结果进行分析。 5 对整个系统的设计过程进行总结，讨论系统存在的不足和改进方案。 9 浙江大学硕士学位论文 1 4 本章小节 本章主要介绍从不同分类标准分别介绍固态生物芯片、悬浮式生物芯片以及置备等 情况，比较了固态生物芯片和悬浮式生物芯片各自的优缺点。进而介绍生物芯片检测技 术，由于论文的核心内容是关于生物芯片的荧光信号检测，所以本章用了较大篇幅介绍 了当前常用的荧光检测手段。最后，概述了本论文的主要内容。 1 0 浙江大学硕士学位论文 第二章悬浮式生物芯片并行检测系统方案设计 2 1 悬浮式生物芯片并行检测系统 由于悬浮式生物芯片的串行检测方法每秒只能检测几十个微球，效率非常低，无法 满足实际应用中生物芯片需要大规模的检测。为了克服使用流式细胞仪作为悬浮式生物 芯片检测平台速度慢的缺点，这里研究了一种采用c c d 的悬浮式生物芯片并行检测方法。 该系统如图2 - 1 所示： 图2 - 1 悬浮式生物芯片并行检测系统 系统使用脉冲氙灯作为激发光源，氙灯功率高、光谱范围宽，可以使检测区的激发 荧光功率密度满足要求。光源经过照明光路中的分色镜，分离出两束不同波长的光束。 一束是用于激发对微球编址的荧光染料，波长为6 3 5 n m ，另一束用来激发报告分子上的 荧光物质，波长为5 3 2 n m 。两束激光通过扩束镜l 1 后均匀的照射到微通道内的检测区域 浙江大学硕士学位论文 上。扁平的微通道是通过特别制备的，它的尺寸、大小能够使流体在通道内流动时近似 为一个二流场。这样的一个通道能使微球在流过检测区域时近似平面，这样检测到的荧 光就只能是一个层面的微球而就不会是两个层面上的微球产生的，检测减少了误差。在 激发光的照射下，微球和待测分子分别发出波长为6 6 0 h m 、7 2 0 h m 的分类荧光和5 8 0 h m 的报告荧光。这三柬荧光通过分光镜组和滤波片组合，被三个c c d 分别接收。其中通过 带通滤波片f 3 后，5 8 0 h m 的荧光被c c d 3 接收：通过带通滤波片f 2 后，6 6 0 h m 的荧光被 c c d 2 接收；通过带通滤波片f 1 后，7 2 0 n t o 的荧光被c c d l 接收。c c d 4 接收的是检测区域 的全息干涉条纹，全息干涉条纹是波长为6 3 5 n m 光线通过检测区域时微球引起的前向散 射光和通过微球探针间隙的直射光干涉产生的。由此全息干涉图可以得到微球的位置和 尺寸信息。 通过对两副待测分子分类信息图象( c c d l 、c c d 2 接收到的图象) 和一副待测分子数 量信息图象( c c d 3 接收到的图象) 的分析，就能够测出悬浮液中所有荧光小球的反应状 况，从而完成悬浮式生物芯片的检测功能，得到待测分子的生物信息。 悬浮式生物芯片的检测速度由c c d 的拍摄速度、c c d 光敏面的大小、成像物镜放大 倍数、微球间的分布距离等决定的。如果采用氤灯作为激励光源，则它的探测区域为 l m m xl 咖。微球间的统计平均间距为l o o g m ，则每次采集到的一副图象中包含1 0 0 个微 球。c c d 的拍摄速度为1 0 帧每秒，则该系统能够每秒检测到1 0 0 0 个微球，相比于串行 检测技术中的几十个微球每秒，速度大大的提高了【m 瑚。 2 1 1 光学子系统 荧光物质发射的荧光强度同激发光的强度成正比。欲得到较高的信噪比，需要提高 荧光信号强度。由于生物芯片上的荧光标记物的含量很低，因此必须提高激发光在检测 区的功率密度。所以，要根据检测区面积大小选择相应的功率较大的光源。一般用的是 激光、氙灯、金属卤素灯等高强度光源。 由于荧光染料具有光漂白特性，多次扫描后，荧光分子发生猝灭，激光诱导的荧光 强度随扫描次数的增加而衰减直至消失，这样所提取到的数据就会出现偏差。这是微阵 列分析中数据不可靠性因素之一，同时，使得不同实验所提取到的数据不具有可比性 2 2 1 。 由于波长短的激发光对荧光材料的光漂白作用较为明显，所以生物芯片检测系统中用到 的激光光源多选用波长较长的激光器。 在光学系统中，滤波片是非常重要的光学器件，因此首先必须得选择质量好的滤波 浙江大学硕 学位论文 片。在系统种，滤波片有两种，一种是激光器后加的滤波片，称为激发光滤波片，它的 作用是从激发光中提出符合要求光谱的波段。另一种是置于c c d 前的滤波片，称为发射 光滤波片，它的作用是使c c d 只能接收到一种波长的荧光而滤除掉波长范围外的杂散光。 激发滤波片与发射滤波片的光谱通过波段不能有重叠区。由于滤波片的截止深度并非理 想的无限深，所以尽管在荧光收集系统中加有滤波片以滤除非信号波段的光，也总有一 定比例的非信号波段的光通过。如果被物镜收集的激发光只来自检测区的散射或反射而 不是直接来自照明光束，就可大幅度减少透过滤波片的激发光强度。因此为了降低背景 光强度，照明光束在透过检测区后应避免进入荧光收集系统。 悬浮式生物芯片在激发光的照射下，发出三个波长的荧光。这三个波长的荧光是混 杂在一起的，经过物镜成像。利用不同分色镜将这样的荧光信号分离成三束，每束光只 包含一个波长的荧光，然后经过对应的发射光滤波片后被c c d 接收。这就是该光学系统。 2 1 2 微流场子系统 微流场系统是整个悬浮式生物芯片的检测平台。微流器件的形状和尺寸参数是专门 设计的，通过对液体流速的控制，使得专门设计的扫读装置把所有悬浮在液体中的待测 微球的荧光信号记录下来，从而获取所需的生物信息。因此，整个微流场系统对整个悬 浮式生物芯片的实验结果将有很大的影响。系统对微流场系统的设计是有要求的： 1 为了保证每个微球通过检测区域时只被c c d 记录一次，要求流场无回流。 2 为了保证每个带有荧光信息的微球都被检测到，要求流场连续、均匀、平稳。 3 为了使微球通过检测区域时的速度和c c d 拍摄速度相匹配，要求能对流场速度 进行控制。 图2 2 是微流场系统示意图微通道在激光照射方向的维度被设计成小于微球的平 均间距，这样，就能确保微球流过检测区域时，近似单层的二流场平面。缓冲区被设计 成鸭嘴型，这是因为微量进样器在步进机推动过程中，由于步进电机启动和停止时速度 不是稳定，缓冲区的目的就是使液体在经过缓冲区后，能够以稳定的速度通过检测区域。 网 i _ j 缓冲区 浙江大学硕士学位论文 图2 2 悬浮式生物芯片检测系统中的微流场系统 通道的加工制备和试剂的驱动是液流系统中两个关键问题。通道加工有机械方法、 激光刻蚀、湿法刻蚀等方法，对制备的透光率、平整度、内部光洁度都有较高要求。驱 动装置作用是推射试剂进入通道，要求能够对液流进行精确控制，使之在扁平通道中稳 定流动，并且能够和氤灯曝光的脉冲频率和c c d 的帧频相匹配。检测区域范围与光学成 像系统的放大率和c c d 的光敏面大小有关。检测区要将通道的宽度方向覆盖，以使待测 悬浮液中的微球全部被c c d 采集到。 2 1 3 图象采集和处理子系统 图象采集和处理系统是悬浮式生物芯片的重要组成部分。当激发光照射到微通道内 的标记荧光的微球时，发射出三种混杂在一起的不同波长的荧光，分别为5 8 0 n t o 、6 6 0 n t o 和7 2 0 n t o 。这三束荧光通过分色镜和带通滤波片后分别被三个c c d 接收采集，c c d 将采 集到的荧光信号转换为数字信息传给数据采集卡，并传送到计算机中去并重新生成图 像。 本课题研究的系统使用c m o s 代替c c d 作为图象接收器。由于荧光信号比较弱，因 此需要高灵敏度、低噪声的c m o s 进行采集。c m o s 的特性参数如分辨率、光敏面大小等 要与检测区域、光学成像透镜等相匹配，满足系统中对图像处理的要求。本系统中使用 的是o m n i v i s i o n 公司的0 v 9 1 2 1 ，分辨率可以设置为1 2 8 0 x 1 0 2 4 和6 4 0 x 4 8 0 像素，像 素尺寸为5 2 “m 5 2 n m 。另外由于在图象采集时需要处理的数据量非常大，因此的系 统中使用专用的图象采集卡p c i 一1 4 2 2 ，实现高速的数据传输。这款采集卡支持高达单通 道1 6 位或双通道8 位的差分视频数据，这也是它被用于多通道同步图象采集系统的原 因。可以通过和这卡件配套的v i s i o na s s i t a n t 软件来方便的采集、查看、处理图象和 对图象采集方式的配置。 2 2 本章小节 由于本文研究内容悬浮式生物芯片中的多通道同步图象采集系统是在悬浮式生物 芯片并行采集系统的基础上的改进和创新，因此本章介绍了这种新型的悬浮式生物芯片 并行采集系统，并且分别详细分析了光学子系统、微流场子系统、图象采集和处理子系 统。从对各子系统的详细分析中，从理论上证明了并行检测方案的可行性。以下各章节 将对如何达到多通道图象的同步采集进行详细分析。 1 4 浙江大学硕士学位论文 第三章多通道同步图象采集系统方案设计 3 1 多通道同步图象采集系统要求分析 本课题设计的悬浮式生物芯片中的多通道同步图象采集系统是用两个c m o s 同时对 生物芯片检测中的两路荧光信号进行检测、成像，并把得到的图象在上位机上保存。该 系统的设计的具体要求如下： 1 由于荧光信号是比较弱的，必须要求c m o s 能够有足够的灵敏度，可以探测到荧 光。 2 c m o s 能正确的接收到采集到图象，并且稳定的传输到上位机保存。 3 在图象采集过程中，能够完成两种模式的图象采集：单帧模式和连续采集模式。 并且连续采集模式要求得达到每秒采集1 0 帧以上。 4 由于悬浮式生物芯片检测时有可能耗时比较长，采集的数据量也比较大，这就 要求系统采集图象时必须稳定，采集到的数据不能在转换或传输或保存时丢失， 并且在长时间的图象采集中要有较强的抗干扰能力。 5 该系统的特点就是两个c m o s 同步图象采集，因此联系两个c m o s 的同步信号必 须严格同步，并且同步时钟信号避免其它信号的干扰。 3 2 多通道同步图象采集系统方案分析 “ 3 2 1 图像采集器件的选择 图像采集器件的主要功能都是把外界的景物以图像的形式记录下来。在本系统中， 图像采集器件的作用是接收探测分子和报告分子发出的荧光信息。由于悬浮式生物芯片 中待探测的荧光信息极其微弱，因而这里要求探测器件必须具有很高的灵敏度。 现在固体图象传感器已经广泛地应用于电子数码摄泉机、p c 摄像，自动监控、智能 机器人和电子数码照相机等，并且已经取代了以前采用外光电效应的光电摄像管。固体 图象传感器是利用半导体材料的内光电效应原理制成的光电转换器件。固体图象传感器 按工艺结构分主要有两类。一类是电荷耦合器件( c c d ) 图象传感器；另一类是互补金属 氧化物( c m o s ) 图象传感器 c c d 传感器和c m o s 传感器都是上世纪7 0 年代开始研制，但c m o s 捕获光信号能力差、 浙江大学硕士学位论文 图像分辨率较低以及噪声严重这三大缺陷的存在，在发展初期得不到重视和发展。但 c m o s 的这些缺陷随着现代集成电路设计技术和工艺水平等的发展，现在都有办法克服。 c c o 和c m o s 各有优缺点，下面对它们作一个比较。 1 从原理上讲，c m o s 的信号是以点为单位的电荷信号，而c c d 是以行为单位的电 流信号，前者更为敏感，速度也更快，更为省电，而c c d 在成像质量上更好，但现在高 级的c m o s 在成像质量上也并不比一般c c d 差。c m o s 最大的缺点就是太容易出现噪点。 2 c c d 存储的电荷信息，需在同步信号控制下一位一位地实施转移后读取，电荷信 息转移和读取输出需要有时钟控制电路和三组不同的电源相配合，整个电路较为复杂， 速度较慢而且体积庞大。c m o s 光电传感器经光电转换后直接产生电压信号，信号读取十 分简单，速度比c c d 快得多，而且集成度高、体积小、重量轻。 3 从功耗和兼容性来看，c c d 需要外部控制信号和时钟信号来获得满意的电荷转 移效率，还需要多个电源和电压调节器，因此功耗大；而c m o s 使用单一工作电压，功 耗低，仅相当于c c d 的1 l o 一1 1 0 0 ，还可以与其他电路兼容，具有功耗低、兼容性好的 特点。 4 c c d 传感器需要特殊工艺，使用专用生产流程，成本高；而c m o s 传感器使用与 制造半导体器件9 0 的相同基本技术和工艺，且成品率高，制造成本低，目前用于摄像 的5 0 万像素的c m o s 传感器不到1 0 美元。表3 1 是c c d 和c m o s 的比较，比较直观。 表3 1c c d 和c m o s 图象传感器的比较 类别c c dc m o s 成本高低 集成状况 低，需外接芯片单片高度集成 系统功耗高( 1 ) 低( 1 l o - - i l o o ) 电源多电源单一电源 电路结构复杂简单 灵敏度优良 信噪比优良 红外线灵敏度低灵敏度高 动态范围 = 7 0 d b = 7 0 d b 体积大小 由于系统将使用两块c m o s 同时工作，如果使用c c d ，那它的功耗和电路复杂度将非 常高，且价钱昂贵。因此在灵敏度足够探测到微弱的荧光信号前提下，本系统使用的是 o r , i n i v i s i o n 公司的c m o s 0 v 9 1 2 1 。 0 v 9 1 2 1 是o m n i v i s i o n 公司出产的高速黑白数字图象芯片，可以通过对其寄存器的 1 6 浙江大学硕士学位论文 配置，使其工作在s x g a ( 1 2 8 0 x 1 0 2 4 ) 或v g a ( 6 4 0 4 8 0 ) 两种分辨率，它的灵敏度达到 1 o v l u x s e e ，由于荧光信号是比较弱的，需要要求光电接收装置的灵敏度比较高，该 款c m o s 的灵敏度能够使用在这里。像素尺寸为5 2 u m x 5 2 u m ，信嗓比为5 4 d b ，光敏面 积6 6 6 ( h ) 哪5 3 2 ( v ) 哪，暗电流2 8 m v s ，图象拍摄速度为1 5 帧秒( s x g a ) 或 3 0 帧秒( v g a ) 【2 3 1 ，这些特点都满足了上文对悬浮式生物芯片的并行检测系统的要求， 如果工作在s x g a 模式下，那这系统一秒钟就可以检测1 5 0 0 个微球了，如果在v g a 模式， 那它检测的小球每秒将达到3 0 0 0 个，比用c c d 的检测速度还快2 倍( 一般c c d 是每秒 图象拍摄速度l o 帧) 。并且它的增益可调，调节范围为o - 2 4 d b ，这样根据荧光信号的 强弱，可以调节增益以获得最好的荧光图象。 0 v 9 1 2 1 对于荧光光谱的响应，也决定了它能使用在该系统。因为从上文的光学子系 统的分析可见，c m o s 将分别接收三种波长的荧光，5 8 0 h m 6 6 0 m l7 2 0 n m ，因此c m o s 必须 对波长5 3 2 “7 2 0 这波段有良好的响应。图3 - 10 v 9 1 2 1 的光谱响应 图3 10 v 9 1 2 1 的波谱响应 从图中可以看到，该款c m o s 对于这三束荧光，有良好的响应加上它的灵敏为 l v l u x s e c ，能够检测到微弱的荧光。 该芯片被选用在本方案的最重要的原因在于它能够在线对其寄存器编程设置为两 种工作模式m a s t e r 和s l a v e 。m a s t e r 模式下，芯片只要外部提供晶振就能工作，工作 时产生同步信号和时钟信号。s l a v e 模式下，芯片需要外部提供时钟信号和同步信号才 1 7 浙江丈学硕士学位论文 能工作。根据这个特点，分别将两个0 v 9 1 2 1 芯片，一个将其设置工作在m a s t e r 模式， 一个工作在s l a v e 模式，用接插件将两个芯片的同步信号引脚连接起来，使之时序和时 钟同步，这样就能完成两个c m o s 图象采集的同步了。图3 - 2 是两种模式下工作的时序 信号的连接示意图 c h s y n cc h s y n c v s y n cv s y n c x c u 匠1x c l k l s l a v ed e v i c em a s t e rd e v i c z 图3 2m a s t e r 和s l a v e 器件的时序信号连接 0 v 9 1 2 1 支持通过s c c b 端口对寄存器设置，s c c b 端口类似于1 2 c 总线，可以方便的 通过使用单片i o 口来模拟1 2 c 总线，对其进行读写。图3 3 是s c c b 的读写时序图 c 尊静o 科 釉o o u t 蜊弋一 l 厂 图3 4s c c b 读写时序图 0 v 9 1 2 1 将荧光信号经过放大、a d 后转换成1 0 位的r g b 数据，传输到采集卡。由于 采集卡支持1 6 位的差分数据，因此现有两个c m o s ，每个c 1 0 s 最多只有8 位数据能够被 采集卡接收。这样的话，0 v 9 1 2 1 采集到的数据只能如图3 - 4 这样传输 浙江大学硕士学位论文 m s b d 9 d 1 5d 7m s bd 9 d 8d 1 4d 6 d 8 d 7d 1 3d 5 d 7 d 2 d 8d o d 2 d 1 d 1 d 0 d o 0 v 9 1 2 1 0 v l t e r ) p c i - 1 4 2 2 o v 9 1 2 1 ( s l a v e ) 图3 - 40 v 9 1 2 1 和数据采集卡p c i 1 4 2 2 的数据传输 如图3 50 v 9 1 2 1 的内部功能图，该c m o s 在成像面上接收到光信号后经过放大，a d 转换后，输出1 0 位的数字信号d 9 ：0 和时钟信号p c l k 和三个时序信号h r e f 、h s y n c 、 v s y n c 。而外部提供的晶振x c l k 经过锁相环后，并且在外部提供r e s e t 、f r e x 等信号下， 产生了c m o s 工作的时序和控制信号。s l oc 、s i o _ d 、s c c b _ e 是通过单片机的模拟1 2 c 总线提供，通过s c c b 端口，对寄存器读写，配置c m o s 为最佳工作方式采集图象。 图3 - 50 v 9 1 2 1 的内部功能图 以下是0 v 9 1 2 1 工作的时序图，图3 - 6 是行输出时序，图3 - 7 是帧输出时序，它们 是个输出信号，提供给s l a v e 模式下的c m o s 。 1 9 浙江大学硕士学位论文 p c u ( 讳 u 嘲e ， 厂l j 几狮厂 l - 一o c 一 f ( 耍萑 斗o 寸删亚 1 一 图3 6 行输出的时序 神：a l = = 函艇匦= = 卫曼旺疆巨缸劲e 孤叠j 眨= = = = 叠 p o p 9 - - 叫 t w of i o - f - m 2r o w 啪 图3 7 帧输出的时序 3 2 2 图像采集卡的选择 c m o s 输出的数据需要存到计算机中，以便进一步对图像信息进行分析处理。由于需 要传输的图像的数据量比较大，特别是当进行连续采集时数据量更大，因此我们采用了 专用的图像采集卡p c i 一1 4 2 2 来实现数据的高速传输。图3 - 8 是p c i - 1 4 2 2 的内部原理图。 n i 公司的p c i 一1 4 2 2 图像采集卡支持p c i 、p x i 接口，可以将图像保存在板载存储器 中( 3 2 mr a m ) 或直接存入系统内存。这款采集卡支持1 6 位的差分视频数据，可通过配置 4 根通用控制线来产生精准的时钟信号控制采集设备工作。该采集卡能够被本方案使用 的特点在于他的工作频率为5 0 0 k l l z 到4 0 m h z ，能够迅速处理从c m o s 传来的大量的数据。 另一个特点是它不仅能够处理一个通道1 6 位差分数据，还能分别处理两个通道各8 位 差分数据，这样就能同时处理前面所说的两个c m o s 同步传来的数据了。 此图像采集卡支持n i 的软件技术，可以方便地开发出用户应用程序。并且可以通 过配套软件v i s i o na s s i t a n t 方便的配置采集的模式( 连续采集和单帧采集) 、采集的 速度、图象数据的位数、图象的像素数等，并且可以l a b v i e w 编写后期的图像处理程序 。 浙江大学硕士学位论文 型室 1 1 岍b ； im 龇m ll掣圃 璺 llp 嘲c l o c k 。一c “- n 蜘 l h l i 附器锄 l刊裂if bf 二划溅 譬7 一 叠 一1 l “il 譬 揭售肾 3 2 2 单片机的选择 图3 - 8p c i - 1 4 2 2 内部原理图 系统中单片机的作用是通过对c m o s 寄存器的设置控制c m o s 的工作模式。本系统使 用的是p 8 9 l v 5 1 r d 2 管脚配置如图3 - 9 。 董l ；ll 饕笋lll l 茎茎ll 川illll 图3 - 9p 8 9 l v s l r d 2 管脚配置图 2 1 浙江大学硕士学位论文 它是一款8 0 c 5 1 微控制器，包含6 4 k bf l a s h 和1 0 2 4 字节的数据r a m 。f l a s h 程序存 储器支持并行和串行在系统编程( i s p ) 。i s p 允许在软件控制下对成品中的器件进行重 复编程。应用固件的产生、更新能力实现了i s p 的大范围应用。3 3 v 的工作电压，操作 频率为0 3 3 m h z ；s p i ( 串行外围接口) 和增强型u a r t ；通过软件或i s p 选择支持1 2 时钟( 默认) 或6 时钟模式；4 个8 位i o 口，含有3 个高电流p 1 口( 每个i o 口的电 流为1 6 f l l a ) ，采用p l e 4 4 封装【州。 3 3 多通道图像同步采集系统整体实现方案 图3 一l o 是悬浮式生物芯片多通道同步图象采集系统的实现方案。如图所示，p c 通 过串口给单片机命令，单片机收到命令后通过u o 模拟i * c 总线，将命令通过s c c b 端口， 对c m o s 的寄存器进行读写，控制c m o s 的工作模式。两个c m o s 中工作在m a s t e r 下的c m o s 在工作中产生时钟和同步信号，同时将采集到的图象经过内部的a d ，转换成1 0 位数据， 取其中高8 位传输到图象采集卡。工作在s l a v e 下的c m o s 在接收到m a s t e r 模式的c m o s 传输来的时钟和同步信号后，开始工作，将采集的图象同样经过内部的a d ，取高8 位 数据传输到图象采集卡。图象采集卡收集到的两个通道各8 位的数据后，通过p c 上的 v i s i o na s