（应用化学专业论文）基于PET机理的Hglt2gt荧光探针的设计和应用研究.pdf

大连理t 大学硕+ 学位论文 摘要 汞是最具有毒性和危险性的重金属元素之一，而汞的污染和传播主要是通过火山喷 发，采矿，固体废弃物的焚烧和矿物燃料的消耗等途径进行的，尤其值得注意的是，汞 可以通过生物富集作用，集中在食物链中，这样会引起危害人类健康的许多疾病。因此， 生物体中或环境中汞的检测引起人们的极大关注。 最近几十年，已经报道多种h 9 2 + 的分析方法，其中荧光光谱法最受关注。荧光探针 能将分子间的相互作用转变成荧光信号传递给外界，从而帮助我们认识和理解微观世界 的状态、性质、及其变化规律，兼备便捷、专一和灵敏的优点，并能对化学体系和生命 体系中的研究对象进行适时原位检测。因此，利用荧光探针来检测环境或生命体内的 h 9 2 + ，成为超分子化学以及生物医学发展领域中重要的研究课题之一。 本论文在组内工作的基础上，对原有的探针进行了改进，设计合成了新的h 9 2 + 探针 b 2 。b 2 在h e p e s 缓冲溶液中，对h 9 2 + 有较高的选择性，不受其他金属阳离子的干扰。 由于醚链末端引入的羧基，增大了b 2 对h 9 2 + 的络合能力，使得b 2 不再受阴离子的干 扰。b 2 的检测限为7 2n m ，对1 0p p b 级别的h 9 2 + 有较好的响应。b 2 的酯化形式，具有 较好的细胞穿透能力，可以应用于p c i 2 细胞中显微成像，实现了活细胞内h 9 2 + 成像。 另外，将不同的含硫开链冠醚引入到h o m o 能级较b o d i p y 更低的罗丹明染料上， 设计合成了一系列的h 9 2 + 探针：r - a e ，r - a ，r o a e ，r - o i l 。探针对h 9 2 + 有不同的 响应程度，其中r _ a 的选择性最好，抗各种阳离子、阴离子的干扰能力最强，对h 9 2 + 有较强的络合能力，较低的检测限。更重要的是，r a 在较宽的p h 范围内，对h 9 2 + 的 响应不受质子的干扰。r - a 对应的酯化形式，r - a e ，也可以用在p c i 2 细胞和h e l a 细 胞中显微成像，在低浓度下可以在活细胞中对h 9 2 + 进行检测。 关键词：荧光探针；汞离子；显微成像；活细胞 大连理工大学硕士学位论文 s t u d yo nt h ed e s i g na n da p p l i c a t i o no f t h ef l u o r e s c e n c es e n s o r sf o r m e r c u r y ( i i ) b a s e do np e t a b s t r a c t m e r c u r yi s o n eo ft h em o s tt o x i ca n dd a n g e r o u sh e a v ym e t a le l e m e n t s m e r c u r y c o n t a m i n a t i o ni sw i d e s p r e a da n do c c u r st h r o u g hv a r i o u sp r o c e s s e s ，e g v o l c a n i ce m i s s i o n s ， m i n i n g ，s o l i dw a s t ei n c i n e r a t i o n ，a n dt h ec o m b u s t i o no ff o s s i lf u e l s o fp a r t i c u l a rc o n c e r n ，i s t h ec o n c e n t r a t i o ni nt h ef o o dc h a i n ，a n db i o a c c u m u l a t i o no fm e r c u r yi na n i m a l s i ti s f r i g h t e n i n gt h a tm e r c u r y c o n t a i n i n gc h e m i c a l sh a v eb e e nl i n k e dw i t han u m b e ro fh u m a n h e a l t hp r o b l e m s t 1 1 u s m u c ha t t e n t i o nh a sb e e nf o c u s e do nd e v e l o p i n gn e wm e t h o d st o m o n i t o rh g z + i nb i o l o g i c a la n de n v i r o n m e n t a ls a m p l e s r e c e n t l y ，m u c hm e t h o dh a sb e e nm a d et od e t e c tm e r c u r y f l u o r e s c e n ts p e c t r o m e t r yi s t h em o s tp r o m i s i n go n e c o m p a r e dw i t ht r a d i t i o n a lm e t h o d sf o r t h ed e t e c t i o no fm e r c u r y ，t h e f l u o r e s c e n tp r o b e sh a v ea t t r a c t e dm u c ha n e n t i o no v e rt h ey e a r sf o ri t sm a n yi n h e r e n tm e r i t s i n c l u d i n gh i g hs p e c i f i t ya n dh i g hs e n s i t i v i t y t h i st e c h n o l o g yh a sb e e nw i d e l yu s e df o rt h e r e a l t i m ei ns i t ud e t e c t i o no ft h em o l e c u l a re v e n t sb o t hi nt h ec h e m i c a la n db i o l o g i c a ls y s t e m s h e n c e ，e x p l o r i n g f l u o r e s c e n c es e n s o r sf o rd e t e c t i o no fm e r c u r yi nb i o l o g i c a la n d e n v i r o n m e n t a ls a m p l e si so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tr e s e a r c hs u b j e c t si ns u p r a m o l e c u l a r c h e m i s t r ya n db i o m e d i c i n e b a s e do nt h ep r e v i o u sw o r ki no u rg r o u p ，a ni m p r o v e df l u o r e s c e n tc h e m o s e n s o rf o rh 9 2 + ， b 2 ，w a ss y n t h e s i z e d i nh e p e sb u f f e rs o l u t i o n ，b 2e x h i b i t s s e l e c t i v ef l u o r e s c e n c e e n h a n c e m e n tt o w a r d sh g 计o v e ro t h e rm e t a li o n s t h ef l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n tw a s u n a f f e c t e db ya n i o n se x i s t i n gi ne n v i r o n m e n ta n do r g a n i s mb e c a u s eo ft h ei n t r o d u c t i o no f c a r b o x y l - t h i o lm o i e t i e s b 2s h o w sh i g hs e n s i t i v i t yt oh g z 十i nac o n c e n t r a t i o no fp p br a n g e w i t hd e t e c t i o nl i m i to f7 7n m b 2 e s t e r ，t h em e m b r a n e p e r m e a b l ee t h y le s t e r i sa b l et ob e h y d r o l y z e dt ob 2i nv i v o ，a n ds u c c e s s f u l l ya p p l i e dt oi m a g ei n t r a c e l l u l a rh 旷+ i nl i v i n gc e l l s i na d d i t i o n d i f f e r e n ta c y c l i ct h i o e s t e r sw e r ei n t u d u c e di n t ot h ef l u o r o p h o r eo fr h o d a m i n e a n das e r i o u so fh g 扩s e n s o r s ，r a e ，r - a 。r - o a ea n dr o hw e r eo b t a i n e d t h ef o u r s e n s o r ss h o w e df l u o r e s c e n c er e s p o n s et o w a r d sh g 付i nd i f f e r e n td e g r e e r as h o w sh i g h s e l e c t i v i t ya n ds e n s i t i v i t yt o w a r d sh g z + a n dt h ef l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n ti su n a f f e c t e db y o t h e rm e t a li o n sa n da n i o n s i naw i d ep hr a n g e t h er e s p o n s eo fr at o w a r d sh g z l 。i s i i i - 基于p e t 机理的h 孑+ 荧光探针的设计和应用研究 u n a f f e c t e db yp r o t o n t h ee t h y le s t e rf o r mo fr a ，r - a e ，i ss u c c e s s f u l l ya p p l i e dt oi m a g e i n t r a c e l l u l a rh 9 2 + i nl i v i n gp c12a n dh e l ac e l l s k e yw o r d s ：f l u o r e s c e n c es e n s o r s ；i m a g i n g ；m e r c u r yi o n ；l i v i n gc e l l s i v 大连理工大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文题目：盘墨乙垫丝垒塑二錾垄塑竺士生墼塑坌垒望苎鱼垒 作者签名：j 掣一魄乎年孚月上日 大连理工大学硕士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关学位论文知识产权的规定，在校攻读学位期间 论文工作的知识产权属于大连理工大学，允许论文被查阅和借阅。学校有 权保留论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印、或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文题目：瑾重至工煎丝圭鱼：鍪查盗丝垒望笪墨蕉因兰生垒 作者签名：生圭! 窆整 日期：2 生年二l 月二- _ 日 导师签名 ：窭丝i 羔型日期：卫年j 月厶日 大连理工大学硕士学位论文 1 绪论 金属离子的研究在生命科学研究中占有重要地位。设计合成对某些金属离子有高选 择性和灵敏度，具有合适光谱性能的荧光探针，在化学环境下试验其性质，并结合荧光 成像技术，实时在线检测细胞内的金属离子，将为生物学以及医学的研究提供必要的依 据。 1 。1 重金属汞对人体和环境的危害 汞是对人体和环境最具威胁和毒害作用的金属元素之一【l - 2 】，汞在自然界的主要存 在形式有三种：元素汞、无机汞和有机汞。 汞及其污染物可以通过火山喷发、采矿、固体废弃物焚化等各种各样的自然或人为 的过程而广泛分布，从而污染大量的水、空气和土壤，并且通过环境中细菌的作用，汞 元素和汞离子都可以被转化成甲基汞，即使是很低的浓度也可以进一步通过食物链富积 于人体中 3 - 1 。环境中的汞污染主要来源于工业使用的汞，拓化学工业中角汞作催化刺， 各种汞制仪表等。大气中的汞可来自汞矿开采冶炼、煤和石油燃料燃烧等。但是在分子 水平上，人们仍然不能完全研究清楚汞中毒的详细机理。 有机汞的毒性大于金属汞和无机汞化合物，因而更容易发生中毒。有机汞和甲基汞 均可通过呼吸道、消化道、皮肤侵入人体。无机汞在人体内的蓄积部位主要是肾脏，其 次是肝脏和脾脏；甲基汞除蓄积在肝、肾等脏器之外，还可通过血脑屏障蓄积于脑组织 内：汞中毒能损伤中枢神经系统，轻者表现为口腔炎、震颤、急躁、易怒和情绪不稳定， 重者则精神紊乱、行为支配能力降低、四肢瘫痪、耳聋跟瞎，甚至成为痴呆。此外。大 量使用有机汞农药，通过生物富集作用进而危害人体，也是汞中毒的主要原因之一。各 种形念的汞及其化合物都具有高度的化学反应活性，它能与体内蛋白质、酶和核酸等生 物分子中的巯基、羧基和磷酸基等官能团发生强烈缔合，进而扰乱细胞分裂和神经子传 递等生命过程，对人的健康有极大的损害【6 墙j 。同时它对大脑、骨骼、肾脏以及中枢神 经，免疫以及内分泌等系统都有不同程度的毒害作用。1 9 5 3 年发生在日本的“水俣病 便是典型的例子。所以对于环境中汞离子的检测以及生物学研究已经成为近年来的研究 热点。 基丁p e t 机理的h 孑+ 荧光探针的设计和应用研究 1 2 对于汞离子的检测方法以及细胞内金属离子成像 为了对由于汞的摄入吸收引起的病理进行研究，建立有效而实用的原位( i ns i t u ) 、 在体( i nv i v o ) 、实时( r e a lt i m e ) 检测系统，将为生物学以及医学的研究提供必要的 依据。 目前已经建立的测定金属离子的方法，主要有原子吸收( a a s ) n 射光谱法 ( a e s ) t 10 1 ，分光光度法f 1 1 1 2 1 ，高效液相色谱法【1 3 】，电感耦合等离子体质谱法( i c p m s ) 【1 4 1 ，化学发光法【1 5 1 ，电化学法( 极谱法和伏安法) 1 1 6 - 1 7 】，荧光分析法1 1 8 之5 1 等，这些方法 也广泛应用于汞的检测。原子吸收分光光度法具有灵敏度高、选择性好、抗干扰能力强、 应用范围广等优点，目前已经成为各个部门、教学科研单位普遍使用的一种分析测试方 法。其缺点是测定难熔元素的灵敏度不高，而且，测定每种元素都需要一个特定元素的 空心阴极灯，这对同时测定试样中多种元素颇为不便，此外，该方法不能反映所测元素 的价态。分光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法，此法定性定量较 好。灵敏度高、操作简单、仪器价格便宜，但是，由于过渡金属离子结构和离子半径差 别不大，在光度分析中常彼此干扰，导致测定方法的选择性不理想。i c p m s 法和h p l c 法所需仪器昂贵，样品预处理复杂，操作也比较繁琐。化学发光法选择性较差，不适于 低浓度的生物样品的测定。电化学方法测定金属离子主要有极谱法和伏安法，具有灵敏、 快速和简单的优点，应用广泛。 荧光检测法不仅方法简便，而且在灵敏度、选择性、响应时间、现场测定( 如荧光 成像技术) 及生物应用等方面均有其突出优点。近年来，荧光分析法在金属元素的分析 中的应用越来越广泛，从天然水、饮用水到废水、污水，从土壤大气到动植物，从人体 的头发骨骼血液到内脏等各个器官，涉及到的样品和应用范围几乎是无所不有。荧光分 析法具有很高的灵敏度，比紫外可见光分光光度法高2 - 4 个数量级，还具有选择性高、 重现性好、取样量少、简洁快速的优点。荧光检测的方法主要有荧光生成、荧光淬灭、 催化荧光，随着微机激光及电子学等一些新科学技术的引入还产生了诸如同步荧光、导 数荧光、三位荧光等的新技术，使荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观和自动化的方 向发展。荧光分析法的灵敏度、准确度和选择性不断提高。而且，最近荧光光谱及成像 技术得到了快速的发展，主要是在生物分析领域中应用广泛。由于多数待测物质本身无 荧光或荧光较弱，检测灵敏度较低，人们用荧光试剂对待测物进行标记或衍生，生成具 有高荧光强度的共价或非共价结合的物质，使检出限大大降低，这就是荧光探针。近几 年来，关于金属离子荧光探针的研究发展迅速，多种荧光探针已被设计合成用于测定金 属离子。仿生过渡和重金属离子荧光探针更是成为科技工作者研究的热点，其中基于光 一2 一 大连理工大学硕士学位论文 诱导电子转移( p e t ) 、分子内电荷转移( i c t ) 、分子内共振能量转移( f r e t ) 等机 理所设计的m 矿+ 、z n 2 + 、c d 2 + 等荧光探针是研究最广泛的几种，一些探针已经可以跨膜 在细胞内对微摩尔级的金属离子进行荧光成像。汞金属离子荧光探针也有相关报道，但 这些探针分子太都受一些重要因素的限制，只有少数分子能够在细胞内荧光成像，不利 于在生命体中对这些痕量金属离子的实时和原位检测。 最近几年才报道出多种用于汞离子的荧光成像的荧光探针。最早用在细胞和组织中 荧光成像的h 矿荧光探针1 是t b a 研究组利用汞的脱硫性反应而设计的罗丹明类分予 2 6 - 2 7 1 0 探针分子1 在闭环时没有特征吸收以及荧光发射，当遇到h 矿后，在h 矿作用 下发生脱硫反应，并形成一个氧杂二唑的五元环，同时原来的内酯环打开，出现罗丹明 类染料的特征吸收和荧光发射。该探针对h 9 2 + 有很好的灵敏性，反应也可在常温状态下 进行，5 0p m 的探针底物在c 2 c 1 2 细胞对等量的h g “实现了细胞成像，而且该探针在 斑马鱼细胞中也实现了较好的成像效果。 ：黢o s 詈e l m ：嵌”“ 熬 f 圈11 基于脱硫成环的h 矿荧光探针及其在c 2 c 1 2 细胞和组织中的成像图 f kl l f l u o r e s c e n tc h c m o d o s i m c t e r b a s e d 0 1 1 h 9 2 + _ i n d u c e d d c s u l f u r i z a t i o na n d i t s f l u o r e s c e n c e i m a g e i n c 2 c 1 2c e l l sa n d t i s s u e c h a n g 研究小组最初合成了以硫杂冠醚作为识别基团的荧光素类汞离子荧光探针 ，在此基础上，他们又在苯环上引入一个甲基，合成出了一个新的h 矿+ 探针2 1 2 0 l ，增 大了空间位阻从而限制了苯环的振动，减少了能量的消耗，增大了灵敏度以及在细胞实 詈一 薹! 坚垫垄塑! ：茎堂塑塑望盐型生旦堡塞 验中的荧光增强程度。2 络合了h 矿+ 后荧光量子产率增大到0 7 2 ，荧光强度约有4 4 倍 增强，使得该探针可以在p p m - p p b 浓度范围内实现对水溶液，细胞以及组织内的汞离子 的检测，1p m 的探针底物在h e k2 9 3 t 细胞对p p b 级别的h 矿+ 就有响应，这是硫杂冠 醚类h ，荧光探针中各项性能最好的例子之一。 妒 藤 圈12 冠醚类的h 矿+ 荧光探针以及在h e k 2 9 3 f 细胞中的成像幽 瞻1 2i m a g i n g i n h e k 2 9 3 tc e l l su s i n g h 9 2 - f l u o r e s c e n t p r o b e w i t h t h i oe - c s t e r 同样是利用h 矿+ 的络合引起罗丹明类染料开环，先后有多个h 矿荧光探针都应用 在了细胞成像中。f u y o u l i 研究组设计合成的探针3 ( 5 “m ) 在c a o v 3 细胞中对1 0 l l m 的h 矿实现了成像。由于在识别基团上引入了具有氧化还原能力的二茂铁，该探针除了 能在可见光，荧光范围内检测，还可以用电化学的方法检测洲。d o s 研究组2 0 “m 的探 针底物4 在p s e u d o m o n a s r p u t i d a 细胞中对1 0 州的h f + 实现了荧光成像，此外，还将法 探针应用到扫描电镜中p “。z , h a “g 通过s i s 键将两个罗丹明b 连在一起，1 0u m 的探针 5 在h k2 细胞中对从o1 2 0 , a m 不同浓度下的h 一+ 都有响应1 3 2 j 。 3 g 莺f应硬l 扩踹 大连理工大学硕士学位论文 o -0 6 ( b ) i _ _ 图13 咀罗丹明为荧光团的h 矿荧光探针及其细胞成像 f i 9 1 3h f + f l u o r e s c e n c es m o r s b a s e do n e d y e sa n d i m a g i n g p l c t i l r e s i nc e le s 而y a o n 研究组将硫原子日l 入到罗丹明6 0 内酯环中，合成了一个灵敏度根高的h 矿 探针6 ，可以在纳摩尔范围实现对h 矿+ 的检测，并且在线虫组织中可以实现荧光成像脚】。 钱旭红研究组以f r e t 为机理设计合成了i - i 矿荧光探针7 口q 。7 在加入 聍+ 前发出 的是b o d i p y 类特征荧光( 5 1 2 a m ) ，在加入h ，+ 后硫厥部分发生脱硫成环反应，b o d i p y 发出的荧光转移到罗丹明，最终发出罗丹明类染料的特征荧光( 5 8 6n m ) 。该体系对 i 矿有着很好的选择性和较高的灵敏度，并且使用5 曲d 的底物实现了等量h 尹在 m c f 一7 细胞内的比率成像，为定量检测h 9 2 + 的研究提供了很多可借鉴之处。 、 ( n 、 一 臀 茎! 型塑塑堕：茎鲨丛生堡生塑皇旦婴塑 图匮 圈14 基于f r e t 机理的h 9 2 + 荧光探针及其在m c f - 7 细胞成像 f i 9 1 4h f + f l u o r e s c e n c e 1 1 5 0 rb a s e d o n f r e ta n d i m a g i n g p i c t u r e s i n m c f 7c e u s 最近，韩国的s h i n 研究组将乙烯基醚引入到荧光素上p ”，利用h 9 2 * 促进乙烯醚的 水解，释放荧光素的荧光来实现对h 矿+ 的检测。值得提的是，这个探针也可以对甲 基汞进行检测，并且在a 5 4 9 细胞和斑马鱼各个组织中都实现了对甲基汞的显微成像， 所使用的探针浓度为5 0m m ，c h 3 h g c i 的浓度为1 0 0m m 。 国15 甲基汞荧光探针及其细胞和组织成像 f i g l5 f l u o w , s c e n c e $ e r l $ o r f o r c 卜b h ga n d 拓i m a g j n g p i c t u r e s i n a 5 4 9c e l l sa n dz c b m f i s h t i s s u e 设计荧光探针引入组织和细胞，富集在组织和细胞的特定成分中，在荧光显微镜下 不仅可观察固定的细胞、组织切片还可对活细胞的结构、生物大分子等进行实时观察 和检测，配合荧光光谱仪获取荧光图像的量化信息。因此，荧光显微镜在生物分析领域 中将具有广泛的应用前景。 荧光成像生物分析的迅速发展，深化了人们在分子水平上对生物化学过程的了解。 荧光显微镜与荧光光谱仪耦合而成的系统仪器能够获取显微荧光成像及微区荧光强度、 荧光寿命的测定信息。选择荧光探针对被标记物进行特异性标记，荧光探针的亮度即荧 光强度可反映被标记物相对含量的多少。荧光显微镜对图像采集后荧光光谱仪可钡懂 图像的荧光强度，对获取的图像进行荧光强度的定量，为全面分析和研究细胞内部结构 提供更加详尽的数据信息。尤其是比率型荧光探针的出现使得对金属离子韵定量测定更 加准确。它能对完整的活细胞和组织或固定的细胞和组织内各种结构进行定性、定量和 大连理t 大学硕十学位论文 定位的测量，功能强大，可操作性强，特别是在细胞生理过程的定量研究方面具有巨大 的优势。在细胞及组织内实时，在线检测金属离子成为研究的热点，设计荧光探针与金 属离子结合，应用荧光显微技术检测细胞内游离金属离子的变化，具有灵敏度高，操作 便捷等优点。 因此设计合成h 9 2 + 离子荧光探针，在化学体系中试验其性质，结合激光共聚焦荧光 成像技术，实时在线检测细胞内h 9 2 + 离子的浓度变化及其分布，探讨它在生命活动中所 发挥的作用以及响应引起的病理进行研究，将为生物学以及医学的发展提供必要的依 据。 1 3 荧光探针的设计 通常评价金属离子荧光探针的性能主要从灵敏度、选择性、实时性和原位检测性能 等方面来考虑。灵敏度方面主要又包括许多因素：如探针与被检测金属离子的结合强度； 识别信息的荧光信号转换效率；另外，荧光团的发射波长、量子产率、斯托克斯位移、 背景荧光干扰和仪器性能等也会影响探针的灵敏度。选择性方面主要取决于探针与被检 测金属离子的结合选择性，有时被结合的金属离子可直接影响荧光团的荧光发射性能， 这种情况下识别选择性还与被结合的金属离子性质有关：当然专一选择性是最好的。荧 光探针的实时性主要包括识别响应的速度和可逆性两方面，如果可逆响应的速度快于或 与被检测金属离子的变化速度相匹配，则可称之为实时响应探针。原位检测性能主要取 决于荧光探针分子与被检测金属离子的相容性，探针能以独立的分子状态分散于被检测 体系并发出识别信号；一般情况下，水溶性的探针比非水溶性探针好。 典型的荧光分子探针主要是由荧光团和识别基团由连接基团( 或没有) 连接组成。 荧光团主要是作为发信号部分，负责把识别信号转化为光信号发出；由特定结构组成的 识别基团则起到对客体的识别作用。 1 3 1 荧光团 有机荧光试剂分子都含有发射荧光的基团，习惯称为荧光团。 1 9 6 8 年t r e i b s 等首次合成了4 d i f l u o r o 4 一b o r a t a - 3 a - a z o n i a - 4 a - a z a - s i n d a c e n e ( b o d i p y ) 1 3 6 j 。b o d i p y 染料由硼桥键和甲川桥键把两个吡咯环固定在一个平面上，使 分子具有刚性共平面结构，在激发光的作用下能产生强烈的荧光( 化合物9 ) 。b o d i p y 类染料分子的高度刚性使其具有高的摩尔消光系数和荧光量子产率、良好的光稳定性、 基丁p e t 机理的h 矿荧光探针的设计和应用研究 激发波长在可见区、结构易于修饰、发射波长可调变到近红外、不易受环境和溶液p h 的影响等优点。 r 2 9 图1 6b o d i p y 荧光团 f i g 1 6 s t r u c t u r eo fb o d i p y 罗丹明类试剂属吡喃型碱性试剂( 化合物1 0 ) ，这类试剂均为红紫色粉末，又称为 玫瑰红染料，易溶于水，水溶液呈鲜红色并发出强烈荧光，罗丹明类染料苯环中有“氧 桥 相联，具有刚性平面结构，容易吸收入射光的能量而发射长波，从而产生荧光。因 此，罗丹明类荧光染料也具有很多的优点，如高摩尔吸收系数，高荧光量子收率，激发 波长长等。这些优点使得罗丹明类染料不仅广泛引用于p h 检测、小分子【3 | 7 j 或离子检测， 还有报道其应用于酶、蛋白、多肽的分析和监测【3 8 】，遗传物质( d n a ，r n a ，p n a ) 的 分析和测定1 3 。 传统的商品化的罗丹明类染料结构及命名如下。由于罗丹明在不同环境下的互变异 构，使得罗丹明类染料可以实现颜色和荧光的双重变化，这一性质使得罗丹明类染料被 广泛应用在荧光分子探针的设计中 2 6 - 2 7 , 3 0 - 3 4 。但是由于罗丹明类染料的活性基团只有底 环上的羧基，限制了识别基团的引入。 假4 民一p n 民n ( r 1 蚴 o r 7 大连理工大学硕士学位论文 其它常用的荧光团还有荧光素，丹磺酰胺，香豆素类，吖啶和菁类荧光染料等。一 般地说，几乎所有的荧光团都可以用作荧光探针的信号基团，但是，荧光基团之间结构 和性能的差异有时会导致不同的识别效果。 荧光探针中信号部分的选择是探针设计中的重要内容之一。不仅要考虑荧光团应具 有良好的光化学和光物理性能，而且也必须考虑合成的合理性和简单性。 1 3 2 识别基团 识别基团的设计是探针分子设计的重要环节，必须考虑识别基团的特性，希望在主 客体作用时荧光团的光物理和光化学性能发生明显的变化。在设计分子荧光探针时在识 别事件中，选择性是最重要的。因此，按照超分子化学的一般原理必须认真选择合适的 识别基团，尽量使识别基团和被测物的性质相匹配。也就是说，对识别基团来讲，配体 的拓扑结构、配位原子或基团的数量和性质应该和被测物特性相匹配( 如阳离子离子直 径、电荷密度、配位数、金属离子的软硬度等) 。对于金属阳离子的识别，大多数荧光 探针分子需要一个或几个可以结合客体的识别基团。 因此，受体在荧光分子探针中具有重要的作用，它决定了分子探针与被识别客体的 结合灵敏性和选择性。这种结合性能是荧光分子探针对被识别客体具有选择性和灵敏性 的前提。荧光分子探针中常用的识别基团有冠醚、开链聚醚、多乙烯多胺、多羧甲基胺、 环糊精、杯芳烃、多肽等，这些识别基团基本上都曾被用作h 9 2 + 的检测。 一9 一 基于p e t 机理的h 9 2 + 荧光探针的设计和应用研究 ( 1 ) 冠醚 自从1 9 8 7 年n o b e l 化学奖授予p e d e r s e n ，c r a m 和l e h n 以来，冠醚化学得到了长 足的发展，并已经取得很多令人瞩目的成就【4 0 4 1 1 。冠醚是一类人工合成的受体，如何设 计对单一金属离子具有高选择性的冠醚，一直是人们所面临的具有挑战性的课题。冠醚 通过配位作用与各种金属离子形成具有一定稳定性的配合物，或者通过氢键与客体分子 形成配合物，如有机中性分子或阴离子等，将其和荧光团连接组成的超分子体系是研究 最多的一类荧光分子探针。 冠醚体系中硫原子的引入使得合成的荧光分子探针对汞的选择性络合能力增加，这 是根据“软硬酸碱理论 得出的结论。氧原子是硬碱，所以氧杂冠醚一般对硬酸的碱金 属和碱土金属络合能力强。硫原子是软碱，硫杂冠醚一般对软酸的重金属和过渡金属络 合能力强。 前面提到的化合物2 就是一个以硫杂冠醚为识别基团的荧光素类h 9 2 + 离子荧光探 针，h 9 2 + 的加入使荧光强度约有4 4 倍增强。 此外，氧杂、氮杂冠醚也可以作为h 9 2 + 的识别基团【4 2 4 5 1 ，图1 8 是以各种冠醚为识 别基团的h 9 2 + 探针。 图1 8 冠醚类h 9 2 + 荧光探针 f i g 1 8h 矛+ f l u o r e s c e n c es e l l s o r sb a s e do nc r o w n - e s t e rr e c e p t o r s ( 2 ) 开链聚醚 由于冠醚的水溶性不好，限制了以其为识别基团的离子探针的应用，为了增加水溶 性，不少开链聚醚化合物被引入到荧光团上，用来识别h 9 2 + 离子，得到了很好的应用。 l i p p a r d 研究组在荧光素上引入开链硫醚，得到一系列h 9 2 + 离子荧光探针【4 6 4 7 1 。同 样的配体被钱旭红实验组应用在罗丹明上，也得到了高选择性的h 孑十探针【4 8 1 。 大连理工大学硕士学位论文 图1 9 开链硫醚类h 孑+ 荧光探针 f i g 1 9 h 9 2 + f l u o r e s c e n c es e n s o r sb a s e do na c y c l i ec r o w n e s t e rr e c e p t o r s ( 3 ) 多酰胺类 钱旭红实验组在b o d i p y 上引入不同数量的酰胺爪，来实现对n g + 离子的识别【4 9 1 。 h o 、 o h h o j | h 扒n 片h 1 8 图1 1 0 多酰胺类h 9 2 + 荧光探针 f i g i 10h 孑+ f l u o r e s c e n c es e n s o r sb a s e do np o l y a m i d er e c e p t o r s ( 4 ) 不饱和烃类 利用不饱和烃类为识别基团来识别h 9 2 + ，是最近的研究成果。前面提到的探针8 就是一个很好的例子。而k o i d e 实验组在荧光素的羟基上引入乙炔基，得到探针2 1 【s o l ， 随着h 孑+ 的加入，使得炔基被h 9 2 + 还原，最终离去，荧光恢复。 2 t 图1 1 1 不饱和烃类h 9 2 + 荧光探针 f i g 1 11h 矿+ f l u o r e s c e n c es e n s o r sb a s e do nu n s a t u r a t e dh y d r o c a r b o n 基于p e t 机理的h 矿+ 荧光探针的设计和应用研究 ( 5 ) 杯芳烃 2 4 图1 1 2 杯芳烃类h 9 2 + 探针 f i g 1 12h 矿+ f l u o r e s c e n c es e n s o r sb a s e do nc a l y xa r e n e 杯芳烃在作为h 矿的识别基团，应用得也比较广泛【5 1 - 5 3 1 。 ( 6 ) 胸腺嘧啶 据报道，胸腺嘧啶( t h y m i n e ) 与h 孑+ 有着较强的结合力，能形成t - h g - t 碰5 4 1 ， 已有不少报道利用这种作用力来实现对h 9 2 + 的检测。化合物就是利用激基缔合物机理设 计的h 9 2 + 探针，随着h 矿+ 的加入，激基缔合物的峰逐渐增吲”1 。 哟例如蛰。 图1 1 3 胸腺嘧啶类h 9 2 + 探针 f i g 1 13h 9 2 + f l u o r e s c e n c es e n s o r sb a s e do nt h y m i n e 此外，还有利用其他识别基团来实现对汞离子的检测的。 1 4 常见h 9 2 + 荧光分子探针识别原理 通过前人不断的努力和众多成功荧光探针的例子的总结分析，得出了常见h f + 荧光 分子探针的基本识别原理。 火连理1 二大学硕士学位论文 1 4 1 光诱导电子转移 典型的光诱导电子( p h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ，p e t ) 转移体系是由包含电子给 体的受体部分r ( r e c e p t o r ) ，通过间隔基s ( s p a c e r , 如一c h 2 一) 和荧光团f ( f l u o r o p h o r e ) 相连而构成的【5 昏5 9 】。其中荧光团部分是能吸收光和发射荧光的场所，受体部分则用来结 合客体，这两部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连而成一个分子，构成了一个在选择性 识别客体的同时又给出光信号变化的超分子体系。p e t 荧光分子探针中，荧光团与受体 单元之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的淬灭作用，通常是电子从供体转移 到激发态荧光团。因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很弱。一旦受 体与客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射荧 光。 p e t 是人们在设计荧光分子探针时使用的最为广泛的原理之一。钱旭红研究小组【6 0 】 设计合成了发卡型萘酰亚胺类的荧光探针2 6 ，该探针分子对汞离子有很好的选择性，并 且具有很好的灵敏度，最低可以检测1 0 x1 0 一m 。l i p p a r d 发表的一系列的荧光素类h 9 2 + 荧光探针1 5 ，1 6 ，2 7 2 9 ( m s l m s 5 ) 也都是基于p e t 机理的【6 1 - 6 2 1 。 s i o o r r = c h 3 ，2 9 图1 1 4p e t 类h 孑+ 探针 f i g 1 14h 9 2 + f l u o r e s c e n c es e n s o r sb a s e do np e t 基于p e t 机理的h 孑+ 荧光探针的设计和应用研究 1 4 2 分子内电荷转移 多数基于分子内电荷转移( i n t r o m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ，i c t ) 6 3 - 6 5 机理的荧光探 针分子是按照下面的原理设计的：含氮的识别基团直接连接到荧光团上，这个氮原子对 荧光团和阳离子都起着电子供体的作用。 化合物3 0 ，3 l 都是典型的i c t 荧光探针。探针3 0 苯胺氮原子和h 孑+ 络合之后， 抑制了苯并噻唑与香豆素之间的电子转移，因此，引起了发射波长近1 0 0n l n 的蓝移， 比率荧光有近3 0 倍的变化【6 6 】。化合物3 1 在p e t 和i c t 共同作用下，化合物1 4 与h 矿 络合后荧光比率增强近3 0 倍【6 7 j 。 h n h j h oo h 、 n h l o h 3 1 图1 1 4i c t 类h f + 探针 f i g 1 14h 9 2 + f l u o r e s c e n c es e n s o r sb a s e do ni c t 1 4 3 激基缔合物 如果两个相同的荧光团( 主要是多环芳烃) 之间的距离和位置合适，当其中一个荧 光团被激发以后就会和另外一个处于基态的荧光团形成激基缔合物( e x e i m e r ) ，其荧光 发射光谱的特征表现是原来单体的发射峰减弱或者消失，取而代之的是一个新的、强而 宽的、长波长的无振动精细结构发射峰。萘、葸、芘等荧光团由于具有较长的激发单线 态寿命，易形成激基复合物，常常用于此类探针的设计中。 前面提到的化合物2 5 就是利用这个机理来识别h 孑+ 的。而探针3 2 ，随着h 孑+ 的加 入，芘单体和复合物的峰分别相应下降了9 7 和3 8 倍【6 8 】。 大连理工大学硕士学位论文 厂ss _ 村靛ss h 衬 图1 1 4 激基缔合物类n g + 探针 f i g 1 14h 9 2 + f l u o r e s c e n c es e n s o r sb a s e do ne x c i m e r 1 4 4 荧光共振能量转移 荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ，f r e t ) 是指在两个不同 的荧光团中，如果个荧光团( 供体d o n e r ) 的发射光谱和另一个荧光团( 受体a c c e p t o r ) 的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光团问的距离合适时( 一般小于l o o a ) ，就可 以观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即用供体的激发波长激发时，可观察到受 体的荧光发射。f r e t 严格受到供体和受体距离的影响，如果识别事件能够改变供体和 受体之间的距离，那么两个波长的荧光强度就会发生变化，从而可以用它们的比值来表 达识别事件。 k n j 3 3 图1 。1 5f r e t 类h 9 2 + 荧光探针 f i g 1 15h 9 2 + f l u o r e s c e n c es e n s o r sb a s e do nf r e t 探针3 3 就是一个f r e th 9 2 + 荧光探针f 鲫，3 3 与h 9 2 + 的结合引发罗丹明内酯环打开， 激发芘就会发射出罗丹明的特征荧光。但是该探针水溶性不好，所有的测试都是在乙腈 中进行的。 前面提到的探针7 也是基于f r e t 机理的h 矛+ 荧光探针，该探针将短波长的 b o d i p y 与长波长的罗丹明结合起来，未结合孵+ 之前，7 发出b o d i p y 的特征荧光( 5 1 2 n m ) ，由于h 9 2 + 的加入，导致硫脲部分脱硫成环，同时罗丹明的内酯环打开，此时再 基于p e t 机理的h 孑+ 荧光探针的设计和应用研究 激发，7 发出罗丹明的特征荧光( 5 8 6n m ) 。该体系对h 矿+ 有着很好的选择性和灵敏度， 并且实现了比率细胞成像。 1 4 5 反应型h 9 2 十荧