（应用化学专业论文）BODIPY荧光染料的合成、光谱性能研究及在生物探针中的应用.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 生命科学的发展，就是人们对组成生物体的各种物质( 如蛋白质，d n a ，糖，及 微量的金属离子，阴离子，中性分子等) 不断的深入研究和了解的过程，在这个过程当 中对某种物质的检测是研究的根本，要达到识别和检测这些物质的目的就需要有一种能 够被检测到的信号来反映这些物质的浓度和所处的状态。荧光化合物能够发出光信号， 而且对生物体无伤害作用，是完成这一任务的理想选择，所以荧光化合物的研究直是 人们关注的焦点，它伴随着生命科学的发展发挥着越来越重要的作用。 b o d i p y ( 氟化硼络合二毗咯甲川类) 荧光染料由于其独特的光化学光物理性质引 起了人们的广泛关注，成为近十几年研究的热点。本论文选择b o d i p y 为母体，设计 合成了一系列新的荧光化合物，并且标识了化合物的结构，测定了其光化学光物理性 质，而且以所合成的荧光染料为体系构架设计了一个p h 荧光探针和个z n 2 + 荧光探 针。 _ 本论文采取了与传统合成b o d i p y 荧光染料不同的合成路线。传统的合成路线是 以醛为原料，与吡咯氢缩合再氧化脱氢，然后与三氟化硼络合得到目标化合物，氧化 过程会产生大量的副产物降低了产率，并且缩合后要经过一系列的后处理过程。本论文 用酰氯代替醛，无需氧化过程，提高了收率，且两步反应在同一个反应器里完成，简化 了合成工艺。本论文还讨论了酰氯上不同取代基对该反应活性的影响，并且对该反应的 机理进行了一些探讨。 染料母体光谱的研究：对所合成的化合物进行了紫外吸收光谱、荧光发射光谱和荧 光量子产率的测定，通过对光谱的研究探讨了不同的取代基对化合物荧光性质的影响。 在生物标识中的应用研究：以该化合物为母体设计了一个p h 探针，该探针对环境 p h 有很高的灵敏性，在p h9 3 8 7 6 0 范围内，荧光增强1 5 倍。基于同样的体系，以 d p a 为受体设计合成了一个z n 2 + 荧光探针，该分子对z n 2 + 有特异性识别，且其p k a 低 至2 2 ，有效地避开了人体内p h 的影响，并且已经将该探针应用于活细胞中。 关键词：b o d ip y ：荧光染料；生物标识；锌粒子探针；p h 探针 b o d i p y 荧光染料的合成、光谱陛能研究及在生物探针中的应用 s y n t h e s i s ，s p e c t r a lp r o p e r t i e s a n dt h e a p p l i c a t i o n i nb i o l o g i c a l l a b e l i n go f n e ws e r i o u sb o r o n d i p y r r o m e t b e n ed y e s a b s t r a c t t h e d e v e l o p m e n to f l i f es c i e n c ei sap r o c e s so fad e e p e ra n dw i d e r s t u d yo f t h em a t e r i a l s ( s u c ha sp r o t e i n , d n a , s o g a r , m e t a li o n , a n i o na n dn e u t r a lm o l e c u l a re ta 1 ) t h a tm a k eu po f o r g a n i s m s i n t h i sp r o c e s s , ab a s i cp r o b l e mi st h ed e t e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f t h e s em a t e d a l s f l u o r e s c e n td y e sc a n g i v eo f f f i g h ts i g n a l ，d od o h a r mt oh u m a n b o d y a n dc a nb e e a s i l yd e t e c t e d , s oi ti sa ni d e a ll a b e l i n g r e a g e n t i nt h el a s td e c a d e s ，b o r o nd i p y r r o m e t h e n ed y e s ( b o d i p y ) h a v ed r a wm u c ha t t e n t i o no f t h er e s e a r c h e r sf o rt h e i re x c e p t i o n a lp h o t o c h e m i s t r ya n d p h o t o p h y s i c a lp r o p e r t i e s i nt h i sp a p e r , n e ws e r i e so fb o d i p yd y e sh a v eb e e ns y n t h e s i z e da n di d e n t i f i e d t h ea b s o r b a n c ea n d f l u o r e s c e n c es p e c t r u m , t h eq u a n t u my i e l d s , t h em o l e c u l a rc o e f f i c i e n t sa r eo b t a i n e d b a s e do n t h e b o d y s t r u c t u r e ap h p r o b e a n da z n 2 + p r o b e a r es y n t h e s i z e d t h e s t u d yo f t h es y n t h e s i sr o u t e ：t h et r a d i t i o n a ls y n t h e s i sw a y o f b o d i p y d y e si st a k i n g a l d e h y d e s a st h es t a r t i n gm a t e r i a l sc o n d e n s a t i o nw i t ht h ea - h o f p y r r o l ，o x i d a t i o nb yp - c h l o r a n u ， t h e nc o o r d i n a t i o n w i t h b f 3 t h e o x i d a t i o ns t e pc p r o d u c e m a n y b y p r o d u c b a n dd e t h e y i e l d e s i n t h i s p a l a - , a c e t y lc h l o r i d e s w a st a k e n p l a c ea l d e h y d e sa st h es t a r t i n gm a t e r i a l s ，s on o o x i d a t i o nr e a g e n t i sn e e d e dt h et w os t e p sc a l lb ep e r f o r m e di nao n e - r e a c t o r , s ot h ep r o c e s sw a ss i m p l i f i e da n d t h e y i e l d sw e r ei m p r o v e d t h e s t u d y o ft h e s p e c t r u m ：t h e a b s o r b a n c e s p e c t r u m , f l u o r e s c e n c es p e c t r u m , t h e a b s o r p t i o n c o e f f i c i e n t sa n d q u a n t u my i e l d w e r ed e t e c t e d t h er e l a t i o nb e t w e e nt h e p h o t o p h y s i c a lp r o p e r t i e sa n d t h es t r u c t u r eo f t h e d y e s w e r e i n v e s t i g a t e d ， t h er e s e a r c hi nb i o l o g i c a ll a b e l i n g ：b a s e do nt h ef l u o m p h o r e , ap h p r o b ew a so b t a i n 缸 t h ep r o b ee x h i b i t sg o o dp r o p e r t i e sa sap hf l u o r e s c e n t i l s o rw i t ha1 5 - f o l df l u o r e s c e n c e e n h a n c e m e n ti nt h ep h r a n g eo f 9 3 8 - 7 6 0 az n 2 + p r o b e w a ss y n t h e s i z e d t h ep r o b ee x h i b i t e d h i 曲s e l e c t i l i t yf o rz n 2 + ，w i t hp k ao f 2 2 ，u p t on o w , i tw a st h el o w e s tp k ai na l lz n z + p r o b e sa n d c a na v o i dt h ee f f e c to f t h e 矿i nh u m a n b o d y i th a sa p p f i e d i nl i v i n gc e l la n d g e tg o o d r e s u l t k e yw o r d s ：b o d i p y ；f l u o r e s c e n td y e s ；b i o l o g i c a ll a b e l ；z n 2 + p r o b e ；p hp r o b e 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究 工作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得 大连理工大学或其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢 意。 作者签名：翌型! 煎鸯日期 2 p d 5 6 大连理工大学硕士学位论文 1 文献综述 1 1 概述 二十世纪是生命科学飞速发展的时期，从d n a 双螺旋结构的发现到现在人类基因 组计划的完成，以及已经启动的后基因组计划一蛋白质工程，人类正从分子水平认识生 命，阐述人的生老病死。生命活动是由体内的各种物质( 如蛋白质，d n a ，糖，各种微 量的金属离子，中性分子等) 来完成的，对生命的研究就是研究这些物质的活动形式， 在人体内起的作用，以及衰变代谢等，这就要求我们能对其进行准确的检测和识别。 传统的生物标识方法包括放射性同位素法和荧光标记法。放射性同位索会对生物体 产生辐射，对环境造成污染，而且放射性同位素都有其自身的半衰期，信号会越来越 弱，所以该方法现在已经渐渐被人们抛弃。而荧光检钡4 法不会对人体产生辐射，且信噪 比高，灵敏度好，是现在研究和应用最多的一种方法。所以对荧光染料的理论研究和应 用研究是近5 0 年人们研究的热点，至今方兴未艾。 、 11 1 荧光产生的理论基础 当紫外或可见光照射到某些物质上时，这些物质就发射出波长和强度各不相同的 光，停止照射光照射时，光线马上或逐渐消失，这就是荧光。 荧光现象旱在1 6 世纪就被发现，但对荧光的产生原理和条件直到1 9 世纪中期才清 楚。s t o k e s 在1 8 5 2 年详细考察了奎宁和叶绿素的荧光后，发现他们的荧光波长比照射 光波长要长，认定是物质吸收光后重新发射出的光，并且波长不同，荧光是发射光被证 实。根据“萤石”能发出这种光，提出了“荧光”这一名称。 荧光产生过程如图1 1 所示盼”。通常情况下，荧光试剂分子处于基态，吸收光 后，试剂分子的电子被激发而处于激发态，基态和激发态都有单重态和三重态两种类 型，多重态用2 s + 1 表示。s 为电子自旋量子数的代数和，其数值为0 或1 。s 为0 时， 分子内轨道中的所有电子自旋配对，日旋方向相反，此时分子处于单线态，大多数有机 物分子的基态是处于单线态。分子吸收光能后，电子跃迁到高能级，电子自旋方向不 变，此时分子处于激发单重态。s n s 。s 2 ，表示分子的基态和第一，第二，激发单 重态，能量由低到高。如果处于基态单重态的有机物分子的电子在跃迁过程中伴随有电 子自旋方向的变化，在激发态分子轨道中就有两个自旋不配对的电子，此时s = 1 ，表 明分子处于激发态的三重态，用t 表示，t 1 t 2 分别表示三重态的第一第二激发态。分 子中的电子从基态s 。跃迁到激发态s - ，s 2 比较容易发生，进行很快( 约l 酽s ) ，而从基 b o d i p y 荧光染料的合成、光谱陛能研究及在生物探针中的应用 态单重态到激发态三重态不易发生。高能量的单重态激发态分子( 如s 2 ) 可以与其他同 类分子或溶剂分子碰撞通过内转换( 无辐射跃迁) 回到激发态的最低能级s - ，这一过程 为1o _ ”s ，处于激发态最低能级的分子寿命一般为1 0 。4 1 0 4 s ，它们会放出光子返回基 态，这时产生的光就是荧光。即最低激发态( s 1 ) 分子回到基态( s o ) 会产生荧光。从 s 。到t l 能量转化是系间跨越。从t l 回到s o 有两种过程，一个是系间跨越，无能量释 放；另一个是放出光子，即磷光，在1 0 4 1 0 s 间完成。 e 能量，f 荧光，p 磷光，k 体系间跨越，i e 内转换 图1 1 分子荧光的产生过程 11 2 分子结构与荧光的关系 大量实验事实证明，有机试剂分子的荧光特性如荧光量子产率，紫外吸收光谱，荧 光发射光谱等首先取决于它自身的能量状态，即取决于它自身的分子结构，而外界因 素，如温度，压力，浓度，介质，酸度等对荧光特性的影响是次要的。对于试剂分子结 构跟荧光特性的关系的规律，人们做了大量的研究，认为试剂的荧光性能与其共轭体系 的大小，共轭大n 键的共平面性及刚性程度，分子母体上取代基的种类及取代基所在位 置和分子的几何结构等因素有关，下面分别给予讨论。 1 1 21 分子共轭体系大小对荧光的影响 有机荧光试剂分子都含有发射荧光的基团，习惯称为荧光团。荧光团必须含有共轭 大n 键，而且大兀键达到一定程度才会发出荧光，如( 一c h = c h 一) n ( 1 1 2 ) ，苯， 萘，对苯二醌，苯并杂环等。芳环类碳氢化合物与直链的烯烃化合物相比，激发能向振 大连理工大学硕士学位论文 动能的转换更难，因而荧光强度更大。共轭体系越大，兀电子越容易激发，荧光( 或者 磷光) 越容易产生，荧光发射峰向长波方向移动，多数隋况下荧光量子产率增加，荧光 强度大的有机化合物绝大多含有芳香环或者芳香杂环，芳香环数越多，共轭体系越大， 荧光越强，但芳香环或者共轭体系增加到一定程度时，只是荧光发射波长红移，荧光量 子产率不但没有增加，反而降低，这一现象涉及共轭大n 键共平面及其刚性的影响，下 面将进一步讨论。 11 2 2 共轭大键共平面及其刚性的影响【4 】 分子取得平面结构才能显示出荧光特性。对于具有强荧光的有机化合物和荧光试 剂，仅有大的共轭体系还不够，分子的共轭体系必须具备共平面性并且还要有一定程度 的刚性。如图1 2 所示，联苯由0 t 键连接，两个苯环由于立体结构效应或者空间位阻不 能共平面，处于最大自由度，量子产率为0 1 8 ，而芴相当于一个c h 2 一，把联苯的两 个苯环固定在一个平面上，不能扭曲或者转动，共平面性大且刚性强，荧光量子产率接 近1 。 的 图1 2 两个荧光化合物的结构 f i g 1 2t h e s t r u c t u r e so f t w of l u o r e s c e n tc o n p o u n d s 1 12 3 取代基对荧光的影响 有机荧光化台物分子中的取代基对其荧光性能影响显著，在荧光团上引入取代基有 推电子和吸电子取代基两种类型，取代基的影响分为取代基种类和取代基所处位置两 种。 取代基种类的影响。推电子取代基增强荧光，这类取代基有：n h 2 ，豫，一 n r 2 ，o h ，0 r 。含这类取代基的荧光有机分子，其激发态的产生常常是由取代基的 o 或n 的非键电子被激发到兀* 键上造成的，取代基共轭电子参与有机荧光分子的大n 键等于扩大共轭体系，使最大吸收和荧光发射红移，荧光强度增强。但是含推电子基团 的荧光分子在极性溶剂中容易形成氢键而质子化，使其带部分正电荷，荧光会显著减 弱，离解出氢后荧光又恢复。吸电子取代基有：c = o ，n 0 2 ，c o o h ，c h o ，一 c o r ，- n = n 一，x ( f ，c l ，b r ，i ) 。他们对荧光强度的影响与推电子基相反，即减 b o d i p y 荧光染料的合成、光谱性能研究及在生物探针中的应用 弱荧光，但波长红移。因为这类取代基中的n 电子跃迁到n + 键上属于禁阻跃迁，激发 态分子数少，而且s l _ t 的系间跨越占优势，放出光子的激发态分子数大为减少，致 使荧光减弱。硝基吸电子能力最大，对荧光抑制非常严重，几乎所有荧光化合物中引入 硝基都没有荧光，其s 。t l 系间跨越率达到0 6 。氰基虽然也是强吸电子基团，但是却 表现出推电子效果，它能使荧光增强。磺酸基以及羧酸基含不饱和基团，表现出吸电子 性能，减弱荧光，但当它离解出h 质子后带负电，又表现出推电子行为，荧光增强。 一般在荧光染料中引入羧酸或者磺酸基是为了增加水溶性。 取代基位置的影响。取代基在试剂分子上的位置及取代基数量对试剂的荧光量子产 率的影响视具体情况而定，只有一个推电子取代基，处于空间位阻最小或者没有位阻 时，可以使荧光增强。当推电子基和吸电子基共存时，推电子基结合在对于吸电子基共 振电子密度减小的原予上，构成荧光性，即存在推拉电子效应，从而使荧光大大增强。 取代基加重效应对荧光的影响。般说来随着取代基原子量的增加，化合物的量子 产率会降低。如卤素，硫，磷等都存在加重效应同。 芳香环中杂原子的影响。杂原子对荧光的影响比较复杂，有时使荧光增强，有时使 其减弱，主要看杂原子的结构。 11 , 3 外部环境对荧光的影响 温度影响：一般说来，荧光物质随着溶液温度的升高其荧光强度会降低，主要原因 是分子内部能量的转换作用随着温度的升高而加快，同时激发态分子和溶剂分子之间发 生某些可逆的光化学反应，这也是荧光强度下降的原因之一。 溶剂效应：溶剂的极性对荧光化合物的光谱会发生影响，一般说来随着溶剂极性的 增加，化合物的吸收和发射光谱会蓝移，这成为负向溶剂化显色。 p h 对光谱的影响：很多荧光化台物尤其是含有氮、氧或酸根离子的荧光化合物， 对d h 极其敏感，因为染料的质子化和非质子化的两种状态能显著改变荧光分子的电子 云密度，从而极大改变其光谱特性，所以在应用于离子探针时，这一点尤其重要。 l1 4 描述荧光特。眭的参数 1l41 荧光吸收光谱，激发光谱，发射光谱和s t o k e s 位移 吸收光谱就是荧光染料分子吸收光能使电子从基态跃迁到激发态而产生的吸收光 谱。而测定激发光谱时，把荧光物质试液置于荧光光度计光路中，固定荧光发射波长和 狭缝宽度，扫描，得到荧光激发波长和相应荧光强度的关系曲线，即荧光激发光谱。荧 大连理工大学硕士学位论文 光发射光谱即荧光光谱的获得的过程，类似于激发光谱。固定激发波长和狭缝宽度，扫 描，得到荧光发射波长和相应荧光强度的关系曲线，即荧光光谱。而s t o k e s 位移指的是 荧光最大发射波长跟最大吸收波长的差值。荧光物质的荧光激发光谱和发射光谱形状相 似且成镜像对称。根据荧光产生的原理不难理解这一现象，激发光谱所反映的是电子跃 迁到第一激发态的情形，而荧光光谱所反映的是电子从激发态的最低能级回到基态的情 形。能量在基态的振动能级上的分布情形和第一激发态中的振动能级上的分布情况相类 似，所以激发态光谱中跃迁能量最小的波长与荧光光谱中盘鼯够发射能量最大的波长相 对应。 1 14 2 荧光强度，荧光量子产率和荧光寿命 荧光强度是指在一定条件下仪器所测得荧光物质发射荧光大小的一种量度，荧光物 质所发射的荧光无固定方向，实际上所测量的是某一方向的荧光，它除与物质本身的荧 光量子产率有关，还与介质、环境、仪器性能等因素有关。物质吸收光越多，处于激发 态的分子数越多，发出的荧光强度就越大。 f = 2 3 由f i oeb c f 为荧光强度；巾f 为荧光量子产率：i o 为照射到被测物质上的光强度；e 为该物 质的摩尔吸光系数；b 为检测池厚度：c 为物质浓度。 荧光量子产率也称为荧光效率，是物质的固有属性，理论上定义为荧光物质吸收光 后所发射的荧光光子数与吸收的激发光光子数之比。在同一浓度下，产率越大，荧光强 度也大。可用下式测定： ( i ) s a m p l e = m s t a n d a n d j 。p l 。s t a n d a r d( 1 2 ) 式中：巾。叫。，巾“蝴分别表示待测物质和参比物质的荧光量子产率 i s t a n d a ， d 分别表示待铡物质和参比物质的积分荧光强度。 荧光寿命( t ) 可以用下式测定： h f o i nf t - - - - 一t 1 ( 1 3 ) b o d m y 荧光染料的合成、光谱性能研究及在生物探针中的应用 f o 和f 。分别代表t = 0 和t - t 时的荧光强度，通过实验测量不同时间的r 值，确定 l nr t 关系曲线，其斜率就是荧光寿命。 1 2 荧光染料的介绍 1 2 1b o d p y 荧光染料 本论文所研究的b o d 口y 荧光染料是近二十几年才发展起来，并受到广泛重视的 一种较新的荧光化合物。它以其独特的光化学光物理性质在荧光染料的大家族中扮演着 越来越重要的角色。例如高的摩尔消光系数，高的荧光量子产率，对p h 以及溶剂不敏 感，窄的吸收发射带宽等等口6 。下面介绍一下该染料的发展过程。 1 9 6 8 年，at r e i b s 和fhk r e u z e r 首次合成了氟硼荧类荧光染料7 l ，它的母体结 构如下： 图1 3b o d 碑y 化合物的母体结构 f i g1 _ 3t h eb o d y s t m c t u mo f t h eb o d 口y d y e s 他们合成了染料的母体结构，同时也合成了r 1 r 7 为不同烷基取代基的氟硼荧染 料。采用不同取代基的吡咯甲醛与伍位没有取代基的吡咯或吡咯衍生物在酸性条件下缩 合，然后氧化脱去一分子氢，形成吡咯甲烯，然后在碱性条件下与三氟化硼络合，形成 氟硼荧染料；氟硼荧染料的最大发射波长大概在4 9 0 5 2 0 n m 范围内。从而开刨了氟硼荧 类染料的历史。 然而，在其后的近十年里，与氟硼荧染料研究相关的报道十分稀少，可能是因为该 染料周边的取代基团都是没有任何反应活性的烷基，而想要引入活性基团比较困难的原 因，许多人认为这种染料没有什么应用价值。 1 9 7 7 年，ev o sd ew a e l 和j ap a r d e o n 等人研究了取代基位置不同对氟硼荧染 料光谱特性的影响f 8 ，发现在2 、6 位上有取代基时对氟硼荧染料的光谱影响较大，在 大连理工大学硕士学位论文 这两个位置上的烷基取代会明显增大染料的最大发射波长 一，使最大发射波长增至 5 4 0 n m 左右，首次较系统的讨论了氟硼荧染料的结构和光谱性能关系。 在其后的七、八年间，氟硼荧染料的发展仍然极其缓慢，几乎没有什么突破性的进 展。直到1 9 8 5 年，hjw o r r i e s 和j hk o e k 等人合成了带有磺酸基团的氟硼荧染料 9 1 ，使氟硼荧染料具有了很好的水溶性。他们采用已经合成好的氟硼荧染料与氯磺酸反 应，在2 位上引入磺酸基，如图1 4 ，并且合成了磺酸钠盐形式的氟硼荧染料。首次成 功的在氟硼荧染料母体中引入了活性基团，为氟硼荧染料日后广泛应用于生物分析领域 走出了第一步，使人们认识到了氟硼荧染料潜在的应用价值。 s o a h 图1 4 带磺酸基的b o d i p y 化合物 f i g 1 4a b o d i p y d y e w i t hs u l f o n i cg r o u p 1 9 8 8 年，氟硼荧染料得到空前的发展，r i c h a r dph a u g l a n d 和h e ec k a n g 等人的 最新专利文献【捌描述了近5 0 种新结构氟硼荧染料的合成，并给出了相应的光谱数据。 他们为氟硼荧染料的发展做出了巨大的贡献，起了至关重要的推动作用。氟硼荧染料母 体结构上被引入了羧基，大大提高了氟硼荧染料的应用价值。更令人关注的是，在染料 母体的3 位引入了苯乙烯基，还在1 、3 位上引入了两个苯基，如图1 5 ，合成了两种波 长超过6 0 0 n m 的长波长荧光染料，为氟硼荧染料的合成向长波长方向努力迈开了第一 步。 b o d 口y 荧光染料的合成、光谱性能研究及在生物探针中的应用 图1 5 两种长波长的b o d p y 荧光染料 f i g 1 5t w ol o n g - w a v e l e n g t h b o d i p yd y e s 1 9 9 3 年，h e eck a n g 再接再厉，又有一份新的专利闻世 1 ，在这篇专利中重点阐 述了长波长氟硼荧染料的合成方法。其中包括：五元杂环取代的氟硼荧染料；苯乙烯 基，萘乙烯基取代的氟硼荧染料；苯丁烯基取代的氟硼荧染料等等6 0 余种染料结构。 取代的位置主要集中在1 位和7 位上，其最大发射波长一般都大于5 7 0 n m ，量子产率 也都比较高。 1 9 9 5 年，r i c h a r dph a u g l a n d 和h e ec k a n g 为了合成更长波长的氟硼荧染料采用 邻苯二羰基化合物为原料，与羟胺反应，生成了异吲哚二甲烯化合物，然后与三氟化硼 络合，形成了大共轭体系的氟硼荧染料【1 2 1 ，如图1 6 所示。这类荧光染料的最大发射波 长甚至超过了7 0 0 n m 。 图1 6 用吲哚合成的长波长b o d i p y 荧光染料母体 f i g1 6 a b o d ys t r u c t u r e o f b o d i p y d y e ss y n t h e s i z e d f r o m i n d o l e 大连理工大学硕士学位论文 至此，长波长的氟硼荧染料的合成取得了长足的进展，越来越能够满足各种分析应 用场合的需要，但是对于氟硼荧染料的结构和性能的研究仍在深入地进行中，并不断取 得瞩目的成就。 1 9 9 6 年，r i c h a r dw w a n g n e r 和j o n a t h a nsl i n d s e y 仔细的研究并对比了两类氟硼 荧染料的光谱特性1 13 1 ，发现用不带取代基的吡咯合成的氟硼荧染料比用1 位甲基取代 的吡略合成的氟硼荧染料荧光弱得多，但是并没有给出一个十分合理的解释。怀疑可能 是取代基的存在增大了荧光分子的刚性，阻碍了分子内部的扭转和震动，从而荧光性能 相对较好。其结构对比如图1 7 所示。 图1 8 一个b o d i p y 染料的单晶结构 f i g1 8ac r y s t a ls t r u c t u r eo f a b o d i p y d y e b o d i p y 荧光染料的合成、光谱性能研究及在生物探针中的应用 近年来，k e v i nb u r g e s s 领导的研究组在合成长波长的氟硼荧染料方面作了大量的 工作，1 9 9 9 年，他们以苯甲酰氯和苯环取代的吡咯为原料合成了最大发射波长大于 5 5 0 n m 的一系列氟硼荧染料【l ，并且测定了该系列染料的氧化还原电位。这又开辟了一 种合成氟硼荧染料的新方法，用酰氯比用醛反应迅速，质处理简便，收率相对较高。 2 0 0 0 年，b u r g e s s 研究组合成了系列含有吡咯环的杂环化合物，以此为原料与酰氯缩 合研发了最大发射波长大于6 5 0 n m 的一类氟硼荧染料1 1 6 】，典型结构如图： 图1 9 一种长波长b o d i p y 荧光染料的母体结构 f 逸19a b o d y s t r u c t u r eo f l o n g w a v e l e n g t h b o d i ：p y d y e 此外，b u r g e s s 研究组还通过炔键将氟硼荧与蒽相连，并在葱的一端引出羧基，使 氟硼荧染料很方便的用于荧光标识，可以连接到d n a 的碱基上用于d n a 的测序。为 了提高荧光染料在生物标识中的灵敏度，b u r g e s s 研究组将两个含炔键的氟硼荧染料与 二溴代苯甲酸相连接，这样，形成了一个荧光更强的复合荧光团【”，其结构如图： 图1 1 0 一种荧光更强的b o d i p y 荧光化合物 f i g 1 1 0 a b o d i p y d y e w i t hs t r o n g e r f l u o r e s c e n t b u r g e s s 等人还系统的研究了氟硼荧染料与溴代蒽通过炔键连接起来后，分子内的 电子转移过程【，证明两个荧光团之间的电子转移过程非常迅速和有效，氟硼荧染料作 大连理工大学硕士学位论文 为电子的受体，而葸作为电子的给体。尽管无法比较电子转移的速率大小( 由于电子转 移速度太快) ，但是电子转移的现象是存在于这样的系统中的，这可以通过观察氟硼荧 染料的光谱变化并通过计算得到。 氟硼荧染料的衍生物还有许多，其中工作做得比较详细完善的是氟硼荧染料与吡 啶，二联毗啶以及三连吡啶等吡啶类化合物形成的配体，他们可能成为潜在的合成新型 配位化合物的良好底物。2 0 0 3 年，g i l l e su l r i c h 和r a y m o n dz i e s s e l 发表了一篇合成带 有氟硼荧染料基团的吡啶类化合物的方法，其中详尽的描述了近2 0 种配体的合成步骤 1 9 1 , 而且分成了不同的三种方案来合成，对其荧光性能，电化学性质，以及酸碱性对 化合物的影响都一一作了表述。相信不久以后，利用这些配体合成的一系列金属配合物 将出现，必定会给氟硼荧染料的研究作出更大贡献。一下举俩个典型的分子结构，如 图： 图1 1 1 两个衍生化的b o d y 化合物 f i g 1 11t w o r a m i f i e db o d i p y c o m p o u n d s 对氟硼荧染料的研究还涉及到电化学发光的现象，2 0 0 3 年，r e b e c c ayl a i 和 a l l e njb a r d 等人研究了5 种不同取代基的氟硼荧染料的电致发光现象1 2 0 ，除了一种染 料以外其余4 种染料都有很高的电致发光量子产率，高度的取代基效应不利于提高染料 的光量子产率。电致发光的整个过程，在适度电压的条件下是可逆的：而母体的氟硼荧 染料由于没有任何取代基酶存在，在电压存在下容易形成自由基离子，所以其电发光过 程是不可逆的。 综上所述，( 1 ) 由于氟硼荧染料其母体结构周围一般不直接连接对酸碱较敏感的 氨基，羟基等，所以氟硼荧染料一般对酸碱不敏感。( 2 ) 氟硼荧染料的荧光量子产率 一般都比较高，有的甚至在水中的荧光量子产率也可以达到接近1 , 0 的水平。( 3 ) 具 b o d p y 荧光染料的合成、光谱性能研究及在生物探针中的应用 有相对较好的光稳定性，比荧光索等其他染料的光稳定性好。( 4 ) 氟硼荧染料的荧光 光谱半峰宽较窄，作为荧光标识的时候有很好的灵敏度。( 5 ) 氟硼荧染料的摩尔吸光 系数e 很大，通常大于8 0 0 0 0c m l m l ，吸光效率比较高。 尽管氟硼荧染料有诸多的优点，但是也还是有一些不尽如人意的地方。比如说氟硼 荧染料难于引入活性基团，使应用增加了难度。长波长的氟硼荧染料的量子产率相对较 低，合成难度较大。另外，氟硼荧染料的合成收率一般都很低，提纯比较麻烦。以上问 题都有待于今后的工作来逐步解决和完善。本论文的重点工作就是合成了带有活性基团 的氟硼荧染料。 1 2 2 其它荧光染料简介 荧光素和罗丹明染料口1 。2 4 1 ： 荧光素和罗丹明类荧光染料是制作生物分子荧光探针和进行生物分子检测的常用的 两类荧光染料，在d n a 、r n a 的标记和序列分析，氨基酸、多肽和蛋白质等物质的分 析检测以及荧光免疫分析领域有广泛的应用。该两种荧光染料量子产率高，光稳定性好 是两类传统的常用染料，但是由于染料中氧和氦的存在，使得该类染料对p h 值很敏 感，在用于金属离子、阴离子或者生物小分子探针中时有一定的局限性。该两类染料的 经典结构如下： h 图1 1 2 荧光素和罗丹明的母体结构 f i g 1 1 2t h eb o d y s t r u c t u r e so f f l u o r e s c e i na n dr h o d a m i n e 在苯环上可以连接不同的取代基以改变其性质或者联入活性基团用于生物标识 菁染料社5 2 q ： 菁染料以往主要用作感光材料中乳化银的光敏增感剂，近年来逐渐用于红外激光染 料和生物大分子荧光标记等方面，该系列的染料摩尔消光系数高，荧光量子产率适中， 可以通过调节中间共轭碳链的长短在极广的范围内调节其光谱性质，但是它的一个突出 的缺点是光稳定性差。最近大连理工大学的宋锋玲博士对七甲川系列的菁染料做了大量 大连理工大学硕士学位论文 研究通过对中位取代基的调节，极大地改变了该系列染料的性质，在菁染料的研究中取 得了突破性进展。菁染料母体结构如图所示： 图1 1 3 菁染料的母体结构 f i g 1 1 3t h e b o d ys t r u c t u r eo f c y a n i n e d y e 香豆素荧光染n t 2 9 1 ： 香豆素荧光染料量子产率高，s t o k e s 位移大，光稳定性好，而且分子体积比较小， 非常适合用于生物标识中，其结构如下： 图1 1 4 香豆素的母体结构 f i g 1 1 4t h eb o d ys t r u c t u r eo f c o u m a r i n 芘荧光染料3 0 1 ：该染料本身荧光不强，但是其衍生物的荧光很强，而且该染料很容 易衍生化，在旺位可以与含羰基的化合物反应，引入活性基团，因为该染料完全为平面 结构，比较适合作为d n a 的嵌入型探针。 结构如下： 图1 1 5 芘的母体结构 f i g 1 1 5t h eb o d y s t r u c t u r eo f p y r e n e b o d p y 荧光染料的合成、光谱性能研究及在生物探针中的应用 11 3 荧光染料在生物标识中的应用 最近2 0 年内，随着新型氟硼荧染料不断地被合成，尤其活性官能团的引入使该类 染料的应用范围也越来越广。因为该类荧染料与其他荧光染料相比具有光稳定好、量子 产率高、摩尔消光系数大等优点，这样使他们代替了许多其早期的的荧光染料而应用在 生物和化学分析方面。这包括利用氟硼荧染料合成形形色色自可分子探针，合成核酸的荧 光标记物，用于d n a 的澳4 序，掺杂在高聚物中，形成具有特殊功能的材料等等许多方 面。 1 3l 荧光染料在生物体中对金属阳离子，阴离子以及中性分子的检测 在分子探针的设计中最常用的荧光团是荧光索和罗丹明，他 f 被广泛的应用于金属 离子，阴离子，中性分子的检测和其他的生物标识中，人们对该类染料作为荧光团的研 究已经比较成熟，而且很多产品已经工业化，但是基于b o d 疋y 为荧光团的分子探针 才刚刚起步，是现在研究的热点，下面就把以该染料为母体的分子探针做简单介绍。 1 9 9 8 年，m a r l l i a sk o l l m a n n s b e r g e r 和j j r gd a u b 等人以带有单氮杂冠醚的苯甲醛 为原料合成了带有冠醚识别基团的氟硼荧类染料的首个分子探针p l 】，同时合成了两个相 关的氟硼荧染料，对他们的荧光特性加以对比。该分子探针对于碱金属和碱土金属离子 具有很好的响应和识别能力，对于m 9 2 + 的识别能力相对较强，探针系统加入镁离子后 可以使整个检测溶液的荧光增大被数超过1 0 0 0 倍，荧光寿命也相应的变长。同时观察 到探针分子对于溶液极性比较敏感，在极性和非极性溶剂里存在着原位激发和电荷转移 的两种不同状态。探针的分子结构见图1 1 6 所示。 2 0 0 0 年，k n u tr ：u r a c k 和j j r gd r a b 等人又合成了带有单氮杂的硫冠醚氟硼荧分子 探针 ”l 。主要目的是利用硫冠醚对重金属离子很好的识别作用来进行重金属离子的荧 光检测。监测的结果证明该探针在乙腈溶液里对重金属离子有很好的选择性，对a g + 具有很强的响应，使检测溶液的荧光增强，荧光量子产率明显提高，从底物的o 0 0 0 1 升高至o 2 2 。该探针对h 矿和c u 2 + 也有荧光增强的作用，尤其是对h 酽+ 的响应最为 强烈，荧光量子产率升高至o 5 9 。而以前报道的许多阳离子荧光探针的荧光大多都能 被h 9 2 + 和c u 抖淬灭，而不是像该探针会使荧光增强。探针的结构如图： 大连理工大学硕士学位论文 图1 1 6 碱土金属和重金属离子探针分子结构 f i g 1 ，1 6s t r u c t u r e so f t w op r o b e s f o ra l k a l i e a r t ha n d h e a v y m e t a li o n s 锌离子是人体内含量第二多的金属离子，仅次子铁，在任何细胞内都有锌离子的存 在，它对人体起着很重要的作用。目前锌离子探针很多p ”9 1 ，但是以b o d i p y 为荧光团 的只有两种，下面分别予以介绍： ： 2 0 0 2 年，b i l g et u r f a n 和e n g i nu a k k a y a 等人合成了一个z n ”探针【邶 ，探针结 构中以2 , 2 一联毗啶为z n 2 十的识别基团，每一个吡啶上连有一个氟硼荧染料，分子设计 的最终识别方式和上两个例子瀹好相反，这个探针体系对z n 2 + 的作用是使探针的荧光极 大的淬灭，原因是当联毗啶络合了z n 2 + 后，在光激发下联毗啶z n 2 + n 合物会向氟硼荧染 料基团转移电子，从而把整个探针分子的荧光强度降低，达到荧光淬灭的效果。这个探 针结构巧妙的利用了联毗啶上的氮原子能够络合并识别金属离子的特点采用引入醛基的 办法成功的引入了氟硼荧染料基团，合成了探针。其结构如图1 1 7 所示。 图1 1 7 b o d i p y 为荧光团的两个z n 2 + 探针结构 r i g 1 1 7t h e s t l l l c t u r e so f t w o p r o b e sf o r z n 2 + b o d y 荧光染料的合成、光谱性能研究及在生物探针中的应用 而t e t s u on a g a l l o 也以b o d p y 为母体合成了一个锌离子探针】，该探针络合锌离 子后荧光增强，而且其p k a 降到5 ，使得其在人体内几乎不受p h 影响，非常适合应用 于细胞中，在锌粒子探针中又迈进了一大步，其设计结构如图1 1 7 。 2 0 0 3 年，s oy o u nm o o n 和s u k - k y uc h a n g 等人继续探索了用氟硼荧染料合成重金 属离子荧光探针i4 2 】，他们采用8 一羟基喹啉作为重金属离子的识别分子。当把h 矿 加入到探针系统中时，会将探针的荧光淬灭9 8 以上，同时，耳矿加入后，还会引起 探针系统溶液的颜色发生变化，从亮的橘红色变为没有荧光的普通红颜色，完全可以通 过肉眼来观察到。其他金属离子对探针的淬灭作用很小，或者根本没有什么影响，唯独 h 9 2 + 淬灭非常显著，这样保证了探针具有很好的专一性识别功能。然而，该探针与h 缸“ 发生相互作用的机理并不明确，目前也难于给出一个很好的解释，有待于后面的工作给 与阐明。该探针的结构如图： 图1 1 8b o d 口y 为荧光团的h 酽+ 探针结构 f i g1 1 8t h es t m c t u r eo f p r o b ef o r f i 9 2 + 在d h 探针方面，c e r e nn b a k i 以b o d p y 为母体设计合成了一个可以在近中性 环境中对p h 敏感的荧光探针1 4 3 】，该探针以杯芳烃为接受质子的受体，在p h8 2 - - 5 6 范围内有2 3 荧光强度变化，在近中性环境中，非常微小的p h 变化就会从荧光发射中 灵敏的检测出来。该分子的结构如图1 1 9 所示。 今年，在p h 探针方面又有新突破m u k u l e s hb a r u a l l 以b o d 口y 为母体设计了一系 列的口h 探针m ，检测范围可以达到p k a 从7 5 - - 9 3 ，其受体结构也是基于酚和萘酚系 列，所设计的分子结构如图1 1 9 所示： 大连理工大学硕士学位论文 茹嚣盎， s ， 3 ：r 1 - h , r 2 - c i o r 】。h r 尸p - m